Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-12-12T12:53:00Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_JulianadeOliveiraRodrigues - D_96.pdf.pdf: 4817215 bytes, checksum: 7ac1142aa29870d7fa74bb378fb8569d (MD5) / Made available in DSpace on 2013-12-12T12:53:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_JulianadeOliveiraRodrigues - D_96.pdf.pdf: 4817215 bytes, checksum: 7ac1142aa29870d7fa74bb378fb8569d (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou / A temperatura ambiental afeta diversos processos bioquímicos, fisiológicos e comportamentais, especialmente em animais ectotérmicos. Mudanças nesse parâmetro podem alterar o fitness de insetos vetores e sua distribuição no ambiente, modificando consequentemente, a dinâmica de transmissão de doenças. O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos da temperatura no desenvolvimento da infecção de Trypanosoma cruzi e Trypanosoma rangeli em Rhodnius prolixus. Os ensaios com T. rangeli foram desenvolvidos com parasitos submetidos a dois tratamentos. T. rangeli T1 foram obtidos através de passagens em LIT por três meses. T. rangeli T2 foram mantidos em LIT por um mês após uma passagem triatomíneo-camundongo. Inicialmente, o crescimento dos parasitos em meio de cultura submetidos a diferentes temperarturas (21, 24, 27 e 30°C) foi avaliado. O crescimento do T. cruzi foi termodependente, com um aumento de 28 vezes da população mantida em 30°C ao final de sete dias. A mortali dade ficou abaixo dos 10%, exceto para os parasitos mantidos a 21°C, onde esse valor ficou próximo aos 20%. Para os dois tratamentos de T. rangeli , o crescimento máximo foi observado a 27°C. Entretanto, as populações de T. rangeli T2 cresceram mais do que as de T. rangeli T1 e apresentaram taxas de mortalidade mais baixas, em torno de 5%. O próximo objetivo foi avaliar diferentes parâmetros fisiológicos de R. prolixus infectados pelos parasitos e submetidos às mesmas condições de temperaturas. A infecção por T. cruzi prolongou o período intermudas em todas as temperaturas e reduziu o número de insetos aparentemente saudáveis em 20%. A virulência do parasito foi dependente da temperatura e do estado nutricional dos insetos. T. rangeli T1 foi mais virulento do que T. rangeli T2, particularmente nas temperaturas mais baixas. Finalmente, o crescimento do T. cruzi no inseto foi quantificado por qPCR e câmara de Neubauer. Os resultados, ainda preliminares, corroboraram com os dados do crescimento do parasito em LI T. De maneira geral, os resultados sugerem que os dois parasitos podem ser patogênicos ao vetor na natureza dependo das condições a que são submetidos.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-02-07T18:23:30Z No. of bitstreams: 1 Renata Siqueira Portella.. Presença de células....pdf: 2025004 bytes, checksum: a85d3195f20f2a79bd6ff1b32049c260 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-02-07T18:23:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Renata Siqueira Portella.. Presença de células....pdf: 2025004 bytes, checksum: a85d3195f20f2a79bd6ff1b32049c260 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Medicina. Salvador, BA, Brasil / A doença de Chagas é caracterizada por apresentar duas fases com curso clínico bastante variável. Na fase aguda ocorre uma intensa miocardite, sendo o parasita facilmente detectado no sangue periférico e nos tecidos. A fase crônica cardíaca é caracterizada por uma cardiopatia, com intensa destruição das fibras cardíacas, presença de áreas de fibrose e escassos parasitas. Os mecanismos envolvidos na patogenia dessa miocardite ainda não são muito claros. Acredita-se que as células reguladoras e as células dendríticas estejam envolvidas nesse processo. Para compreender os mecanismos envolvidos, na resposta inflamatória à infecção pelo T. cruzi, resolvemos investigar a participação das células dendríticas, das células reguladoras e o perfil dos linfócitos T CD4+ e CD8+, utilizando duas linhagens de camundongos isogênicos, que apresentam diferentes graus de susceptibilidade a infecção. Em nossos resultados constatamos que os camundongos DBA/1 apresentaram maior sobrevida à fase aguda (90%), mesmo tratando os camundongos A (70%) com benzonidazol por três dias consecutivos, com o intuito de diminuir a carga parasitária prevenindo a alta mortalidade. A resistência dos DBA/1 e a susceptibilidade dos A, a infecção pelo T. cruzi, estaria relacionada ao perfil da resposta inflamatória e regulatória desenvolvida no decorrer da doença. Observamos que os camundongos DBA/1 possuem mais células dendríticas ativadas no baço e coração e mais células T CD4+CD25hi do que os camundongos da linhagem A. Essa diferença do perfil de resposta pode estar provocando uma maior expansão e diferenciação dos linfócitos T CD4+ pelas células dendríticas, levando ao controle da carga parasitaria. / Chagas’diseasse, due to Trypanosoma cruzi infection is characterized by the development of two phases with a variable clinical course. During the acute phase there occurs a severe myocarditis with the parasite being easily detected in peripheral blood and tissues. The chronic cardiac phase is characterized as a chronic cardiopathy, when severe destruction of cardiac myocells and fibrosis are present and parasites are rare. The mechanisms involved in the pathogenesis of this myocarditis are somewhat obscure. It is believed that regulatory and dendritic cells play a role in this process. In an attempt to clarify the mechanisms involved in the inflammatory response to infection with T. cruzi we decided to investigate the participation of dendritic and regulatory cells and of TCD4 and TCD8 lymphocytes, using two strains of isogenic mice , which exhibit different degrees of susceptibility to infection. Our results have shown that the DBA/1 mice presented a higher survival (90%) in the acute phase than the A mice (70%), even when these were treated with Benznidazole for three consecutive days, with the objective of to reduce the parasitemia and the high mortality. Resistance of DBA/1 mice and susceptibility of A mice could be related to the evolution of the inflammatory and regulatory responses, during the infection. It was seen that DBA/1 mice disclosed a higher number of activated dendritic cells in the spleen and heart and a higher number of T CD4+CD25hi than the mice of A strain. This differences of the response could be influencing in the TCD4 differentiation and on the control of parasitic load

Neglected diseases constitute a major public health problem worldwide, quantifying a total of 1 billion people suffering from some kind of infection of bacterial, viral or parasitic origin. Among them, we can highlight Chagas disease, caused by the parasite Trypanosoma cruzi, which affects more than 8 million people around the world. In order to discover new active compounds against T. cruzi, developed herein the synthesis of new prototypes of thiophene-2- thioureic and 2-iminothiazolidine rationally designed with potential antichagasic activity, biological evaluation and study docking. Initially, the start material was the polysubstituted thiophene derivatives synthesized via Gewald reaction, which were converted into thioureic derivatives and then cyclized with five different electrophiles, generating thiophene-2- iminothiazolidine derivatives. The intermediates and final compounds were synthesized in yields between 40 and 98%, and characterized by NMR. For docking study was initially performed by minimizing the energy of the ligands by ArgusLab® software, using AM1, and applying the software AutoDock Tools® and AutoDock Vina®, using the Gasteiger method. All compounds were evaluated in the anti-T. cruzi assays, in vitro, and the most active serie was selected for the cytotoxicity assay (MTT) in J774 cell line. It was possible to determine the enzymes involved in the probable mechanisms of action for the ligands. It has been observed that in 50% of cases, TcDHFR enzyme is the main target of the new compounds, in amastigotes. The pharmacological tests in amastigotes and trypomastigotes, line of C2C12 and MK2 cells was established as validation for the theoretical studies. The compound 3d probably develops its mechanism of action by inhibition of the enzyme TcTS (IC50= 10.3 µM) in trypomastigotes of the parasite. Since the compound 7c possibly acts by inhibition of the enzyme TcDHFR (IC50= 9.2 µM) in amastigotes. In additional, it was proposed that the compound 7b carries out its activity by inhibition of the enzyme TcDHFR (IC50 = 5.0 µM). Finally, it was observed that the most active compounds obtained in this study were more effective than the benznidazole, gold standard drug used in pharmacotherapy clinical of the Chagas disease, additionally has a low cytotoxicity (CC50> 100 µM). / As doenças negligenciadas configuram um grande problema de saúde pública mundial, quantificando um total de 1 bilhão de pessoas acometidas por algum tipo de infecção de origem bacteriana, viral ou parasitária. Dentre elas, podemos destacar a Doença de Chagas, causada pelo parasito Trypanosoma cruzi, a qual acomete mais de 8 milhões de pessoas em todo o mundo. No intuito de se descobrir novos compostos ativos capazes de combater o T. cruzi de maneira eficaz, desenvolvemos neste trabalho a síntese de novos protótipos de fármacos tiofeno-2-tioureicos e 2-iminotiazolidínicos racionalmente planejados com potencial atividade antichagásica, avaliação biológica e estudo de docking. Para a síntese dos compostos planejados, partiu-se de derivados tiofenos polissubstituídos, sintetizados via reação de Gewald, os quais foram convertidos em derivados tioureicos e, em seguida, ciclizados com cinco diferentes di-eletrófilos, gerando derivados tiofeno-2- iminotiazolidínicos. Os intermediários e compostos finais foram sintetizados com rendimentos entre 40 e 98%, e caracterizados por RMN. Para o estudo de docking, inicialmente foi realizada a minimização das energias dos ligantes pelo software ArgusLab®, usando o método AM1, e aplicando os softwares AutoDock Tools® e AutoDock Vina®, empregando o método de Gasteiger. Todos os compostos foram submetidos à avaliação in vitro de suas atividades anti-T. cruzi, e a série mais ativa foi selecionada para ensaio de citotoxicidade (MTT) em células da linhagem J774. Foi possível determinar as enzimas envolvidas nos prováveis mecanismos de ação para os ligantes. Foi observado que, em 50% dos casos, a enzima TcDHFR é o principal alvo dos novos composto, em formas amastigotas. Os ensaios farmacológicos em formas amastigotas e tripomastigotas, linhagem de células C2C12 e MK2 funcionaram como métodos de validação dos estudos teóricos. O composto 3d, provavelmente desenvolve seu mecanismo de ação através da inibição da enzima TcTS (IC50= 10.3 µM), em formas tripomastigotas do parasito. Já o composto 7c,possivelmente atua por meio da inibição da enzima TcDHFR (IC50= 9.2 µM) em formas amastigotas. Em adicional, foi proposto que o composto 7b desenvolve sua atividade através da inibição da enzima TcDHFR (IC50= 5.0 µM). Por fim, foi verificado que os compostos mais ativos obtidos neste trabalho se mostraram mais eficientes do que o fármaco benznidazol, padrão-ouro utilizado na clínica farmacológica da doença de Chagas, além destes apresentarem baixa citotoxicidade (CC50> 100 µM).

Submitted by Éder Freyre (ederfreyre@icict.fiocruz.br) on 2012-01-26T18:26:50Z No. of bitstreams: 1 Tese_Fernanda Barbosa Nogueira final.pdf: 11450025 bytes, checksum: c179ee0162b50ea1a899a05b9d391bfb (MD5) / Made available in DSpace on 2012-01-26T18:26:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Fernanda Barbosa Nogueira final.pdf: 11450025 bytes, checksum: c179ee0162b50ea1a899a05b9d391bfb (MD5) / Este projeto foi realizado com financiamento da CAPES, CNPQ, FAPEMIG, PRONEX e PAPES 3/FIOCRUZ. / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou, Belo Horizonte, MG, Brasil. / O sistema de defesa antioxidante nos tripanosomatídeos é um potencial alvo para quimioterapia. Este sistema é baseado no tiol de baixa massa molecular “tripanotiona”, que mantêm o ambiente intracelular reduzido pela ação da tripanotiona redutase (TR). As vias que metabolizam o peróxido de hidrogênio em moléculas de água envolvem as enzimas triparedoxina peroxidase citosólica (cTcTXNPx) e mitocondrial (mTcTXNPx) e a ascorbato peroxidase (APX). No presente trabalho, os genes que codificam as enzimas antioxidantes cTcTXNPx, mTcTXNPx, APX e TR foram caracterizados em 18 populações do T. cruzi sensíveis e resistentes ao benzonidazol (BZ). Nossos resultados mostraram que os níveis de mRNA dos genes cTcTXNPx e mTcTXNPx foram duas vezes maior na população do T. cruzi com resistência induzida in vitro ao BZ (17LER), do que seu par sensível (17WTS). No entanto, estes genes não estão amplificados no genoma do parasito. Os genes cTcTXNPx e mTcTXNPx podem apresentam oito e duas cópias, respectivamente, dispersas ao longo do genoma do parasito. Análises de western blot, utilizando anticorpos policlonais anti-cTcTXNPx e anti-mTcTXNPx, mostraram que o nível de expressão destas proteínas nativas foi similar para todas as amostras, exceto na população 17LER que apresentou um aumento de duas vezes na expressão. Além disto, a proteína oxidada mTcTXNPx demonstrou uma expressão 5.5 vezes maior na população 17LER, comparada ao par sensível. Análises filogenéticas das proteínas do T. cruzi cTcTXNPx e mTcTXNPx com outros tripanosomatídeos mostraram que elas estão estreitamente relacionados com seus homólogos em T. brucei. A enzima APX do T. cruzi pode ser considerada um bom alvo para drogas, uma vez que ela não é encontrada em hospedeiros mamíferos. O nível de mRNA e número de cópias do gene TcAPX não apresentaram diferenças significativas entre as populações do T. cruzi sensíveis e resistentes ao BZ. O gene TcAPX pode apresentar duas cópias dispersas ao longo do genoma do parasito e está localizada em uma banda cromossômica em todas as cepas do parasito analisadas A proteína TcAPX apresentou maior similaridade com a APX de espécies de Leishmania, quando comparada com plantas. Observamos que o nível de expressão da proteína TcAPX foi duas vezes maior na população do T. cruzi com resistência selecionada in vivo ao BZ (BZR), do que seu par sensível (BZS). A tripanotiona redutase é a enzima chave do parasito que mantêm o ambiente intracelular reduzido. O nível de mRNA e o número de cópias do gene TR não apresentaram diferenças significativas nas amostras analisadas. Este gene apresenta uma única cópia no genoma do parasito e está mais relacionado com a TR de T. brucei, comparado com outros tripanosomatídeos. Baseado nos nossos resultados, sugerimos que a população do T. cruzi com resistência induzida in vitro ao BZ exibe um aumento no nível da proteína TXNPx juntamente com outras enzimas associadas com o sistema de defesa antioxidante, como a TcFeSOD-A previamente descrita (Nogueira et al., 2006), protegendo estes parasitos resistentes contra o estresse oxidativo. / Antioxidant defense in trypanosomatids have been indicated as a potential target for chemotherapy. This system is based on low molecular weight thiol trypanothione, which maintain the reduced intracellular environment by the action of trypanothione reductase (TR). The pathways that metabolize the hydrogen peroxide to water molecules surrounding the cytosolic (cTXNPx) and mitochondrial (mTXNPx) tryparedoxin peroxidase enzymes and ascorbate peroxidase (APX). In the present work, the genes that encode cTXNPx, mTXNPx, APX and TR antioxidants enzymes were characterized in 18 T. cruzi populations susceptible and resistant to benznidazole (BZ). Our results showed that the levels of cTcTXNPx and mTcTXNPx mRNA were two-fold higher in the T. cruzi population with in vitro-induced resistance to BZ (17LER) than its sensitive pair (17WTS). However, these genes are not amplified in the parasite genome. cTcTXNPx and mTcTXNPx genes can have eight and two copies, respectively, dispersed throughout of the parasite genome. Western blot analysis using anti-cTcTXNPx and anti-mTcTXNPx polyclonal antibodies showed that the expression level of native proteins was similar for all samples, except the 17LER population that showed the expression two-fold more. In addition, the oxidized mTcTXNPx protein demonstrated 5.5- fold greater expression in the 17LER population than 17WTS. Phylogenetic analysis of cTcTXNPx and mTcTXNPx proteins from T. cruzi and other trypanosomatids showed that they are closely related to their homolog in T. brucei. The T. cruzi APX enzyme is considered a good target for drug because it is not found in mammalian hosts. The mRNA level and copy number of the TcAPX gene showed no significant difference between T. cruzi populations susceptible and resistant to BZ. The TcAPX gene presents two copies dispersed throughout of the parasite genome and it is located in one chromosomal band in all T. cruzi strains analyzed. TcAPX protein showed greater similarity to APX from Leishmania than plants. The expression level of TcAPX protein was two-fold more in T. cruzi population with in vivoselected resistance to BZ (BZR), than its susceptible counterpart BZS. Trypanothione reductase is the key enzyme of the parasite to maintain a reduced intracellular environment. The mRNA level and copy number of the TR gene showed no significant difference in the samples analyzed. This gene presents a single copy in the parasite genome and it is more related to TR from T. brucei than other trypanosomatids. Based on our results, we suggest that the T. cruzi population with in vitro resistance to BZ exhibits an increase in TcTXNPx protein levels together with other enzymes associated with peroxide metabolism, such as the previously described TcFESOD (Nogueira et al., 2006), protecting these resistant parasites against oxidative stress.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-03-14T19:12:00Z No. of bitstreams: 1 alejandro_mh_moreno_ioc_mt_0001_2010.pdf: 339583 bytes, checksum: 457b4793ca6b03e5f5a4b94f0e5534b1 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-14T19:12:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 alejandro_mh_moreno_ioc_mt_0001_2010.pdf: 339583 bytes, checksum: 457b4793ca6b03e5f5a4b94f0e5534b1 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O objetivo deste trabalho é descrever a evolução eletrocardiográfica, sorológica e parasitológica de pacientes com doença de Chagas na forma indeterminada, tratados com benzonidazol, comparando-os com um grupo controle de pacientes que não receberam tratamento etiológico. Para determinação da freqüência de surgimento de alterações eletrocardiográficas durante o período de seguimento, os grupos de pacientes tratados (n = 62) e não tratados (n = 62) foram observados por, em média, 118,3 ± 61,7 meses (7333,7 pacientes-meses) e 144,51 ± 49 meses (8959,9 pacientes-meses), respectivamente. A freqüência de surgimento de alterações eletrocardiográficas foi de 8/62 (12,9%) no grupo tratado e 10/62 (16,1%) no grupo não tratado (p = 0,400), com densidades de incidência de 1,09 / 1000 pacientes-meses e 1,11 / 1000 pacientes-meses nestes dois grupos, respectivamente (risco relativo = 0,98). Não foi observada relação entre a evolução para piora eletrocardiográfica e as variáveis idade (35,2 ± 9,6 entre os que evoluíram para este desfecho e 34,8 ± 6,7 entre os que não evoluíram), sexo ou naturalidade. Para comparação da evolução dos títulos sorológicos, os grupos de pacientes tratados e não tratados foram observados por 88,7 ± 49,6 meses e 140,9 ± 47,8 meses, respectivamente. Após conversão dos títulos de diluição sorológicos para valores em uma escala linear na qual o valor 1 representa a diluição de 1:40 e o valor 6 a diluição de 1:1280, observou-se que os pacientes tratados evoluíram com uma redução significativa dos títulos (4,07 no pré-tratamento e 2,85 ao fim do acompanhamento, p < 0,001), redução esta que não foi observada entre os não tratados (4,22 no início do acompanhamento e 4,11 ao término do seguimento, p = 0,503). Embora quando comparados aos títulos observados antes da terapia específica os títulos sorológicos pós- tratamento apresentem significativa redução, estes últimos apresentam uma tendência de elevação com o passar do tempo, após 100 a 150 meses de acompanhamento. Não foi observada relação entre a evolução dos títulos sorológicos ou os títulos sorológicos iniciais e o surgimento de alterações eletrocardiográficas, assim como entre estes títulos e a naturalidade dos pacientes. No grupo tratado com benzonidazol, todos os pacientes (62) realizaram xenodiagnóstico, observando-se 32 pessoas com exames positivos (51,6%). Após o tratamento, apenas um destes pacientes permaneceu positivo. Conclui- se que, na amostra de pacientes estudada: i) os pacientes com xenodiagnóstico positivo, ao serem tratados evoluem, em sua maioria, com negativação deste exame; ii) o tratamento específico proporciona uma redução significativa dos títulos sorológicos e iii) não há relação entre o tratamento etiológico da doença de Chagas com benzonidazol e a evolução eletrocardiográfica. / The aim of this study was to describe the effect of benzonidazol treatment on the electrocardiographic, serological and parasitological evolution of patients in indeterminate form of Chagas disease. In order to do this, we retrospectively analyzed a group of 62 patients that were treated with benzonidazol and compared their clinical findings with the findings of an untreated group (n=62) with Chagas disease. The frequency of electrocardiographic alterations in the treated group was followed for 118.3 ± 61.7 months (7333.7 patients-months) and in the untreated group was followed for 144.51 ± 49 months (8959.9 patients-months). The rate of disease progression from indeterminate to the cardiac form of Chagas disease based on electrocardiographic findings was 12.9% (8/62) among treated patients and 16.1% (10/62) among untreated (p = 0.4). The incidence densities of this outcome was 1.09/1000 patients-months and 1.11/1000 patients-months in treated and untreated groups, respectively (relative risk = 0.98). There was no correlation between the progression to cardiac form and age, sex or place of birth. The serological titers of benzonidazol treated and untreated patients were followed for 88.7 ± 49.6 months and 140.9 ± 47.8 months, respectively. The titers were converted to a linear scale, where 1 represented a 1:40 dilution and 6 a 1:1280 dilution. The serological titer reduced significantly after benzonidazol treatment ((4.07 before treatment vs. 2.85 post-treatment, p < 0.001). Such reduction was not observed among untreated persons (4.22 at the beginning of the follow-up vs. 4.11 at the end, p = 0.503). Despite the observed reduction of the serological titers after benzonidazol treatment, the post-treatment titers tended to increase throughout the follow-up period, mainly after 100-150 months. Furthermore, we failed to detect a relationship between serological evolution and electrocardiographic alterations. All treated patients were submitted to xenodiagnosis and 32 proved positive. After treatment, xenodiagnosis remained positive in only one patient. We concluded that: i) parasitemia seems to be suppressed soon after specific treatment ii) treatment with benznidazole is associated with a significant reduction in serological titers, and iii) among studied patients there was no relationship between etiologic treatment and electrocardiographic evolution

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-03-23T18:08:27Z No. of bitstreams: 1 lauren_h_jaeger_ioc_mt_0003_2010.pdf: 980575 bytes, checksum: 58e8d10d1a1194b26a55ff028cdccc2e (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-23T18:08:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 lauren_h_jaeger_ioc_mt_0003_2010.pdf: 980575 bytes, checksum: 58e8d10d1a1194b26a55ff028cdccc2e (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Trypanosoma cruzi (T. cruzi) é o agente causador da doença de Chagas, que afeta entre 8 e 9 milhões de pessoas em todo mundo. Este protozoário é responsável por uma variedade de manifestações clínicas em humanos, possui uma ampla gama de hospedeiros e apresenta grande diversidade genética e biológica. As pequenas regiões codificantes (uORFs) presentes na região 5’não traduzida (5’UTR) de mRNAs maduros são conhecidas por afetar a eficiência da tradução de muitos genes eucariotos. Pouco é conhecido sobre a existência e conservação de uORFs em genes de Tripanossomatídeos. Este trabalho se propôs avaliar o grau de conservação das uORFs e seu potencial como marcador molecular das populações de T. cruzi, através da análise de sete genes contendo uORFs previamente selecionados. Oligonucleotídeos iniciadores foram desenhados e fragmentos das 5’UTRs contendo uORFs foram amplificados, através de PCR, de cepas representativas de cada um dos três grupos populacionais do parasito, TcI, TcII e ZIII. Após clonagem e sequenciamento, alto grau de conservação das uORFs foi observado de um ponto de vista populacional e a ruptura de uma uORF foi observada em apenas um gene. Isto é um forte indicativo de que em T. cruzi essas uORFs são funcionalmente ativas, pois do contrário teriam sido extintas das 5’UTRs durante o processo evolutivo sofrido pelos grupos populacionais de T. cruzi. A observação de mutações grupo-específicas nas sequências nucleotídicas das 5’UTRs de alguns genes, motivou a realização de testes para a utilização desses fragmentos como possíveis marcadores moleculares para as populações do parasito. A obtenção dos fragmentos dos genes codificantes de ATPase e Ferredoxina foi realizada em mais de 15 cepas e isolados. Verificou-se a existência de mutações grupo-específicas na 5’UTR do gene ATPase, que corroboram com a classificação filogenética proposta deste parasito. Na 5’UTR do gene Ferredoxina, notou-se a presença de uma sequência repetitiva simples, composta por dinucleotídeos CA (citosina e adenina) seguidos de mononucleotídeos A. As variações desta repetição puderam ser utilizadas para agrupar todos os isolados/cepas de T. cruzi do estudo em nove genótipos distintos, os quais são relativamente independentes da classificação atualmente proposta de três grandes grupos populacionais. O uso desta pequena repetição na 5’UTR do gene Ferredoxina permite uma nova forma de classificar os isolados e cepas de T. cruzi. / Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease in humans, and affects about nine million of people around the world. It induces a variety of clinical presentations in patients, have a wide range of vertebrate hosts and exhibits great diversity of genetic and biological characteristics. Upstream Open Reading Frames (uORFs) are small open reading frames located in the 5’ UTR of a mature mRNA. They have been shown to affect the translation efficiency of many eukaryotic genes. Scarce information is available about the existence and conservation of uORFs in Trypanosomatids genes. This study aims to evaluate both the degree of sequence conservation in uORFs and its potential as molecular marker of populations of T. cruzi. To this end, upon a PCR amplification and cloning of 5'UTR fragments, sequence analysis of seven genes that presents uORFs were carried out in four strains that are typical representative of three main population groups in T. cruzi. A remarkable degree of conservation of uORFs was observed in all isolates. Out of several mutational events observed in these uORFs, a disruption of a uORF was observed in only one gene. This indicates that in T. cruzi these uORFs are functionally active, otherwise it would have changed during the evolutionary process. The observation of group-specific mutations in the 5'UTRs of some genes suggested that they could be used in an PCR amplification assay as molecular markers for T. cruzi populations. The fragments of genes ATPase and Ferredoxin were amplified from 15 strains and isolates. After sequencing, the group-specific mutations observed in the 5'UTR of the gene ATPase corroborate the current classification of T. cruzi populations in three main groups: TcI, TcII and ZIII. In the 5'UTR of the Ferredoxin gene, the sequence alignment revealed the presence of a small repetitive sequence composed of dinucleotides CA and mononucleotides Adenine. The variations in length and composition of this simple repetitive sequence allowed the clustering of all 15 isolates into nine distinct genotypes, which were not correlated to main population groups. Thus, a new approach to strain typing in T. cruzi can be envisaged by using this SSR (simple sequence repeat).

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2012-08-21T18:46:11Z No. of bitstreams: 1 FERNANDO Tese FINAL!!.pdf: 9425666 bytes, checksum: 1a96c7aab4a723a257e2c184189c0b67 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-08-21T18:46:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 FERNANDO Tese FINAL!!.pdf: 9425666 bytes, checksum: 1a96c7aab4a723a257e2c184189c0b67 (MD5) / Projeto Poor Land Use, Poor Health (PLUPH) International Development Research Centre (IDRC) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ). Centro de Pesquisa René Rachou (CPqRR) Centre Nationale de la Recherche Cientifique (CNRS) / O número crescente de casos agudos da doença de Chagas no estado do Pará, notificados nas últimas duas décadas, tem sido associados, em parte, a ingestão de suco de frutos de palmeiras locais, principalmente açaí e bacaba. O objetivo do presente trabalho foi avaliar os aspectos ecológicos da Tripanossomíase Americana em comunidades do médio Tapajós, Pará, Brasil, e riscos de transmissão do Trypanosoma cruzi às populações humanas da região. Para isto, foram dissecadas 136 palmeiras, sendo 60 no final do período chuvoso e 76 no final do período de seca. Destas, 73 (53,7%) estavam infestadas por triatomíneos e foram encontradas três espécies, a saber: Rhodnius robustus, Rhodnius pictipes e Panstrongylus lignarius. Foram coletados 743 triatomíneos, sendo predominante a presença de R. robustus (n=739). A identificação da infecção natural dos insetos por tripanosomatídeos revelou que 125 triatomíneos estavam infectados pelo T. cruzi, 69 por T. rangeli e 14 apresentaram ambos os parasitas, indicando a presença de infecção mista no mesmo vetor. Foi realizada a tipagem molecular de T. cruzi de acordo com a nova nomenclatura e os resultados demonstraram predominância do grupo TCI (n=29). Além disso, foi constatada a ocorrência de TCII, a presença de TCI e TCII no mesmo triatomíneo e 12 isolados de TCI apresentaram uma variante, sugerindo a existência de um subgrupo dentro de TCI. A análise das fontes alimentares revelou que R. robustus, espécie predominante de triatomíneo coletada nas palmeiras investigadas, alimentou-se na sua grande maioria em mamíferos silvestres. Foram também identificados “sangue” de outras fontes alimentares, como aves e répteis no conteúdo digestivo dos espécies investigados. As análises cartográficas de Kernel e do Interpolador de Médias demonstraram que a comunidade São Tomé apresenta maiores aglomerados (hotspots) tanto em infestação das palmeiras, quanto na densidade triatomínica e número de insetos infectados. Desta forma, os resultados sugerem que São Tomé é a comunidade com maior risco de infecção à população e demonstram a existência de um ciclo silvestre intenso na região que demanda vigilância para prevenção da transmissão. / The increasing number of acute cases of Chagas Disease in the state of Pará, notified in the last two decades, were in part associated with the ingestion of juice from fruits of local palm trees, mainly açaí and babaca. The objective of this study was to evaluate the ecological aspects of American Trypanosomiasis in communities from the middle of Tapajós, Pará, Brazil, as well as the risks of transmission of Trypanasoma cruzi to the human populations of the region. In order to achieve this, 136 palm trees were dissected; 60 of them during the rainy season and 76 during the end of the dry season. Seventy-three (53.7%) of these were infested with three different species of triatomines: Rhodnius robustus, Rhodnius pictipes and Panstrongylus lignarius. In total, 743 triatomines were collected with R. robustus (n=739) as the most abundant. Through dissection of the collected insects, the presence of a natural infection by T. cruzi (n=125) and T. rangeli (n=69) was shown, while 14 insects had a mixed infection of both parasites. The molecular typing of T. cruzi according to the new nomenclature showed a predominance of the group TCI (n=29). The presence of TCII was also observed, as well as the presence of mixed infections of TCI and TCII, but most importantly, 12 isolates of TCI presented a variation, suggesting the presence of a subgroup within TCI. Analysis of the food sources revealed that R. robustus, the predominant triatomine species collected from the investigated palm trees, fed mainly from wild mammals. “Blood” from other food sources, like birds and reptiles, were also found in the digestive content of the species collected. The analysis of Kernel´s cartography and of the Interpolatation of Average showed that the community of São Tomé presents the largest hotspots with respect to the infestation of palm trees, the density of triatomines and the number of insects with natural infections. Therefore, the population of the community of São Tomé is considered to be the one with the greatest risk of infection and our results show the existence of an intense sylvatic cycle that demands surveillance in order to prevent transmission in the region.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-10-18T20:17:52Z No. of bitstreams: 1 anissa_daliry_ioc_bcm_0031_2011.pdf: 14613668 bytes, checksum: 93e5077e14be3ffeb54129fc214799c9 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-18T20:17:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 anissa_daliry_ioc_bcm_0031_2011.pdf: 14613668 bytes, checksum: 93e5077e14be3ffeb54129fc214799c9 (MD5) Previous issue date: 2011 / Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A doença de Chagas, causada pelo Trypanosoma cruzi, é endêmica na América Latina, afetando mais de 15 milhões de pessoas. Como seu tratamento apresenta eficácia limitada e considerável toxicidade novas drogas são necessárias. Neste contexto, com a colaboração de grupos de química medicinal, nosso objetivo é a investigação da atividade tripanocida, seletividade, alvos celulares e mecanismos de ação de diamidinas aromáticas (DAs) e análogos. Inicialmente avaliamos o efeito tripanocida de onze DAs sobre as formas tripomastigotas e amastigotas intracelulares, assim como sua toxicidade para células de mamíferos e localização intracelular no parasito. Entre estes onze compostos, 2, 5 e 7 foram os mais ativos, com valores de IC50 na faixa micromolar e um alto índice de seletividade sobre as duas formas de T. cruzi. Através de microscopia de fluorescência (MF) foi possível localizar todos os compostos em organelas ricas em DNA, núcleo e mitocôndria (kDNA) e a análise ultraestrutural utilizando os compostos 5 e 7 revelou que estes compostos levam a danos mitocondriais, incluindo desorganização do kDNA em formas tripomastigotas. O acúmulo das diamidinas foi maior no kDNA do que no núcleo, porém tal acúmulo não está correlacionado a uma maior atividade tripanocida. A seguir, visando um melhor entendimento do mecanismo de ação de diamidinas e análogos, investigamos uma possível correlação entre as propriedades de ligação ao kDNA de treze compostos com a atividade tripanocida, através de estudos de desnaturação térmica (Tm) e dicroísmo circular (DiC). Nossos resultados mostram tanto com kDNA purificado de epimastigotas como com uma sequência conservada de 22-mer presente em minicírculos de T. cruzi, que a forte interação de amidinas ao kDNA não é o fator determinante para desencadear sua atividade tripanocida. Nosso próximo passo foi a avaliação de alterações topológicas induzidas por dez compostos aromáticos sobre o kDNA de T. cruzi através de alteração da mobilidade em gel e MF. Os estudos eletroforéticos foram conduzidos pela incubação de fragmentos de kDNA, obtidos pela digestão com as endonucleases EcoRI e CvQI, com os compostos por análise em gel de poliacrilamida. As diamidinas DB889 e DB185 induziram consideráveis alterações na mobilidade dos fragmentos. Além disso, incubando a rede intacta e purificada de kDNA com a DB75 e monitorando o efeito por MF, obervarmos a capacidade desta DA de induzir um grande aumento da área da rede. Em resumo, nossos resultados revelam que diamidinas e congêneres são capazes de induzir profundas alterações na topologia do kDNA do T. cruzi sugerindo que esta estrutura pode ser um dos possíveis alvos destes compostos. Entretanto, a localização preferencial dos compostos no kDNA, assim como sua afinidade à esta estrutura e capacidade de alterar a mobilidade dos fragmentos em géis de poliacrilamida não está correlacionada com sua atividade tripanocida. Estes dados sugerem fortemente que outros fatores podem estar envolvidos no mecanismo de ação destes compostos, operando de modo primário ou secundário a interação composto:kDNA. Outros estudos serão necessários para melhor identificar os mecanismos envolvidos na ação destes compostos, visando contribuir para o desenho racional de compostos líderes para o tratamento da doença de Chagas. / Chagas disease, caused by Trypanosoma cruzi, is endemic in Latin America, affecting more de 15 million people. Due to the limited efficacy and considerable toxicity, the therapy for Chagas disease is far from being considerable ideal and thus alternative drugs are urgently needed. In this context, with the collaborations of medicinal chemistry groups, our aim was to investigate the trypanocidal activity, selectivity, cellular targets and mechanisms of action of aromatic diamidines (ADs) and analogues. First, we tested the trypanocidal effect of eleven ADs upon intracellular amastigotes and trypomastigotes, their toxicity towards mammalian cells and their sub-cellular localization. Compounds 2, 5 and 7 were the most active, presenting IC50 values on the micromolar range and displaying high selectivity indexes for both T. cruzi forms. Using fluorescence microscopy (FM), all the compounds were localized in organelles rich in DNA, nucleus and mitochondrion (kDNA) and in bloodstream forms treated with the compounds 5 and 7 we observed ultrastructural damages on mitochondrial organelle, including kDNA disorganization. The accumulation of the diamidines was higher in the kDNA than in the nucleus, but such accumulation could not be correlated with a higher trypanocidal activity. Next, aiming to better understand the mechanism of action of diamidines and analogues, we investigated the possible correlation between kDNA binding properties of thirteen compounds with their anti-T. cruzi effect, through thermal denaturation (T m) and circular dichroism (CiD) studies. Our data demonstrated using the purified kDNA of epimastigotes or a conserved synthetic parasite sequence of 22-mer present in T. cruzi minicircles, that the strong interaction of the amidines with the kDNA is not a determinant factor to the triggering of the trypanocidal activity. Our next step was the evaluation of topological changes induced by ten aromatic compounds on T. cruzi kDNA, through gel mobility shifts and FM. The eletrophoretic studies were conducted by the incubation of kDNA fragments obtained by digestion with the endonucleases EcoRI e CvQI with the compounds and analysis by poliacrylamide gel. The diamidines DB889 and DB185 induced substantial mobility shifts in the fragmented bands. Additionally, by FM of whole kDNA network incubated with DB75 we observed the ability of this diamidine to cause a striking expansion of the kDNA network area. Taken together our results suggest that diamidines and related compounds provoke profound alterations in the normal topology of T. cruzi kDNA suggesting that this structure may represent one of the potential targets of these compounds. However, the compound preferential accumulation in kDNA, as well as their affinity and capability of inducing topological changes in that structure is not correlated with their anti-T. cruzi activity. These findings strongly suggest that other molecular mechanisms may be also operating primarily or secondarily to the drug:KDNA interaction. Further studies are needed to better identify the mechanisms involved in the activity of this class of chemical, aiming to contribute to the rational design of lead compounds for the treatment of Chagas disease .

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-11-26T15:43:37Z No. of bitstreams: 1 daniel_a_p_martins_ioc_bcm_0024_2010.pdf: 10130276 bytes, checksum: 596c01e9402f3b4dd80395ef8bc4aa50 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-26T15:43:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 daniel_a_p_martins_ioc_bcm_0024_2010.pdf: 10130276 bytes, checksum: 596c01e9402f3b4dd80395ef8bc4aa50 (MD5) Previous issue date: 2010 / Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho. Departamento de Neurobiologia. Rio de Janeiro, RJ,Brasil / A doença de Chagas é causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi sendo a principal causa de morbi-mortalidade entre as cardiopatias na América Latina, onde é endêmica. No presente trabalho nós utilizamos modelos experimentais tais como cultivo celular e infecção de camundongos albinos para avaliar aspectos relacionados à patogênese desta doença. Primeiramente utilizamos a técnica de microarranjos de oligonucleotídeos para determinar as diferentes assinaturas transcriptômicas induzidas por quatro diferentes cepas de T. cruzi em uma linhagem de células musculares. Neste trabalho, verificamos que os genes alterados significativamente nas células infectadas (p<0,05) foram diferentes para cada cepa e apenas 21 sofreram a mesma alteração nas quatro cepas estudadas. No entanto, mioblastos apresentaram assinaturas transcriptômicas únicas após infecção pelas quatro cepas de T. cruzi utilizadas. Estes resultados indicam que a infecção com diferentes cepas do parasito modula vias similares, porém não idênticas, nas células hospedeiras. Em seguida analisamos o impacto da infecção de cardiomiócitos murinos na expressão de caveolina-3 (Cav-3), proteína formadora das cavéolas, importantes para a manutenção da homeostase de cálcio intracelular e envolvida em processos de hipertrofia cardíaca. A infecção in vitro e in vivo por T. cruzi induziu redução significativa (p<0,05) nos níveis de Cav-3. Esta redução foi acompanhada pela ativação da quinase regulada por sinal extracelular (ERK), majoritariamente envolvida no processo de remodelamento e hipertrofia cardíacos, sugerindo a participação desta via de sinalização na patogênese da doença de Chagas. Por último, avaliamos a capacidade tripanocida do composto antiarrítmico amiodarona em culturas de cardiomiócitos infectadas. Este composto apresentou atividade seletiva anti-T. cruzi, promovendo danos ultra-estruturais às formas amastigotas intracelulares e a recuperação da célula hospedeira, incluindo restabelecimento do citoesqueleto de actina e junções comunicantes, além da contratilidade espontânea das culturas. O conjunto de dados gerado com esta tese traz importantes avanços para o entendimento do estabelecimento da doença de Chagas cardíaca e novas opções para o tratamento etiológico desta doença negligenciada. / Chagas’disease is caused by the protozoan Trypanosoma cruzi and is the main cause of morbidity and mortality by heart problems in endemic countries in Latin America. In the present work we employed as experimental models cell cultures and murine experimental infection to evaluate aspects related to the pathogenesis of this disease. In the first part we determined through oligonucleotide microarrays the transcriptomic signatures induced in a myoblast cell line by four reference T. cruzi strains. We observed that the significantly altered (p<0.05) genes differed for each strain studied and only 21 suffered changes in the same direction in all four strains. However, infected myoblasts presented proportional alterations in the the overall transcriptome. These results indicate that the infection with distinct strains modulate similar, but not identical, pathways in the host cell. Next we analyzed the impact of T. cruzi infection on cardiac caveolin-3 (Cav-3) expression, which has an important role in the maintenance of intracellular calcium homeostasis and is also involved in cardiac hypertrophy pathways. Both in vitro and in vivo infection induced a significant reduction of Cav-3 levels. This reduction was followed by the activation of extracellular signal regulated kinase (ERK), which plays a major role in cardiac remodeling and hypertrophy, suggesting that this pathway may be involved in the pathogenesis of Chagas’ heart disease. Finally we tested the tripanocidal potential of the anti-arrhythmic drug amiodarone in infected cultures of cardiac myocytes. This compound displayed a selective anti-T. cruzi activity, inducing ultrastructural alterations in intracellular amastigotes and promoted host cell recovery with actin cytoskeleton and gap junction reassembly, followed by restoration of the spontaneous contractility. The data generated in this work bring important advances into the understanding of Chagas heart disease establishment and also a new option for the etiological treatment of this neglected disease.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-01-25T10:55:52Z No. of bitstreams: 1 Ana Carolina borella anhe.pdf: 14934696 bytes, checksum: 8837678c96ca7fb7e6fb4a64a9f5b3a8 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-25T10:55:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ana Carolina borella anhe.pdf: 14934696 bytes, checksum: 8837678c96ca7fb7e6fb4a64a9f5b3a8 (MD5) Previous issue date: 2011 / Os triatomíneos são vetores do Trypanosoma cruzi e do Trypanosoma rangeli. Apresentam hábito hematófago durante todo o ciclo de vida. Durante o repasto, secretam uma saliva que antagoniza os sistemas hemostático, inflamatório e imunológico do hospedeiro vertebrado. A fim de caracterizar os aspectos morfológicos da glândula salivar, foi desenvolvido um estudo do crescimento desse órgão em triatomíneos de três espécies: Rhodnius prolixus, Panstrongylus megistus e Triatoma infestans. Os insetos foram cedidos pelo insetário do Laboratório de Triatomíneos e Epidemiologia da Doença de Chagas (CPqRR - FIOCRUZ). As glândulas salivares foram dissecadas e processadas para microscopia de luz, de fluorescência, laser confocal e eletrônica de varredura. Os resultados indicaram que a glândula é morfologicamente semelhante durante todo o ciclo de vida do inseto, sendo formada por um par de lobos, cada qual formado por dois (R. prolixus) ou três lóbulos (P. megistus e T. infestans). Durante o ciclo de vida, a glândula quadruplicou o seu tamanho inicial, devido ao crescimento celular, visto que o número de células permaneceu constante. Os lóbulos se mostraram formados por um epitélio simples que delimita o lúmen (onde a saliva é armazenada), revestidos por fibras musculares (cuja contração permite a liberação da saliva), traquéias e nervos. Serotonina apresentou intensa atividade na glândula das três espécies analisadas durante alimentação. Em R. prolixus, atividade dopaminérgia e de tirosina-hidroxilase (enzima da via das catecolaminas) também foram observadas. Dobras de membrana foram visualizadas na região apical das células e associadas ao aumento da área de secreção (tipo merócrina). Além disso, a presença de vesículas de secreção e células inteiras (estas observadas apenas em R. prolixus) no lúmen indicaram secreções do tipo apócrina e holócrina, respectivamente. Bactérias Gram-negativas e Gram-positivas foram observadas dentro das células e do lúmen do lóbulo posterior de T. infestans. / Triatomines are vectors of Trypanosoma cruzi e Trypanosoma rangeli. They are hematophagous during all life cycle. During the bite, they secrete saliva that antagonizes hemostatic, inflammatory and immunological systems imposed by the vertebrate host. In order to understand gland structure, a study of the organ growth was carried out with three important species: Rhodnius prolixus, Panstrongylus megistus e Triatoma infestans. The triatomines were provided by the Insectary of the Insectary of the Laboratory of Triatomines and Epidemiology of Chagas Disease (CPqRR - FIOCRUZ). Glands were dissected and processed routinely for light, fluorescence, laser scanning confocal and scanning electron microscopies. The results indicated that the gland is very similar during all cycle. It is formed by a pair of lobes, each one formed by two (R. prolixus) or three lobules (P. megistus e T. infestans). During the life cycle, salivary gland grew four times. This happened because cell volume increased, since the number of cells was the same during all life. The results showed that lobules are formed by a single epithelium that delimits a large central lumen (where saliva is stored), covered by muscle fibers (gland contraction and saliva releasing), trachea and nerves. Serotonin was considered an important neurotransmitter released during feeding, since it showed intense activity in the gland of the three species. In R. prolixus, activity of dopamine and tyrosine-hydroxylase (indicative of the presence of catecholamines) were also visualized. Membrane infoldings were observed in the apical surface of the cells, increasing the membrane area available for secretion (merocrine type). In addition, the presence of secretion vesicles and entire cells in the lumen (just in R. prolixus) indicated aprocrine and holocrine types of secretion, respectively. Gram-negative and Gram-positive bacteria were observed inside the cells and in the lumen of the posterior lobule of T. infestans.