Introdução: Com o aumento da resistência bacteriana à antibioticoterapia tornou-se necessário o desenvolvimento de técnicas antimicrobianas alternativas. Assim, na busca de novas metodologias contra microrganismos, estudos usando a Terapia Fotodinâmica (TFD) antimicrobiana tem sido realizados. Objetivo: Realizar análise morfométrica, radiográfica e molecular do processo de reparo alveolar após a TFD antimicrobiana em ratos Wistar. Material e Métodos: Foram utilizados 85 ratos, divididos nos seguintes grupos: GRUPO C: Animais com alvéolo não tratado (grupo controle); GRUPO S+L: Animais com alvéolo preenchido com soro fisiológico e tratado apenas com aplicação do Laser de baixa intensidade (660 nm), com fluência de 50 J/cm2; GRUPO ATO: Animais com alvéolo tratado apenas com aplicação tópica de azul de toluidina - O (ATO) na concentração de 100 µg/mL e GRUPO ATO+L: Animais com alvéolo tratado com aplicação tópica de azul de toluidina O (ATO) na concentração de 100 µg/mL + aplicação de Laser de baixa intensidade (660 nm), com fluência de 50 J/cm2. Os animais foram sacrificados aos 6, 15 e 28 dias pós-operatório. O mapeamento térmico foi realizado em um animal para confirmar a ausência de efeito térmico do Laser sobre o local irradiado. Foram realizadas as análises microscópicas: qualitativa e quantitativa de tecido conjuntivo, tecido ósseo, coágulo sanguíneo, vaso sanguíneo, infiltrado inflamatório e espaço vazio; radiográfica: por meio do valor de pixel e dimensão fractal e molecular: quantitativa da expressão de genes envolvidos no processo de reparo: colágeno tipo I (COL-I), fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), runt-related transcription factor 2 (RUNX2), osteocalcina (OCN) e fosfatase alcalina (ALP), por meio da PCR Real Time. Resultados e Conclusão: Os resultados demonstraram que a TFD antimicrobiano não atuou negativamente na evolução do processo de reparo alveolar; a análise radiográfica por meio dos valores de pixel pode ser usada como indicador para avaliar a neoformação óssea no processo de reparo alveolar em ratos; a expressão de VEGF pode ser usada como marcador molecular para a angiogênese no processo de reparo alveolar em ratos e a expressão de fosfatase alcalina pode ser usada como marcador molecular nos estágios iniciais do metabolismo ósseo no processo de reparo alveolar em ratos. / Introduction: Antibiotics resistance made the development of antimicrobial alternative techniques necessary. Consequently, others alternatives such as antimicrobial photodynamic therapy (PDT) have been studied. Objective: The objectives were to perform morphometric, radiographic and molecular analyses of alveolar repair process in rats after antimicrobial photodynamic therapy. Methods: Eighty-five rats were used in this study, divided according to the following groups: C: untreated socket; S+L: socket treatment with physiologic saline solution and low intensity laser therapy (660nm - 50J/cm2); ATO: socket treatment with topic application of toluidine blue-O (100 µg/mL) and ATO+L: socket treatment with topic application of toluidine blue-O (100µg/ml) and low intensity laser therapy (660nm - 50J/cm2). The animals were sacrificed at a postoperative period of 6, 15 and 28 days. Thermal variation was carried out in an animal to confirm the absence of Laser thermal effect on irradiation area. Quantitative and qualitative microscopic analyses were performed to evaluate the connective tissue, bone tissue, blood clot, blood vessel, inflammatory infiltrate and empty space. Fractal and Pixel radiographic analysis were performed. A quantitative analysis was performed using a RealTimePCR to evaluate the genes expression involved Collagen Type I (COL-I), vascular endothelial growth factor (VEGF), runt-related transcription factor 2 (RUNX2), osteocalcin (OCN), alkaline phosphatase (ALP), in the alveolar repair process. Results and Conclusions: Based in the results, it can be concluded that antimicrobial photodynamic therapy did not act negatively in the socket bone repair evaluation. Pixel values analysis could be used as indicators to evaluate the dry socket bone neoformation. The VEGF molecular marker could be used as angiogenesis indicator to evaluate the dry socket bone neoformation as well as alkaline phosphatase as a molecular marker in the early stage of bone neoformation.

INTRODUÇÃO: Nas últimas três décadas E. aerogenes e E. cloacae vem sendo reportado como importante patógeno de infecção relacionada a assistência à saúde e vem cada vez mais apresentando resistência a vários antibióticos incluindo os carbapenêmicos. Poucos estudos, entretanto, avaliaram os mecanismos de resistência aos carbapenêmicos em espécies de Enterobacter no Mundo e no Brasil. OBJETIVO: Avaliar a presença de genes codificadores de carbapenemases, genes de ?- lactamases de espectro estendido e de bomba de fluxo AcrAB-TolC e alteração de proteínas de membrana externa de 44 isolados de E. aerogenes e 8 isolados de E. cloacae resistentes aos carbapenêmicos de 03 hospitais brasileiros. MATERIAL E MÉTODOS: Para determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM), foi realizado o teste de microdiluição em caldo, com os antibióticos: Imipenem, Meropenem, Ertapenem, Cefepima, Tigeciclina e Polimixina B e para Fosfomicina foi realizado o teste de diluição em ágar, segundo CLSI. Foi realizado PCR para identificar os genes codificadores de Serino Beta-lactamase da Classe A de Ambler (blaKPC, blaIMI e blaGES), de Metalo-beta-lactamase da Classe B de Ambler (bla IMP, blaVIM, blaGIM, blaSIM, blaSPM e blaNDM), de Oxacilinases da Classe D de Ambler (bla OXA-48), as ESBL (blaTEM, blaCTX e blaSHV) e da bomba de efluxo AcrAB-TolC. A tipagem molecular foi feita pela técnica de PFGE, as proteínas de membrana externa pelo método de SDS-PAGE e a atividade da bomba de efluxo por meio da determinação da CIM dos carbapenêmicos com e sem inibidor Carbonyl cyanide mchlorophenylhydrazone (CCCP). RESULTADOS: No período de 2005 a 2011, foram analisados, 130 isolados de Enterobacter spp, 105 (80,8%) dos isolados foram identificados como Enterobacter aerogenes, destes 44 (41,9%) apresentaram resistência ao Imipenem, Ertapenem ou Meropenem e 25 (19,2%) foram identificados como Enterobacter cloacae, destes 8 (32,0%) apresentaram resistência aos carbapenêmicos. Os isolados de E. aerogenes apresentaram CIMs que variaram de 2 a 128ug/mL para Imipenem, 4 a 64ug/mL para Meropenem e para Ertapenem 1 a >=128 ug/mL e os isolados de E. cloacae apresentaram CIMS que variaram de 8 a 64?g/mL para Imipenem, 2 a 16ug/mL para Meropenem e 8 a 64 ug/mL para Ertapenem. Todos isolados foram sensíveis a Fosfomicina, Polimixina B e Tigeciclina. A única carbapenemase identificada foi KPC, que estava presente em ambos isolados e em todos hospitais estudados. Os 39 isolados de E. aerogenes apresentaram 5 clones diferentes, sendo o clone A predominante. Os 5 isolados de E. aerogenes do Hospital de Itapecerica da Serra pertenciam ao mesmo clone. Os 8 isolados de E. cloacae apresentaram 2 clones diferentes. E a maioria dos isolados analisados apresentarou mecanismos de resistência aos carbapenêmicos como: gene blaKPC associado com o gene blaTEM e/ou blaCTX, associado com diminuição ou ausência de proteína 35-36kDa e 39 kDa. CONCLUSÃO: Em nosso estudo foi observado alta resistência aos carbapenêmicos nos isolados de E. aerogenes e E. cloacae nos 3 hospitais estudados. Os mecanismos observados que contribuíram para a resistência aos carbapenêmicos foram: a presença de KPC, ESBL e impermeabilidade da membrana para os isolados de E. aerogenes e para os isolados de E. cloacae foi observado também como mecanismo o gene da bomba de efluxo AcrART. Para os isolados de E. aerogenes, não foi observado o gene da bomba de efluxo, mas todos isolados analisados apresentaram atividade da bomba de efluxo para os carbapenêmicos, possivelmente nos indicando a presença de outra bomba de efluxo ainda não identificada / INTRODUCTION: In the last three decades, E. aerogenes and E. cloacae have been reported as important opportunistic pathogens in humans. They have been showing an increase resistance to multiple antibiotics including carbapenem. Few studies, however, evaluated the mechanisms of resistance to carbapenem in Enterobacter species in the world and in Brazil. OBJECTIVES: To evaluate the presence of genes encoding carbapenemases, genes of beta- lactamases of extended spectrum and AcrAB TolC- efflux pump and amendment of outer membrane proteins of 44 isolates of E. aerogenes and 8 isolates of E. cloacae carbapenems resistant of 03 Brazilian hospitals. METHODS: To determine the minimum inhibitory concentration (MIC), microdilution broth test was performed for the followings antibiotics: Imipenem, Meropenem, Ertapenem, Cefepima, Tigecycline and Polymyxin B and agar dilution for Fosfomycin, according to CLSI. PCR was performed to identify the genes encoding Serino Beta-lactamase Class A Ambler (blaKPC, blaIMI and blaGES) of Metallo-beta-lactamase Class B Ambler (blaIMP, blaVIM, bla GIM, blaSIM, blaSPM and blaNDM) of Oxacilinases Class D Ambler (blaOXA-48), the ESBL (blaTEM, blaSHV and blaCTX) and efflux pump AcrAB-TolC. Molecular typing was performed by PFGE, outer membrane proteins by SDS-PAGE method and the activity of the efflux pump by carbapenem´s MIC by agar diluition with and without inhibitor Carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP). RESULTS: In the period from 2005 to 2011, 130 isolates of Enterobacter spp were analyzed, 105 (80.8%) isolates were identified as Enterobacter aerogenes, of these 44 (41.9%) were resistant to Imipenem, Meropenem or Ertapenem and 25 (19.2%) were identified as Enterobacter cloacae, and 8 (32.0%) showed resistance to carbapenems. The isolated E. aerogenes presented MIC ranging from 2 to 128?g /ml for Imipenem, 4 to 64ug /ml for Meropenem and Ertapenem 1 to >= 128 mg /mL. E. cloacae isolated showed MIC ranged from 8 to 64ug / ml for Imipenem, 2 to 16ug / ml for Meropenem and 8 to 64 mg / mL to Ertapenem. All isolates were susceptible to fosfomycin, polymyxin B and tigecycline. The only carbapenemase identified was KPC, which was present in both isolated and in all hospitals studied. The 39 isolates of E. aerogenes presented five different clones, the clone A being predominant. The five isolates of E. aerogenes in the Hospital of Itapecerica da Serra belong to same clone. Eight isolates of E. cloacae showed two different clones. Most of the isolates analyzed showed resistance mechanisms to carbapenems like: blaKPC gene associated with blaTEM gene and / or blaCTX associated with a decreased or absent protein 35- 36kDa and 39 kDa. CONCLUSION: In our study, we observed high carbapenem resistance in isolates of E. aerogenes and E. cloacae in the three studied hospitals. The observed mechanisms that contributed to resistance to carbapenems were: the presence of KPC, ESBL and impermeability of the membrane in E. aerogenes and in E. cloacae isolates. E. cloacae presented also that gene of the efflux pump AcrART. Among E. aerogenes, the gene wasn´t observed, but all isolates analyzed demonstrated active efflux pump to carbapenems possibly indicating the presence of other efflux pump still unidentified

Introdução: a infecção hospitalar tem se tornado um problema de saúde pública, no Brasil e na maioria dos países do mundo, sobretudo devido ao aumento gradativo da resistência dos microrganismos aos antimicrobianos. Nos pacientes que apresentam deficiências no sistema imunológigo como os indivíduos que vivem com o vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou com a síndrome da imunodeficiência adquirida (aids) o quadro clínico dessas infecções pode se tornar extremamente grave, aumentando a morbimortalidade. Objetivo: determinar a prevalência de microorganismos gram-negativos em indivíduos com HIV/aids internados num hospital escola do interior paulista. Material e Método: trata-se de um estudo de corte transversal, aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Escola de Enfermagem de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. No período de 01 agosto de 2011 a 28 de fevereiro de 2013, foram abordados 365 indivíduos internados em duas unidades especializadas de um hospital escola público do interior paulista, sendo a população do presente estudo composta por 220 sujeitos. Os dados sociodemográficos, clínicos e hábitos de saúde foram obtidos por meio de entrevista individual e consulta aos prontuários. Coletou-se também amostras de saliva e swab nasal nas primeiras 24 horas de internação, as quais foram processadas pelo Laboratório de Microbiologia do referido hospital. Os dados foram inicialmente digitados em planilha do Microsoft Office Excel for Windows 2011, realizada dupla digitação e validação dos dados, a fim de identificar possíveis erros de digitação. Posteriormente, a planilha definitva foi transportada para o programa Statistical Package for the Social Science (SPSS), versão 17.0 for Windows, onde foi estruturado o banco de dados e realizada análise estatística. Resultados: a prevalência de microorganismos gram negativos nos indivíduos com HIV/aids foi de 15,4% independente do sítio onde foi isolado. Pseudomonas aeruginosa foi o micoorganismo mais frequentemente isolado tanto na saliva (50%), quanto no swab nasal (37,5%), seguida por Klebsiella pneumoniae (30,7%) isolada somente na saliva. Em relação aos aspectos clínicos 29,4% dos indivíduos com amostras positivas para microorganismos gram negativos tinham carga viral acima de 1000.000 cópias,ml, CD4 menor que 200 céluas/mm3 (50%), tiveram internações prévias (52,9%), estavam em uso de antimicrobiano (64,7%), não usavam antirretrovirais (52,9%) e tinham algum procedimento invasivo no momento da coleta (67,6%). Nenhum microorganismo apresentou resistência aos antimicrobianos. Conclusão: a prevalência de microorganismos gram-negativos foi maior na saliva (11,8%) que no swab nasal (3,6%), indicando que coletar amostras de mais de um sítio pode favorecer a identificação de indivíduos colonizados e ou infectados / Introduction: the hospital infection has become a public health problem in Brazil and in most countries of the world, mainly due to the gradual increase of resistance of microorganisms to antibiotics. In patients who have deficiencies in the immune system such as individuals living with human immunodeficiency virus (HIV) or acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), the clinical picture of these infections can become very serious, increasing morbidity and mortality. Objective: to determine the prevalence of gram-negative microorganisms in individuals with HIV/AIDS hospitalized at a teaching hospital in the interior of São Paulo state. Material and Method: this is a cross-sectional study, approved by the Ethics Research Committee of the University of São Paulo at Ribeirão Preto College of Nursing. In the period from August 01, 2011 to February 28, 2013, 365 individuals hospitalized in two specialized units of a public teaching hospital in the interior of São Paulo state were approached, and the study population was comprised of 220 subjects. The sociodemographic and clinical data and health habits were obtained through individual interviews and medical records. Saliva samples and nasal swabs were collected in the first 24 hours of admission, which were processed by the Microbiology Laboratory of the hospital. The instrument variables were coded and cataloged in a dictionary (codebook). The data were initially recorded in a Microsoft Office Excel spreadsheet for Windows 2011, performed a double entry and data validation in order to identify possible typing errors. Subsequently, the final worksheet was transported to the Statistical Package for Social Science (SPSS), version 17.0 for Windows, in which database was structured and statistical analysis was performed. Results: the prevalence of gram-negative microorganisms in individuals with HIV/AIDS was 15.4% regardless of where it was isolated. Pseudomonas aeruginosa is the most frequently isolated microorganisms both in saliva (50%) and in nasal swabs (37.5%), followed by Klebsiella pneumoniae (30.7%) isolated only in saliva. In regard to clinical aspects, 29.4% of individuals with positive samples for gram-negative microorganisms had viral load above 1000,000 copies/ml, CD4 less than 200 cells/mm3 (50%), had previous hospitalizations (52.9%), were using antimicrobials (64.7%), did not use antiretroviral drugs (52.9%) and had some invasive procedure at the time of collection (67.6%). No microorganism was resistant to antimicrobials. Conclusion: the prevalence of gram-negative microorganisms was higher in saliva (11.8%) than in nasal swabs (3.6%), indicating that collecting samples from more than one location may facilitate the identification of individuals colonized and/or infected

Cheung Hoi Hung. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2006. / Includes bibliographical references (leaves 151-166). / Abstracts in English and Chinese. / ACKNOWLEDGEMENT --- p.I / ABSTRACT --- p.II / ABBREVIATIONS --- p.IV / LIST OF FIGURES --- p.VII / LIST OF TABLES --- p.IX / CONTENTS --- p.X / Chapter CHAPTER ONE: --- GENERAL INTRODUCTION / Chapter 1.1 --- Non-coding RNAs in transcriptional output --- p.2 / Chapter 1.2 --- Diverse functions of non-coding RNAs --- p.5 / Chapter 1.3 --- HI9: imprinted non-coding RNA --- p.6 / Chapter 1.4 --- Objective --- p.7 / Chapter CHAPTER TWO: --- The ROLE OF H19 RNA IN MDR1 EXPRESSION OF HUMAN HEPATOCELLULAR CARCINOMA HepG2 CELLS / Chapter 2.1 --- Introduction / Chapter 2.1.1 --- H19-Igf2 locus as a model for genomic imprinting --- p.10 / Chapter 2.1.2 --- HI9 as a non-protein coding regulatory RNA --- p.12 / Chapter 2.1.3 --- Controversial roles of H19 RNA --- p.13 / Chapter 2.1.4 --- Novel role of H19 RNA in drug resistance --- p.15 / Chapter 2.2 --- Materials and methods / Chapter 2.2.1 --- Materials --- p.17 / Chapter 2.2.2 --- Methods / Chapter 2.2.2.1 --- Cell culture --- p.19 / Chapter 2.2.2.2 --- Plasmid construction and stable cell transfection --- p.19 / Chapter 2.2.2.3 --- Transient gene transfection --- p.20 / Chapter 2.2.2.4 --- RNA isolation and RT-PCR --- p.21 / Chapter 2.2.2.5 --- MTT drug sensitivity assay --- p.22 / Chapter 2.2.2.6 --- Western blot analysis --- p.22 / Chapter 2.3 --- Results / Chapter 2.3.1 --- Differential expression of H19 RNA in different human cancer cell lines --- p.24 / Chapter 2.3.2 --- R-HepG2 cells over-expressed P-glycoprotein and H19 RNA --- p.24 / Chapter 2.3.3 --- Development of H19-silenced cell lines in HepG2 cells by RNA interference --- p.26 / Chapter 2.3.4 --- Altered drug sensitivity in H19-silenced cells --- p.28 / Chapter 2.3.5 --- Expression of P-glycoprotein in H19-silenced cells --- p.31 / Chapter 2.3.6 --- Overexpression of H19 RNA in HepG2 cells --- p.34 / Chapter 2.3.7 --- Induction of H19 RNA and MDR1 in HepG2 cells --- p.34 / Chapter 2.4 --- Discussion / Chapter 2.4.1 --- H19 regulation of MDR1 associated drug resistance --- p.38 / Chapter 2.4.2 --- The puzzle of riboregulation in drug resistance --- p.40 / Chapter CHAPTER THREE: --- The ROLES OF PTB AND IMP1 IN H19-RELATED MDR1 EXPRESSION OF HUMAN HEPATOCELLULAR CARCINOMA HepG2 CELLS / Chapter 3.1 --- Introduction / Chapter 3.1.1 --- H19 RNA binding proteins --- p.43 / Chapter 3.2 --- Materials and methods / Chapter 3.2.1 --- Materials --- p.46 / Chapter 3.2.2 --- Methods / Chapter 3.2.2.1 --- Cell culture --- p.48 / Chapter 3.2.2.2 --- Plasmid construction and stable cell transfection --- p.48 / Chapter 3.2.2.3 --- RNA extraction and RT-PCR --- p.48 / Chapter 3.2.2.4 --- MTT drug sensitivity assay --- p.48 / Chapter 3.2.2.5 --- Western blot analysis --- p.48 / Chapter 3.2.2.6 --- Real-time PCR analysis of gene expression --- p.49 / Chapter 3.2.2.7 --- DOX efflux assay --- p.49 / Chapter 3.3 --- Results / Chapter 3.3.1 --- PTB knockdown increased P-glycoprotein expression --- p.51 / Chapter 3.3.2 --- IMP1 knockdown decreased MDR1 /P-glycoprotein expression --- p.54 / Chapter 3.3.3 --- Altered drug sensitivity in IMP 1 -knockdown cells --- p.60 / Chapter 3.4 --- Discussion / Chapter 3.4.1 --- Antagonistic effect of PTB and IMP1 on H19/MDR1 expressions --- p.64 / Chapter 3.4.2 --- Complexity of riboregulation --- p.65 / Chapter CHAPTER FOUR: --- IDENTIFICATION OF H19 RNA BINDING PROTEINS FROM HUMAN HEPATOCELLULAR CARCINOMA HepG2 CELLS / Chapter 4.1 --- Introduction / Chapter 4.1.1 --- Overview of RNA-protein interactions --- p.69 / Chapter 4.1.2 --- Methodology in the study of RNA-protein interactions --- p.71 / Chapter 4.1.3 --- Identification of RNA-binding proteins --- p.72 / Chapter 4.2 --- Materials and methods / Chapter 4.2.1 --- Materials --- p.75 / Chapter 4.2.2 --- Methods / Chapter 4.2.2.1 --- Screening of H19 cDNA from human placenta cDNA library --- p.78 / Chapter 4.2.2.2 --- Preparation of nuclear and cytoplasmic extracts from HepG2 cells / Chapter 4.2.2.3 --- In vitro RNA transcription and RNA labeling --- p.80 / Chapter 4.2.2.4 --- RNA electrophoretic mobility shift assay --- p.81 / Chapter 4.2.2.5 --- In vitro UV-crosslinking assay --- p.82 / Chapter 4.2.2.6 --- Preparation of RNA-affinity column and isolation of RNA binding proteins --- p.83 / Chapter 4.2.2.7 --- In-gel digestion and MALDI-TOF mass spectrometry --- p.84 / Chapter 4.3 --- Results / Chapter 4.3.1 --- Screening of H19 cDNA and preparation ofH19 RNA --- p.86 / Chapter 4.3.2 --- Electrophoretic mobility shift analysis of H19 RNA with HepG2 cytoplasmic extract --- p.87 / Chapter 4.3.3 --- UV-crosslinking of H19 RNA with HepG2 nuclear and cytoplasmic extract --- p.90 / Chapter 4.3.4 --- Isolation of H19 RNA binding proteins by RNA-affmity chromatography --- p.94 / Chapter 4.3.5 --- Confirmation of PTB and IMP1 as H19 RNA binding protein --- p.96 / Chapter 4.3.6 --- MALDI-TOF mass spectrometric analysis of isolated H19 RNA binding proteins --- p.96 / Chapter 4.4 --- Discussion / Chapter 4.4.1 --- RNA-protein interactions: an initial step for mechanistic study --- p.99 / Chapter 4.4.2 --- In vitro and in vivo methods for isolation of RNA binding proteins --- p.101 / Chapter 4.4.3 --- Novel role of hnRNP M protein in H19 RNA binding --- p.103 / Chapter CHAPTER FIVE: --- THE ROLE OF PTB IN APOPTOSIS / Chapter 5.1 --- Introduction / Chapter 5.1.1 --- Overview of polypyrimidine tract-binding protein in RNA processing and post-transcriptional gene regulation --- p.106 / Chapter 5.1.2 --- Evidences of polyrimidine-tract binding protein in the regulation of apoptosis --- p.108 / Chapter 5.2 --- Materials and methods / Chapter 5.2.1 --- Materials --- p.111 / Chapter 5.2.2 --- Methods / Chapter 5.2.2.1 --- Cell culture --- p.114 / Chapter 5.2.2.2 --- Stable cell transfection in A431 cells --- p.114 / Chapter 5.2.2.3 --- Western Blot analysis --- p.114 / Chapter 5.2.2.4 --- MTT drug sensitivity assay --- p.114 / Chapter 5.2.2.5 --- DNA fragmentation assay --- p.115 / Chapter 5.2.2.6 --- Flow cytometry analysis of apoptosis --- p.115 / Chapter 5.2.2.7 --- Caspase activity assay --- p.116 / Chapter 5.3 --- Results / Chapter 5.3.1 --- Taxol as an apoptosis inducer in HepG2 cells --- p.117 / Chapter 5.3.2 --- PTB was cleaved during Taxol-induced apoptosis --- p.118 / Chapter 5.3.3 --- PTB knockdown increased Taxol cytotoxicity and apoptosis --- p.118 / Chapter 5.3.4 --- Effect of PTB knockdown on drug sensitivity of cells --- p.121 / Chapter 5.3.5 --- Effect of PTB knockdown on other drug-induced apoptosis --- p.121 / Chapter 5.3.6 --- Effect of PTB knockdown on the basal expressions of genes in apoptosis pathway --- p.126 / Chapter 5.3.7 --- The role of caspase-9 activation in PTB-regulated apoptosis --- p.129 / Chapter 5.3.8 --- The effect of PTB knockdown on pro-caspase-9 expression and Taxol-induced apoptosis in A431 cells --- p.133 / Chapter 5.3.9 --- The role of PTB in the regulation of intrinsic apoptosis pathway --- p.136 / Chapter 5.4 --- Discussion / Chapter 5.4.1 --- The role of PTB in intrinsic apoptosis pathway --- p.138 / Chapter 5.4.2 --- PTB in regulation of pro-caspase-9 expression --- p.139 / Chapter CHAPTER SIX: --- GENERAL DISCUSSION AND CONCLUSION / Chapter 6.1 --- H19 as a potential target in anti-cancer gene therapy --- p.143 / Chapter 6.2 --- Conclusion --- p.144 / Chapter 6.3 --- Unanswered questions and future work --- p.145 / Chapter 6.4 --- A proposed model for H19 pathway --- p.148 / REFERENCES --- p.151

Introdução - A resistência bacteriana aos antimicrobianos é resultado de mecanismos adaptativos destes microrganismos e se constitui em importante problema de saúde pública em razão da limitação terapêutica que este fenômeno impõe, sobretudo no tratamento de infecções invasivas de pacientes críticos. O surgimento de patógenos resistentes no ambiente hospitalar assim como seu comportamento epidemiológico é um evento complexo de múltiplas causas. A pressão seletiva decorrente do uso destas drogas é evidente desde o início do uso clínico da penicilina. No entanto, a inter-relação entre pressão seletiva e determinantes de outra natureza como sociais, econômicos e geográficos precisam ser mais bem compreendidos. Objetivos - 1. Investigar a existência de dependência espacial na ocorrência de infecção da corrente sanguínea em UTI no estado de São Paulo causadas por bactérias multirresistentes (BMR). 2. Investigar a associação entre a ocorrência de infecção da corrente sanguínea por BMR e consumo global de antimicrobianos no estado de São Paulo, indicadores socioeconômicos e de saúde. Método - Planejamos um estudo descritivo, ecológico e de multinível envolvendo unidades de terapia intensiva do estado de São Paulo. Definimos infecção da corrente sanguínea causada por seis patógenos multirresistentes e notificada à Secretaria de Saúde do Estado de São Paulo entre os anos de 2008 a 2011 como variável dependente. As variáveis independentes foram o consumo global (comunitário e hospitalar) de antimicrobianos neste período e variáveis socioeconômicas e de qualidade e acesso aos serviços de saúde. O consumo de antimicrobianos foi obtido a partir de um banco de dados de uma empresa de prospecção de vendas destas drogas, IMS Health Brazil. As variáveis socioeconômicas e de qualidade e acesso aos serviços de saúde foram obtidas do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) e do Sistema Estadual de Análise de Dados (SEADE). Utilizamos um modelo hierárquico (multinível) incluindo as variáveis socioeconômicas distalmente, variáveis de acesso e qualidade de serviços de saúde medialmente e uso de antimicrobianos proximalmente. Dado o grande número de zeros em nossa variável de desfecho (34% a 85% a depender do patógeno avaliado), a verosimilhança foi modelada com base em uma distribuição de Poisson inflada por zeros. Os modelos foram ajustados seguindo a abordagem INLA, especificando prioris não informativas para as variáveis \"município\" e \"hospital\". As análises foram feitas no software R 3.2.1, usando os pacotes INLA 0.0-1432754561 e INLAOutputs 0.0.2. Resultados - Identificamos associação direta entre consumo global de penicilina e inversa com índice de Gini no estado de São Paulo e infecção da corrente sanguínea causada por Staphylococcus aureus resistente à oxacilina (MRSA). Para os demais agentes etiológicos estudados, não observamos o consumo global (comunitário e hospitalar) de antimicrobianos ou de variáveis socioeconômicas, de acesso e qualidade da assistência à saúde como determinantes da infecção da corrente sanguínea em unidades de terapia intensiva do estado de São Paulo. Observamos maior incidência de Enterococcus resistente à vancomicina (VRE), Pseudomonas aeruginosa resistente a carbapenens, Acinetobacter sp resistente a carbapenens e Escherichia coli resistente a cefalosporinas de terceira geração em hospitais públicos comparados a hospitais filantrópicos e menor incidência de VRE, Klebsiella pneumoniae resistente a cefalosporinas de terceira geração, Pseudomonas aeruginosa resistente a carbapenens, Acinetobacter sp resistente a carbapenens e Escherichia coli resistente a cefalosporinas de terceira geração em Santas Casas comparadas a hospitais filantrópicos. Por fim, observamos maior incidência de Klebsiella pneumoniae resistente a cefalosporinas de terceira geração em hospital privado comparado a hospital filantrópico. Conclusões - 1. Observamos que, embora não de maneira uniforme, a maioria dos patógenos estudados, nos diferentes anos, forma agrupamentos geográficos, ou seja, não estão distribuídos aleatoriamente no espaço estudado. 2. Não observamos, neste estudo, relação entre consumo de antimicrobianos na comunidade e infecção por patógenos multirresistentes em pacientes críticos tratados em unidades de terapia intensiva, exceto entre uso de penicilina e infecção por MRSA. 3. Observamos relação entre maior concentração de renda e menor incidência de infecção por MRSA. 4. Observamos associação entre baixas incidências de infecção por patógenos multirresistentes e Santas Casas, o que pode ser um marcador de desigualdade social confirmando o achado descrito acima da relação entre alto índice de Gini (maior concentração de renda) e menor incidência de MRSA ou, alternativamente, se constituir em fragilidade do diagnóstico laboratorial. 5. Há necessidade de estudos que explorem esta relação observada entre maior concentração de renda e categoria do hospital (Santa Casa) com menores incidências de infecção por patógenos multirresistentes em UTI / Introduction - Bacterial resistance to antimicrobial drugs is a result of microrganisms adaptive mechanisms and poses a great problem for public health because this phenomenon limits therapeutic options, especially for critical patients. The emergence of resistant pathogens in the hospital setting and their epidemiological behavior is a complex event with multiple causes. Selective pressure due to the use of these drugs has been evident since we started using penicillin for clinical purposes. However, interactions between selective pressure and other determinants like social, economic and geographic need to be better understood. Objetives - 1.To investigate the occurrence of spatial dependency among intensive care units (ICU) in the state of São Paulo related to the incidence of bloodstream infection caused by multidrug resistant organisms (MDRO). 2.To investigate the association of the incidence of bloodstream infection caused by MDROs, socioeconomic and health indicators. Method - We planned a descriptive, ecologic and multilevel study involving ICUs of the state of São Paulo. The incidences of bloodstream infection caused by a priori defined six MDROs reported to the State Health Department between 2008 and 2011 were defined as dependent variables. Independent variables were the global consumption (community and hospital) of antimicrobial drugs during the period of the study which was obtained from sales database of IMS Health Brazil, a sales prospecting company. Socioeconomic, quality and access to healthcare services indicators were obtained from Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) and Sistema Estadual de Análises de Dados (SEADE). We used a hierarchical model (multilevel) including socioeconomic variables distally, quality and access to healthcare services medially and antimicrobial use proximally. Because of the great number of zeros observed within the dependent variable (34% to 85% depending on the pathogen), the likelihood was modeled based on a Poisson distribution inflated with zeros. The models were adjusted following an INLA approach, determining non-informative prioris for the variables \"municipality\" and \"hospital\". Analysis were performed using R 3.2.1 software, INLA packages 0.0-1432754561 and INLAOutputs 0.0.2. Results - We identified significant positive association between global consumption of penicillin and negative association with higher Gini index both with methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA). We did not identified other significant associations between global antimicrobial use, socioeconomic and healthcare indicators and multiresistant organisms causing bloodstream infections. There were greater incidences of vancomycin resistant Enterococci (VRE), carbapenem resistant Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter sp, third generation cephalosporin resistant Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in public hospitals compared to philanthropic hospitals and there were lower incidences of VRE, carbapenem resistant Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter sp, third generation cephalosporin resistant Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in Santas Casas compared to philanthropic hospitals. Finally, we observed greater incidence of third generation cephalosporin resistant Klebsiella pneumoniae in private hospitals compared to philanthropic hospitals. Conclusions - 1. We observed that, although not consistently, for most of analized pathogens, in different years, form geographic clusters, i.e they are not randomly spatially distributed. 2. Based on our findings, the incidence of bloodstream infections caused by MDROs in ICUs are not related to global antimicrobial use, except for the relation between penicillin use and MRSA infection. 3. We observed that greater income concentration is related to lower incidence of MRSA. 4. The lower incidences of bloodstream infections caused by MDROs in Santas Casas might be a surrogate for social inequality confirming the finding of higher Gini index related to lowest MRSA infection or, alternatively being related to poor laboratory diagnostic performance. 5. Further studies exploring the observed relationship between greater income concentration and low incidence of MDRO infections in ICU are needed

O objetivo principal deste estudo foi avaliar a frequência de cepas do HBV com mutações de resistência aos análogos nucleos(t)ídeos (AN) utilizados no tratamento da hepatite B entre indivíduos cronicamente infectados, não submetidos a tratamento, procedentes de diferentes regiões do Brasil. Além disso, foram avaliadas a presença de mutações que alteram a antigenicidade do HBsAg promovendo escape dos anticorpos anti-HBs; mutações nos genes pré-core/core e a associação dos diferentes subgenótipos com as mutações encontradas e características demográficas e laboratoriais dos pacientes. Foram incluídas 779 amostras de soro de pacientes com infecção crônica pelo HBV e virgens de tratamento com AN ou interferon, as quais foram coletadas no período de 2006 a 2011. Os pacientes eram procedentes dos seguintes estados brasileiros: Pará, Maranhão, Bahia, Minas Gerais, São Paulo, Paraná e Rio Grande do Sul. O DNA do HBV foi extraído das amostras de soro utilizando o Kit QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen) e posteriormente foi realizada a amplificação das regiões S/polimerase (S/P) e pré-core/core (PCC) do genoma viral por nested PCR. O fragmento amplificado foi submetido a sequenciamento direto em sequenciador automático de DNA (ABI 3500) e as sequências obtidas foram analisadas para identificação dos genótipos e subgenótipos do HBV, pesquisa de mutações na polimerase, no HBsAg e nos genes pré-core/core. A região S/Pol foi amplificada e sequenciada com sucesso em 702 amostras, as quais foram incluídas para atender aos objetivos deste estudo. Entre as 702 amostras analisadas sete genótipos e 12 subgenótipos do HBV foram identificados. O subgenótipo A1 foi o mais frequente (63,7%, 447/702), seguido pelo HBV/D3 (14,5%, 102/702). Os demais genótipos e subgenótipos encontrados e suas frequências foram as seguintes: A2 (3,3%, 23/702), A3 (0,1%, 1/702), B1 (0,1%, 1/702), B2 (0,1%, 1/702), C2 (0,9%, 6/702), D1 (0,9%, 6/702), D2 (4,6%, 32/702), D4 (5,1%, 36/702), D com subgenótipo não identificado (0,7%, 5/702), E (0,6%, 4/702), F2a (4,6%, 32/702), F4 (0,4%, 3/702), e G (0,4%, 3/702). Cepas do HBV com mutações de resistência (rtS202G, rtM204V/I, rtA194T, rtM250I, rtA181T/S, rtT184S) associadas ou não a mutações compensatórias (rtL80I, rtV173L, rtL180M, rtV207I) foram identificadas em 1,6% (11/702) das amostras analisadas. Cepas com mutações potencialmente associadas com resistência ao adefovir (rtS85A, rtL217R, rtI233V, rtN238T, rtN238D, rtN248H, rtV214A,e rtQ215S) ou ao entecavir (rtS219A) foram identificadas em 7,7% (54/702) e 2,6% (16/702) dos pacientes, respectivamente. Cinquenta e sete (8,5%) amostras apresentaram cepas do HBV com mutações na principal região hidrofílica do HBsAg previamente relacionadas com escape dos anticorpos anti-HBs ou com prejuízo na secreção do HBsAg. Foram feitas análises estatísticas para avaliar a correlação entre os subgenótipos do HBV mais frequentes na casuística (A1, A2, D1, D2, D3, D4 e F2a) e a presença de mutações nos genes PCC. Dentre as mutações nos genes PCC associadas com redução ou falha na expressão do HBeAg, as mutações A1762T/T1764A estiveram associadas aos subgenótipos A1 e F2a; G1862T e mutações nas posições 1809-1812 ao subgenótipo A1; G1896A e/ou G1899A aos subgenótipos D2, D3 e D4. Mutações associadas com evolução da doença foram detectadas e entre essas as mutações C1766T e T1768A estiveram associadas aos subgenótipos A1 e F2a, e a mutação G1888A foi associada ao subgenótipo A1. As cepas do HBV que circulam nas diferentes regiões brasileiras estudadas apresentam grande variabilidade genética e a distribuição dos genótipos e subgenótipos reflete a formação histórica de cada região e do fluxo migratório mais recente. A frequência de cepas do HBV com mutações de resistência aos AN circulando entre pacientes virgens de tratamento com esses medicamentos nas diferentes regiões do Brasil estudadas é baixa, sendo que o perfil de mutações que confere resistência total à lamivudina e parcial ao entecavir parece ser o mais disseminado. Embora tenham sido detectados casos de infecção com cepas do HBV portando mutações com grande impacto na antigenicidade dessa proteína todas as amostras apresentaram HBsAg detectável. Pacientes com HBeAg negativo foram mais frequentes na casuística estudada, independente do subgenótipo. As mutações encontradas nos genes PCC sugerem que há perfis de mutações diferentes envolvidos na negatividade do HBeAg para cada subgenótipo / The main aim of this study was to evaluate the frequency of HBV strains harboring mutations that confer resistance to nucleos(t)ide analogues (NA) used to hepatitis B treatment among treatment-naïve patients with chronic hepatitis B from different Brazilian region. Furthermore, we evaluated the presence of mutations that alter the antigenicity of HBsAg causing anti-HBs escape; mutations in genes pre-core/core and the association of different subgenotypes with the mutations detected and demographic and laboratory characteristics of the patients. Serum samples from 779 treatment-naïve patients with chronic HBV infection were included in this study. The samples were collected between 2006 to 2011 and the patients were from the following states: Pará, Maranhão, Bahia, Minas Gerais, São Paulo, Paraná and Rio Grande do Sul. HBV DNA was extracted from serum samples using the QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen) and amplification of S/polymerase (S/Pol) and pre-core/core (PCC) regions were performed by nested PCR. The amplified PCR products were submitted to sequencing in an automatic DNA sequencer (ABI 3500). The sequences obtained were analyzed to classify HBV genotypes/subgenotypes and to analyze the presence of mutations. S/Pol region was amplified and sequenced successfully from 702 samples, which were included in this study. Among these 702 samples, seven genotypes and 12 subgenotypes have been identified. HBV subgenotype A1 was the most frequent (63.7%, 447/702), followed by HBV/D3 (14.5%; 102/ 702). The remaining genotypes and subgenotypes identified and their frequencies were as follows: A2 (3.3%, 23/702), A3 (0.1%, 1/702), B1 (0.1%, 1/702), B2 (0.1%, 1/702), C2 (0.9%, 6/702), D1 (0.9%, 6/702), D2 (4.6%, 32/702), D4 (5.1%, 36/702), D unclassified subgenotype (0.7%, 5/702), E (0.6%, 4/702), F2a (4.6%, 32/702), F4 (0.4%, 3/702), and G (0.4%, 3/702). HBV strains harboring mutations conferring NA resistance alone (rtS202G, rtM204V/I, rtA194T, rtM250I, rtA181T/S, rtT184S) or combined with compensatory mutations (rtL80I, rtV173L, rtL180M, rtV207I) were identified in 1.6% (11/702) of the patients. Isolates harboring mutations potentially associated with adefovir resistance (rtS85A, rtL217R, rtI233V, rtN238T, rtN238D, rtN248H, rtV214A, and rtQ215S) or entecavir resistance (rtS219A) were identified in 7.7% (54/702) and 2.6% (16/702) of the patients, respectively. HBV with HBsAg mutations previous related with anti-HBs escape or impaired secretion were detected in 8.5% (57/702) of the samples. Statistical analyzes were performed to assess the correlation between the more frequent HBV subgenotypes found in this study (A1, A2, D1, D2, D3, D4 and F2a ) and mutations in PCC genes. Among the mutations found in these genes that were associated with reduction or failure in HBeAg synthesis, A1762T/T1764A mutations were associated to subgenotypes A1 and F2a; G1862T and mutations at positions 1809-1812 to subgenotype A1; G1896A and/or G1899A to subgenotypes D2, D3 and D4. Other mutations associated with disease progression were found: C1766T and T1768A mutations were associated with subgenotypes A1 and F2a, and the G1888A mutation was associated with subgenotype A1. HBV strains circulating in different Brazilian regions studied showed high genetic variability and distribution of genotypes and subgenotypes reflects the population formation history of each region and the occurrence of recent events of migration. The frequency of HBV strains with NA resistance mutations circulating among treatment-naive patients in different regions of Brazil studied is low and the profile of mutations that confer total resistance to lamivudine and partial resistance to entecavir is more widespread. Although some cases of infection have been detected with HBV strains carrying mutations associated with major impact on the antigenicity of this protein, all samples had detectable HBsAg. HBeAg negative cases were more frequent in the studied population, regardless of subgenotype. Different pattern of mutations were found in PCC genes, suggesting that different mechanisms are involved in HBeAg negativity for each subgenotype

O melanoma cutâneo é um tipo de tumor formado a partir dos melanócitos, células de origem neuroectodérmica que habitam a epiderme, sendo responsáveis por sua pigmentação. Embora este tumor seja o tipo menos frequente de câncer de pele, ele está associado com altas taxas de mortalidade, principalmente devido a seu comportamento agressivo (alta capacidade metastática) e quimiorresistência aos tratamentos (quimioterapia e radioterapia). Os processos da quimiorresistência em melanoma ainda não são totalmente conhecidos. Estudos prévios de nosso grupo evidenciaram que a expressão da proteína Proibitina (PHB) encontra-se aumentada em células de melanoma frente à exposição a certos quimioterápicos, executando sua função de molécula anti-apoptótica, quando localizada no citoplasma, e/ou supressora tumoral quando no núcleo. Adicionalmente, foi visto que a repressão de PHB sensibiliza as células de melanoma, enquanto a sua superexpressão protege da morte celular induzida por cisplatina. Além disso, estudos de associação genótipo-fenótipo revelaram que o alelo menos frequente/raro do SNP rs6917 (C1703T) na região 3\'UTR do gene da PHB foi associado com o risco aumentado de desenvolvimento do melanoma. O objetivo do nosso trabalho foi avaliar o envolvimento do SNP rs6917 da 3\'UTR do gene PHB em linhagens de melanoma humano e sua resposta celular frente ao tratamento com agentes quimioterápicos indutores de estresse celular como temozolomida, cisplatina e vemurafenib. Para avaliar a contribuição do polimorfismo rs6917 no desenvolvimento de melanoma, foi desenvolvido um estudo tipo caso-controle numa população brasileira. O estudo analisou 198 pacientes com melanoma e 200 controles. Em ensaios in vitro as linhagens celulares de melanoma humano SK-Mel 05 e UACC-62 (BRAFV600E mutadas) foram transfectadas com as variantes polimórficas UTR/C e UTR/T clonadas no plasmideo pmirGLO Dual-Luciferase nos sítios de restição NheI/XhoI. A Geneticina (G418) foi utilizada para seleção estável das células, ensaios de western Blot, qRT-PCR e luminiscencia confirmaram a expresão do transgene. As diferentes doses de cisplatina, temozolomida e vemurafenib foram definidas para o tratamento das células. Para avaliar a morte celular foi realizada a técnica de citometria de fluxo após incorporação com iodeto de propidio. Após os tratamentos, foram realizados ensaios clonogênicos e de imunofluorescencia para determinar sobrevivencia celular e localização subcelular da proibitina, respectivamente. Nossos resultados revelaram que variáveis clinicas como a presença de cabelos claros (loiros ou ruivos), mais de 20 pintas, exposição solar intermitente, queimaduras solares na infância e adolescência são fatores de risco para o aparecimento de melanoma. Nos casos, os portadores do alelo T mostraram um risco aumentado em 5,6 vezes para o desenvolvimento de melanoma de crescimento vertical em comparação com os pacientes com genótipo CC. Ensaios in vitro, mostraram que células de melanoma humano superexpressando o alelo raro 3\'UTR/T após tratamento com cisplatina, temozolomida e vemurafenib apresentavam um fenotipo mais proliferativo e clonogênico com menor morte celular quando comparadas com as células 3\'UTR/C e vetor vazio. Ensaios de Western blot e bioluminescência mostraram, respectivamente, um aumento na expressão e atividade do gene da luciferase nas células 3\'UTR/T. Estes resultados mostram que o SNP rs6917 modula a expressão de PHB e que o alelo raro T representa um polimorfismo funcional promovendo a quimiorresistência em melanoma / Melanoma is a type of skin tumor formed from melanocytes, cells of neuroectodermal origin that inhabit the epidermis, being responsible for its pigmentation. Although its low incidence, melanoma is associated with high rates of mortality due to its resistance to chemotherapy. The mechanisms involved in melanoma chemoresistance are not well fully understood yet, therefore, the comprehension of this phenomenon may be useful for the development of new treatment strategies. Previous results from our laboratory showed that Prohibitin (PHB), a protein with diverse functions including regulation of cell cycle progression and apoptosis, was overexpressed in human melanoma cells lines when exposed to high-doses of the chemotherapy drug, cisplatin. PHB knockdown sensitized melanoma cells, meanwhile PHB recombinant overexpression protected melanoma cells to cisplatin-induced cell death. Studies of genotype-phenotype association revealed that the Single Nucleotide Polymorphism rs6917 at the portion 3\'UTR of the PHB gene showed an association with some risk factors for the development of melanoma. The aim of this study was to investigate if the SNP rs6917 affects PHB protein function by modulating cell proliferation and chemoresistance in human melanoma cell lines when exposed to stress inductors agents such as cisplatin, temozolomide and vemurafenib. A hospital-based case-control study was carried out in a Brazilian sample to evaluate the contribution of rs6917 polymorphism in melanoma development. The study comprised 198 melanoma patients and 200 controls. For invitro assays SK-Mel 05 and UACC-62 human melanoma cell lines (both BRAFV600E mutated) were used. The 852bp of PHB-3\'UTR harboring wild-type (3\'UTR/C) or the rare allele (3\'UTR/T) were cloned at pmirGLO Dual-Luciferase plasmid at NheI/XhoI restriction sites and stable cell lines were generated. Geneticin (G418) was used for stable selection, qRT-PCR, Western Blot and luciferase assays confirmed the transgene expression. Different doses of cisplatin, temozolomide and vemurafenib were defined to treat the cells. Cell death was evaluated using flow cytometry after propidium iodide incorporation. Cell survival was assessed by clonogenic assay after cells undergone treatment. Our results revealed that clinical variables like presence of light hair, more than 20 moles, intermintent sun expossure and sunburns at childhood are risk factors for melanoma development. We also showed that T allele carriers have a 5,6 times increased risk to develop vertical growth melanoma in comparison with the CC genotype patients. In vitro assays with transfected melanoma cells, SK-Mel 05 and UACC-62, overexpressing the rare allele 3\'UTR/T showed a more proliferative and clonogenical phenotype and less induced cell death after cisplatin, temozolomide and vemurafenib treatment when compared to cells overexpressing the wild-type allele 3\'UTR/C and empty vector. Westernblot and bioluminiscence assays showed respectively an increase in the expresion and activity of the luciferase gene of the 3\'UTR/T cells in comparison with the 3\'UTR/C and empty vector cells. All together these results showed that the SNP rs6917 modulates the expression of PHB and that the rare allele T represents a functional polymorphism by promoting a chemoresistance phenotype in melanoma

INTRODUÇÃO: A mudança nos critérios de introdução das drogas anti- retrovirais, assim como a dificuldade na manutenção da terapia anti-retroviral de alta eficácia, tem levado à descontinuação da terapêutica por longo período de tempo em alguns pacientes infectados pelo Vírus da Imunodeficiência Humana Adquirida-Tipo 1 (HIV-1). O objetivo deste estudo foi a caracterização dos fatores que levam à interrupção terapêutica e a avaliação da persistência da resistência aos anti-retrovirais após a interrupção da terapia anti-retroviral. MÉTODOS: Foram incluídos na pesquisa 150 pacientes de dois serviços de atendimento ambulatorial de atenção a pacientes infectados pelo HIV-1 da cidade de São Paulo, os quais se achavam em interrupção terapêutica havia pelo menos 6 meses. Os pacientes foram submetidos a um questionário e houve consulta aos prontuários. Foi realizada coleta de amostra de sangue para teste de genotipagem. O DNA pró-viral foi amplificado e seqüenciado para a região da protease e transcriptase reversa do vírus. As seqüências foram analisadas por meio do algoritmo de Stanford, sendo consideradas resistentes as amostras com resultado parcial ou completo de resistência a pelo menos uma droga. RESULTADOS: Dos 150 pacientes, 137 tiveram DNA do HIV-1 amplificado e seqüenciado, sendo que 38 (27,7%) apresentaram cepas resistentes. Entre os 38 pacientes com resistência, 29 (76,3%) apresentavam mutações para os análogos nucleosídeos inibidores da transcriptase reversa, 15 (39,4%) para os não análogos nucleosídeos inibidores da transcriptase reversa, e 5 (13,1%) para os inibidores da protease. A detectabilidade da carga viral antes da interrupção terapêutica foi o único fator associado com a resistência do vírus. Cento e dez (73,3%) pacientes suspenderam a medicação por orientação médica. A principal causa das interrupções terapêuticas foram os efeitos adversos para 58 (38,7%), seguida de 45 (30,0%) pacientes fora dos critérios atuais de início da terapia e/ou boas condições clínico/laboratoriais, e baixa adesão em 30 (20%). No ano anterior à pesquisa, 56 (37,3%) pacientes relataram relação sexual desprotegida e 130 (86,7%) mais que 2 parceiros. CONCLUSÕES: A freqüência de mutações de resistência revelou-se alta nesse grupo de pacientes. Tais mutações parecem ter um fitness semelhante ao das cepas selvagens, pois mesmo sem a pressão seletiva do medicamento por mais de 6 meses, mantiveram-se como cepas majoritárias. O aumento da carga viral, associado a comportamentos de risco, torna esses indivíduos uma fonte de cepas resistentes para a população, reforçando a necessidade de atenção especial para a prevenção da transmissão do HIV-1 nesse segmento de pacientes. / INTRODUCTION: Changes in guidelines for antiretroviral introduction and difficulties in maintaining Highly Active Antiretroviral Therapy have lead some physicians in Brazil to interrupt for long periods of time the treatment in some Human Immunodeficiency Virus-1 (HIV-1) infected patients. The objective of this study was to evaluate the causes that influenced long term treatment interruption and to determine the frequency of resistant strains among these patients. METHODS: A total of 150 patients, previously treated with antiretroviral therapy and under treatment interruption TI for at least 6 months, were recruited from two HIV outpatients clinics in São Paulo city. Patients responded to a questionnaire and the medical records were also analyzed. Plasma samples were obtained to HIV-1 genotypic resistance test. DNA was amplified for the protease and reverse transcriptase gene. Sequences were analyzed using Stanford algorithm; samples were considered resistant if they resulted in partial or complete resistance to at least one drug. RESULTS: One hundred thirty seven of the 150 samples had their DNA amplified, 38 (27.7%) of them harboring a resistant strain. Nucleoside reverse-transcripatse inhibitors, nonnucleoside reverse- transcripatse inhibitors and protease inhibitors associated mutations were present in 29 (76.3), 15 (39.4%) and 5 (13.1%) samples respectively. We could only associate presence of resistance to viral load detection before TI.. Of the 150 patients, 110 (73.3%) had interrupted treatment following medical advice, the remaining stopped by their own decision. The reasons for TI were: 58 (38.7%) had ARV-related side-effects, 45 (30.0%) had good laboratory parameter and/or started therapy based on criteria that were no longer used, 30 (20.0 %) had poor adhesion. During the 12 months prior to the study, there were 56 (37.3%) who had unprotected sexual relations and 130 (86.7%) had had sex with two or more partners. CONCLUSION: The frequency of drug resistance strains in this group of patients was high. These strains seem to have a good fitness because they were present after 6 months of drug interruption. The high viral load associated to non sexual protection in this group of patients may lead to increase in transmission of drug resistance strains.This highlights the need of prevention measures in this special group.

Introdução: Estimativas mostram que mais de dois terços das mulheres com câncer de mama possuem receptores hormonais positivos, e recebem terapia endócrina como tratamento, sendo tamoxifeno (TAM) o tratamento padrão (EBCTCG 2005; Davies et al., 2012). Porém, muitas pacientes se tornam resistentes com o passar do tempo. Estudos prévios mostraram que a expressão do receptor de estrogênio β (REβ) aumenta a resposta ao tratamento com TAM em células de câncer de mama, assim como a coexpressão de REα e REβ esta associada com maior ação proliferativa de TAM (Treeck et al., 2010; Sun et al., 2014). Também foi observada a existência de “cross-talk” entre os RE e a família do receptor do fator de crescimento epidérmico (HER) na resposta ao tratamento com TAM (Lindberg et al., 2011; Blows et al., 2010). Objetivo: Verificar a expressão do REβ, e suas interações com REα e receptores HER, durante o tratamento com TAM e em células resistentes ao TAM. Métodos: A expressão do REβ foi analisada em dois bancos de dados contendo informações de pacientes com câncer de mama. A expressão de RNAm dos RE, receptores HER e vias de sinalização PTEN, Akt e MAPK foram avaliadas após tratamento com TAM, em células resistentes ao TAM e em células silenciadas para os genes dos RE. Também foi avaliada a viabilidade celular após tratamento com TAM e nas células silenciadas para os genes dos RE. Resultados: Pacientes com câncer de mama apresentaram expressão reduzida do REβ, e os subtipos de câncer de mama REα positivos apresentaram baixa expressão do REβ quando comparados aos subtipos REα negativos. Células expressando níveis moderados de REβ apresentaram melhor resposta ao tratamento com TAM. Diminuição nos níveis dos RE é acompanhada por aumento nos níveis dos receptores ErbB2 e ErbB3, aumento de PTEN e diminuição de Akt e MAPK3 após tratamento com TAM. ERβ modula a ação antiproliferativa do TAM através da via de MAPK3. Células resistentes ao TAM apresentaram baixos níveis dos RE e altos níveis dos receptores EGFR, ErbB3 e ErbB4. Conclusão: Estes resultados demonstram que o REβ, e suas interações com REα e receptores HER, possuem papel importante na resposta ao tratamento com TAM. / Introduction: Approximately two-thirds of all breast cancer patients overexpress hormonal receptors, and are treated with endocrine therapy, being tamoxifen (TAM) the standard treatment. However many of initial responders to TAM as first-line experience relapse. Several mechanisms have been proposed to explain the occurrence of acquired TAM resistance. Previous studies showed that estrogen receptor β (ERβ) expression is associated with better response to tamoxifen treatment, as the co-expression of ERα and ERβ is associated with TAM antiproliferative effects. Moreover, there is growing interest about the cross-talk between ERs and ErbB family in response to endocrine therapy. Suggesting that TAM can acts through ERβ and/or ErbB family as compensatory pathways. Objective: To evaluate the expression of ERβ and the relation of ERβ with ERα and ErbB family in response to TAM treatment and in TAM resistant cells. Methods: ERβ expression was analyzed in two different databases of breast cancer patients. The mRNA levels of ER, HER receptors and PTEN, Akt and MAPK signal pathways were measured after TAM treatment, in TAM resistance cells and in cells silenced for ER genes. The cellular viability was also measured after TAM treatment, in TAM resistance cells and in cells silenced for ER genes. Results: Breast cancer patients presented reduced ERβ expression and the ERα-positive breast cancer subtypes presented lower ERβ levels when compared to ERα-negative breast cancer subtypes. Cells expressing moderates levels of ERβ presented better response to TAM treatment. Down-regulation of ERs induced by TAM treatment are accompanied with an increase in ErbB2 and ErbB3, reduced AKT and MAPK3 mRNA levels and increased PTEN levels. ERβ modulates TAM anti-proliferative effects through MAPK3 pathway. TAM– resistant cells expressed decreased ER mRNA levels and increased EGFR, ErbB3 and ErbB4 levels. Demonstrating that the cross-talk between ERs and HER family influence the response to TAM treatment. Conclusion: These results provide additional data indicating the importance of ERβ, and the relation with ERα and HER receptors, to predict TAM responsiveness.

FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / Baixas concentraÃÃes sÃricas de drogas antituberculose podem ser causa da resistÃncia de Mycobacterium tuberculosis Ãs drogas utilizadas para tratamento, a qual à mais freqÃente em pacientes em tratamento irregular, mas pode ser verificada em pacientes em tratamento diretamente observado. Os objetivos desse estudo foram avaliar a permeabilidade intestinal e a biodisponibilidade de rifampicina, isoniazida e pirazinamida em pacientes com tuberculose pulmonar ativa. Realizou-se estudo transversal controlado. No perÃodo entre julho de 2004 e dezembro de 2005 foram selecionados 56 pacientes consecutivos com tuberculose pulmonar ativa, atendidos no Centro de SaÃde Carlos Ribeiro em Fortaleza, Cearà e 29 controles sadios recrutados entre profissionais de saÃde, seus familiares e vizinhos para avaliaÃÃo da permeabilidade intestinal. Foram coletadas informaÃÃes sociodemogrÃficas e exames bioquÃmicos e realizou-se o teste de lactulose/manitol de todos. Os primeiros 30 casos de tuberculose e os 29 controles dessa amostra foram selecionados para a avaliaÃÃo da biodisponibilidade sÃrica de rifampicina, isoniazida e pirazinamida em amostras coletadas duas horas e seis horas depois da ingestÃo. A mÃdia de idade dos casos foi de 39,2  15 anos e a dos controles 34  11,0 (p=0,61). Eram do sexo masculino 71 % dos casos e 66% dos controles (p=0,57). O peso mÃdio dos casos (52,4  6,3 kg) foi significativamente menor do que o dos controles (71,1  14,0 kg) (p=0,014). Verificou-se menor excreÃÃo de lactulose entre os casos (mediana de 0,1721%; variando de 0,0-5.0139%) do que entre os controles (0,4301%; variando de 0,0-2,064) (p=0,049%); a excreÃÃo de manitol entre os casos foi 17,9910% (1,9567-71,5446%) e entre controles foi de 24,3899% (1,3883-63,0539%) (p=0,147); a relaÃÃo lactulose/manitol foi de 0,0095 (0,0-0,0759%) entre os casos e 0,0136 (0,0-0,0136%) entre os controles (p=0,018). A concentraÃÃo sÃrica mÃxima de rifampicina teve mÃdia de 1,46  0,72 Âg/ml nos casos e de 6,69  3,07 Âg/ml nos controles (p<0,001); a de isoniazida foi 2,62  1,53 Âg/ml entre os casos e 1,98  0,76 Âg/ml entre os controles (p=0,057) e a de pirazinamda foi de 44,10  10,40 Âg/ml entre os casos e 36,32  12,02 Âg/ml entre os controles (p=0,007). Quatro (13,3%) casos nÃo chegaram a alcanÃar os limites mÃnimos das concentraÃÃes normais esperadas de nenhuma das drogas de primeira linha para o tratamento da tuberculose; 21 (70,0%) alcanÃaram essa concentraÃÃo sÃrica apenas para uma droga (pirazinamida) e cinco (16,7%) apenas para duas drogas (pirazinamida e isoniazida). Nenhum caso alcanÃou as concentraÃÃes sÃricas normais esperadas para as trÃs drogas, simultaneamente. Em conclusÃo, observou-se reduÃÃo da absorÃÃo paracelular entre os pacientes com tuberculose bem como mà absorÃÃo intestinal de rifampicina e isoniazida. Estes resultados sugerem a necessidade da avaliaÃÃo de medidas para reduzir a mà absorÃÃo intestinal de drogas e evitar o retardo ou a impossibilidade de cura da doenÃa, bem como o risco de multirresistÃncia / Reduced antituberculosis drugs concentrations are associated with Mycobacterium tuberculosis resistance, mostly in patients in irregular but also in directly observed treatment. This study aims to evaluate intestinal permeability and bioavailability of rifampin (R), isoniazid (I) and pyrazinamide (P) in patients with active pulmonary tuberculosis. A controlled cross sectional study evaluated intestinal permeability from 56 consecutive active pulmonary tuberculosis (TB) patients who attended Carlos Ribeiro Health Unit in Fortaleza, CearÃ, northeast of Brazil, from July 2004 to December 2005. The Thirty who first came were selected to have R, I and P serum concentration dosed. Twenty nine healthy controls were select among health professionals, their relatives and neighboring. To access intestinal permeability lactulose/manitol (L/M) test was performed by HPLC in urine samples collected during five hours. To access bioavailability two blood samples were collect at 2 and 6 hours after drug ingestion. Demographic information was recorded from all volunteers. Mean age was 39.2  15 years in cases and 34  11.0 in controls (p=0.61); 71.4% cases and 65.5% controls were men (p=0.57). Lactulose urinary excretion was significantly lower in TB patients (median 0.1721%; range 0.0-5.0139) than in controls (median 0.4301%; range 0.2125-2.064) (p=0.0194); median manitol excretion in cases was 17.9910% (1.9567-71.5446) and in controls, 24.39894% (range 1.3883-63.0539) (p=0.147) and the lactulose/manitol ratio was of 0.0095 (range 0.0-0.0759) in cases and 0.0153 (0.0-0.0136) in controls (p=0.0698). Maximum means seric rifampin concentration in cases was1.46  0.72 Âg/ml and in controls, 3.07  6.69Âg/ml (p<0.001); maximum means seric isoniazid concentration was 2.62  1.53 Âg/ml in cases and 0.76  1.98 Âg/ml in controls (p=0.057); maximum means seric pirazinamide concentratio was 44.10  10.40 Âg/ml in cases and 12.02  36.32 Âg/ml in controls (p=0.007). Four cases (13.3%) had all tested drugs serum concentrations under expected normal; 21/30 (70.0%) had expected normal concentrations only for one drug (pyrazinamide) and 5/30 (16.7%) for 2 drugs only (pirazinamide and isoniazid). None of the cases had expected concentration levels for all 3 drugs, simultaneously. In conclusion, there was lesion in the functional intestinal barrier and malabsorption for rifampin and isoniazid in active pulmonary TB patients suggesting it is necessary a deeper evaluation of measures to reduce malabsorption, since only these drugs are used during last the four months of treatment