Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-27Bitstream added on 2014-06-13T20:19:15Z : No. of bitstreams: 1 rocha_nas_me_jabo.pdf: 503011 bytes, checksum: f1714a5fae847fcec5ec5165da511227 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O estudo foi conduzido com o objetivo de avaliar os efeitos da suplementação com antioxidantes intracelulares e extracelulares em diferentes etapas da PIV (MIV e/ou CIV), e da tensão de oxigênio durante o CIV sobre o desenvolvimento e criotolerância de embriões bovinos. No Exp.1 foi realizada a suplementação com antioxidantes {0,6 mM cisteína (CIST), 0,6 mM cisteína associado á 100 μM de cisteamina (C+C) e 100 UI catalase (CAT)} durante todo o período de CIV, em diferentes atmosferas gasosas {5% CO2 em ar (20% O2) ou atmosfera controlada (7% O2, 5% CO2 e 88% N2)}. Já, no Exp. 2 foi realizada a suplementação com antioxidantes {0,6 mM cisteína (CIST), 100 UI catalase (CAT) e 100 μM de β-mercaptoetanol (β-ME)} durante 72 horas de CIV, nas diferentes atmosferas gasosas. Posteriormente, após definir a tensão de oxigênio, bem como, o período de suplementação adequado para o CIV, foi realizada a adição de antioxidantes durante a maturação in vitro (MIV) e/ou 72 horas de CIV (Exp.3). No Exp.1, a taxa de desenvolvimento embrionário foi adversamente afetada (P<0,05) pelos tratamentos CIST (11,2%) e C+C (1,4%), em relação ao Controle (26,6%), e pela tensão de oxigênio (17,2% e 11,1%; 20 e 7% O2, respectivamente). Em relação à taxa de re-expansão, após reaquecimento e cultivo in vitro por 24 horas, não houve diferença significativa (P>0,05) entre os tratamentos avaliados (66,7% a 100%). No Exp.2, as taxas de blastocistos não foram afetadas (P>0,05) pelos tratamentos CIST, β-ME e CAT (43,7% a 48,5%), porém a baixa tensão de oxigênio afetou adversamente (P<0,05) o desenvolvimento embrionário (52,1% e 38,4%; 20 e 7% O2 respectivamente). A mensuração dos níveis intracelulares de ROS não foi afetada (P>0,05) pelas variáveis tratamentos (0,95 a 0,78) e tensão de oxigênio... / This study was conducted to evaluate the effects of intracellular and extracellular antioxidants supplementation, in different stages of IVP (IVM and/or IVC), and oxygen tension during IVC on development, quality and cryotolerance of bovine embryos. Exp.1 was performed with the supplementation with antioxidants {0.6 mM cysteine (CIST); 0.6 mM cysteine associated to 100 μM cysteamine (C+C); 100 UI catalase (CAT)} during entire period of IVC in different gaseous atmospheres {5% CO2 in air (20% O2) or controlled atmosphere (7% O2, 5% CO2 and 88% N2)}. Already, in Exp.2 was performed the antioxidant supplementation {0.6 mM cysteine (CIST); 100 μM β-mercaptoethanol (β-ME); 100 UI catalase (CAT)} for 72 hours of IVC in different gaseous atmospheres. Later, after setting the oxygen tension as well as the supplementation period suitable for IVC, was carried out the addition of antioxidants during in vitro maturation (IVM) and/or 72 hours of IVC (Exp.3). In Exp.1, the rate of embryo development was adversely affected (P<0.05) by the treatments CIST (11.2%) and C+C (1.4%), compared to Control (26.6%), and oxygen tension (17.2% and 11.1%, 20 and 7%O2, respectively). Regarding the re-expansion rate after warming and in vitro culture for 24 hours, no difference (P>0.05) between the treatments were found (66.7% to 100%). In Exp.2, blastocysts rates were not affected (P>0.05) by treatments CIST, β-ME and CAT (43.7% to 48.5%), but the low oxygen tension adversely affected (P<0.05) embryo development (52.1% to 38.4%, 20 and 7%O2, respectively). The quantification of intracellular levels of ROS was not affected (P>0.05) by the variables treatments (0.95 to 0.78) and oxygen tension... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Joaquim Mansano Garcia / Banca: Juliana Corrêa Borges Silva / Resumo: O estudo foi conduzido com o objetivo de avaliar os efeitos da suplementação com antioxidantes intracelulares e extracelulares em diferentes etapas da PIV (MIV e/ou CIV), e da tensão de oxigênio durante o CIV sobre o desenvolvimento e criotolerância de embriões bovinos. No Exp.1 foi realizada a suplementação com antioxidantes {0,6 mM cisteína (CIST), 0,6 mM cisteína associado á 100 μM de cisteamina (C+C) e 100 UI catalase (CAT)} durante todo o período de CIV, em diferentes atmosferas gasosas {5% CO2 em ar (20% O2) ou atmosfera controlada (7% O2, 5% CO2 e 88% N2)}. Já, no Exp. 2 foi realizada a suplementação com antioxidantes {0,6 mM cisteína (CIST), 100 UI catalase (CAT) e 100 μM de β-mercaptoetanol (β-ME)} durante 72 horas de CIV, nas diferentes atmosferas gasosas. Posteriormente, após definir a tensão de oxigênio, bem como, o período de suplementação adequado para o CIV, foi realizada a adição de antioxidantes durante a maturação in vitro (MIV) e/ou 72 horas de CIV (Exp.3). No Exp.1, a taxa de desenvolvimento embrionário foi adversamente afetada (P<0,05) pelos tratamentos CIST (11,2%) e C+C (1,4%), em relação ao Controle (26,6%), e pela tensão de oxigênio (17,2% e 11,1%; 20 e 7% O2, respectivamente). Em relação à taxa de re-expansão, após reaquecimento e cultivo in vitro por 24 horas, não houve diferença significativa (P>0,05) entre os tratamentos avaliados (66,7% a 100%). No Exp.2, as taxas de blastocistos não foram afetadas (P>0,05) pelos tratamentos CIST, β-ME e CAT (43,7% a 48,5%), porém a baixa tensão de oxigênio afetou adversamente (P<0,05) o desenvolvimento embrionário (52,1% e 38,4%; 20 e 7% O2 respectivamente). A mensuração dos níveis intracelulares de ROS não foi afetada (P>0,05) pelas variáveis tratamentos (0,95 a 0,78) e tensão de oxigênio... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This study was conducted to evaluate the effects of intracellular and extracellular antioxidants supplementation, in different stages of IVP (IVM and/or IVC), and oxygen tension during IVC on development, quality and cryotolerance of bovine embryos. Exp.1 was performed with the supplementation with antioxidants {0.6 mM cysteine (CIST); 0.6 mM cysteine associated to 100 μM cysteamine (C+C); 100 UI catalase (CAT)} during entire period of IVC in different gaseous atmospheres {5% CO2 in air (20% O2) or controlled atmosphere (7% O2, 5% CO2 and 88% N2)}. Already, in Exp.2 was performed the antioxidant supplementation {0.6 mM cysteine (CIST); 100 μM β-mercaptoethanol (β-ME); 100 UI catalase (CAT)} for 72 hours of IVC in different gaseous atmospheres. Later, after setting the oxygen tension as well as the supplementation period suitable for IVC, was carried out the addition of antioxidants during in vitro maturation (IVM) and/or 72 hours of IVC (Exp.3). In Exp.1, the rate of embryo development was adversely affected (P<0.05) by the treatments CIST (11.2%) and C+C (1.4%), compared to Control (26.6%), and oxygen tension (17.2% and 11.1%, 20 and 7%O2, respectively). Regarding the re-expansion rate after warming and in vitro culture for 24 hours, no difference (P>0.05) between the treatments were found (66.7% to 100%). In Exp.2, blastocysts rates were not affected (P>0.05) by treatments CIST, β-ME and CAT (43.7% to 48.5%), but the low oxygen tension adversely affected (P<0.05) embryo development (52.1% to 38.4%, 20 and 7%O2, respectively). The quantification of intracellular levels of ROS was not affected (P>0.05) by the variables treatments (0.95 to 0.78) and oxygen tension... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Eunice Oba / Coorientador: Alicio Martins Júnior / Banca: Fernanda da Cruz Landin / Banca: Yeda Fumie Watanabe / Resumo: O objetivo deste estudo foi verificar o efeito de diferentes meios e tempos de refrigeração sobre o desenvolvimento e expressão gênica de embriões bovinos produzidos in vitro. Para tanto, blastocistos D7 foram divididos em três grupos: controle, embriões mantidos em meio SOFaa, em incubadora de CO2, por 6 e 48h; refrigerados, embriões mantidos a 5 °C, em Meio 199, por 24 (M199-24h) e 48h (M199-48h) ou em meio BotuEmbryo®, por 24 (BE-24h) e 48h (BE-48h). Após a refrigeração, os embriões foram cultivados sob as mesmas condições do grupo controle para avaliação da viabilidade embrionária às 6 e 48h, e das taxas de reexpansão e eclosão, às 24 e 48h, respectivamente. Às 6h de cultivo parte dos embriões foi retirada e armazenada para posterior análise de qPCR e TUNEL. Menor porcentagem (P<0,05) de blastocistos viáveis, às 6 e 48h, foi observada no grupo M199-48 em relação ao grupo controle. A taxa de reexpansão não diferiu entre os embriões refrigerados e o grupo controle, porém, menor (P<0,05) taxa de eclosão foi observada nos grupos M199-48h e BE-48h do que no grupo controle. Maior (P<0,05) porcentagem de células apoptóticas foi observada no grupo BE-48h do que nos grupos controle e BE-24h. Os meios e tempos utilizados não alteraram a expressão dos genes HSPA1A, PRDX1, SOD1 e SLC2A1. Portanto, de modo geral, o meio e o tempo de refrigeração não promoveram efeito potencial adverso sobre a viabilidade embrionária, taxa de reexpansão e eclosão, número de células apoptóticas e expressão gênica, sugerindo o emprego do meio BotuEmbryo®, o qual é disponível comercialmente / Abstract: This study was carried out to investigate the effects of different media and cooling times on the development and gene expression of in vitro-derived bovine embryos. Therefore, blastocysts D7 were divided into three groups: control, embryos kept in SOFaa medium, under CO2 incubation, for 6, 24 and 48 hours; cooled embryos, kept in Medium 199, for 24 (M199-24h) and 48 hours (M199-48h) or in BotuEmbryo® medium, for 24 (BE-24h) and 48 hours (M199-48h). After cooling, the embryos were cultured under the same conditions used for the control group for evaluation of embryo viability at 6 and 48 hours, and of re-expansion and hatching rates, at 24 and 48 hours, respectively. At 6h of culture part of the embryos was removed and stored for later analysis of qPCR and TUNEL. Low percentage (P<0.05) of viable blastocysts, at 6 and 48 hours, was observed in group M199-48h than for control group. Re-expansion rate did not differ between cooled embryos and control group, however, lower (P<0.05) hatching rate was observed in M199-48h and BE-48h groups than for control group. Higher (P<0.05) percentage of apoptotic cells was found in BE-48h compared with control and BE-24h groups. Media and cooling times used did not alter the expression of genes HSPA1A, PRDX1, SOD1 and SLC2A1. Thus, overall, medium and cooling time did not promoted potential adverse effect on the embryonic viability, re-expansion and hatching rate, number of apoptotic cells and gene expression, suggesting the use of BotuEmbryo® medium, which is commercially available / Mestre

Submitted by Amauri Alves (amauri.alves@ufv.br) on 2015-10-16T11:25:49Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 566274 bytes, checksum: 435b70c31d30f285a894df8e6609cd67 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-16T11:25:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 566274 bytes, checksum: 435b70c31d30f285a894df8e6609cd67 (MD5) Previous issue date: 2015-06-26 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da adição de L-carnitina, um acelerador do metabolismo lipídico, e ácido linoléico conjugado (trans-10, cis-12) em diferentes fases da produção in vitro de embriões sobre o desenvolvimento e criotolerância embrionária. Em todos os experimentos, embriões foram produzidos in vitro utilizando-se complexos cumulos-oócitos (CCO) provenientes de ovários coletados em abatedouro. Foram calculadas as taxas de clivagem (dia 3 do cultivo), taxa de formação de blastocistos expandidos e blastocistos em estágio avançado de desenvolvimento (dia 7 do cultivo) em função do total de CCO inseminados. Embriões em estágio de blastocisto expandido foram coletados de cada tratamento no dia 7 do cultivo in vitro e submetidos ao congelamento lento. Avaliou-se a taxa de reexpansão e eclosão embrionária 24, 48 e 72 h após o descongelamento em função do total de embriões descongelados. No experimento 1, oócitos fertilizados foram incubados em meio de cultivo contendo diferentes concentrações de L-carnitina (0,00; 0,75; 1,50 ou 3,03 mM) suplementado ou não com 5 % de soro fetal bovino (SFB). A adição de L-carnitina ao meio de cultivo na concentração de 1,5 mM melhorou a taxa de formação de blastocistos em estágio avançado de desenvolvimento quando comparado ao grupo controle (15,2±2,0 vs. 11,2±1,5; P<0,05). A L-carnitina também apresentou efeito positivo sobre a reexpansão embrionária 24 e 48 h pós-descongelamento quando adicionada na concentração de 0,75 e 3,03 mM (77,4±4,5; 80,1±4,0 e 75,0±5,5; 78,0±4,2 vs. 64,0±4,7; 67,4±4,7) ao meio de cultivo (P<0,05). Não houve interação entre os efeitos da adição de L-carnitina e SFB ao meio de cultivo embrionário. Apesar da suplementação do meio de cultivo com SFB ter melhorado o desenvolvimento embrionário (27,2±1,1 vs. 19,4±0,9; P<0,01), houve uma redução das taxas de reexpansão 24, 48 e 72 h pós-descongelamento (65,8±2,9; 67,8±2,8; 66,0±3,0 vs. 78,1±3,8; 81,4±3,0; 79,1±3,5; P<0,01). No experimento 2, os embriões foram cultivados em meio contendo L-carnitina (0,75 mM) ou ácido linoleíco conjugado (CLA – 100 mM) durante as primeiras 96 h, últimas 72 h ou durante todo o cultivo in vitro. A suplementação do meio de cultivo com L-carnitina ou CLA durante diferentes vifases do cultivo in vitro não afetou o desenvolvimento e a criotolerância embrionária. No experimento 3, avaliou-se o desenvolvimento e a crioresistência embrionária quando oócitos foram maturados em meio suplementado com L-carnitina (3.03 mM) e/ou CLA (100 mM). L-carnitina e CLA não afetaram o desenvolvimento embrionário quando adicionados ao meio de maturação. Apesar da L-carnitina não ter afetado a a taxa de reexpansão embrionária pós-descongelamento, o CLA apresentou efeito negativo sobre a eclosão embrionária 72h pós-descongelamento (53,3±3,6 vs. 65,1±4,3; P<0,05) quando adicionado ao meio de maturação oócitaria. Como conclusão, a L- carnitina melhora a criotolerância de embriões produzidos in vitro quando adicionada à concentração de 0,75 mM ao meio de cultivo embrionário. Já o CLA apresenta efeito negativo sobre a sobrevivência embrionária após o descongelamento quando adicionado ao meio de maturação oócitaria. / High lipid content in embryo is associated with low freezing tolerance. This study assessed the effects of exogenous L-carnitine and trans-10, cis-12 (t10, c12) conjugated linoleic acid (CLA) on in-vitro development and cryotolerance of bovine embryos when added during different stages of in vitro production of embryos. For all experiments, embryos were produced in vitro using slaughterhouse cows oocytes. Cleavage rates on Day 3, blastocyst and advanced blastocyst (hatching/hatched blastocyst) formation rates on Day 7 were calculated from the total number of oocytes subjected to in vitro fertilization (IVF). Expanded blastocysts-stage embryos from each treatment were harvested on Day 7 and subjected to slow freezing. Embryo viability was assessed 24, 48 and 72 h after thawing. In experiment 1, fertilized oocytes were incubated with different L-carnitine concentrations (0.0, 0.75, 1.50 or 3.03 mM) in the presence or absence of fetal bovine serum (FBS). There was an improvement (P<0.05) on embryo development when 1.5 mM of L-carnitine was added to in vitro culture (IVC) medium. L-carnitine had also a positive effect (P<0.05) on post thaw embryo competence when supplemented at 0.75 and 3.03 mM during IVC. There was no interaction (P>0.05) between the effects of L-carnitine and FBS supplementation on IVC on embryo development and cryosurvival. Although FBS supplementation had increased blastocyst development (P<0.05), it reduced the reexpansion rates at 24, 48 and 72 h post thawing. In experiment 2, L-carnitine (0.75 mM) or CLA (100 mM) were supplemented during the first 96 h, last 72 h or throughout the entire IVC period. There was no effect of L-carnitine or CLA supplementation during different periods of IVC on embryo development and cryotolerance. In experiment 3, embryo development and cryosurvival were evaluated when oocytes were maturated in medium supplemented with L-carnitine (3.03 mM) or/and CLA (100 mM). No effect of L-carnitine and CLA supplementation during in vitro maturation (IVM) on IVP embryo development was detected. Although there was no effect (P>0.05) of L-carnitine supplementation on embryo cryotolerance, CLA showed a negative effect (P<0.05) on embryo cryosurvival when added during IVM. In conclusion, L-carnitine improved embryo cryosurvival viiiwhen added at 0.75 mM during IVC and CLA supplementation during IVM has a negative effect on post thaw embryo survival.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-04-29Bitstream added on 2014-06-13T19:24:35Z : No. of bitstreams: 1 prado_fra_dr_jabo.pdf: 264327 bytes, checksum: dd7379d7711c643e9ed9087d9e75a42d (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / objetivo deste estudo foi contribuir para o conhecimento da técnica de criopreservação de embriões in vitro. Oócitos (n=965) foram maturados durante 24h em TCM-199 suplementado com 0,2mM de piruvato, 25 mM de bicarbonato de sódio e 75 mg/ml de gentamicina. Os zigotos foram cultivados em meio SOFm suplementado com 0,5% BSA e FCS 2,5%. Culturas foram realizadas a 38,5°C em 5% de CO2 no ar umidificado, em 100 μl de meio de gotículas recuperado com óleo mineral. No sétimo dia da cultura, os embriões (n = 387) foram marcados e apenas blastocistos excelente a boa qualidade foram criopreservados (10 embriões / palheta 0,25 ml). Os seguintes grupos experimentais foram concebidos, nomeado de acordo com a solução de crioprotetor utilizado: glicerol 1,0 M de etileno glicol em PBS (G); glicerol 1,0 M + 0,3 M de sacarose em PBS (GS); etilenoglicol 1.5 M em PBS (E) e 1,5 M + 0,3 M de sacarose em PBS (ES). Após o descongelamento, os embriões foram re-cultivadas em 100 ml de meio de gotas SOFm a 38,5 º C e 5% de CO2 no ar por 72 h. Os dados demonstraram que a qualidade do embrião, avaliada pelo escore de embriões e número de células embrionárias, parece ser melhor no grupo E e ES. No processo de vitrificação, 300 embriões de excelente qualidade morfológica, Bi e Bl foram vitrificados, e foram sincronizadas 500 receptoras de embriões, divididas em 3 grupos de 150 animais cada grupo. O diagnóstico de gestação nas receptoras após a inovulação dos embriões foram realizados após 42 dias. A taxa de concepção variou entre os grupos, sendo que no grupo I obteve 6 gestações (18,75%) de receptoras que receberam embriões da raça Nelore, 9 gestações (26,47%) de receptoras que receberam embriões da raça Brangus e 12 gestações (35,3%) de receptoras que receberam embriões da raça Brahman... / The aim of this study was to contribute to the knowledge of the technique of cryopreservation of embryos in vitro. Oocytes (n = 965) were matured for 24h in TCM- 199 supplemented with 0.2 mM pyruvate, 25 mM sodium bicarbonate and 75 mg / ml of gentamicin. Zygotes were cultured in medium supplemented with 0.5% SOFm BSA and 2.5% FCS. Cultures were performed at 38.5 ° C in 5% CO2 in humidified air in 100 l of medium droplets recovered with mineral oil. On the seventh day of culture, the embryos (n = 387) were scored and only good quality excellent blastocysts were cryopreserved (10 embryos / straw 0.25 ml). The following experimental groups were designed, named according to the cryoprotectant solution used: glycerol 1.0 M ethylene glycol in PBS (G) 1.0 M glycerol + 0.3 M sucrose in PBS (GS), ethylene glycol 1.5 M PBS (E) and 1.5 M + 0.3 M sucrose in PBS (ES). After thawing, the embryos were re-grown in 100 ml of medium SOFm drops to 38.5 º C and 5% CO2 in air for 72 h. The data demonstrated that embryo quality was evaluated by scoring the number of embryos and embryonic cells, seems to be better in group E and ES. In the process of vitrification, 300 embryos of excellent morphology, Bi and Bl, were vitrified, and 500 were synchronized embryo recipients were divided into 3 groups of 150 animals each group. Pregnancies after embryo transfer in recipient embryos were performed after 42 days. The conception rate varied between the groups, whereas in group I had six pregnancies (18.75%) of recipients that received embryos Nellore, 9 pregnancies (26.47%) of recipients that received embryos of Brangus and 12 pregnancies (35.3%) of recipients that received embryos from Brahman ... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2018-07-27T18:26:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-09-30. Added 1 bitstream(s) on 2018-07-27T18:30:18Z : No. of bitstreams: 1 000866601.pdf: 1192960 bytes, checksum: b230a294adc85fc16f62c1b42c3673a6 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste estudo foi verificar o efeito de diferentes meios e tempos de refrigeração sobre o desenvolvimento e expressão gênica de embriões bovinos produzidos in vitro. Para tanto, blastocistos D7 foram divididos em três grupos: controle, embriões mantidos em meio SOFaa, em incubadora de CO2, por 6 e 48h; refrigerados, embriões mantidos a 5 °C, em Meio 199, por 24 (M199-24h) e 48h (M199-48h) ou em meio BotuEmbryo®, por 24 (BE-24h) e 48h (BE-48h). Após a refrigeração, os embriões foram cultivados sob as mesmas condições do grupo controle para avaliação da viabilidade embrionária às 6 e 48h, e das taxas de reexpansão e eclosão, às 24 e 48h, respectivamente. Às 6h de cultivo parte dos embriões foi retirada e armazenada para posterior análise de qPCR e TUNEL. Menor porcentagem (P<0,05) de blastocistos viáveis, às 6 e 48h, foi observada no grupo M199-48 em relação ao grupo controle. A taxa de reexpansão não diferiu entre os embriões refrigerados e o grupo controle, porém, menor (P<0,05) taxa de eclosão foi observada nos grupos M199-48h e BE-48h do que no grupo controle. Maior (P<0,05) porcentagem de células apoptóticas foi observada no grupo BE-48h do que nos grupos controle e BE-24h. Os meios e tempos utilizados não alteraram a expressão dos genes HSPA1A, PRDX1, SOD1 e SLC2A1. Portanto, de modo geral, o meio e o tempo de refrigeração não promoveram efeito potencial adverso sobre a viabilidade embrionária, taxa de reexpansão e eclosão, número de células apoptóticas e expressão gênica, sugerindo o emprego do meio BotuEmbryo®, o qual é disponível comercialmente / This study was carried out to investigate the effects of different media and cooling times on the development and gene expression of in vitro-derived bovine embryos. Therefore, blastocysts D7 were divided into three groups: control, embryos kept in SOFaa medium, under CO2 incubation, for 6, 24 and 48 hours; cooled embryos, kept in Medium 199, for 24 (M199-24h) and 48 hours (M199-48h) or in BotuEmbryo® medium, for 24 (BE-24h) and 48 hours (M199-48h). After cooling, the embryos were cultured under the same conditions used for the control group for evaluation of embryo viability at 6 and 48 hours, and of re-expansion and hatching rates, at 24 and 48 hours, respectively. At 6h of culture part of the embryos was removed and stored for later analysis of qPCR and TUNEL. Low percentage (P<0.05) of viable blastocysts, at 6 and 48 hours, was observed in group M199-48h than for control group. Re-expansion rate did not differ between cooled embryos and control group, however, lower (P<0.05) hatching rate was observed in M199-48h and BE-48h groups than for control group. Higher (P<0.05) percentage of apoptotic cells was found in BE-48h compared with control and BE-24h groups. Media and cooling times used did not alter the expression of genes HSPA1A, PRDX1, SOD1 and SLC2A1. Thus, overall, medium and cooling time did not promoted potential adverse effect on the embryonic viability, re-expansion and hatching rate, number of apoptotic cells and gene expression, suggesting the use of BotuEmbryo® medium, which is commercially available / FAPESP: 13/15905-9

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-01-18T15:22:38Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 561367 bytes, checksum: 578cf6d1c681a3a9046579ae376b988c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-18T15:22:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 561367 bytes, checksum: 578cf6d1c681a3a9046579ae376b988c (MD5) Previous issue date: 2016-09-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os experimentos descritos no presente trabalho foram realizados com o objetivo geral de avaliar se a adição dos antioxidantes ácido ascórbico (AA) e ditiotreitol (DTT), ou o inibidor da caspase-3 (z-DEVD-fmk), durante a criopreservação podem melhorar o criotolerância de embriões bovinos produzidos in vitro. Foram realizados cinco experimentos representados assim: experimento 1, 2 e 3 no capitulo 1 e, experimento 4 e 5 no capitulo 2. Para todos os experimentos, os complexos cumulus- oócitos foram obtidos a partir de ovários de vacas de abatedouros. Os oócitos foram maturados, fertilizados e cultivados in vitro até o dia 7. Blastocistos e blastocistos expandidos foram aleatoriamente submetidos ao congelamento com taxa controlada seguindo o equilíbrio de 10 min em meio de congelamento (Hepes-TALP acrescido de 1,5 M de etilenoglicol e 0,1 M de sacarose) com os tratamentos tal como descrito abaixo. No experimento 1, os embriões foram equilibrados no meio de congelamento contendo 0,0; 0,1; 0,3 ou 0,5 mM de AA. Os embriões em palhetas foram então colocados numa máquina de congelamento programável em -6,0 °C a -32 °C antes de ser mergulhado em nitrogênio líquido (-196 °C). Em seguida, os embriões foram descongelados e cultivados durante 72 h em meio SOF-BE1 suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino a 38,5 °C numa atmosfera umidificada de 5% de CO 2, 5% O2 e 90% N2. Os embriões tratados com 0,1 mM de AA apresentaram maiores taxa de re-expansão às 24, 48 e 72 h e na taxa de eclosão às 72 h em comparação com os embriões do controle (P<0,05), assim, essa concentração foi considerada como ótima para os seguintes experimentos. Para o experimento 2 e 3, os embriões foram criopreservados em meio de congelamento contendo ou não 0,1 mM de AA, em seguida foram descongeladas e cultivadas durante 24 h. As concentrações intracelulares de espécies reativas de oxigénio foram reduzidos (P<0,001) pelo antioxidante AA (30,3 ± 2,4) em comparação com o controle (49,3 ± 1,9). Não houve efeito sobre o número total de células de blastocisto (P>0,05). Contudo, o AA 0,1 mM reduziu (P<0,001) a percentagem de células apoptóticas e a fragmentação do DNA comparado ao grupo controle. Os experimentos 4 e 5 foram conduzidos para avaliar os efeitos do DTT ou z-DEVD-fmk durante a criopreservação. Blastocistos e blastocistos expandidos foram equilibrados em meio de congelamento contendo DTT (0, 50, 100 e 200 μM) ou z-DEVD-fmk (0, 50, 100 e 200 μ M). Os embriões em palhetas foram colocados numa máquina de congelamento programável em -6,0 °C a -32 °C antes de ser mergulhado em nitrogênio líquido (-196 °C). Os embriões foram descongelados e cultivados em seguida durante 72 h. A taxas de re-expansão e eclosão foram registradas às 24, 48 e 72 h. Não houve efeito (P>0,05) do tratamento com DTT ou z-DEVD-fmk nas taxas de re-expansão e eclosão às 24, 48 ou 72 h pós- descongelamento. Este é o primeiro trabalho que utiliza os antioxidantes AA e DTT ou o inibidor específico da apoptose z-DEVD-fmk no meio de criopreservação de embriões bovinos produzidos in vitro. Em conclusão, a adição de AA (0,1 mM) no meio de congelamento lento melhora a crio-sobrevivência de embriões bovinos produzidos in vitro, reduz as concentrações intracelulares de espécies reativas de oxigénio e a fragmentação do DNA. Os tratamentos DTT e z-DEVD-fmk não apresentaram nenhum efeito sobre a sobrevivência dos embriões pós- descongelamento. / Experiments described in this study were performed with the overall objective to evaluate whether the addition of antioxidants ascorbic acid (AA) and dithiothreitol (DTT), or inhibitor of caspase-3 (z-DEVD-fmk) during cryopreservation could improve the cryotolerance of in vitro produced bovine embryos. Five experiments were performed and represented as follows: experiment 1, 2 and 3 in Chapter 2 and experiment 4 and 5 in Chapter 3. For all experiments, cumulus oocyte complexes were obtained from ovaries of slaughterhouse cows. Oocytes were in vitro matured, fertilized and cultured to day 7. Blastocysts and expanded blastocysts were randomly assigned to be subjected to controlled-rate freezing following equilibration for 10 min in freezing medium (Hepes-TALP plus 1.5 M ethylene glycol and 0.1 M Sucrose) with treatments as described below. For experiment 1, the embryos were equilibrated in freezing medium containing 0.0; 0.1; 0.3 or 0.5 mM of AA. The embryos into straws were then placed into programmable freezing machine at -6.0 °C to -32 °C prior to being plunged into liquid nitrogen (-196 °C). Then, embryos were thawed and cultured for 72 h in SOF-BE1 supplemented with 10% (v/v) fetal bovine serum at 38.5 oC in a humidified atmosphere of 5% CO2, 5% O2 and 90% N2. Embryos treated with 0.1 mM AA showed higher re-expansion at 24, 48 and 72 h and hatching rates at 72 h compared to control embryos (P<0.05), thus concentration was considered as the optimal for the sequential experiments. For experiment 2 and 3, embryos were cryopreserved in freezing medium containing or not 0.1 mM AA, then were thawed and cultured for 24 h. Intracellular reactive oxygen species levels were reduced (P<0.001) by AA treatment (30.3 ± 2.4) compared with control (49.3 ± 1.9). There was no effect of the total cells number of blastocyst (P>0.05). However, 0.1 mM AA reduced (P<0.001) the percentage of apoptotic cells and DNA fragmentation compared with the control group. Experiments 4 and 5 were conducted to assess the effects of DTT or z-DEVD-fmk during cryopreservation. Blastocyst and expanded blastocysts embryos were equilibrated in freezing medium containing DTT (0, 50, 100 and 200 μM) or z-DEVD-fmk (0, 50, 100 and 200 μM). The embryos into straws were then placed into programmable freezing machine at - 6.0 °C to -32 °C prior to being plunged into liquid nitrogen (-196 °C). Embryos were thawed and then cultured for 72 h. Re-expansion and hatching rates were recorded at 24, 48 and 72 h. There was no effect (P>0.05) of treatment with DTT or z-DEVD- fmk on re-expansion or hatching rates at 24, 48 or 72 h post-thaw. This is the first report that used AA and DTT antioxidants or z-DEVD-fmk a specific inhibitor of the apoptosis in the cryopreservation medium of in vitro produced bovine embryos. In conclusion, addition of AA (0.1 mM) in slow-freezing medium improves the cryosurvival of in vitro produced bovine embryos, reduces intracellular reactive oxygen species levels and DNA fragmentation. DTT and z-DEVD-fmk treatments had no effect on post-thaw embryo survival.

Orientador: Joaquim Mansano Garcia / Banca: César Roberto Esper / Banca: Karina Beloti Avelino / Resumo: Dentre as biotecnologias aplicadas à reprodução animal, atualmente um dos maiores desafios é a criopreservação de embriões PIV. Esses embriões apresentam alta criosensibilidade, devido principalmente a excessiva deposição lipídica no citoplasma, e que por sua vez está relacionada com a utilização de SFB nos meios. Neste trabalho foram avaliados os efeitos da suplementação protéica com BSA, SFB e FE e suas associações na PIV de embriões bovinos durante as etapas de MIV e CIV, visando melhorar sua criotolerância. Na MIV foram utilizadas sete diferentes combinações (SFB, BSA, FE, BSA+SFB, BSA+FE, SFB+FE e BSA+SFB+FE), e no CIV quatro tratamentos (BSA, BSA+SFB, BSA+FE e BSA+SFB+FE). Os embriões em estádios de Bl e Bx foram vitrificados e após seu reaquecimento foram avaliadas as taxas de eclosão embrionária em 24 e 48 horas. Dos oócitos colocados em maturação, obteve-se um total de 85,4% de clivagem e 35,52% de produção embrionária. Ao analisar os efeitos da fonte protéica na MIV notou-se que o grupo tratado com BSA apresentou as piores taxas de clivagem (80,96%) (p<0,05) em relação aos demais grupos, o melhor resultado de produção embrionária foi obtido com BSA+SFB (46,69%) e os melhores índices de eclosão embrionária pós reaquecimento foram nos tratamentos BSA+FE (44,35%), SFB+FE (44,90%) e BSA+SFB+FE (42,48%). Quando se avaliou os efeitos de fonte protéica na CIV, não houve diferença significativa entre os tratamentos quanto a clivagem, o BSA apresentou o pior desempenho na produção de embriões (31,88%) (p<0,05) em relação aos demais grupos que não diferiram entre si, e os melhores índices de eclosão embrionária 24 e 48h pós reaquecimento foram obtidos com o tratamento BSA+FE (37,64% e 51,34%, respectivamente) / Abstract: Among the biotechnology applied to animal reproduction, nowadays one of the biggest challenges is the cryopreservation of embryos produced in vitro. These embryos have a high cryosensitivity, mainly due to excessive fat deposition in the cytoplasm, which in turn is related with the FCS used in the mediums for embryo production in vitro. The aim of this study was to evaluate the effects of protein supplementation with BSA, FBS and FE, and their associations in IVP bovine embryos during the stages of IVM and IVC, to improve their cryotolerance. For IVM were used seven different combinations (FCS, BSA, FE, BSA + FCS, BSA + FE, FE and FBS + BSA + FCS + FS), and four treatments during IVC (BSA, BSA + FCS, BSA + FE, BSA+ FE+ FCS). Embryos in stage of Bl and Bx were vitrified and after their reheating the rates of hatched blastocysts at 24 and 48 hours were evaluated. Of the oocytes placed into maturation, we obtained 85.4% of cleavage and 35.52% of embryo produced. When were evaluated the effects of protein source in IVM was noted that the BSA-treated group showed the worst rates of cleavage (80.96%) (p <0.05) compared to other groups, the best result of embryo production was obtained with FCS + BSA (46.69%) and the highest rates of hatched blastocysts after rewarming were obtained with FE + BSA (44.90%), FE + FCS (44.35%) and FS + FCS + BSA ( 42.48%). When we assessed the effects of protein source in the IVC, there was no significant difference between treatments for the cleavage, the BSA group had the worst performance in the production of embryos (31.88%) (p <0.05) compared to other groups that not differ, and the highest hatched blastocysts in 24 and 48 hours after rewarming were obtained by treating BSA + FE (37.64% and 51.34%, respectively) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-25Bitstream added on 2014-06-13T19:59:06Z : No. of bitstreams: 1 lima__mr_me_jabo.pdf: 1535432 bytes, checksum: 7fba3e3ae5e6792c02b0d8168157e36d (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Dentre as biotecnologias aplicadas à reprodução animal, atualmente um dos maiores desafios é a criopreservação de embriões PIV. Esses embriões apresentam alta criosensibilidade, devido principalmente a excessiva deposição lipídica no citoplasma, e que por sua vez está relacionada com a utilização de SFB nos meios. Neste trabalho foram avaliados os efeitos da suplementação protéica com BSA, SFB e FE e suas associações na PIV de embriões bovinos durante as etapas de MIV e CIV, visando melhorar sua criotolerância. Na MIV foram utilizadas sete diferentes combinações (SFB, BSA, FE, BSA+SFB, BSA+FE, SFB+FE e BSA+SFB+FE), e no CIV quatro tratamentos (BSA, BSA+SFB, BSA+FE e BSA+SFB+FE). Os embriões em estádios de Bl e Bx foram vitrificados e após seu reaquecimento foram avaliadas as taxas de eclosão embrionária em 24 e 48 horas. Dos oócitos colocados em maturação, obteve-se um total de 85,4% de clivagem e 35,52% de produção embrionária. Ao analisar os efeitos da fonte protéica na MIV notou-se que o grupo tratado com BSA apresentou as piores taxas de clivagem (80,96%) (p<0,05) em relação aos demais grupos, o melhor resultado de produção embrionária foi obtido com BSA+SFB (46,69%) e os melhores índices de eclosão embrionária pós reaquecimento foram nos tratamentos BSA+FE (44,35%), SFB+FE (44,90%) e BSA+SFB+FE (42,48%). Quando se avaliou os efeitos de fonte protéica na CIV, não houve diferença significativa entre os tratamentos quanto a clivagem, o BSA apresentou o pior desempenho na produção de embriões (31,88%) (p<0,05) em relação aos demais grupos que não diferiram entre si, e os melhores índices de eclosão embrionária 24 e 48h pós reaquecimento foram obtidos com o tratamento BSA+FE (37,64% e 51,34%, respectivamente) / Among the biotechnology applied to animal reproduction, nowadays one of the biggest challenges is the cryopreservation of embryos produced in vitro. These embryos have a high cryosensitivity, mainly due to excessive fat deposition in the cytoplasm, which in turn is related with the FCS used in the mediums for embryo production in vitro. The aim of this study was to evaluate the effects of protein supplementation with BSA, FBS and FE, and their associations in IVP bovine embryos during the stages of IVM and IVC, to improve their cryotolerance. For IVM were used seven different combinations (FCS, BSA, FE, BSA + FCS, BSA + FE, FE and FBS + BSA + FCS + FS), and four treatments during IVC (BSA, BSA + FCS, BSA + FE, BSA+ FE+ FCS). Embryos in stage of Bl and Bx were vitrified and after their reheating the rates of hatched blastocysts at 24 and 48 hours were evaluated. Of the oocytes placed into maturation, we obtained 85.4% of cleavage and 35.52% of embryo produced. When were evaluated the effects of protein source in IVM was noted that the BSA-treated group showed the worst rates of cleavage (80.96%) (p <0.05) compared to other groups, the best result of embryo production was obtained with FCS + BSA (46.69%) and the highest rates of hatched blastocysts after rewarming were obtained with FE + BSA (44.90%), FE + FCS (44.35%) and FS + FCS + BSA ( 42.48%). When we assessed the effects of protein source in the IVC, there was no significant difference between treatments for the cleavage, the BSA group had the worst performance in the production of embryos (31.88%) (p <0.05) compared to other groups that not differ, and the highest hatched blastocysts in 24 and 48 hours after rewarming were obtained by treating BSA + FE (37.64% and 51.34%, respectively)