Les thérapies génique et cellulaire sont à l'avant-garde de la recherche sur le traitement des dystrophies musculaires. La thérapie par transfert de myoblastes a été proposée comme traitement potentiel de ces dystrophies et les transplantations de myoblastes ont donné des résultats significatifs. Dans cette optique, une thérapie cellulaire autologue est à favoriser et cette approche implique une modification génétique ex vivo. Cette méthode nécessite une efficacité exemplaire du transfert, de l'implantation et de l'expression de l'ADN recombinant. Les myoblastes du muscle squelettique humain sont cependant plus ou moins réfractaires à certains vecteurs viraux. Nous avons donc procédé à l'étude de l'efficacité de vecteurs dérivés d'un rétrovirus, d'un lentivirus, d'un adénovirus et de virus adéno-associés, dans la transduction d'un transgène dans les myoblastes humains. Nous établissons que les vecteurs rétroviraux et lentiviraux démontrent un potentiel remarquable dans une perspective de thérapie génique ex vivo, dédiée à la musculature squelettique humaine. / Gene and cell therapies are at the forefront of research for the treatment of muscular dystrophies. Myoblast transfer therapy was proposed as a potential treatment for these diseases and myoblast transplantation experiments yielded significant results. In this approach, an autologous cell therapy would be preferable and this implies ex vivo gene therapy. However, gene delivery and expression must be optimal in this context and human myoblast is refractory to some viral vectors. For that reason, we have studied the transduction capacities, on such cells, of viral vectors derived from retrovirus, lentivirus, adenovirus and adeno-associated virus. We concluded that the retroviral and lentiviral vectors are the best suited for ex vivo gene therapy of human skeletal muscle cells dedicated to cell therapy.

Titre de l'écran-titre (visionné le 29 janvier 2024) / La dystrophie endothéliale cornéenne de Fuchs (FECD) est une pathologie qui touche la couche postérieure de la cornée, l'endothélium cornéen. Ce dernier fait office de barrière physique entre l'humeur aqueuse et le reste de la cornée. De ce fait, lorsqu'il est défectueux, une accumulation de l'humeur aqueuse dans le stroma entraîne l'apparition d'un œdème stromal et de bulles épithéliales. Il s'en suit une opacification cornéenne menant à une perte de vision irréversible. Cliniquement, la pathologie est associée à l'épaississement de la membrane de Descemet (DM) dû à un dépôt accru de matrice extracellulaire (MEC), entraînant la formation d'excroissances, appelées guttae. Puis, une perte de densité des cellules endothéliales cornéennes (CECs) se produit contribuant aux difficultés de maintenir la déturgescence du stroma. En Amérique du Nord, la FECD est la principale cause de transplantation de cornées qui représente son seul traitement. De nouveaux traitements sont à l'étude mais nécessitent une bonne compréhension de la maladie et des dérégulations de l'endothélium cornéen. La FECD étant une pathologie multifactorielle, son étiologie reste difficile à déterminer. La recherche a mené à la proposition de différentes hypothèses d'explications au développement de la maladie. Parmi elles, la transition endothélio-mésenchymateuse ou épithélio-mésenchymateuse (TEM). Ce processus cellulaire consiste au passage d'un phénotype endothélial ou épithélial vers un phénotype mésenchymateux. Malgré quelques mises en évidence de la TEM dans la FECD, des signes clés de cette transition manquent dans la maladie, tels que le passage à une morphologie fibroblastique et un changement de cadhérines. C'est pourquoi notre laboratoire a décidé de clarifier la présence de la TEM dans la FECD. L'objectif de ce projet est de comprendre comment la TEM est activée dans la FECD et son impact sur les CECs. De ce fait, notre laboratoire a étudié la TEM à un niveau intracellulaire et extracellulaire en utilisant aussi bien des CECs primaires que des modèles tissulaires. Notre attention s'est d'abord portée sur l'étude des protéines impliquées dans les voies TGF-β/Smad et Wnt/β-caténine (connues pour activer la TEM) dans les CECs *ex vivo* et *in vitro*. Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressées au dépôt anormal de MEC, un des signes d'une TEM. En effet, nous avons proposé que les protéines matricielles anormalement déposées seraient impliquées dans la perte cellulaire endothéliale dans la FECD. Nous avons donc étudié l'expression de protéines matricielles dans les stades précoces et avancés de la FECD et leur influence sur l'adhésion et la migration des CECs en culture. Pour répondre au premier objectif, des données transcriptomiques et l'expression des protéines liées à la TEM ont été étudiées *ex vivo*. Les protéines d'intérêt ont également été étudiées *in vitro* avec ou sans irradiation chronique d'UVA. Nos travaux en *ex vivo* FECD ont révélé l'absence de l'activité des voies Wnt/β-caténine et TGF-β/Smad. *In vitro*, ces deux voies de signalisations étaient actives et une augmentation de TGF-β2 a également été observée. Néanmoins, l'exposition aux UVA n'a pas modifié le profil d'expression des protéines. Pour le deuxième objectif, les données transcriptomiques du matrisome de CECs *ex vivo* et *in vitro* ont été analysées. Nous avons ensuite étudié la morphométrie des guttae en *ex vivo* et l'expression de nos protéines d'intérêt en *ex vivo* et sur les endothélia cornéens reconstruits sains et pathologiques. Des tests d'adhésion et de migration ont ensuite été réalisés. Les gènes *SPP1* (Ostéopontine), *FN1* (Fibronectine) et *TNC* (Ténascine-C) étaient régulés à la hausse en *ex vivo* et SPP1 était régulé à la hausse aussi bien *ex vivo* qu'*in vitro*. La fibronectine (FN), ténascine-C (TN-C), ostéopontine (OPN) et le collagène de type XIV (COL XIV) étaient exprimés dans les DM FECD mais seules la TN-C et la FN se retrouvaient dans les endothélia reconstruits FECD. La FN et la TN-C n'ont pas modifié l'adhésion des CECs mais l'OPN l'a diminuée. La FN et la combinaison de FN et TN-C ont augmenté significativement la migration des CECs. Les travaux de cette thèse permettent d'apporter plus de connaissances sur l'activation de la TEM dans la FECD et mettent en évidence une chronologie du dépôt de MEC anormale dans la pathologie ainsi que la façon dont les CECs y réagissent. Une meilleure compréhension du développement de la FECD pourrait apporter des clés pour la conception de nouveaux traitements. / Fuchs corneal endothelial dystrophy (FECD) is a pathology that affects the posterior layer of the cornea, the corneal endothelium. The endothelium acts as a physical barrier between the aqueous humor and the rest of the cornea, so when it is defective, an accumulation of aqueous humor in the stroma leads to stromal edema and epithelial bullae. This leads to corneal opacification and irreversible vision loss. Clinically, the pathology is associated with thickening of Descemet's membrane (DM) due to an increase of extracellular matrix (ECM), leading to the formation of outgrowths known as guttae. This is followed by a loss of corneal endothelial cell (CEC) density, making it difficult to maintain stromal deturgescence. In North America, FECD is the leading cause of corneal transplantation, which is its only treatment. New treatments are under study but require a good understanding of the disease and corneal endothelium dysregulation. As FECD is a multifactorial pathology, its etiology remains difficult to determine. Research has led to the proposal of various hypothesis to explain the development of the disease. One of these is endothelial to mesenchymal or epithelial to mesenchymal transition (EMT). This cellular process is characterized by the transition from an endothelial or epithelial phenotype to a mesenchymal one. Despite some evidence of EMT in FECD, key signs of this transition are missing in the disease, such as the transition to a fibroblastic morphology or the cadherins switch. Therefore, our laboratory decided to clarify the presence of EMT in FECD. The aim of this project is to understand how EMT is activated in FECD and its impact on CECs. Accordingly, our laboratory has studied EMT at both intracellular and extracellular levels, using both primary CECs and tissue models. Our first focus was on the study of proteins involved in the TGF-β/Smad and Wnt/β-catenin pathways (known to activate EMT) in *ex vivo* and *in vitro* CECs. In a second step, we focused on abnormal ECM deposition, one of the key signs of EMT. Indeed, we proposed that abnormally deposited matrix proteins would be involved in endothelial cell loss in FECD. We therefore studied the expression of matrix proteins in the early and late stages of FECD and their influence on the adhesion and migration of cultured CECs. To address the first objective, transcriptomic data and the expression of EMT-related proteins were studied *ex vivo*. Proteins of interest were also studied *in vitro* with or without chronic UVA irradiation. Our *ex vivo* FECD work revealed the absence of Wnt/β-catenin and TGF-β/Smad pathway activity. *In vitro*, both signaling pathways were active, and an increase in TGF-β2 was also observed. Nevertheless, UVA exposure did not alter the protein expression profile. For the second objective, transcriptomic data from the *ex vivo* and *in vitro* matrisome were analyzed. We then studied guttae morphometry in *ex vivo* specimens and the expression of our proteins of interest in *ex vivo* specimens and on healthy and pathological tissue engineered corneal endothelia. Adhesion and migration assays were then performed. *SPP1* (Osteopontin), *FN1* (Fibronectin) and *TNC* (Tenascin-C) genes were up-regulated *ex vivo*, and *SPP1* was up-regulated both *ex vivo* and *in vitro*. Fibronectin (FN), tenascin-C (TN-C), osteopontin (OPN) and collagen type XIV (COL XIV) were expressed in FECD DMs, but only TN-C and FN were found in reconstructed FECD endothelia. FN and TN-C had no impact on CEC adhesion, but OPN did. FN and the combination of FN and TN-C significantly increased CEC migration. The studies of this thesis provide further insight into the activation of EMT in FECD, highlight the chronological abnormal ECM deposition in the pathology and how CECs respond to it. A better understanding of the FECD development could bring keys to design new treatments.

Des difficultés de compréhension interpersonnelles sont régulièrement rapportées par les proches et les patients atteints de Dystrophie Myotonique de type I (DM1) ou de Dystrophie Facio-Scapulo-Humérale (FSHD). Nous nous sommes intéressés à différents facteurs qui peuvent éclairer la présence d’un contresens relationnel au sein des couples (le patient avec son conjoint). Les facteurs étudiés sont : les troubles cognitifs, l’atteinte des mimiques faciales et le style d’attachement de chacun des partenaires. La méthode utilisée est basée en partie sur l’observation de l’interaction (communication verbale et non verbale) au sein des couples lors la réalisation d’une tâche de résolution de problème. Un test de reconnaissance des émotions faciales avec des visages atteints et des visages contrôles a également été construit et proposé à 57 sujets naïfs. Les résultats observés permettent de confirmer que l’atteinte du visage et de la cognition sociale (théorie de l’esprit) ainsi que le style d’attachement des membres du couple jouent un rôle dans les difficultés à se comprendre entre partenaires de l’interaction. Il est important de sensibiliser chacun des partenaires au rôle de la communication non verbale (CNV) dans leur quotidien. La CNV transmet non seulement des informations sur l’état interne (notamment les émotions) de l’autre, mais également sur ses besoins d’attention, de soutien, de support émotionnel. / Interpersonal communication difficulties are regularly reported by individuals suffering from Myotonic Dystrophy type I (DMI) and Facioscapulohumeral muscular Dystrophy (FSHD), and their families. Our study focuses specifically on communication between patients and their spouses. In order to investigate the nature of communication difficulties, cognitive impairment, impaired facial expression and the attachment styles of subjects were examined. Our investigation procedure involved detailed observation of couples’ communication processes (verbal and non-verbal communication) while completing a problem-solving task. Furthermore, we construct a test of facial emotion recognition composed of images from the DM1 and control groups, which was administered to 57 naive subjects. Results enables us to confirm that impaired facial expression, social cognition difficulties (theory of mind) and attachment style play a major role, in the communication and comprehension difficulties reported by patients and their families. A phenomenon of relational misinterpretation seems to occur between patients and their partners. It is therefore important to raise couples’ awareness of the role of non-verbal communication in everyday life. Non-verbal communication not only provides information about an individual’s internal state (such as emotions), but also about his or her needs for attention and emotional support.

Les dystrophies musculaires des ceintures (ou limb-girdle muscular dystrophy, LGMD) sont un groupe hétérogène de dystrophies musculaires chez l’adulte et sont définies par une atrophie et une faiblesse progressive qui surviennent dans les muscles proximaux. Chez une cohorte canadienne-française, nous avons précédemment décrit une nouvelle forme récessive, désignée LGMD2L et marquée par une atrophie asymétrique du quadriceps, que nous avions cartographiée au chromosome 11p12-p13 grâce à des analyses de liaison. L’objectif de ce projet de thèse était de raffiner l’intervalle candidat, puis d’identifier et de caractériser le gène muté responsable de la LGMD2L. Grâce à une cartographie par homozygotie de polymorphismes de nucléotide simple (SNPs) réalisée sur une grande famille consanguine, nous avons redéfini l’intervalle candidat à une région du chromosome 11p14.3-p15.1. Par séquençage de l’ADN génomique et complémentaire au gène Anoctamine 5 (ANO5) inclus dans cet intervalle, nous avons identifié trois mutations, chez autant de familles: une substitution créant un site d’épissage aberrant, une insertion d’un nucléotide et une mutation faux-sens. Les deux premières mutations étaient associées à une hausse de la dégradation de l’ARN messager médiée par une troncation prématurée. Nous avons également identifié des mutations ANO5 chez une seconde dystrophie musculaire de type distal cartographiant au même locus que la LGMD2L, nommée MMD3, et dont la manifestation initiale était une faiblesse des mollets, mais qui pouvait progresser vers une atrophie des quadriceps. Une réparation membranaire défective avait été observée chez les fibroblastes de deux patients MMD3, suggérant un rôle pour ANO5 dans ce mécanisme. La localisation et la fonction d’ANO5 dans le muscle sont inconnues, mais cette protéine fait partie d’une famille conservée de protéines à huit domaines transmembranaires, les Anoctamines, dont certains membres sont des transporteurs chloriques activés par le calcium. Les résultats de nos études d’immunofluorescence suggèrent qu’ANO5 se localise peu au sarcolemme, mais plutôt à une structure intracellulaire qui suit la ligne Z des myofibrilles. De façon étonnante, cette localisation était préservée chez un patient LGMD2L porteur homozygote de la mutation d’épissage, en dépit du fait que cette dernière était considérée comme une mutation nulle. Néanmoins, nous avons identifié un épissage alternatif de l’exon 15 qui se produisait sur une proportion des transcrits porteurs de la mutation d’épissage, ce qui rétablirait le cadre de lecture, soulignant la complexité de la régulation de l’épissage d’ANO5 et laissant croire que la LGMD2L pourrait être causée par une perte de fonction partielle, et non complète, d’ANO5. Des études subséquentes par des groupes européens ont montré que les anoctaminopathies 5 sont une cause fréquente de dystrophies musculaires des ceintures chez l’adulte. Notre découverte de mutations au gène Anoctamine 5 a mis en évidence une nouvelle classe de protéines importantes pour la biologie du muscle et a ouvert la voie à de nouvelles pistes pour étudier les mécanismes par lesquels un défaut de réparation membranaire progresse en une dystrophie musculaire. / Limb-girdle muscular dystrophies (LGMD) encompass a broad spectrum of muscular dystrophies in which the initial weakness arises in proximal muscles. We previously described in French-Canadian (FC) families a new form of LGMD characterized by asymmetrical quadriceps femoris atrophy, named LGMD2L, which we mapped to chromosome 11p12-p13 using linkage analyses. The objectives of this thesis project were to refine the candidate interval, identify and characterize the LGMD2L gene. Using single nucleotide polymorphisms (SNPs) homozygosity mapping in a large consanguineous family, we narrowed down the LGMD2L candidate interval to a region on chromosome 11p14.3-p15.1, and identified three mutations in the Anoctamin 5 (ANO5) gene located in the interval. These mutations consisted of a missense, a one-bp duplication and a splice site mutation. We demonstrated that the latter two triggered the nonsense-mediated RNA decay pathway. In addition, we identified ANO5 mutations in cases affected by a non-dysferlin Miyoshi muscular dystrophy mapped also to chromosome 11, termed MMD3. In two MMD3 families of European descent, patients presented with calf weakness as the initial symptoms, sometimes evolving to quadriceps atrophy. Fibroblasts from one MMD3 family were shown to be defective for membrane repair. ANO5 localization and function in muscle are unknown, but it is a member of the conserved Anoctamin family of proteins with eight transmembrane domains, of which some function as calcium-activated chloride channel. Our immunofluorescence studies on longitudinal muscle sections suggest that ANO5 is not importantly localized to the sarcolemma, but rather to a structure following the Z-line. To our surprise, this localization was preserved for a LGMD2L patient homozygous for the splice site mutation, previously considered as a null mutation. By studying the splicing isoforms in this patient, we observed that skipping of exon 15 occurs on a proportion of transcripts, in addition to the aberrant splicing caused by the mutation. This alternative splicing event would recover the reading frame, thus underlining the complexity of ANO5 splicing and suggesting that LGMD2L could be the consequence of a partial, rather than complete, loss-of-function. Subsequent studies by other groups have shown that anoctaminopathies 5 are a common cause of adult-onset LGMD. Our discovery of ANO5 mutations has shed light on a new class of proteins important for the muscle biology and opened new research avenues to study how defective membrane repair progresses into muscular dystrophies.

La dystrophie facio-scapulo-humérale (FSHD) est une maladie autosomique dominante fréquente et mystérieuse sur le plan clinique, moléculaire, et physiopathologique. Elle se caractérise par une atteinte sélective facio-scapulo-humérale débutant à l'adolescence et d'évolution descendante mais la variabilité clinique est extrême et les défauts de pénétrance existent. La FSHD1 définit le phénotype FSHD associé à la contraction du macrosatellite répété D4Z4 dans la région subtélomérique 4q35, à moins de 11 unités répétées. Plusieurs variants génomiques associés en cis et constituant des haplotypes permissifs sont requis pour le développement de la FSHD. La FSHD2 est un variant épigénétique de la FSHD1 qui n'est pas associé à la contraction de D4Z4. La physiopathologie de la FSHD fait intervenir des mécanismes épigénétiques complexes encore mal connus. Aucun gène majeur n'a fait preuve de sa responsabilité, même si le rétrogène DUX4 contenu dans D4Z4 semble contribuer à la pathogenèse. La méthode diagnostique universelle, le Southern blot sur ADN génomique, est insatisfaisante car elle pose des difficultés techniques et de nombreux problèmes d'interprétation, notamment dans les cas complexes des variants non canoniques tels les mosaïques somatiques, les translocations de D4Z4, les délétions proximales. Dans ce travail, nous avons mis au point une nouvelle approche diagnostique basée sur la technique du peignage moléculaire de l'ADN génomique. Cette technologie a pour principe d'étirer uniformément et de fixer les molécules d'ADN sur une lame, et d'hybrider des sondes fluorescentes dont la combinaison détermine un code-barre génomique spécifique de la région d'intérêt. / Facio-Scapulo-Humeral Dystrophy (FSHD) is one of the most common muscular dystrophy with selective involvement of facial and scapular fixator muscles starting in teenage and a descending progression. Inheritance is autosomal dominant, with frequent de novo cases, extreme clinical variability and incomplete penetrance. FSHD1 is defined by the FSHD phenotype associated with the contraction of the polymorphic macrosatellite repeat D4Z4 on chromosome 4q35. In FSHD patients, several genomic factors have to co-segregate including a reduced number of D4Z4 copies fewer than 11 units and genomic variations in cis all together defining permissive haplotypes. FSHD2 is an epigenetic variant, which is not associated with contraction of D4Z4. Pathogenesis of FSHD is complex and involves epigenetic mechanisms still not well known. Inappropriate expression of the retrogene DUX4 has been recently implicated in the pathogenesis of FSHD. The most common diagnostic method, based on Southern blotting of genomic DNA is unsatisfactory because of the numerous problems in interpreting the results, particularly in complex cases such as somatic mosaics, translocated D4Z4 arrays, and proximal deletions. We developed a novel diagnostic approach based on molecular combing of genomic DNA. In this technology, hundreds of single molecules of DNA are uniformly combed and fixed on a slide and subsequent hybridized with a set of fluorescent probes. The combination of specific probes determines a genomic morse code that is specific of the genomic region of interest. Molecular combing allows visualizing large regions of genomic DNA with a high resolution (1 kb) at the scale of a single molecule.

Durant ma thèse, mes recherches se sont principalement portées sur l'identification des propriétés modulaires de la dysferline, une protéine impliquée dans des dystrophies musculaires, afin d'identifier les approches thérapeutiques les plus prometteuses. Mon travail s’est donc orienté selon deux axes de recherche, une approche par « mini-protéines » et une approche par «saut d’exon », toutes deux basées sur des preuves de principe obtenues chez des patients. Nous avons tout d'abord testé une approche de saut d'exon pour l'exon 32 de DYSF. Nous avons pu établir la fonctionnalité de cette protéine tronquée en permettant son expression dans des cellules de patients déficients en dysferline. Ceci a suggéré que le domaine C2D (encodé par les exons 31 à 34) n'est pas essentiel pour la dysferline puisque l'absence d'une partie de celui-ci n'empêche pas sa fonctionnalité. Nous avons dans le même temps analysé les caractéristiques d'autres domaines de la dysferline, en créant des miniprotéines contenant différentes combinaisons de domaines. Nous avons montré que la partie C-terminale de la dysferline (composée des deux derniers domaines C2 et du passage transmembranaire) était essentielle et suffisante pour la fonctionnalité de la dysferline dans le muscle. L'ensemble de ces résultats démontre que certains domaines de la dysferline sont dispensables, ouvrant ainsi la voie à l'étude d'approches de thérapie génique basé sur les minigènes ou le saut d'exon pour les dysferlinopathies. / During my thesis, my researches have mainly concerned the modular properties of dysferlin, a protein involved in muscular dystrophies, in order to identify the most promising therapeutic approaches.My work has been oriented within two research axes, a mini-proteins approach and an exon-skipping approach, both based on proofs of concept obtained in patients. We first tested an exon-skipping approach for the exon 32 of DYSF, based on the identification of a protein lacking the encoded part of this exon, in an asymptomatic person. We have established the functionality of this truncated protein by allowing its expression in dysferlin-deficient patients' cells. This suggests that the C2D domain (encoded by exons 31 to 34) is not essential for dysferlin since the absence of a part of it don't block its functionality.In the same time we analyzed the characteristics of the others domains of dysferlin, by creating miniproteins containing different combinations of domains. By studying the abilities of this constructs, we have showed that the C-ter part of dysferlin (composed of the last C2 domains and the transmembrane domain) was essential and sufficient for the functionality of dysferlin in muscle. All these results demonstrate that several domains of dysferlin are dispensable, paving the way for studying gene therapy approaches, based on minigenes or exon-skipping for dysferlinopathies.

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est la maladie neuromusculaire la plus fréquente de l'enfant. Son évolution progressive inexorable conduit habituellement au décès dans la troisième décade. La DMD constitue cependant une affection hétérogène pour la sévérité de l'atteinte musculaire, cognitive et cardiaque, et cette hétérogénéité n'est pas totalement expliquée par la localisation des mutations dans le gène de la dystrophine. Ma thèse comporte trois volets: (1) une analyse clinique multivariée d'une cohorte de DMD suivie à long terme qui nous a permis de définir 4 phénotypes distincts de DMD; (2) une étude de corrélation clinico-pathologique qui a identifié la fibrose endomysiale précoce comme seul facteur histologique prédictif de sévérité motrice; (3) la mise au point d'un modèle murin original de myofibrose dystrophique chez la souris mdx déficiente en dystrophine. 1- Étude multiparamétrique clinique. La saisie par la même équipe des données fonctionnelles musculaires, cardiaques, respiratoires et cognitives de 75 patients atteints de DMD (tous génotypés et présentant une absence complète de dystrophine musculaire), suivis pendant &gt;10 ans, a permis d'établir un modèle multiparamétrique satisfaisant à deux dimensions principales, cognitive et motrice, et de définir 4 clusters phénotypiques : (i) DMD cognitive et motrice congénitale (20%), (ii) DMD classique (28%), (iii) DMD motrice pure modérée (22%), (iv) DMD motrice pure sévère (30%). La corrélation génotypephénotype était restreinte à la seule atteinte cognitive. Des indicateurs pronostics précoce ont été identifiés et validés sur une 2ème série de 34 patients. 2- Étude histopathologique. Les variations de sévérité de l'atteinte musculaire n'étant pas expliquées par la génétique moléculaire, nous avons cherché à corréler les paramètres moteurs et la biopsie musculaire prélevée dans le quadriceps à un stade précoce (3-7 ans) chez 25 patients (analyse stéréologique des images numérisées pour les paramètres élémentaires: nécrose/régénération, fibres hypercontractées, adipocytes, fibrose endomysiale et périmysiale). Seule la fibrose endomysiale était associée à un pronostic moteur défavorable (p&lt;0.002) attesté par l'âge de perte de marche, la force du quadriceps et le testing musculaire global à 10 ans. Cette fibrose endomysiale dissociait les capillaires des myofibres (écartement x 2.5), et s'accompagnait d'une augmentation sélective des macrophages CD206+ activés dans la voie alterne (M2) et d'une diminution relative des cellules satellites musculaires (p&lt;0.0001). Ces données suggèrent un rôle clé de la fibrose endomysiale (et des macrophages M2 profibrosant) et dans la sévérité clinique de la DMD. 3- Étude expérimentale. Ces éléments rendent nécessaire la mise au point d'un modèle expérimental de myofibrose dystrophique, la souris mdx présentant peu de fibrose et un déficit moteur modéré et tardif. Nous avons mis au point une nouvelle méthode de lésion musculaire focale profibrosante du tibialis antérieur chez la souris mdx (piqûres multiples quotidiennes pendant 15 jours). Une fibrose endomysiale attestée par un fort immunomarquage du collagène I (à 8, 30, 60 et 90 jours) a été quantifiée et corrélée à la perte de la force musculaire dans la patte lésée (comparée au muscle contralatéral). Ces résultats légitiment et préparent les futures stratégies thérapeutiques "anti-fibrosantes" dans la DMD</abstract> / The clinical heterogeneity of Duchenne muscular dystrophy (DMD) may prove a major obstacle to the interpretation of therapeutic trials but has not been subjected to systematic analysis. In a first part, we present a statistical analysis on two series of steroid-free patients with complete lack of dystrophin determined by Western blot. Series 1 consisting of 75 patients longitudinally evaluated for motor, respiratory, cardiac and cognitive functions by the same team (median follow-up: 10.5yrs) was subjected to exploratory data analysis whose main conclusion were confirmed by exploration of data obtained from 34 routinely evaluated patients (series 2). Main outcome measures were age at loss of ambulation and of onset of contractures, manual muscle testing (MMT), cardiac and respiratory functional tests, general intelligence assessment (IQ), educational level. Multivariate exploratory analysis of series 1 classified 70/75 patients into 4 clusters with distinctive intellectual and motor outcomes: A (congenital DMD, 20%): markedly poor intellectual and motor outcome; B (classical DMD, 28%): intermediate intellectual and poor motor outcome; C (moderate pure motor DMD, 22%): normal intelligence and delayed motor impairment; and D (severe pure motor DMD, 30%): normal intelligence and poor motor outcome. Group A patients had the most severe respiratory and cardiac involvement. Frequency of mutations upstream to exon 30 increased from group A to D, but genotype/phenotype correlations were restricted to cognition. Diagnostic accuracy tests showed that combination of "clinical onset &lt;2yrs" with "mental retardation" reliably assigned patients to group A (sensitivity 0.93, specificity 0.98). Combination of "lower limb MMT score&gt;6 at 8yrs" with "normal or borderline mental status" reliably assigned patients to group C (sensitivity: 1, specificity: 0.94). These early criteria were also predictive of "congenital DMD" and "moderate pure motor DMD" in series 2. In a second part, we included 25 steroid-free DMD patients in a multiparametric analysis plotting initial histological alterations in quadriceps muscle with 13 relevant clinical data collected by the same team over a long-term follow-up (mean&gt;10yrs). Elementary histological parameters (fiber size, hypercontracted fibers, necrotic/basophilic fibers, edema, endomysial and perimysial fibrosis, and fatty degeneration) were assessed by morphometry. Endomysial fibrosis was the sole myopathological parameter significantly correlated with poor motor outcome, assessed by quadriceps muscle strength, manual muscle testing of upper and lower limbs at 10yrs, and age at ambulation loss (all p&lt;0.002). Motor outcome and fibrosis were not correlated with genotype. Myofibers exhibited oxidative stress-induced protein alterations and became separated from capillaries by fibrosis, which was associated with both increase of CD206+ alternatively activated macrophages and relative decrease of CD56+ satellite cells (both p&lt;0.0001). This study provides firm basis for antifibrotic therapeutic strategies in DMD, and supports the view that alternatively activated macrophages, known to inhibit myogenesis while promoting collagen-producing cell formation, play a key role in myofibrosis. In the third experimental part, experiments were conducted on mdx mice at 6-8 weeks of age. Fifteen micropunctures were made daily in the right tibialis anterior (TA) muscle with micropins used for entomology (150 µm diameter) during 2 weeks. Our data suggest that repeated microinjuries of muscle deficient in dystrophin protein triggers a endomysial fibrotic process that stabilizes with time well associated with muscle strenght decrease. Endomysial fibrosis seems to be one of the target of therapy in DMD. This satisfactory model will be usefull to study the mechanisms of fibrosis process in dystrophin deficient muscle and to evaluate antifibrotic treatment

Les cellules souches pluripotentes (CSP) humaines sont devenues en quelques années des modèles de choix pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires qui gouvernent l'apparition de maladies monogéniques, mais également pour le développement de criblages à haut débits afin d'identifier parmi plusieurs milliers de molécules chimiques celles qui ont un potentiel thérapeutique. C'est dans ce contexte de criblage que mes travaux de thèse s'inscrivent, alliant automatisation et miniaturisation de la biologie des CSP dans le cadre de deux maladies monogéniques, l'amyotrophie spinale infantile (SMA) et la dystrophie myotonique de type I (DM1). De manière générale, la mise en place d'une telle stratégie repose sur trois étapes essentielles qui sont l'obtention de CSP porteuses d'une mutation donnée, l'identification d'un modèle d'étude pertinent et la réalisation du criblage à proprement parlé. L'obtention de CSP humaines repose sur deux approches principales. La première consiste en la dérivation de cellules embryonnaires humaine (hES) issues de diagnostiques préimplantatoires et la seconde repose sur la reprogrammation de cellules somatiques par l'induction de pluripotence (iPS). Une partie de mon travail a consisté en la création de cellules iPS modèles de la SMA et leur caractérisation par une approche à haut débit. Par la suite un travail d'optimisation du protocole de génération de motoneurones à partir de CSP humaines a permis d'accélérer et augmenter les rendements de production de ces cellules qui sont principalement affectées dans la SMA. Enfin, l'utilisation de cellules hES porteuses de la mutation causale de la DM1 a permis le criblage de 12000 molécules et a conduit à l'identification d'une famille chimique capable de restaurer plusieurs défauts typiques de cette maladie tels que des défauts d'épissage et de fusion moléculaire. / For only few years, Human pluripotent stem cells (PSC) have become wide spread models in order to study and decipher cellular or molecular mechanims involved in monogenic diseases, but also for the development of large scale screening strategies allowing the identification of new therapeutics among thousands of chemicals. Mythesis research aimed at the development of such strategies, miniaturizing and automating PSC biology within the framework of two monogenic diseases, namely spinal muscular atrophy (SMA) and myotonic dystrophy type 1 (DM1).Basically, PSC based screening programs are generally built around three main steps which are the access to a stem cell model, the identification of a relevant cell type and lastly the screening campaign. There is actually two main ways to generate human PSC. Firstly, human embryonic stem cells (hES) can be derived from the inner cell mass of blastocyte through a pre-implantation diagnosis and secondly, induced pluripotent stem cells (iPS) can be generated after somatic cell reprogramming in vitro. A part of my work has consisted in the generation of hiPS cellular models for SMA by reprogramming fibroplasts that carried SMN1 gene deletion, followed bay the characterization of several dozen of independant clones with high throughput. Then an optimization process of the protocol for the generation of Motoneuron from PSC has been done multiplying experimental conditions. This finally allowed the description of a fast and efficient protocol to generate the most affected cell type in SMA. Finally, DM1 mutated hES were uded for the screening of 12.000 compounds among which a chemical family has been identified to rescue DM1 typical splicing and myogenesis defects.

Parmi leurs applications prometteuses, les lignées de cellules souches embryonnaires humaines (hES) présentent un potentiel inestimable pour améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement de maladies monogéniques. Cette application de modélisation pathologique est devenue possible grâce à l'utilisation de lignées hES porteuses de la mutation causale d'une maladie monogénique, obtenues au cours d'un diagnostique pré-implantatoire. L'équipe dans laquelle j'ai effectué mes travaux de thèse a démontré que des lignées hES et leurs progénies, porteuses de la mutation causale de la dystrophie myotonique de type 1 (DM1), exprimaient des défauts moléculaires caractéristiques de la pathologie, permettant ainsi leur analyse de façon plus pertinente par rapport à des cultures primaires dérivées de biopsies de patients et validant l'utilisation de ce modèle cellulaire. Dans ce contexte, dans la première partie de mon travail de thèse, mon objectif a été de mettre au point des conditions de culture permettant la différenciation des cellules hES normales et mutantes vers le lignage neural afin d'obtenir des populations homogènes de progéniteurs neuraux et de cellules souches neurales, puis de les caractériser sur le plan phénotypique et fonctionnel. Par une étude transcriptomique, j'ai ensuite comparé le profil d'expression de ces progéniteurs neuraux à une autre population homogène de précurseurs mésenchymateux. J'ai ainsi identifié des gènes et des voies de signalisation spécifiques à chacune de ces populations. (Article 1). Dans la seconde partie de mes travaux, ma contribution au projet de modélisation pathologique de DM1 a été d'utiliser ces progéniteurs neuraux et les cellules souches neurales mutés pour explorer les mécanismes physiopathologiques responsables des symptômes neurologiques observés dans cette pathologie. J'ai ainsi identifié une anomalie dans une voie de signalisation cellulaire perturbée, la voie la voie mTORC1, basée sur l'observation selon laquelle les cellules NSC porteuses de la mutation DM1 proliféraient plus lentement que les cellules contrôles (Article II). J'ai également étudié l'expression la protéine Tau, connue pour son implication dans la maladie d'Alzheimer, et mis en évidence des modifications suggérant une altération du transport axonal dans les neurones issus des lignées hES mutantes. Ces résultats, associés à ceux réalisés dans l'équipe, permettent d'apporter la preuve de concept de l'intérêt d'un tel modèle cellulaire pour la modélisation pathologique des maladies monogéniques.

Les mutations du gène LMNA, codant les lamines A/C, des protéines ubiquitaires de l'enveloppe nucléaire, sont responsables de formes autosomiques de dystrophie musculaire d'Emery-Dreifuss (EDMD), pathologie associant une atteinte des muscles squelettiques et une cardiomyopathie dilatée (DCM) avec troubles rythmiques et/ou conductifs. Lors de ma thèse j'ai analysé le phénotype musculaire et cardiaque de souris LmnaΔK32/+ (Het), mutation identifiée chez des patients présentant une EDMD sévère. Les souris Het n'ont pas d'atteinte musculaire mais développent une DCM conduisant au décès entre l'âge de 35 et 7O semaines. Le niveau de lamines A/C est diminué de 50% dans le cœur des souris Het avant et au début de la DCM mais similaire aux Wt chez les souris Het souffrant de DCM. La diminution de la quantité de lamines A/C est liée à leur dégradation par le système ubiquitine-protéasome (UPS) dont la fonction est altérée dans le cœur des souris Het, conduisant à l'augmentation de la quantité de lamines K32 avec l'âge. In vitro, l'accumulation des lamines A/C K32 conduit à leur agrégation nucléaire, suggérant un effet dominant négatif de ces protéines mutées. Pour conclure, la souris LmnaΔK32/+ est le premier modèle murin porteur d'une mutation du gène Lmna qui développe une cardiomyopathie isolée à l'état hétérozygote. L'UPS joue un rôle important dans la dégradation des lamines A/C mutées, limitant leur effet délétère. Les mécanismes physiopathologiques à l'origine de la DCM chez les souris Het sont donc doubles : à l'haploinsuffisance des lamines A/C, connue comme préjudiciable pour le cœur, s'ajoute un effet poison des lamines mutées augmentant avec la dysfonction de l'UPS