Protein synthesis is principally regulated at the initiation stage in which eIF4F complex plays an important role. The eIF4F complex contains three subunits - eIF4A, eIF4E and eIF4G. The eIF4E is cap binding protein, the eIF4A is RNA dependent helicase which unwinds secondary structures at mRNA and scaffolding eIF4G protein. The interaction with other translation initiation factors is important for protein synthesis. The goal of my thesis was to create a new Saccharomyces cerevisiae yeast strain with the human eIF4F factor. Firstly I replaced yeast eIF4E protein with human eIF4E protein. I used a cre/loxP recombination to prepare yeast strains with deleted genes eIF4GI (huΔ4G1) and eIF4GII (huΔ4G2). Characterization of the new yeast strains showed that the human eIF4E protein replaced yeast ortholog factor better than the eIF4E protein from yeast Candida albicans. First experiments showed putative role of the eIF4GII protein during the cell growth under the temperature and osmotic stress. Key words: translation initiation, eIF4E, eIF4G, Saccharomyces cerevisiae

Développer des plantes résistantes aux pathogènes nécessite d’identifier des sources de résistance, de les introduire dans le fonds génétique souhaité et de s’assurer de leurs performance et durabilité. Par l’étude de 2 pathosystèmes distincts, ces travaux de thèse m’ont permis d’appréhender ces différentes étapes.Le pathosystème tomate-bégomovirus présente un intérêt économique important. Une étude par transgénèse suggère que la surexpression de SlNAC1 (codant un facteur de transcription) est bien impliquée dans des mécanismes de résistance au bégomovirus, probablement en activant les mécanismes de résistance systémique acquise. Cette surexpression semble s’accompagner d’un retard de croissance, incompatible avec une utilisation en amélioration des plantes. Le pathosystème tomate-potyvirus permet de comparer au sein d’une même espèce des allèles de résistance naturels et induits, reposant sur des mutations affectant un facteur d’initiation de la traduction eIF4E1. Les travaux menés sur ces allèles ont permis de mettre en lumière une redondance au sein de la petite famille multigénique eIF4E vis-à-vis de la résistance, impliquant eIF4E2 dans les mécanismes de sensibilité et sont en faveur de l’utilisation d’allèles de résistance fonctionnels. De plus, l’introgression de l’allèle naturel dans une lignée de tomate possédant déjà d’autres gènes de résistance aux pathogènes s’accompagne d’une érosion du spectre de résistance dû à un contournement massif par la souche PVY-LYE84.Nos travaux soulignent ainsi les précautions à prendre lors de la mise en place de résistances génétiques ainsi que la nécessité de concilier ces approches avec l’étude du développement de la plante. / The development of plants resistant to need to identify sources of resistance, to introduce them into the desired genetic background and subsequently to monitor their performance and durability. By studying two distinct pathosystems, this thesis work has allowed me to address those three stages.The tomato-begomoviruses pathosystem presents a significant economic interest. Transgenic approach suggests that SlNAC1 (coding for a transcription factor) is involved in resistance mechanisms to begomoviruses, probably by triggering systemic acquired resistance. Besides, the SlNAC1 overexpression seems to be associated with growth retardation, a side-effect incompatible with its use in plant breeding.The tomato-potyviruses pathosystem allowed the comparison within the same species of both natural and induced resistance alleles, associated with mutations affecting the translation initiation factor eIF4E1. Work on those alleles highlighted a redundancy effect within the eIF4E small multigenic family toward resistance, affecting eIF4E2 and favouring the use of functional resistance alleles in resistance. In parallel, the introgression of thebroad-spectrum resistance natural allele was introgressed into a tomato line that already possess other pathogen resistance genes is accompanied by an erosion of the resistance spectrum, due to a massive resistance breakdown by the PVY-LYE84 strain.Altogether, this current work highlight cautions to be taken for introducing resistance genes as well as stressing the importance of combining those approaches with the study of plant development.

Ces dernières années, les facteurs du complexe d'initiation de la traduction eucaryote ont été identifiés comme des déterminants essentiels dans la sensibilité des plantes aux virus à ARN, y compris les potyvirus, genre le plus important à la fois de par leur nombre et leur importance économique chez des espèces légumières, fruitières et de grandes cultures.En particulier, les allèles récessifs mo11 et mo12 du gène mo1 précédemment identifié comme codant pour le facteur d'initiation de la traduction eIF4E, sont actuellement utilisés pour protéger les cultures de laitue contre le potyvirus de la mosaïque de la laitue (LMV).Partant des résultats obtenus au laboratoire démontrant que les déterminants du LMV impliqués dans le contournement de la résistance mo1 comprennent non seulement le domaine codant pour la VPg mais aussi, en amont, l’extrémité carboxy-terminale de celui codant pour la CI, mon travail de thèse a consisté à (1) confirmer que le LMV code pour deux facteurs de virulence, la CI et la VPg (2) identifier par mutagenèse dirigée et aléatoire des acides aminés clés de la CI impliqués dans le contournement de la résistance contrôlée par eIF4E (3) entamer une caractérisation fonctionnelle des interactions impliquant les trois partenaires eIF4E, CI et VPg.Les résultats obtenus ont montré que l'échange de la VPg d'un isolat virulent (LMV-E) dans un non virulent (LMV-0) est suffisant pour restituer la compatibilité complète avec les variétés de laitue portant l'allèle mo11, mais pas mo12, alors que la région codant pour la portion C-terminale de la CI et la 6K2, suffit pour contourner les deux allèles de mo1. Le mutant ponctuel dans la CI (LMV-0-S621T) obtenu par mutagenèse dirigée est capable de contourner la résistance conférée par mo12 et partiellement celle conférée par mo11 tandis que le mutant réciproque (LMV-E-T621S) perd sa capacité à contourner les deux allèles de résistance. Il s’agit donc là du premier exemple d'un gène de CI de potyvirus, agissant comme un déterminant de contournement de la résistance récessive contrôlée par eIF4E. En effet, la VPg des potyvirus a été identifiée jusque là comme l’unique facteur de virulence vis-à-vis de eIF4E. Il semble donc que le LMV puisse utiliser deux facteurs viraux (CI et VPg) pour le contournement des allèles de résistance mo1.Cette propriété, associée au fait que des isolats de LMV d’origine sauvage ou ornementale soient capables d’évoluer vers le contournement pourraient donc présenter un risque pour la durabilité des résistances mo1. Des travaux préliminaires ont été menés lors de cette thèse afin de mieux comprendre le rôle exact des mutations des facteurs de virulence dans le processus évolutif d’adaptation du LMV aux pressions imposées par les allèles mo1.Enfin, l’implication de la CI dans le contournement de la résistance mo1 laisse supposer que cette protéine pourrait elle aussi interagir (comme la VPg), directement ou non, avec eIF4E. Nous avons montré pour la première fois in vitro et in vivo l’interaction entre la région C-terminale de la CI et la protéine eIF4E de laitue. De plus, la mutation en position 621 de la CI ayant un rôle clé dans le contournement de la résistance mo1 ne semble pas affecter ces interactions in vitro / In recent years, the factors of the eukaryotic translation initiation complex were identified as essential determinants of plant susceptibility to RNA viruses, including potyviruses, the largest and economically the most important of the plant virus groups. Members of this group are responsible for important virus diseases affecting all types of vegetable, fruit, and field crops.In particular, the recessive alleles mo11 and mo12 of mo1 gene, which previously identified as encoding for the translation initiation factor eIF4E, are currently used to protect lettuce crops against lettuce mosaic potyvirus (LMV).Based on the results obtained in the laboratory showing that the LMV determinants involved in the mo1 resistance overcoming include not only the area encoding for the VPg but also upstream, the C-terminal region of that encoding for the CI, my work of thesis consisted in (1) confirm that LMV encodes for two virulence factors, CI and VPg (2) identified by site-directed and random mutagenesis a key amino acids of the CI protein involved in eIF4E-mediated resistance overcoming (3) initiate a functional characterization of interactions involving the three partners eIF4E, VPg and CI.The results obtained showed that the exchange of VPg of a virulent isolate (LMV-E) in a non-virulent (LMV-0) is sufficient to restore full compatibility with lettuce cultivars carrying mo11 allele, but not mo12, whereas the region encoding for the C-terminal portion of the CI and 6K2, is sufficient to overcoming both mo1 alleles. The point mutation in the CI (LMV-0-S621T) obtained by site-directed mutagenesis is able to overcome the resistance conferred by mo12 and partly that conferred by mo11 while the reciprocal mutation (LMV-E-T621S) loses its ability to overcome both resistance alleles.So this is the first example of a potyvirus CI gene acting as a virulence determinant in overcoming eIF4E-mediated resistance. Indeed, the potyvirus VPg was previously identified as the sole virulence determinant vis-a-vis eIF4E. It seems that LMV can use two viral factors (CI and VPg) to overcome the mo1 resistance alleles.This property, combined with the fact that LMV isolates from the wild or ornamental origin are able to evolve towards the overcoming could therefore pose a risk to the durability of the mo1 resistance. Preliminary works were carried on during this thesis to better understand the exact role of mutations affecting virulence factors in the evolutionary process of adaptation of LMV to the pressures imposed by mo1 alleles.Finally, the involvement of the LMV CI in mo1 resistance breaking suggests that this protein could also interact (such as VPg), directly or indirectly with eIF4E. We have shown for the first time in vitro and in vivo interactions between the C-terminal region of the CI protein and the lettuce eIF4E protein. In addition, the mutation at position 621 of the CI which has a key role in mo1 resistance overcoming does not seem to affect these interactions in vitro.

Les facteurs d’initiation de la traduction sont des protéines de plante cruciales pour l’établissement du cycle viral des Potyvirus. Des mutations dans ces facteurs sont la source de résistances récessives chez de nombreuses plantes d’intérêt agronomique. Ces résistances peuvent être déjouées par les Potyvirus, principalement par l’acquisition de mutations dans la VPg (Viral Protein Genome-linked) permettant de rétablir une interaction compatible avec les formes mutées des facteurs eIF4E. Ce modèle simple de co-évolution n’est pas applicable au pathosystème Laitue/LMV (Lettuce mosaic virus). En effet, chez la laitue, deux allèles mo11 et mo1² du gène mo1 codant pour eIF4E confèrent la résistance au LMV. Dans ce pathosystème, la VPg n’a été associée qu’au contournement de l’allèle de résistance mo11. Un deuxième facteur de virulence entre en jeu : la protéine CI (Cylindrical Inclusion, helicase caractéristique des potyvirus), responsable du contournement des résistances mo11 et mo1². L’étude approfondie de la diversité naturelle du LMV a permis d’identifier 4 positions en acides aminés dans la CI, potentiellement impliquées dans le mécanisme de contournement. Celles-ci ont été étudiées par une approche de génétique inverse. Les résultats mettent pour la première fois en évidence l’existence d’un contournement de résistance partiel (toutes les plantes ne sont pas infectées) et graduel (la proportion de plantes infectées augmente avec le nombre de mutations). Par ailleurs, ce contournement est associé au rétablissement du mouvement en systémie du virus en contexte de résistance et est dépendant du fond génétique du virus. / Eukaryotic translation initiation factors are essential host factors required for Potyvirus infection and represent a major component of recessive resistance against potyviruses in several crops. Potyvirus adaptation to eIF4E-mediated resistance usually occurs through mutations in the VPg (Viral Protein Genome-linked), restorating its interaction with the mutated eIF4E factor. Such co-evolution model doesn’t match the Lettuce/LMV (Lettuce mosaic virus) pathosystem. Indeed, two resistance alleles mo11 and mo1² of the mo1 gene encoding eIF4E, confer resistance against LMV in lettuce. The VPg triggers virulence only towards the mo11 allele. Another virulence determinant was identified: the CI (Cylindrical inclusion, potyviral helicase), which was associated with both mo11 and mo1² overcoming. By investigating the LMV natural diversity, we identified 4 amino acid positions in the CI-Cterminus potentially involved in mo1 overcoming. Reverse genetics experiments were carried out, demonstrating that mutations at these positions are associated with a partial (not all the plants are infected) and gradual (increase with the accumulation of mutations) resistance breaking mechanism. Resistance-breaking mutations were shown to restore the systemic movement of the virus and to be influenced by the viral genetic background.

Le virus Y de la pomme de terre (PVY) est l’un des virus les plus dommageables sur tabac. Pour contrôler les épidémies de PVY, différents allèles du gène de résistance récessive va ont été introgressés dans des variétés de tabac. Ce gène récemment cloné code pour une copie du facteur d’initiation de la traduction (eIF4E-1). Toutefois, l’émergence de variants de PVY contournant va, dont des isolats nécrotiques particulièrement sévères, montre que cette résistance n’est pas toujours durable. L’objectif du travail de thèse était i) de comprendre les mécanismes génétiques modulant la durabilité de la résistance va ii) d’identifier des facteurs génétiques différents de va, contrôlant une tolérance aux symptômes de nécrose nervaire induits par certains isolats de PVY. Le phénotypage, le génotypage et l’analyse du transcriptome de 13 variétés résistantes portant va montrent que le type de mutation affectant le locus eIF4E-1 ainsi que la fonctionnalité et le niveau d’expression d’autres copies d’eIF4E impactent la durabilité de va. Nos données permettent de proposer un modèle de leurre où la surexpression de la copie eIF4E-2, sous l’effet de la délétion complète du gène eIF4E-1 et partielle du gène eIF4E-3, limiterait l’apparition de variants contournants, augmentant ainsi la durabilité de la résistance contrôlée par va. En parallèle, un gène R de type NB-LRR nommé NtTPN1 (pour Nicotiana tabacum Tolerance to PVY-induced Necrosis1) a été identifié comme étant directement impliqué dans l’absence de développement de la nécrose nervaire induite par les isolats nécrotiques de PVY. Le phénotype de tolérance au PVY conféré par NtTPN1 ouvre de nouvelles perspectives de contrôle du PVY et en particulier des isolats nécrotiques capables de contourner la résistance liée à va. / Potato virus Y (PVY) is one of the most damaging viruses on tobacco crops. To control PVY, allelic forms of the recessive resistance gene va were introgressed into many tobacco cultivars. This gene was recently identified and encodes a copy of eukaryotic initiation translation factor (eIF4E-1). However, the va-mediated resistance is sometimes overcome by resistance-breaking variants including particularly severe necrotic isolates. The present PhD project had two objectives i) to further our understanding of the mechanism(s) modulating va-mediated resistance durability ii) to identify new, vaindependent genetic factors confering tolerance to veinal necrosis symptoms induced by necrotic PVY isolates. Phenotypic, genetic and transcriptomic analyses of 13 resistant tobacco accessions showed that the type of mutation at the locus eIF4E-1, together with the functionality and expression levels of other eIF4E copies, impact va-mediated resistance durability. The results obtained support a decoy model where the overexpression of the eIF4E-2 gene, as a consequence of the complete deletion of eIF4E-1 and of the partial deletion of eIF4E-3, would limit the ability of PVY to evolve towards resistancebreaking, increasing va-mediated resistance durability. In parallel, a NB-LRR R gene, called NtTPN1 (for Nicotiana tabacum Tolerance to PVY-induced Necrosis1) directly involved in the tolerance to PVY-induced systemic veinal necrosis symptoms in tobacco was identified. The phenotype of tolerance to PVY conferred by NtTPN1 opens novel breeding options to minimize the impact of the emerging and so far uncontrolled va-mediated resistance breaking necrotic PVY isolates.

Le facteur d'initiation de la traduction chez les eukaryotes eIF4E (4E) est un puissant oncogène en raison de sa capacité à faciliter l'export et/ou la traduction de certains transcripts, dont beaucoup sont eux-mêmes des oncogènes. 4E intéragit avec un grand nombre de protéines régulatrices dont la protéine 4E-T (pour 4E-Transporter). La capacité de 4E-T à modifier la localisation subcellulaire de 4E pourrait offrir un mécanisme permettant de modifier le potentiel oncogène d'une cellule. La surexpression de 4E-T dans des cellules d'ostéosarcome conduit à l’augmentation du nombre et de la taille des P-bodies, dans lesquels 4E colocalisent avec 4E-T mais pas avec la version tronquée 4E-T/Y30A. Cependant, les différentes expériences menées, permettant d’analyser les taux de transcription, la quantité de protéine, les profiles polysomiques ainsi que la distribution nucléo-cytoplasmique, montrent que la surexpression de 4E-T n'a pas d'effet sur la fonction de 4E. L'observation d’un enrichissement cytoplasmique et d’une charge réduite de ribosomes sur les transcripts codant les protéines cycline D1 et ODC (profile polysomique) dans la lignée 4E-T suggère un role de 4E-T dans la séquestration cytoplasmique de certains transcrips par un mécanisme qui reste encore à déterminer. / The eukaryotic translation initation factor eIF4E (4E) is a potent oncogene due to its ability to facilitate export and/or translation of certain transcripts, many of which are, themselves, oncogenes. 4E has many protein-binding partners including the 4E transporter protein (4ET). The ability to alter the subcellular localization of 4E via 4E-T could offer a mechanism by which to alter the oncogenic potential of a cell. Overexpression of 4E-T in osteosarcoma cells leads to formation of larger and more numerous P-bodies that can effectively colocalize with 4E than either a vector control (E) or a less efficient 4E-binding version of 4E-T (Y30A). However, the overexpression of 4E-T did not affect the 4E’s function as determined by examining global levels of transcription, polysome profile, cytoplasmic/nuclear distribution, or protein levels of most of the transcripts tested. The observation that there was cytoplasmic enrichment and reduced loading of ribosomes on cyclin D1 and ODC transcripts (polysome profile) in the 4ET line suggests a possible 4ETmediated cytoplasmic sequestration of certain transcripts by an as yet to be determined mechanism.

Le contrôle traductionnel est une étape critique de la régulation de l'expression des gènes impliqués dans le développement embryonnaire et de nombreux processus cellulaires. Au cours de l'initiation de la traduction chez les eucaryotes, le facteur eIF4E (eukaryotic Initiation Factor 4E) fixe la coiffe des ARNm et recrute la protéine eIF4G pour former le complexe d'initiation. L' interaction eIF4E/eIF4G est une étape clé de la régulation traductionnelle, faisant du site de liaison à eIF4E un lieu de compétition entre eIF4G, le répresseur général de la traduction 4E-BP et d'autres régulateurs appelés 4E-IPs (4E-interacting partners), qui partagent avec eIF4G un motif consensus de liaison à eIF4E. Longtemps considérée comme une protéine désordonnée, nous avons montré au cours de cette thèse que 4E-BP adopte en réalité une conformation repliée lorsqu'il se lie à eIF4E, impliquant une surface d'interaction plus importante. Ces résultats ont apporté un nouveau regard sur les interactions qui s'établissent entre eIF4E et ses partenaires, et ont fourni des informations cruciales pour l'établissement de nouvelles thérapies, notamment celles développées dans le cadre des cancers. Mon travail de thèse a également permis l'établissement d'un criblage de nouvelles 4E-IPs, basé sur une approche alliant analyses structurales, bioinformatiques et biochimiques. Parmi les 4E-IPs détectées, nous avons caractérisé la protéine Angel1, membre d'une famille de déadénylases. Ces résultats ont ouvert de nombreuses perspectives pour la compréhension du métabolisme des ARNm mais aussi celle des régulations traductionnelles spécifiques prenant pour cible moléculaire eIF4E

Le facteur d'initiation de la traduction chez les eukaryotes eIF4E (4E) est un puissant oncogène en raison de sa capacité à faciliter l'export et/ou la traduction de certains transcripts, dont beaucoup sont eux-mêmes des oncogènes. 4E intéragit avec un grand nombre de protéines régulatrices dont la protéine 4E-T (pour 4E-Transporter). La capacité de 4E-T à modifier la localisation subcellulaire de 4E pourrait offrir un mécanisme permettant de modifier le potentiel oncogène d'une cellule. La surexpression de 4E-T dans des cellules d'ostéosarcome conduit à l’augmentation du nombre et de la taille des P-bodies, dans lesquels 4E colocalisent avec 4E-T mais pas avec la version tronquée 4E-T/Y30A. Cependant, les différentes expériences menées, permettant d’analyser les taux de transcription, la quantité de protéine, les profiles polysomiques ainsi que la distribution nucléo-cytoplasmique, montrent que la surexpression de 4E-T n'a pas d'effet sur la fonction de 4E. L'observation d’un enrichissement cytoplasmique et d’une charge réduite de ribosomes sur les transcripts codant les protéines cycline D1 et ODC (profile polysomique) dans la lignée 4E-T suggère un role de 4E-T dans la séquestration cytoplasmique de certains transcrips par un mécanisme qui reste encore à déterminer. / The eukaryotic translation initation factor eIF4E (4E) is a potent oncogene due to its ability to facilitate export and/or translation of certain transcripts, many of which are, themselves, oncogenes. 4E has many protein-binding partners including the 4E transporter protein (4ET). The ability to alter the subcellular localization of 4E via 4E-T could offer a mechanism by which to alter the oncogenic potential of a cell. Overexpression of 4E-T in osteosarcoma cells leads to formation of larger and more numerous P-bodies that can effectively colocalize with 4E than either a vector control (E) or a less efficient 4E-binding version of 4E-T (Y30A). However, the overexpression of 4E-T did not affect the 4E’s function as determined by examining global levels of transcription, polysome profile, cytoplasmic/nuclear distribution, or protein levels of most of the transcripts tested. The observation that there was cytoplasmic enrichment and reduced loading of ribosomes on cyclin D1 and ODC transcripts (polysome profile) in the 4ET line suggests a possible 4ETmediated cytoplasmic sequestration of certain transcripts by an as yet to be determined mechanism.

Las enfermedades de etiología viral destacan por ser el principal factor limitante de las hortalizas. La estrategia más eficaz para el control consiste en la identificación de genes de resistencia y el posterior desarrollo de variedades resistentes. El principal objetivo de esta tesis se centra en el aprovechamiento y la caracterización de la variabilidad genética de las especies cultivadas del género Capsicum (C. annuum, C. chinense, C. frutescens, C. baccatum y C. pubescens). Se ha puesto a punto una plataforma de EcoTILLING que permite un cribado eficiente de la colección de entradas de Capsicum del Banco de Germoplasma del COMAV. Esta plataforma se exploró para la búsqueda de variantes alélicas de los genes eIF4E y eIF(iso)4E, implicados en la resistencia a virosis. Una colección de 31 entradas que representan distintas combinaciones de los alelos eIF4E y eIF(iso)4E se inocularon mecánicamente con el Potato virus Y (PVY) y el Tobacco etch virus (TEV). Cinco nuevas variantes del gen eIF4E (pvr210, pvr211, pvr212, pvr213, pvr214) están relacionadas con la respuesta de resistencia al PVY y al TEV. Diez microsatélites y cuatro combinaciones de AFLPs se utilizaron para caracterizar 260 entradas del género Capsicum. Se detectó la existencia de cierta estructuración intraespecífica relacionada geográficamente. C. baccatum y C. pubescens muestran un par de grupos genéticos, por un lado están las entradas procedentes de Bolivia y por el otro las entradas de Ecuador y Perú. Además, las entradas de C. chinense procedentes de Perú pudieron ser diferenciadas del resto. En este estudio las entradas de Ecuador y Perú han mostrado una diversidad elevada y similar a las de Bolivia, el cual es un importante centro de diversidad del género Capsicum. Por tanto, las entradas procedentes de estos países podrán constituir fuentes importantes de variación para ser utilizadas en los programas de mejora del pimiento. / Ibiza Gimeno, VP. (2011). Nuevas herramientas en la lucha contra las virosis del pimiento [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/11549 / Palancia

The eIF4E is an important eukaryotic translation initiation factor, because of its ability to bind cap at 5'end of mRNA. There are three members of this protein family found in humans: eIF4E1, eIF4E2 and eIF4E3. eIF4E1 also plays role in in export of some mRNA from nucleus to cytoplasm. This protein is mostly regulated by mTOR signaling pathway and malfunctions in regulation leads to increased cell proliferation and thus tumorogenesis. eIF4E2 plays a role in regulating of translation during embryogenesis and it is known to mediate translation in terms of hypoxia. Role of eIF4E3 is so far shrouded in mystery. Some studies suggest it might be able to suppress tumor growth, but no studies have been done on human eIF4E3. Big potential of our work is, that all proteins we work with, are human. Based on our results, the endogenous amount of eIF4E3 protein is higher than it was thought. This is one of the reasons, why this protein should not escape our attention. In my diploma thesis, I have studied physiological characteristics of cell cultures overexpressing eIF4E proteins after mTOR inhibition treatment. I have realized that the most efficient inhibitor in all tested cell cultures is PP-242, which binds directly into active site of mTOR kinase. I have cloned 3xC FLAG tagged eIF4Es constructs and used...