Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-01-25T11:42:48Z No. of bitstreams: 1 Ana Cristina renna de vitta.pdf: 4127367 bytes, checksum: 25de75c84e71cf4d8ed4adf6415a78b7 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-25T11:42:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ana Cristina renna de vitta.pdf: 4127367 bytes, checksum: 25de75c84e71cf4d8ed4adf6415a78b7 (MD5) Previous issue date: 2009 / O presente estudo privilegia os aspectos comportamentais relacionados com a atração sexual em Triatoma brasiliensis. Considerando o fato de que o abrigo é um recurso fundamental para a sobrevivência na maioria das espécies de triatomíneos e que o sucesso reprodutivo se dá por meio de um eficaz encontro com o parceiro sexual, optamos por analisar o padrão de atividade locomotora em relação ao abrigo por adultos desta espécie durante a fase escura do ciclo diário e verificar o efeito da presença de coespecíficos nesta atividade. Uma vez fora do abrigo e motivados a procurar alimento e/ou parceiro para o acasalamento, estes insetos podem caminhar ou voar em direção à fonte de estímulo. Neste sentido, avaliamos se existem sinais químicos emitidos por indivíduos do sexo oposto que sejam capazes de disparar o voo de machos ou fêmeas. Sabendo que estes insetos deslocam-se fundamentalmente caminhando, testamos se há comunicação mediada por odor entre os sexos através da técnica de olfatometria. O próximo passo foi determinar a origem do sinal químico que promovia as respostas dos machos no olfatômetro. Foi realizada a identificação química da secreção das glândulas metasternais através de cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (CGEM) e os diferentes componentes da secreção destas glândulas foram testados na antena de machos de T. brasiliensis por meio de cromatografia gasosa acoplada a eletroantenografia (CG-EAD). Adicionalmente, foram descritos detalhadamente os aspectos gerais do comportamento durante a cópula e caracterizados fatores fisiológicos, tais como idade e estado nutricional, que afetam a receptividade da fêmea. Finalmente, o efeito da presença de grupos de machos sobre a duração da cópula e a existência de comportamentos relacionados com competição sexual entre indivíduos foi analisada. Os resultados encontrados mostram que a atividade locomotora nas proximidades do abrigo (saídas do abrigo e atividade locomotora) é maior na primeira hora da fase escura, tanto em fêmeas quanto em machos de T. brasiliensis. Além disso, odor de fêmea foi capaz de provocar um aumento significativo no número de machos que saíram do abrigo. Uma vez fora do abrigo, os machos aumentaram sua atividade quando odor de fêmea foi apresentado. Verificamos que uma proporção importante dos machos e fêmeas inicia o voo quando confrontados com correntes de ar limpo, porém de maneira não orientada. A atividade de início de voo parece ser maior durante as primeiras horas da fase escura tanto em fêmeas quanto em machos. Foi observado que a presença de odor de fêmea provoca um aumento da atividade de início de voo nos machos. Além disso, foi possível comprovar que as respostas dos machos foram orientadas contra a corrente de ar quando na presença de odor de fêmea. Nosso resultados mostram que as secreções das glândulas metasternais de fêmeas são relevantes para o sucesso da cópula nesta espécie. Surprendentemente, os dados mostraram que as secreções das glândulas de Brindley de fêmea também parecem relevantes para o sucesso da cópula em T. brasiliensis. Nos testes de olfatômetro verificamos que machos são significativamente atraídos por odor de fêmea e de macho. Adicionalmente, foi possível demonstrar que os odores emitidos pelas glândulas metasternais de fêmea são responsáveis pela resposta de orientação dos machos no olfatômetro. Os dados mostram que as glândulas metasternais não são a fonte dos sinais químicos que provocaram a atração de machos por machos. As glândulas metasternais de T. brasiliensis também estão envolvidas na síntese de substâncias voláteis, basicamente cetonas, dioxolanos e álcoois, sendo a 3- pentanona o principal componente em ambos os sexos. No estudo de eletrofisiologia, 100% das antenas responderam à 3-pentanona, 71% ao (4R)-metil-1-heptanol, 28% ao (2S)-metil-1-butanol e (1R)-feniletanol e 14% ao 2,2,4-trietil-5-metil-1,3-dioxolano. Fêmeas de T. brasiliensis exibem três tipos de comportamento de rejeição em resposta as tentativas de cópulas realizadas pelos machos: movimentos abdominais, achatamento corporal e evasão. A idade afeta a motivação dos machos para realizar tentativas de cópula e o estado nutricional afeta a receptividade da fêmea. Machos de T. brasiliensis reagem à presença de machos competidores guardando a fêmea por um longo intervalo de tempo. A análise do comportamento de fêmeas sugere que elas são capazes de reconhecer o estado nutricional dos machos e aceitar com maior frequência as tentativas de cópula dos machos alimentados. / The present study privileges behavioral aspects related with the sexual communication of Triatoma brasiliensis. The long range communication between sexes mediated by odors was evaluated using an olfactometer. Males were significantly attracted by odors of females or from other males. We tested whether males or females are activated to leave their refuges in the presence of odors from individuals of the opposite sex. The results show that male T. brasiliensis respond to the presence of female odor leaving their refuges and showing a significantly higher locomotor activity. Moreover, flight initiation experiments demonstrated that male insects take off more frequently and in an oriented manner in the presence of air currents associated to female odor. The metasternal glands of females showed to be the source of the signals mediating male orientation. Nevertheless, the products of male MGs were not relevant to mediate the observed male orientation to air currents associated to the odor of males. Our results demonstrated that the metasternal glands of T. brasiliensis are involved in the synthesis of volatile substances. These glands produce basically ketones, dioxolanes and alcohols; 3-pentanone was the major constituent of the mixture for both sexes. The use of GC-EAD allowed showing that male antennae respond to at least five of the main compounds produced by female MGs. The relevance of these results for understanding the behavioral repertoire of this species, particularly in the sexual context, is discussed. The frequency of male copulatory attempts varied according to insect age. Females of this species showed three types of rejection behaviour in response to male copulatory attempts: flattening, abdominal movements and evasion. The analysis of female behavior revealed that this rejection frequency was kept unchanged during the pre-feeding period. After feeding, a gradual decrease in the number of rejections was observed, showing no rejections after approximately 8 days post-feeding. We suggest that feeding triggers the acceptance of the male copulatory attempts in T. brasiliensis females. Data showed that 70% of the females accepted to copulate with 3 different males in a one hour interval and the remaining 30% did so with two different males. Pos-mating association behaviour is described here for males of this species.

Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2013-02-15T18:25:22Z No. of bitstreams: 1 vitor_e_vidal_ioc_bcm_0021_2010.pdf: 5115263 bytes, checksum: fa627a814efc2aa5bda7207fe780c399 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-02-15T18:25:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 vitor_e_vidal_ioc_bcm_0021_2010.pdf: 5115263 bytes, checksum: fa627a814efc2aa5bda7207fe780c399 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / As calpaínas constituem uma família de cisteína-peptidases neutras dependentes de cálcio presentes numa ampla variedade de organismos. Em virtude da relevância fisiológica dessa proteases, inibidores de calpaínas já vêm sendo desenvolvidos para o tratamento de doenças humanas e microbianas. Estudos recentes vêm relatando a presença de diversas proteínas relacionadas às calpaínas em tripanossomatídeos, mas pouco se sabe a respeito das funções específicas dessas proteínas nesses micro-organismos. Nesse contexto, uma vez que os fármacos atualmente disponíveis para o tratamento da doença de Chagas apresentam sérios efeitos colaterais e podem ser ineficazes, inibidores proteolíticos poderiam ser uma alternativa no tratamento desta doença. Portanto, o presente trabalho investiga a presença de moléculas similares às calpaínas no Trypanosoma cruzi e o efeito inibidor do inibidor III de calpaínas (MDL28170) sobre a proliferação, viabilidade, diferenciação, ultraestrutura e interação das diferentes formas do parasito com células hospedeiras em ensaios in vitro. Nossos resultados revelam a reatividade cruzada de anticorpos produzidos contra calpaínas já bem caracterizadas de Drosophila melanogaster, Homarus americanus e. Trypanosoma brucei contra moléculas de superfície do T. cruzi, conforme demonstrado por imunofluorescência e citometria de fluxo. Em ensaios de Western Blotting foi possível observar que o anticorpo anti-DM-calpaína foi capaz de reagir contra uma proteína de 80 kDa. Pesquisas realizadas no GenBank demonstraram a presença de 4 seqüências nomólogas à calpaína de D. melanogaster no genoma do T. cruzi. Essas 4 seqüências foram identificadas como cisteína-paptidases de massa molecular predita em torno de 80kDa. Nos ensaios de inibição com o MDL28170 foi possível observar a redução da proliferação das formas epimastigotas ao longo de 5 dias de cultura; e a redução significativa da viabilidade das formas tripomastigotas sanguíneas dos parasitos tratados com 25 µM do composto. O inibidor, adicionado nas concentrações de 6,25 à 25 µM, também foi capaz de diminuir de forma dose- e tempo-dependente o número de macrófagos parasitados e o número de parasitas interiorizados nos ensaios de interação com macrófagos peritoneais murinos. O MDL28170 em concentração a partir de 12,5 µM teve ainda um efeito inibitório significativo sobre a adesão de formas epimastigotas ao epitélio intestinal de Rhodnius prolixus; assim como os anticorpos anti-calpaínas foram capazes de inibir significativamente a interação com o inseto vetor. Por fim, foi possível observar uma redução significativa no processo de diferenciação por metaciclogênese em meio TAU e alterações ultraestruturais em reservossomos, Golgi e membrana plasmática quando formas epimastigotas do T. cruzi foram tratadas com MDL28170.. Embora mais estudos sejam necessários para melhor caracterizar moléculas similares às calpaínas no T. cruzi, o nosso trabalho acrescenta novos conhecimentos sobre as possíveis funções dessas moléculas e sobre a possibilidade de utilização de inibidores de calpaínas como uma alternativa promissora para o desenvolvimento de compostos mais potentes e seletivos para o tratamento da doença de Chagas. / The calpains are a family of cysteine ​​peptidases neutral calcium dependent present in a wide variety of organisms. Due to the physiological relevance of such proteases, calpain inhibitors have already been developed for the treatment of human diseases and microbial. Recent studies have reported the presence of several proteins related to calpain in trypanosomatids, but little is known about the specific functions of these proteins in these micro-organisms. In this context, since the drugs currently available for the treatment of Chagas' disease have serious side effects and can be ineffective, proteolytic inhibitors could be an alternative in treatment of this disease. Therefore, the present study investigates the presence of molecules similar to calpain in Trypanosoma cruzi and the inhibitory effect of calpain inhibitor III (MDL28170) on proliferation, viability, differentiation, ultrastructure and interaction of the different forms of the parasite with host cells in vitro tests . Our results reveal the cross-reactivity of antibodies produced against calpains already well-characterized Drosophila melanogaster, and Homarus americanus. Trypanosoma brucei against surface molecules of T. cruzi, as demonstrated by immunofluorescence and flow cytometry. In assays Western Blotting was observed that the anti-DM-calpain was able to react against a protein of 80 kDa. Surveys conducted in GenBank showed the presence of 4 nomólogas the calpain sequences of D. melanogaster genome of T. cruzi. These four sequences were identified as cysteine ​​paptidases predicted molecular mass of around 80 kDa. In inhibition assays with MDL28170 was possible to observe a reduction in the proliferation of epimastigotes over 5 days of culture, a significant reduction in the viability of blood trypomastigotes of parasites treated with 25 mM of the compound. The inhibitor added at concentrations of 6.25 to 25 mM, was also able to decrease in a dose-and time-dependent number of infected macrophages and the number of parasites internalized interaction assays with murine peritoneal macrophages. The MDL28170 in concentration from 12.5 mM still had a significant inhibitory effect on the adhesion of epimastigotes to the intestinal epithelium of Rhodnius prolixus, as well as anti-calpain were able to significantly inhibit the interaction with the insect vector. Finally, we observed a significant reduction in the differentiation process by metacyclogenesis amid TAU and ultrastructural changes in reservossomos, Golgi and the plasma membrane when epimastigotes of T. cruzi were treated with MDL28170 .. Although more studies are needed to better characterize molecules similar to calpains in T. cruzi, our work adds new insights into the possible roles of these molecules and the possibility of using inhibitors of calpain as a promising alternative for the development of more potent and selective compounds for the treatment of Chagas' disease.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-07-21T18:21:23Z No. of bitstreams: 1 Marcio Cerqueira de Almeida, Avaliação da associação... 2013.pdf: 1510563 bytes, checksum: 0e9c49e3f55ccee94564fa6d382253e8 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-07-21T18:21:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marcio Cerqueira de Almeida, Avaliação da associação... 2013.pdf: 1510563 bytes, checksum: 0e9c49e3f55ccee94564fa6d382253e8 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A doença de Chagas (DC) é causada pelo protozoário hemoflagelado Trypanosoma cruzi. Estima-se que ainda existam 10 milhões de pessoas infectadas na América Latina. Para a quimioterapia específica da DC o benzonidazol (BZ) é o medicamento de escolha. A eficácia terapêutica dos compostos atualmente em uso clínico tem sido questionada, tendo em conta os diferentes índices de cura já registrados na literatura. A associação do BZ, com medicamentos que apresentem um efeito anti-T. cruzi poderá potencializar a ação antiparasitária do mesmo e possivelmente permitirá o uso de doses menores e consequentemente diminuição dos efeitos tóxicos. O objetivo da presente investigação é avaliar o efeito do tratamento com o BZ associado aos medicamentos nifurtimox (NF) e cetoconazol (CETO), em duplas combinações, sobre o curso da infecção aguda pela cepa Y do T. cruzi, em camundongos suíços. Foram feitos três experimentos: A e B, nos quais os camundongos foram inoculados com 5 X 104 formas de tripomastigotas sanguícolas do T. cruzi e o C formado por animais não infectados. O tratamento foi feito por entubação (via oral) a partir do 6º dia pós-infecção e teve duração de 60 dias. Experimento A (A1 – controles infectados e não tratados; A2 – infectados e tratados com 100 mg/kg/dia BZ; A3 – infectados e tratados com dose inicial de 200mg/kg/dia e seguidos de 50 mg/kg/dia NF; A4 – infectados e tratados com BZ + NF); Experimento B (B1 – controles infectados e não tratados; B2 – infectados e tratados com 100 mg/kg/dia BZ; B3 – infectados e tratados com 120 mg/kg/dia CETO; B4 – infectados e tratados com BZ + CETO); Experimento C (C1 – tratados com 100 mg/kg/dia BZ; C2 – tratados com dose inicial de 200 mg/kg/dia seguido de 50 mg/kg/dia NF; C3 – tratados com 120 mg/kg/dia CETO; C4 – tratados com BZ + NF; C5 – tratados com BZ + CETO). Os níveis parasitêmicos e a mortalidade foram avaliados a partir do 6º dia pós-infecção, e trinta dias após o fim do tratamento foram realizados os testes de cura parasitológicos (parasitemia, xenodiagnóstico e hemocultura) e o teste sorológico de imunofluorescência indireta (IFI). O critério de cura foi baseado na combinação dos resultados dos testes de cura parasitológicos com a IFI. Os resultados do Experimento A indicaram uma taxa de mortalidade de 100% para o grupo controle, 5,26% para os grupos BZ e BZ + NF e 0% para o NF; o índice de cura foi de 80% para o grupo BZ, 5,26% para o NF e 100% para o BZ + NF; Os resultados do Experimento B mostraram uma taxa de mortalidade de 100% para o grupo controle, 0% para os grupos BZ e CETO, e 5,26% para o BZ + CETO; o índice de cura foi de 80% para o grupo BZ, 81,8% para o CETO e 100% para o BZ + CETO. O estudo histopatológico demonstrou que o tratamento com BZ isoladamente ou em combinação com o NF ou com o CETO determinou significativa diminuição da intensidade das lesões no miocárdio e músculo esquelético quando comparado aos controles não tratados. O grupo GC, não demonstrou alterações inflamatórias em miocárdio. Em conclusão, o tratamento combinado do BZ com outras drogas (NF e CETO) não determinou aumento significante dos índices de cura e diminuição das lesões histopatológicas do miocárdio quando comparado com o tratamento isolado com o BZ. Provavelmente, o uso neste trabalho, de doses previamente estabelecidas, influenciou no efeito das referidas associações. Novos experimentos são necessários, com o uso de doses decrescentes do BZ, para melhor avaliar o efeito das referidas combinações sobre a toxicidade da droga. / Chagas’disease (CD) is caused by the hemoflagelate protozoa Trypanosoma cruzi. It is estimated that 10 million infected people are still living in Latin America. For the specific chemotherapy of CD, the Benznidazole (BZ) is the drug of choice. However, the therapeutic efficacy of the compounds now in clinical use is not confirmed, taking into account that different cure rates have been registered. It is possible that the association of BZ with other drugs with an anti-T. cruzi action could improve its anti-parasitic effect, with the use of lower dose and consequent decrease of the toxic effects. The objective of the present investigation is to evaluate the effect of the treatment with BZ in association with the drugs Nifurtimox (NF) and Ketoconazole (CETO) in double combinations, on the evolution of the acute phase of the infection of Swiss mice, with the Y strain of T. cruzi. Three experimental groups were performed: Group A (GA) and Group B (GB) in which the mice were inoculated with 5x104 trypomastigote blood forms; Group GC of uninfected mice, submitted to the same treatment schedules. Treatment was performed by gavage (oral route) from the 6th day after infection, during 60 days; Group GA: I - infected, non treated controls; II - infected and treated with 100 mg/kg/day of BZ; III - infected and treated with NF ( initially 200 mg/kg/day, followed by 50 mg/kg/day); IV – infected and treated with BZ + NF; Group GB: I - infected, non treated controls; II - infected and treated with 100 mg/kg/day of BZ; III - infected and treated with 120 mg/kg/day CETO; IV – infected and treated with BZ + CETO; Group C: I - treated with 100 mg/kg/day of BZ; II - treated with NF ( initially 200 mg/kg/day, followed by 50 mg/kg/day); III - treated with 120 mg/kg/day CETO; IV - treated with BZ + NF; V - treated with BZ + CETO. Parasitemia and mortality were evaluated from the 6th day of infection. Thirty days after the end of treatment, parasitologic cure tests of the mice of the several groups were performed (parasitemia after Cyclophosphamide injection: 250mg/kg b.w, xenodiagnosis and hemoculture). Cure criteria was based on the combination of the results of parasitological tests and the serological titles (cut off 1:20). Results: GA – 100% of mortality for untreated control, 5,26% for sub-groups BZ and BZ +NF and 0% for NF group. Cure rate was of 80% for the subgroup BZ, 5.26%, for the NF group and 100% for the group BZ+NF Results – GB – 100% of mortality for untreated controls; 0% for the subgroups BZ and CETO and 5.26% for the group BZ + CETO. Cure rates: 80% for the subgroup BZ, 81.8% for the subgroup CETO and 100% for the group BZ + CETO. Histopatological study showed that treatment with BZ only or in combination with NF or CETO determined significant decrease in the intensity of the inflammatory lesions of the myocardium and skeletal muscles, as compared with untreated controls. However isolated treatment with NF or CETO did not determined regression of the inflammatory lesions. The group GC did not show inflammatory lesions in the myocardium or skeletal muscle. Conclusion – the combined treatment with BENZ and other drugs (NF and CETO) did not determine a significant increase of the cure indices when compared to the isolated treatment with BZ. These combinations have not determined a significant decrease of histopathological lesions of the myocardium, as compared to the treatment with BZ. Probably the use of previously established doses interferes with the analysis of the effect of the cited combinations. New experiments are necessary with the use of lower doses of BZ to a better evaluation of the efficacy and toxicity of the drug.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-10-29T18:55:27Z No. of bitstreams: 1 Bruno Teixeira Goes Desempenho....pdf: 1185695 bytes, checksum: 95359124751a99db60aa2e7cac925e8a (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-29T18:55:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bruno Teixeira Goes Desempenho....pdf: 1185695 bytes, checksum: 95359124751a99db60aa2e7cac925e8a (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A doença de Chagas é responsável por cerca de 15.000 óbitos por ano, principalmente nas Américas do Sul e Central, onde 7-8 milhões de pessoas encontram-se em risco de contrair a doença. A combinação de inflamação muscular e desnervação podem ocorrer durante o curso desta patologia podendo limitar a ativação neuromuscular durante a inflamação e após reparo ou remodelamento da lesão devido a uma complexa reorganização das unidades neuromotoras. Desta forma, faz-se necessário investigar o desempenho locomotor de camundongos com infecção chagásica experimental aguda. Camundongos suíços foram alocados em dois grupos portadores de infecção (cepa Y e Colombiana) e comparados ao grupo controle (sem infecção) quanto ao desempenho locomotor no teste do Campo Aberto, na Escala Basso de avaliação locomotora murina (BMS) e Rota-Rod. Avaliações histopatológicas do músculo cardíaco, esquelético (isquiotibiais e tríceps sural) e nervo isquiático foram realizadas. A infecção pela cepa Y e Colombiana provocou piora do desempenho locomotor a partir do 7º dia de infecção com redução significativa dos quadrados percorridos no teste do campo aberto. A qualidade da marcha foi prejudicada a partir do 9º dia para o grupo cepa Y e 23º dia para o grupo cepa Colombiana sendo caracterizada pela incapacidade de sustentação da cauda e instabilidade moderada ou grave do tronco. Modificação na coordenação e equilíbrio foi observada apenas no grupo cepa Y a partir do 11º dia de infecção quando os animais estavam impossibilitados de realizar o teste. Os resultados do desempenho locomotor estiveram associados a alterações histopatológicas no músculo cardíaco e esquelético e todos os dados deste estudo corroboram com os achados histológicos e com outros modelos de avaliação locomotora encontrados na literatura. O modelo de avaliação proposto neste trabalho possibilitou a caracterização de um padrão nas modificações do desempenho locomotor no modelo experimental de infecção aguda pela cepa Y e Colombiana do Trypanosoma cruzi. / Chagas disease is responsible for about 15,000 deaths per year, mainly in Central and South America, where 7-8 million people are at risk of contracting the disease. The combination of muscle inflammation and denervation may occur during the course of this pathology limiting neuromuscular activation during inflammation and remodeling after injury or repair due to a complex reorganization of neuromotor units. Thus, making it necessary to investigate the locomotor performance of mice with experimental acute Chagas infection. Swiss mice were divided into two groups with the infection (Y strain and Colombian) and compared to the control group (without infection) on the locomotor performance in the Open Field Test, Scale Basso locomotor evaluation murine (BMS) and Rota-Rod. Histopathological evaluations of cardiac muscle, skeletal (hamstrings and triceps surae) and sciatic nerve were performed. Infection by strain Y and Colombian caused worsening of locomotor performance from the 7th day of infection with significant reduction of squares traversed in the open field test. The quality of gait was impaired from the 9th day for group Y strain and 23 days for the group Colombian strain is characterized by the inability to support the tail and moderate or severe instability of the trunk. Change in coordination and balance was observed only in group Y strain from the 11th day of infection when the animals were unable to perform the test. The results of locomotor performance were associated with histopathological changes in cardiac and skeletal muscle and all data in this study corroborate the findings with other histological and locomotor assessment models found in the literature. The evaluation model proposed in this work allowed the characterization of a pattern of changes in locomotor performance in an experimental model of acute infection for the Y and Colombian strain of Trypanosoma cruzi.

Submitted by Andrea Hartke (andreamh@fiocruz.br) on 2014-11-24T17:22:58Z No. of bitstreams: 1 Tese Doutorado Saloê Bispo.pdf: 7313913 bytes, checksum: 084107e9ced08be104473d461e3b1102 (MD5) / Approved for entry into archive by Andrea Hartke (andreamh@fiocruz.br) on 2014-11-24T17:25:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese Doutorado Saloê Bispo.pdf: 7313913 bytes, checksum: 084107e9ced08be104473d461e3b1102 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-24T17:25:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Doutorado Saloê Bispo.pdf: 7313913 bytes, checksum: 084107e9ced08be104473d461e3b1102 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia. Curitiba, PR, Brasil. / O Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da Doença de Chagas. O controle da expressão de genes é fundamental para gerar as mudanças morfológicas durante o ciclo de vida do parasita. Entretanto, os tripanosomatídeos possuem peculiaridades quanto a sua biologia molecular, como por exemplo, a transcrição policistrônica e a ausência de promotores definidos para a RNA polimerase II. Acredita-se, portanto, que grande parte da regulação da expressão gênica nestes parasitas ocorra em nível pós-transcricional por mecanismos que envolvem mudanças na estabilidade e no acesso dos mRNAs aos polissomos. Estudos prévios do nosso grupo mostraram que alguns mRNAs que codificam proteínas do complexo proceossomo (SSU) em T. cruzi são mais abundantes em tripomastigotas metacíclicos que em epimastigotas. No entanto, apesar da grande quantidade de mRNAs da proteína TcSof1 nas formas infectantes, o mRNA de TcSof1, esta imobilizado dentro dos polissomos e não é traduzido. O sequestro de mRNA dentro polissomos é uma maneira de bloquear a tradução, sugerindo um mecanismo de regulação negativa da tradução, provavelmente nas etapas de elongação e terminação. O objetivo do nosso trabalho foi caracterizar os mecanismos de regulação da expressão gênica envolvidos na expressão negativa do gene de TcSof1 na forma tripomastigota metacíclica de T. cruzi. Primeiramente isolamos e analisamos mais de 500 RNAs pequenos na forma metaciclica que pudessem estar regulando negativamente a tradução de TcSof1. Embora, nenhum RNA regulador tenha sido identificado, uma grande população de fragmentos de tRNAs foi encontrada. Sua participação na maquinaria de tradução ativa foi excluída, uma vez que os mesmos não foram detectados associados aos polissomos ou ribossomos. Padronizamos e empregamos a técnica de Ribossome Footprinting para a análise da eficiência de tradução em T. cruzi, avaliando a população de mRNA total e os mRNA que estavam associados aos ribossomos, provenientes da forma metacíclica. Os resultados mostraram que de aproximadamente 9.000 genes presentes nesta etapa do ciclo de vida, apenas 4.241 estavam associados aos ribossomos nas amostras do footprinting, ao contrário do que foi visto na forma epimastigota, onde dos 9.000 genes presentes 7. 419 genes estavam associados aos polissomos. Este resultado indica que quase a metade dos genes transcritos nas formas tripomastigotas estão sendo regulados negativamente, provavelmente em nível de tradução. Confirmamos com esta técnica a presença do mRNA de TcSof1 associado aos polissomos na forma metacíclica mesmo sem haver expressão da proteína nesta forma, e outros genes que apresentam o mesmo padrão de expressão também foram analisados. Através do tratamento dos parasitas com a droga harringtonina, um inibidor da tradução, seguido das análises por Ribosome Footprinting, foi possível evidenciar um acúmulo de ribossomos nos locais de inicio da tradução da maioria dos mRNAs mostrando que a droga bloqueia os ribossomos no sitio de inicio da tradução. Pelo contrario, o mRNA de TcSof1 apresentou marcas de ribossomo ao longo de toda a região codificante do gene nas formas metacíclicas, sugerindo que os ribossomos estão parados na etapa de elongação da tradução. Este resultado confirmou que a ausência de expressão desta proteína nesta etapa do ciclo de vida do parasita, é controlada em nível de tradução por um mecanismo de parada dos ribossomos nos polissomos. / Trypanosoma cruzi is the etiologic agent of Chagas disease. The parasite alternates between different morphological and functional forms during its life cycle. Control of gene expression is key to generate the morphological changes during the life cycle of the parasite. However, trypanosomatids display very peculiar cellular processes, as polycistronic transcription and the lack of canonical RNA II polymerase promoters. Therefore, gene expression regulation occurs mainly at the posttranscriptional level by mechanisms that involve changes in the stability of mRNAs and their access to polysomes. Previous studies from our group have shown that some mRNAs, which encode proteins of the proceossome complex (SSU) in T. cruzi, are more abundant in metacyclic trypomastigote than in epimastigote stages. However, even though a greater amount of TcSof1 mRNA is observed in the infective forms and is associated with the polysomes it is not translated. Trapping the mRNA in polysomes is a way to block translation, suggesting a mechanism of translation down-regulation, probably during the elongation and termination stages. The aim of our study was to characterize the mechanisms of gene expression regulation involved in the negative expression of TcSof1 gene in the metacyclic stage of T. cruzi. First, we isolated and analyzed more than 500 small RNAs in the metacyclic form that could be negatively regulating the translation of TcSof1 gene. Although no regulatory RNA was identified, a large population of tRNAs fragments was found. Their association to the active translation machinery was excluded, since they were not detected in association with polysomes or ribosomes. After that, we standardized and applied the Ribosome Footprinting technique to analyze translation efficiency in T. cruzi, and to assess which mRNAs were protected by ribosomes in the metacyclic form. Our results showed that from some 9,000 genes present in this life cycle stage, only 4,241 were associated with ribosomes. On the other hand, in epimastigote forms from 9,000 genes present, 7,419 genes were associated with polysomes. This indicates that almost half of the transcribed genes in metacyclic trypomastigotes are being negatively regulated, probably at translation level. Through the ribosome profiling technique we confirmed ours previous results and showed that TcSof1 mRNA is associated to metacyclic polisomes though the protein is not expressed in this form. Similarly, other genes that have the same TcSof1 expression pattern were also analyzed. By treating parasites with harringtonine, an inhibitor of translation, followed by Ribosome Footprinting analysis, it was possible to show an accumulation of ribosomes at the initiation translation sites of most mRNAs. We could observe the presence of ribosome footprints along the coding region of TcSof1 gene in metacyclic forms, suggesting that ribosomes are stalled onto the mRNA. This result confirms that the absence of protein expression at this stage is controlled at the translation level by a mechanism that stalls the ribosomes on the mRNA.

Made available in DSpace on 2014-12-22T16:37:24Z (GMT). No. of bitstreams: 2 fabiana_muccillo_ipec_mest_2013.pdf: 3501706 bytes, checksum: 490677170f5d89981511695714c158af (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014-08-11 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas, Rio de Janeiro, RJ, Brasil / As cardiopatias crônicas estão nos primeiros lugares da lista de doenças com elevado índice de morbimortalidade mundial. Dentre elas, a doença de Chagas, considerada negligenciada pela Organização Mundial de Saúde, integra esse grupo, e afeta, aproximadamente, nove milhões de brasileiros, sendo que entre esses, 30% poderão desenvolver algum grau de comprometimento cardíaco durante a fase crônica da doença. O acometimento cardíaco da doença é caracterizado por uma resposta inflamatória exacerbada que leva à destruição progressiva do miocárdio, resultando em insuficiência cardíaca congestiva (ICC). O único tratamento disponível para pacientes, nesse estágio da doença, seria o transplante cardíaco, com todas as suas complicações clínicas e sócio-econômicas. Nesse contexto, surge a terapia celular como alternativa terapêutica. Estudos na Bahia comprovaram segurança no uso da terapia celular em cardiopatas chagásicos. A partir deles, iniciou-se, no Brasil, o Estudo Multicêntrico Randomizado de Terapia Celular em Cardiopatias (EMRTCC), com o objetivo de verificar a eficácia do tratamento com células mononucleares de medula óssea (CMMO) na cardiopatia chagásica e em mais três outras cardiopatias Diversos estudos com CMMO de pacientes com cardiopatia isquemia crônica e aguda demonstraram diferenças expressivas em parâmetros importantes quando comparados a CMMO de indivíduos normais, tais como: a capacidade de migração e de formação de colônias após implante. O nosso trabalho analisou a fração mononuclear das CMMO extraídas dos pacientes portadores da doença de Chagas crônica para o EMRTCC no Instituto Nacional de Cardiologia (INC), visando caracterizar fenotipicamente as linhagens celulares da mesma. Averiguamos o percentual de células precursoras e o perfil leucocitário dessa fração, através da imunofenotípagem por citometria de fluxo. A fim de comparação, utilizamos amostras da mesma fração extraída de medulas de doadores normais e pacientes do EMRTCC com cardiopatia isquêmica crônica. Concluímos que pacientes com doença de Chagas submetidos à terapia celular apresentam um perfil hematopoiético com produção de todas as linhagens constitutivas da medula óssea, além de apresentarem atividades funcionais de caráter imunológico, tanto de resposta inata, quanto adaptativa, esperadas em pacientes acometidos pela cardiopatia chagásica crônica / Chronic h eart diseases occupy the first places in the list of diseases with high morbidity and mortality rate worldwide. Among them, Chagas disease, c onsidered neglected by the World Health Organization, integrates this group, and affects approximately nine million Brazilians, among whose , 30% will develop some degree of cardiac involvement during the chronic phase of the disease. The cardiac disease is characterized by an exaggerated inflammatory response that leads to the progressive destruction of the myocardium, resulting in congestive heart failure. The only treatment available to patients at this stage of the disease would be heart transplantation, with all its clinical and socio - economic complications . In this context cell therapy is an alternative therapy. Studies in Bahia proved cell therapy in cardiac chagasic patients to be safe and based on them, began in Brazil, the Randomized Multicenter Stu dy of Cell Therapy in Cardi opathies (EMRTCC), in order to verify the effec acy of treatment with mononuclear cells Bone marrow (BMMC) in Chagas heart disease and in three other heart diseases. Several studies with BMMC from patients with with acute and chro nic ischemi c heart disease demonstrated significant differences in important parameters when compared to BMMC from normal patients, such as: migration ability and colony formation after implantation. Our study analyzed the mononuclear fraction of BMMC extr acted from Chagas ic patients enrolled in the EMRTCC at the National Cardiology Institute (INC), to characterize the se cells phenotyp ically . Using flow citometry we establis hed the percentage of precursor cells and white blood cell count in this fraction. F or comparison, we used the same fraction extracted from the marrow of normal donors and EMRTCC patients with chronic ischemic heart disease . We conclude that patients with Chagas disease who underwent stem cell therapy have a profile with production of all hematopoietic lineages constituents of bone marrow , b esides presenting character istic of both in n a te , as well adaptive immune responses , expected from patients suffering from Chagas heart chronic

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-09T18:17:38Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DIP_LauraCottaRepoles.pdf: 2325297 bytes, checksum: be8a47328cb27845c949da8c4cdb022f (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-09T18:17:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DIP_LauraCottaRepoles.pdf: 2325297 bytes, checksum: be8a47328cb27845c949da8c4cdb022f (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-09T18:17:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DIP_LauraCottaRepoles.pdf: 2325297 bytes, checksum: be8a47328cb27845c949da8c4cdb022f (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-09T18:17:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DIP_LauraCottaRepoles.pdf: 2325297 bytes, checksum: be8a47328cb27845c949da8c4cdb022f (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / A triagem sorológica para doença de Chagas em bancos de sangue, obrigatória no Brasil desde 1969, aliada ao desenvolvimento de métodos para detecção de anticorpos anti-T.cruzi cada vez mais sensíveis, permitiram a diminuição da transmissão transfusional desta doença. No entanto, os resultados não negativos (positivos ou indeterminados/inconclusivos) e a discordância entre testes aumentaram consideravelmente, passando a representar um grande desafio para os hemocentros. Outro desafio está relacionado à reinclusão de indivíduos não negativos em triagens prévias como potenciais doadores. Resultados falso-positivos e inconclusivos promovem o descarte desnecessário de bolsas de sangue, além de rotular pessoas saudáveis como portadoras de uma doença grave. Assim, verifica-se a necessidade de desenvolver métodos capazes de distinguir com segurança resultados positivos verdadeiros dos falsos, além de resolver os resultados indeterminados. Neste contexto, o FC-TRIPLEX-IgG1 se apresenta como um método confirmatório inovador para o diagnóstico diferencial da doença de Chagas, leishmaniose visceral e leishmaniose tegumentar em plataforma única, utilizando citometria de fluxo. O objetivo deste estudo foi verificar o desempenho desta nova metodologia para o esclarecimento diagnóstico de amostras não negativas (n=91) e para o monitoramento sorológico de indivíduos com antecedente de não negatividade (n=100) na triagem para doença de Chagas realizada em três grandes hemocentros brasileiros. Para isto, as amostras foram triadas com os métodos ELISA (I e II) e RIFI e, em seguida, foram realizados os métodos confirmatórios recELISA e FC-TRIPLEX-IgG1. Os resultados mostraram alta discordância entre os testes de triagem (78,0%), além de grande número de reações indeterminadas. Nas amostras positivas em todos os testes de triagem, o FC-TRIPLEX-IgG1 e o recELISA apresentaram desempenho semelhante na confirmação dos resultados. Porém, o desempenho dos métodos no esclarecimento diagnóstico das amostras discordantes foi diferente (p=0,001). O FC-TRIPLEX-IgG1 foi positivo em muitas amostras positivas no ELISA-I e indeterminadas na RIFI, sugerindo sua aplicabilidade na confirmação de resultados e no esclarecimento diagnóstico de amostras não negativas. Já o recELISA foi positivo em muitas amostras negativas nos outros testes, o que mostrou sua baixa especificidade neste estudo. O teste de maior concordância com o FC-TRIPLEX-IgG1 foi a RIFI (k=0,5), seguida do ELISA-I (k=0,5), recELISA (k=0,2) e ELISA-II (k=0,2). O FC-TRIPLEX-IgG1 foi capaz de realizar o diagnóstico diferencial e também se mostrou útil na monitoração sorológica de indivíduos com antecedente de não negatividade na triagem para doença de Chagas, com 98,0% de concordância em amostras ELISA-RIFI- e 94,0% de concordância em amostras ELISA+RIFI+. Os resultados deste estudo sugerem que o FC- TRIPLEX-IgG1 é uma ferramenta promissora, de alta especificidade e desempenho, que pode ser aplicada em hemocentros para auxiliar no esclarecimento diagnóstico de resultados indeterminados/inconclusivos na triagem sorológica para doença de Chagas e na monitoração sorológica periódica de indivíduos com precedente de não negatividade, visando sua exclusão ou reinclusão como possível doador / The serological screening for Chagas' disease in blood banks, mandatory in Brazil since 1969, together with the development of methods for detection of anti-Trypanosoma cruzi antibodies increasingly sensitive, allowed the reduction of transfusion transmission of this disease. However, non-negative results (positive or indeterminate) and the discrepancy between tests increased considerably, and now represent a big challenge for blood banks. Another challenge is related to the re-inclusion of non-negative individuals in previous trials as potential donors. False-positive and inconclusive results further unnecessary disposal of blood bags, and label healthy people as having a serious illness. Thus, there is a need to develop methods capable of reliably distinguish true and false positive results, solving indeterminate results too. In this context, the FC-TRIPLEX-IgG1 presents itself as an innovative confirmatory method for the differential diagnosis of Chagas disease, visceral leishmaniasis and cutaneous leishmaniasis in a single platform, using flow cytometry. The aim of this study was to verify the performance of this new method to clarify the diagnosis of non-negative (n = 91) samples and to serological monitoring of individuals with a history of non-negativity (n = 100) in screening for disease testing Chagas performed in three major Brazilian blood centers. The samples were screened by the methods ELISA (I and II) and IFI and then the confirmatory methods recELISA and FC-TRIPLEX-IgG1 were performed. The results showed high discordance between screening tests (78.0%) and large number of indeterminate reactions. In positive samples in all screening tests, the FC-TRIPLEX-IgG1 and recELISA showed similar performance in confirmation of the results. However, the performance of the methods in diagnostic clarification of discordant samples was different (p=0.001). The FC-TRIPLEX-IgG1 was positive in many samples positive in ELISA-I and indeterminate in IFI, suggesting its applicability in confirmation of results and in clarifying the diagnosis of non-negative samples. Already recELISA was positive in many negative samples in all other tests, which showed a low specificity in this study. The test for a greater agreement with the FC-TRIPLEX-IgG1 was IFI (k=0.5), then the I-ELISA (k=0.5), recELISA (k=0.2) and ELISA-II (k=0.2). The FC-TRIPLEX-IgG1 was able to perform the differential diagnosis and also proved useful in the serological monitoring of individuals with a history of non-negativity in screening for Chagas disease, with 98.0% agreement in RIFI-ELISA- samples and 94.0% of agreement in ELISA+IFI+ samples. The results of this study suggest that FC-TRIPLEX-IgG1 is a promising tool, that has high specificity and performance, which can be applied to blood banks to assist in diagnosis clarifying indeterminate results in serological screening for Chagas disease and in periodic serological monitoring individuals with precedent of non-negativity, for their re-inclusion or exclusion as a possible donor

Made available in DSpace on 2015-05-19T13:30:31Z (GMT). No. of bitstreams: 2 185.pdf: 4365385 bytes, checksum: 6c364e4e8e6f1c7012d8d4bc56993d0c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A doença de Chagas, causada pelo protozoário hemoflagelado Trypanosoma cruzi, consiste em um grave problema de saúde pública na América Latina, com cerca de 7 a 8 milhões de pessoas infectadas. O benznidazol é atualmente o único fármaco disponível para o tratamento, apresentando boa atividade na fase aguda, mas com eficácia questionada na fase crônica, além de apresentar severos efeitos colaterais e longo período de tratamento. Tendo em vista a sua fácil síntese e baixo custo, adutos aromáticos oriundos da reação Morita-Baylis-Hillman têm sido considerados promissores como quimioterápicos. Neste sentido, foi avaliada a atividade tripanocida e citotóxica de seis adutos Morita-Baylis-Hillman. Para analisar possíveis efeitos dos adutos sobre estruturas específicas do protozoário foi utilizado a microscopia confocal a laser, através da marcação com Rodamina 123, MitoSOXT, Laranja de Acridina e Kit Live/Dead(R). As alterações morfológicas em parasitas submetidos ao tratamento foram acompanhadas por microscopia eletrônica de transmissão. Nossos resultados mostraram que todos os compostos foram capazes de inibir o crescimento de formas epimastigotas e causaram uma diminuição da viabilidade em formas tripomastigotas, apresentando uma moderada citotoxicidade para células de mamíferos. Os adutos MBH1, MBH2, MBH5 e MBH7 também foram efetivos em inibir a infecção de macrófagos e diminuir a viabilidade das formas amastigotas. Os compostos não foram capazes de alterar os níveis de produção do óxido nítrico em macrófagos. Análises pela microscopia confocal e microscopia eletrônica de transmissão (MET) apontam a mitocôndria como principal alvo intracelular destes compostos. Alterações compatíveis com a perda da viabilidade e morte celular por necrose e autofagia foram observadas por MET. Os resultados obtidos neste trabalho colocam os adutos Morita -Baylis-Hillman em evidência como agentes promissores para o tratamento da tripanossomíase americana

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-14T14:03:09Z No. of bitstreams: 1 Roberta Carvalho Ferreira - Avaliação da colonização de Trypanosoma cruzi e Trypanosoma rangeli no trato intestinal de Rhodnius prolixus - 2014.pdf: 1324987 bytes, checksum: b6cd417c99954e8fdca43e7c13cf5538 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-14T14:03:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Roberta Carvalho Ferreira - Avaliação da colonização de Trypanosoma cruzi e Trypanosoma rangeli no trato intestinal de Rhodnius prolixus - 2014.pdf: 1324987 bytes, checksum: b6cd417c99954e8fdca43e7c13cf5538 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-14T14:03:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Roberta Carvalho Ferreira - Avaliação da colonização de Trypanosoma cruzi e Trypanosoma rangeli no trato intestinal de Rhodnius prolixus - 2014.pdf: 1324987 bytes, checksum: b6cd417c99954e8fdca43e7c13cf5538 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-14T14:03:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Roberta Carvalho Ferreira - Avaliação da colonização de Trypanosoma cruzi e Trypanosoma rangeli no trato intestinal de Rhodnius prolixus - 2014.pdf: 1324987 bytes, checksum: b6cd417c99954e8fdca43e7c13cf5538 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / Os parasitos Trypanosoma rangeli e Trypanosoma cruzi entram no tubo digestivo do vetor através do repasto sanguíneo e o intestino médio anterior (IMA) é o local onde se dão as primeiras interações parasito-hospedeiro. Sendo assim, a colonização do IMA de Rhodnius prolixus por T. cruzi (cepa CL) e T. rangeli (cepa CHOACHI) foi avaliada no presente estudo. Inicialmente, o estabelecimento da infecção em ninfas infectadas com epimastigotas de cultura ou tripomastigotas sanguíneas foi comparativamente avaliado. A avaliação de diferentes parâmetros mostrou que a dinâmica de colonização foi diferente dependendo da forma do parasito utilizada para a infecção em ambas as espécies. Dessa forma, a avaliação da dinâmica de colonização dos parasitos no intestino de insetos infectados foi realizada com tripomastigotas sanguíneas, as formas naturalmente presentes no hospedeiro vertebrado. Além disso, a porção do trato intestinal onde ocorre a diferenciação das formas tripomastigotas para epimastigotas foi determinada para as duas espécies. Para infecções por T. rangeli, a diminuição gradativa no número de tripomastigotas no IMA e o concomitante aparecimento de formas intermediárias e epimastigotas a partir do primeiro dia pós-infecção (pi) indicaram que a sua diferenciação acontece nessa porção do intestino. No caso de infecções por T. cruzi, a presença de apenas formas tripomastigotas e intermediárias no IMA e a presença de formas intermediárias e epimastigotas no intestino médio posterior (IMP) dos insetos sugere que a sua diferenciação ocorre no IMP do vetor. A quantificação dos parasitos mostrou uma redução de mais de 80% nas populações de T. cruzi nas primeiras 24 horas pi. A primeira hipótese para avaliar esta redução seria a de que os parasitos estariam cruzando rapidamente o IMA e estabelecendo a infecção no IMP dos insetos. Entretanto, o reduzido número de parasitos encontrado no IMP não corroborou a hipótese. Na segunda hipótese, os parasitos poderiam estar aderidos ao epitélio do IMA e por essa razão não teriam sido quantificados nas contagens a fresco. A ausência de parasitos no IMA através da quantificação por qPCR, associada a análise do epitélio intestinal em miscroscópio, sugerem fortemente que o parasito não se adere ao epitélio intestinal do IMA. Finalmente, a possibilidade dos parasitos estarem sendo eliminados do IMA nestas primeiras horas pi foi avaliada. A significativa redução no número de parasitos incubados com diferentes tecidos de R. prolixus, particularmente com o IMA de insetos recém-alimentados, sugere que uma parte significativa da população de T. cruzi que entra no vetor juntamente com o repasto é eliminada por fatores presentes no IMA do inseto. Em conclusão, o presente estudo mostrou que embora T. cruzi e T. rangeli apresentem formas infectivas similares, os parasitos utilizam diferentes estratégias para iniciar a infecção nos seus hospedeiros invertebrados. / Trypanosoma rangeli and Trypanosoma cruzi enter the vector’s intestinal tract together with the bloodmeal and the anterior midgut is the first compartment they interact with. Therefore, in the present study, the colonization of Rhodnius prolixus anterior midgut by T. cruzi (CL strain) and T. rangeli (CHOACHI strain) was evaluated. Initially, the parasite establishment was compared in the anterior midgut of nymphs infected with culture epimastigotes versus blood trypomastigotes. The evaluation of different parameters showed that the colonization dynamics was different according to the parasite development stage used in the infection, for both species. Thereby, the next objective was to evaluate the anterior midgut colonization in insects infected with blood trypomastigotes, which are the forms naturally present in the vertebrate host. Additionally, the midgut portion where trypomastigotes differentiate into epimastigotes was determined for both flagellates. In T. rangeli infections, the gradual decrease in trypomastigote numbers and the finding of intermediate and epimastigote forms 24 hours (pi) in the anterior midgut indicates that the differentiation of the parasite occurs in this portion of the midgut. During T. cruzi infections, only trypomastigote and intermediate forms were observed in the anterior midgut, and the finding of intermediate and epimastigote forms in the posterior midgut suggests that its differentiation occurs in the insect’s posterior midgut. The parasite quantification showed that T. cruzi populations in the anterior midgut were reduced in about 80% during the first 24 hours pi. The first hypothesis to be tested evaluated wheter parasites rapidly crossed the anterior midgut and established infection in the posterior midgut. However, the low amount of parasites in the posterior midgut did not confirm this hypothesis. The other hypothesis suggests that parasites could be attached to the anterior midgut epithelium and, therefore, could not be quantified by the fresh counts. However, absence of parasites in the anterior midgut by qPCR and the analysis of the intestinal epithelium in the microscope showed that no parasites were attached to the anterior midgut at that period time point. Finally, the third hypothesis evaluated the possibility that parasites could have been killed in the anterior midgut during the first 24 hours pi. The reduction in number of parasites incubated with different tissues of R. prolixus, particularly with anterior midguts from blood fed insects indicates that a significant part of the T. cruzi population ingested with the blood meal is eliminated by factors present in the vector’s anterior midgut. In conclusion, this study showed that although T. cruzi and T. rangeli present similar infective forms, the parasites present different strategies to initiate the infection on their invertebrate hosts.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2015-07-23T17:05:59Z No. of bitstreams: 1 Carlos Gustavo Silva dos Santos Caracterização molecular....pdf: 1743940 bytes, checksum: 3a0047fb24b0ac8cad48dfd0a4088b8f (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2015-07-23T17:06:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Carlos Gustavo Silva dos Santos Caracterização molecular....pdf: 1743940 bytes, checksum: 3a0047fb24b0ac8cad48dfd0a4088b8f (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-23T17:06:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carlos Gustavo Silva dos Santos Caracterização molecular....pdf: 1743940 bytes, checksum: 3a0047fb24b0ac8cad48dfd0a4088b8f (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A Doença de Chagas é uma infecção parasitária causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi. As cepas de T. cruzi se constituem de uma população heterogênea, apresentando várias subpopulações. Essas populações circulam entre animais vertebrados domésticos, silvestres e humanos, além de insetos vetores. Devido a essas múltiplas relações, o T. cruzi demostra uma grande variedade biológica, genética, bioquímica e imunológica. A caracterização das cepas de T. cruzi pode utilizar várias metodologias que pode ter foco biológico, bioquímico, isoenzimático e molecular. Dentre essas, a molecular vem ganhando destaque devido a rapidez, sensibilidade e precisão do método. Deste modo, com a presente pesquisa o objetivo foi caracterizar molecularmente as cepas de Tripanosoma cruzi (Chagas 1909) isoladas em vetores e reservatórios na zona urbana de Salvador. Foram incluídas neste estudo amostras de T. cruzi isoladas de triatomíneos e reservatórios provenientes de diversas localidades da cidade de Salvador, capturados entre Julho de 2007 e Junho de 2011, perfazendo um total de 4 anos de amostragem. Adotamos a técnica de tipagem molecular do T. cruzi sugerida por Zingales et al. (2009) em sistema de eletroforese capilar. Das 930 amostras de triatomíneos avaliados, 99,35% da espécie Triatoma tibiamaculata, 482 amostras (52%) não estavam em condições de análise. Das 448 amostras passíveis de análises foram randomizadas 192 amostras (43%) para avaliação das linhagens de T. cruzi. Dentre as amostras analisadas, 20 (10,4%) não apresentaram sinal satisfatório na eletroforese capilar e foram excluídas, restando 172 amostras. Foi detectado T. cruzi em 21,5% das amostras de triatomíneos (n=37). A tipagem revelou o seguinte perfil nas amostras positivas: T. cruzi 1 (32,4%), T. cruzi 2 (59,4%), T. cruzi 3 (2,7%). Foi detectado também triatomíneos com múltipla infecção com linhagens diferentes de T. cruzi 1 & 2 (5,4%). Adicionalmente, foram avaliados 78 marsupiais, Didelphis spp. A taxa de infecção nos marsupiais foi de 29,4%, e nas amostras positivas foi observado o seguinte perfil molecular de tipagem pelo T. cruzi: T. cruzi 1 (30,4%), T. cruzi 2 (60,8%), T. cruzi 1 e 2 (8,6%). A alta taxa de infecção dos vetores e reservatórios avaliados pode ser efeito da fragmentação florestal, causada pela expansão urbana. O Triatoma tibiamaculata já foi associado à transmissão oral do T. cruzi por alimentos infectados no Brasil e a ocorrência de exemplares infectados desta espécie no ambiente intradomicíliar na cidade de Salvador é fator de risco para a transmissão da doença de Chagas para a população local. Os dados obtidos na tipagem molecular das cepas isoladas em Salvador demonstrou maior prevalência do T. cruzi 2 em seguida do T. cruzi 1 nos vetores e reservatórios avaliados. A presença de triatomíneos e marsupiais infectados, co-habitando e albergando diversas linhagens do T. cruzi em áreas de ocupação urbana é razão de alerta para os órgãos de vigilância em saúde locais. / Chagas disease is a parasitic infection caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi. The T. cruzi strains constitute a heterogeneous population, with several subpopulations. These populations move between domestic vertebrate animals, wildlife and humans, and insect vectors. Because of these multiple relationships, T. cruzi demonstrates great biological diversity, genetic, biochemical and immunological. The characterization of T. cruzi strains can use various methodologies that may have biological, biochemical, and molecular isoenzyme focus. Among these, the molecular been gaining attention due to speed, sensitivity and precision of the method. Thus, the present study the objective was to characterize molecularly strains of Trypanosoma cruzi (Chagas 1909) isolated in vectors and reservoirs in the urban area of Salvador. Were included in this study T. cruzi samples of insects and shells from different localities of the city of Salvador, captured between July 2007 and June 2011, a total of four years of sampling. We adopt molecular typing technique of T. cruzi suggested by Zingales et al. (2009) in a capillary electrophoresis system. Of the 930 samples evaluated triatomine 99.35% of Triatoma tibiamaculata, 482 samples (52%) were not in analytical conditions. Of the 448 samples amenable to analysis 192 samples were randomized (43%) for evaluation of T. cruzi strain. Among the samples analyzed, 20 (10.4%) had no satisfactory signal in capillary electrophoresis and were excluded, leaving 172 samples. T. cruzi was detected in 21.5% of samples of insects (n = 37). The typing revealed the following profile in positive samples: T. cruzi 1 (32.4%) T. cruzi 2 (59.4%) T. cruzi 3 (2.7%). Triatominae was also detected with multiple infections with different strains of T. cruzi 1 & 2 (5.4%). Additionally, we evaluated 78 marsupials, Didelphis spp. The infection rate in marsupials was 29.4%, and the positive samples was observed the following molecular profile of typing T. cruzi: T. cruzi 1 (30.4%), T. cruzi 2 (60.8% ), T. cruzi 1 and 2 (8.6%). The high rate of infection vectors and reservoirs can be evaluated effect of forest fragmentation caused by urban sprawl. Triatoma tibiamaculata has been associated with oral transmission of T. cruzi by infected food in Brazil and the occurrence of infected specimens of this species within domestic environments in the city of Salvador is a risk factor for the transmission of Chagas disease to the local population. The data obtained in the molecular typing of strains isolated from Salvador showed a greater prevalence of T. cruzi 2 then 1 of T. cruzi in vectors and reservoirs evaluated. The presence of infected bugs and marsupials, co-habiting and harboring various strains of T. cruzi in urban areas of occupation is warning reason for the oversight bodies in local health