Orientador: Osvaldo Magro Filho / Resumo: A adaptação entre a plataforma do implante e seu respectivo abutment deve ser precisa, isto é, sem nenhuma fenda, que é denominada microgap, entre as estruturas. A presença do microgap permite que microorganismos presentes na microbiota bucal migrem para o interior do implante, o que pode ocasionar problemas de natureza inflamatória e ou infecciosa, e, conseqüentemente, causar a perda do implante. Neste estudo utilizamos uma amostragem de 26 (vinte e seis) implantes e seus respectivos abutments provenientes de 5 (cinco) marcas comerciais diferentes: AS Tecnology, Conexão Sistema de Prótese, Neodent Implante Osteointegrado, Sterngold Implamed, e 3i Implant Innovation. Os abutments receberam um torque de 20Ncm. Os cortes longitudinais da interface implante/abutment foram mensurados em 6 (seis) locais com o auxílio da microscopia eletrônica de varredura. Os resultados das mensurações foram submetidos à análise estatística. Foi possível concluir que: 1) A seqüência dos grupos, em relação ao gap encontrado, do menor para o maior, foram: abutment cônico, abutment gold ucla, abutment mult unit. 2) O abutment cônico e o abutment mult unit apresentaram gaps menores que o abutment gold ucla. 3) O ponto interno apresentou gap menor em relação ao ponto médio, o qual foi menor que o ponto externo, portanto, as peças tenderam a convergir para o ponto interno. / Abstract: The adaptation of the implant platform and its respective abutment must be precise, with no space denominated microgap, between the structures. The presence of a microgap allows microorganisms that are present in the buccal microbiology to migrate into the implant, what could cause inflammatory and/or infectious problems, and consequent loss of the implant. In this study, a sample of 26 (twenty six) implants and their respective abutments was taken: conic, multi unit, and the gold ucla - together with their respective fixing screws. The abutments received a manual torque of 20Ncm. After the manual preparation, the interface implant/abutment longitudinal cuts were measured on 6 (six) different points through an Scanning Electron Microscope (SEM). The results of such measurements were statistically analyzed, and according to the experimental conditions of this study, was possible to conclude: 1) The sequential groups of implants/abutments, in relation to the gap found, from the smaller to the biggest, were: a) conic abutment , b) gold ucla abutment , c) multi unit abutment. 2) The conic and the multi unit abutments showed smaller gaps than the gold ucla abutments. 3) The internal point showed a smaller gap than the middle point, and the middle point, in return, also showed a smaller gap in relation to the external point; therefore, the pieces tended to converge to the internal point. / Mestre

Orientador: Valfrido Antonio Pereira Filho / Resumo: O objetivo desse estudo foi avaliar a resposta óssea peri-implantar de implantes osseointegrados de titânio com dois tipos de tratamento de superfície, na presença ou não de substituto ósseo. Para tanto, foram utilizados 92 implantes dentários que foram divididos em quatro grupos de acordo com a superfície do implante e a presença de hidroxiapatita/beta-tricálcio fostato (HA/TCP) ou coágulo sanguíneo (BC) no defeito peri-implantar: (BC-A = implantes de superfície porosa e hidrofílica sem enxerto de substituto ósseo; HA/TCP-A = implantes de superfície porosa e hidrofílica com enxerto de substituto ósseo; BC-N = implantes de superfície porosa sem enxerto de substituto ósseo; HA/TCP-N = implantes de superfície porosa com enxerto de substituto ósseo). Os implantes foram instalados nas tíbias de 46 coelhos, sendo que cada animal recebeu dois implantes. Os animais foram submetidos a eutanásia em três diferentes períodos: 15 (n=10), 30 (n=10), e 60 (n=26). Após, as amostras foram submetidas a avaliação da qualidade óssea por meio das análises histológica por coloração Hematoxilina-Eosina, imuno-histoquímica para detecção dos anticorpos RUNX2, OPN, OCN, OPG, RANK-L e proteínas presentes na matriz óssea, utilizando imunoperoxidase para detecção e 3,3-diaminobenzidiana e de micro-tomografia computadorizada (micro-CT). Ainda, foi também realizada análise e avaliação histomorfométrica para quantificação do contato osso-implante (BIC) e a expressão gênica foi verificada por meio dos marca... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

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L’endothélium cornéen est responsable de la déturgescence, un processus de déshydratation nécessaire à la transparence de la cornée. La dystrophie endothéliale cornéenne de Fuchs (FECD) est la principale cause de dysfonction endothéliale chez l’humain. C’est une maladie multifactorielle associée à (1) une plus grande apoptose dépendante du stress oxydatif des cellules endothéliales cornéennes, (2) un dépôt accru de protéine matricielle causant un épaississement de la membrane basale, et finalement (3) une perte de la capacité des cellules à assurer la déturgescence cornéenne. Actuellement, les modèles d’étude de la FECD montrent une capacité limitée à caractériser l’étiologie de la maladie, ce qui restreint notre capacité à développer des traitements pharmacologiques appropriés. Le seul traitement pour cette pathologie est la greffe de cornée. Afin d’étudier cette pathologie, mon laboratoire a développé des techniques de culture et de reconstruction par génie tissulaire d’endothélia FECD. Mes travaux ont utilisé ces modèles afin de comparer, par profilage génique, PCR quantitatif, immunofluorescence, résistance transendothéliale et essai de perméabilité, l’expression, la distribution et les capacités fonctionnelles des molécules impliquées dans la déturgescence et la sécrétion matricielle. Les résultats de mes études ont montré que les protéines associées à la fonction des cellules FECD (familles de transporteurs ioniques et de jonctions intercellulaires) n’avaient aucune différence d’expression suivant la mise en culture lorsque comparées à des équivalents non pathologiques. De plus, aucune différence fonctionnelle n’a été déterminée par résistance transendothéliale et essai de perméabilité. Toutefois, une plus grande quantité de fibronectine était déposée sous les cellules. Ce faisant, ces études suggèrent que la perte de fonction dans la FECD n’aurait pas un rôle primaire dans la pathologie et serait secondaire à un dépôt anormal de fibronectine. Des recherches antérieures du laboratoire avaient démontré une amélioration dans l’expression des marqueurs de fonctionnalité suite à des greffes in vivo. Le 3e objectif présenté dans cette thèse était de déterminer si les conditions environnementales in vivo (telle que la pression intraoculaire) étaient impliquées dans cette amélioration. Pour ce faire, nous avons utilisé un système de chambre antérieure artificielle permettant d’exercer une pression sur l’endothélium dans un circuit fermé. Cette étude a montré une plus grande expression de ZO-1 à la périphérie des cellules endothéliales, une protéine associée aux jonctions serrées, par la pression. Ce résultat met en perspective l’importance de l’environnement sur la fonctionnalité de l’endothélium cornéen. / The role of the corneal endothelium is to maintain the corneal transparency by a partial dehydration process named deturgescence. Fuchs endothelial corneal dystrophy (FECD) is the main cause of human endothelial dysfunction. It is a multifactorial disease associated with an increased oxidative-related cell death, a thickened basal lamina and a loss in the endothelial pump function resulting in a corneal opacification. Due to the lack of appropriate models, the exact cause of the pathology remains unknown, which restrains our ability to develop appropriate pharmacological treatments. As of now, the only cure is the transplantation of a healthy endothelium from a deceased donor. My laboratory has previoulsly developed in vitro cell and tissue models of FECD. My research projects used these models and analyzed, by gene profiling, quantitative PCR, immunofluorescence, trans-endothelial resistance and permeability assay, the expression, the distribution and the functional capacity of molecules engaged in deturgescence and extracellular matrix (ECM) deposition. Results show no difference between FECD and healthy cells for genes and proteins related to deturgescence (ion transporters and intercellular jonctions). However, an increased deposition of fibronectin was observed. These studies therefore suggest that the endothelial dysfunction would not be a primary aspect of the pathology and would rather be secondary to an aberrant deposition of fibronectin. A previous in vivo study showed an amelioration of the endothelial phenotype upon transplantation in an animal model. It suggested a beneficial effect from the environment, such as the intraocular pressure (IOP). The effect of pressure on the endothelium was investigated by placing tissue-engineered endothelia in an artificial anterior chamber that mimicked the natural IOP. Increased ZO-1, a protein associated with tight junctions, was observed at the cell periphery. This result suggest that the in vivo environment influences the functionality of the corneal endothelium.

Le présent travail est consacré à l’étude de la construction de la nation en Colombie au XIXe siècle, sujet qui a été traditionnellement étudiée par des historiens et dont le thème de la langue nationale est complètement négligé. Cette problématique est liée au fait que les scientifiques du langage en Colombie n’ont jamais traité le problème de la langue et sa relation avec la nation c’est pourquoi cette nécessité s’impose. Une deuxième préoccupation concerne le rôle des grammairiens-politiciens dans la conformation de la nation. L’élite éclairée qui a participé à l’indépendance et celle d’après qui a fondé la nation ont choisi le modèle de nation européen, et en même temps ont développé une stratégie où le mécanisme administratif colonial espagnol est remplacé par d’autres mécanismes de colonisation interne, que j’appelle d’endo-colonisation. La période d’étude de cette recherche commence en 1770 par l’édit royal du 10 mai qui interdit l’usage des langues autochtones dans tout le royaume espagnol, en passant par la création de l’Académie Colombienne de la Langue Espagnole en 1871, première Académie correspondante de l’Académie Royale Espagnole dans le monde jusqu’à 1886 année de la promulgation de la Constitution nationale qui a dominé le panorama politique Colombien au XXe siècle. L’étude de cette longue période implique l’élaboration d’une méthode d’analyse basée sur la combinaison de la méthode archéologique, généalogique et l’analyse du discours. Elle implique aussi une réflexion sur les rapports pouvoir-savoir et sur la production de subjectivités, qui interrogent notre passé à partir du présent. / This work is devoted to the construction of the nation in Colombia in the nineteenth century. This subject has been traditionally studied by historians who had neglected the national language theme related to the fact that language scientists in Colombia have never studied the relationship between nation and language. That’s why the need arises.A second concern is the role of grammarians-politicians in the conformation of the nation. The enlightened elite who participated in the independency and that who succeeded founding the nation chose the European nation model and at the same time developed a strategy where the Spanish colonial administrative mechanism is replaced by other internal colonization mechanisms that I call endo-colonization. This study examines the period between 1770 when the royal decree of May 10th prohibits the use of natives languages throughout the Spanish kingdom; going through the creation of the Colombian Academy of the Spanish Language in 1871 corresponding the Royal Spanish Academy, until the 1886 Constitution, which dominated the Colombian political landscape of the twentieth century. This study of this period involves the development of an analytical method based on the combination of archaeological, genealogical and discourse analysis method. It also involves a reflection about the relation power-knowledge and the production of subjectivities that interrogates our past from the present.

As mudanças climáticas estão causando prejuízos em vários setores da economia mundial. Na reunião da COP21, que teve como foco estas mudanças climáticas, participantes do mundo todo decidiram tomar atitudes urgentes para tentar conter aumento da temperatura média global. Dentro deste cenário, a produção e o consumo de energia têm uma importância central, onde fontes de energia renováveis vêm sendo preferidas às fontes de energias fósseis. O Brasil tem uma participação importante na geração de energia renovável mundial aportando um 40% do total de sua matriz energética. A degradação dos componentes da parede celular vegetal tem um vasto potencial na geração de biocombustíveis e outros compostos verdes a partir da celulose, hemicelulose e lignina. Para isto estudos das enzimas capazes de degradas estes componentes vem sendo realizados, com ênfase nas enzimas hidrolases de glicosídeos. Dentre as hidrolases, encontram-se as arabinanases, enzimas capazes de hidrolisar o arabinano, componente polissacídeo da hemicelulose, em L-arabinose. Neste trabalho, estudos envolvendo duas arabinanases de Bacillus licheniformis foram realizados, iniciando na etapa de clonagem dos genes. Os produtos foram transformados em Escherichia coli e expressos e purificados. A avaliação da estabilidade térmica indicou uma afinidade das enzimas por metais divalentes. Tentativas de cristalização resultaram na formação de um cristal, que possibilitou a determinação da estrutura uma das arabinanases. Através de ensaios bioquímicos, foi determinada a especificidade por substrato, temperatura e pH ótimos e a atividade frente a metais. Foi observado que as enzimas são seletivas para arabinano não ramificado, tem temperatura ótima em 45 e 40 graus, para BlAbn-1 e BlAbn-2, respectivamente, e pH ótimo em 8 e 7. Por último, foram realizados ensaios complementares de sinergismo e atividade oxidativa. Embora os ensaios de atividade oxidativa tenham sido inconclusivos, os ensaios de sinergismo mostraram que a enzima BlAbn-1 é capaz de aumentar em 30% a atividade do coquetel enzimático Accellerase 1500 sobre biomassa pré-tratada e sobre celulose pura. Este efeito é ainda maior na presença de sulfato de níquel. / Climate change is causing losses in different sectors of the world economy. At the meeting of COP21, focused on climate changes, participants from around the world decided to take urgent actions to try to halt the increase in global average temperature. Within this scenario, the production and consumption of energy are of central importance, where renewable energy sources have been preferred to fossil fuels. Brazil has an important role in the global renewable energy generation by contributing 40% of its total energy mix. The degradation of the components of plant cell wall has a vast potential in the generation of biofuels and other green chemical from cellulose, hemicellulose and lignin. Thus, studies of enzymes that degrade these components have been carried out, with emphasis on glycoside hydrolases. Among the hydrolases are the arabinanases, enzymes capable of hydrolyzing arabinan, a polysaccharide component of hemicellulose, in L-arabinose. In this work, studies involving two arabinanases from Bacillus licheniformis were carried out, starting in gene cloning step. The products were transformed into Escherichia coli, expressed and purified. The evaluation of the thermal stability of the enzymes showed an affinity for divalent metals. Crystallization attempts resulted in the formation of a single crystal, which made it possible to determine the crystal structure of one arabinanase. Through biochemical assays, it was determined the substrate specificity, optimum temperature and pH and activity against metals. It was observed that the enzymes are selective for non-branched arabinan, have optimum temperature at 45 and 40 degrees, to BlAbn-1 and BlAbn-2, respectively, and optimum pH of 8 and 7. Finally, additional tests were performed to evaluate the possible synergism and oxidative activity. Although the oxidative activity assays were inconclusive, the synergism tests showed that BlAbn-1 is able to increase by 30% the activity of the enzymatic cocktail Accellerase 1500 on pre-treated biomass and on pure cellulose. This effect is even greater in the presence of nickel sulfate.

A viabilidade econômica da produção de etanol de segunda geração (2G) depende do desenvolvimento de tecnologias eficientes e baratas para a hidrólise da biomassa lignocelulósica. Em particular, o grande consumo de água nas plantas de processamento de biomassa pode inviabilizar o processo. As xilanases são enzimas chave na hidrólise enzimática da xilana para a produção de etanol 2G e atualmente é grande o interesse na identificação de xilanases tolerantes a altas concentrações salinas, bem como aos subprodutos de etapas de pré-tratamento da biomassa, o que permitiria reduzir o volume de água empregado em etapas de lavagem e/ou a substituição da água doce pela água do mar. Neste contexto, os objetivos deste trabalho foram a purificação e caracterização bioquímica e cinética de uma endo-xilanase halotolerante e termoestável produzida por uma linhagem de C. graminicola isolada da floresta Amazônica (Brasil). A enzima pura (Excg1) apresentou massa molecular aparente de 20,0 ± 2,4 kDa em SDS-PAGE e 17,3 ± 1,9 kDa por filtração em gel, sugerindo que a enzima nativa é monomérica. O teor de carboidratos totais de Excg1 foi de 97,0 ± 3,7 % (m/m) e o seu ponto isoelétrico correspondeu a 9,200 ± 0,018. A enzima manteve cerca de 85% da atividade controle na presença de NaCl 0,5 mol/L. Em ausência e presença de NaCl em concentração 0,5 mol/L a temperatura e o pH ótimos de atividade de Excg1 foram 65 ºC e 5,5, respectivamente, enquanto na presença de NaCl 2,5 mol/L o pH ótimo foi alterado para 6,0. Excg1 mostrou-se bastante termoestável a 50ºC, com tempo de meia-vida de 48 h na ausência do substrato. Já na presença de NaCl 2,5 mol/L a termoestabilidade foi substancialmente maior, com atividade residual de 75% após o mesmo intervalo de tempo. Excg1 apresentou excelente estabilidade na faixa de pH de 3,0-10,0 na ausência de sal, mantendo-se também completamente estável entre pH 4,0 e 10,0 na presença de NaCl em concentração 0,5 e 2,5 mol/L. Os parâmetros cinéticos determinados para a hidrólise de xilana Beechwood por Excg1 na ausência de NaCl foram Vmax= 481,3 ± 34,0 U/mg e KM= 3,7 ± 0,3 mg/mL, resultando em eficiência catalítica (kcat/KM) de 36,9 mL/s.mg. Parâmetros muito similares foram determinados na presença de NaCl 0,5 mol/L, porém em presença do sal em concentração 2,5 mol/L ocorreu diminuição da afinidade aparente pelo substrato e redução da velocidade máxima, resultando em eficiência catalítica 2,3 vezes menor. Já a hidrólise de xilana Birchwood em ausência de sal ocorreu com constante de afinidade aparente similar e eficiência catalítica cerca de 18% maior, se comparada à hidrolise de xilana Beechwood na mesma condição. Excg1 foi tolerante a K+, Na+, Pb2+, Ni2+, Zn2+, Mn2+, Mg2+, Co2+, Ca2+ e Sr2+ em concentração 10 mmol/L, além de Cu2+, Al3+, Cr3+ e Fe3+ em concentração 1 mmol/L. Além disso, Excg1 foi tolerante a diferentes solventes orgânicos e a acetato. A análise dos produtos de hidrólise de xilana Beechwood por Excg1 revelou que os produtos principais formados foram xilobiose e xilotriose com uma ramificação de ácido 4-O-metilglucurônico. A presença de NaCl 0,5 mol/L não afetou este padrão de hidrólise e a enzima mostrou também boa tolerância aos produtos de hidrólise. Em conjunto, as propriedades de Excg1 sugeriram bom potencial de aplicação na sacarificação da biomassa lignocelulósica, particularmente em condições de salinidade elevada e/ou em presença de resíduos de etapas de pré-tratamento, o que é potencialmente interessante para viabilizar economicamente processos de produção de etanol 2G. / The economic viability of the production of second-generation (2G) ethanol depends on the development of efficient and inexpensive technologies for the hydrolysis of lignocellulosic biomass. In particular, the large consumption of water in the biomass processing plants can make the process unfeasible. The xylanases are key enzymes in the enzymatic hydrolysis of xylan aiming the production of 2G ethanol and there is currently great interest in identifying xylanases tolerant to high salt concentrations and to the byproducts from biomass pretreatment steps, allowing the reduction of the volume of water used in washing steps and/or the replacement of fresh water by sea water. In this context, the objectives of this work were the purification and the biochemical and kinetic characterization of a salt-tolerant and thermostable endoxylanase produced by a strain of C. graminicola isolated from the Amazon forest (Brazil). The pure enzyme (Excg1) showed apparent molecular mass of 20.0 ± 2.4 kDa by SDS-PAGE and 17.3 ± 1.9 kDa by gel filtration, suggesting that the native enzyme is monomeric. The total carbohydrate content of Excg1 was 97.0 ± 3.7% (m/m) and its isoelectric point corresponded to 9.200 ± 0.018. The enzyme retained approximately 85% of control activity in the presence of 0.5 mol.L-1 NaCl. In the absence and presence of NaCl at 0.5 mol.L-1 concentration, the optimum reaction temperature and pH of Excg1 were 65 ° C and 5.5, respectively, while in the presence of 2.5 mol.L-1 NaCl the optimum pH was altered to 6.0. Excg1 was highly thermostable at 50 °C, with a half-life of 48 h in the absence of substrate. In the presence of 2.5 mol.L-1 NaCl the thermal stability was greatly increased, and a residual activity of 75% was determined after 48 h at 50 ºC. Excg1 showed excellent stability in the pH range from 3.0 to 10.0 in the absence of salt, and was likewise completely stable at pH 4.0-10.0 in the presence of NaCl at the concentrations 0.5 mol.L-1 and 2.5 mol.L-1. The kinetic parameters for the hydrolysis of Beechwood xylan by Excg1 in the absence of salt were Vmax = 481.3 ± 34.0 U.mg-1 and KM = 3.7 ± 0.3 mg.mL-1, with a catalytic efficiency (kcat/KM) of 36.9 mL.s-1.mg-1. Similar parameters were determined in the presence of 0.5 mol.L-1 NaCl, while in the presence of a higher salt concentration (2.5 mol.L-1) decreases in the apparent affinity for the substrate and in the maximum velocity were observed, resulting in a catalytic efficiency 2.3 fold lower. In comparison with Beechwood xylan, the hydrolysis of Birchwood xylan in the absence of salt occurred with similar apparent affinity and catalytic efficiency about 18% greater. Excg1 was tolerant to 10 mmol.L-1 K+, Na+, Pb2+, Ni2+, Zn2+, Mn2+, Mg2+, Co2+, Ca2+ or Sr2+, and also to Cu2+, Al3+, Cr3+ e Fe3+ at 1 mmol.L-1 concentration. Furthermore, the enzyme was tolerant to various organic solvents and acetate. The analysis of Beechwood xylan hydrolysis products by Excg1 revealed that the main products were xylobiose and xylotriose with a 4-O-methylglucuronic acid branch. The presence of 0.5 mol.L-1 NaCl has not affected the hydrolysis pattern and the enzyme showed good tolerance to the hydrolysis products. Altogether, the properties of Excg1 suggested good potential for the saccharification of lignocellulosic biomass, particularly under high salinity conditions and/or in the presence of residues of pre-treatment steps, which is potentially interesting for the economically viable production of 2G ethanol.

Este trabalho procurou avaliar algumas isozimas envolvidas com o processo de degradação de polissacarídeos da parede celular vegetal, encontradas em Aspergillus versicolor, fungo pertencente a um gênero onde a multiplicidade de componentes enzimáticos com a mesma atividade oscila de uma a três. Duas ß-xilosidases foram purificadas por meio de DEAE-celulose e precipitação com sulfato de amônia. Ambas mostraram-se enzimas que, quando deglicosiladas por PNGaseF, apresentam mesmos mapas trípticos. A glicosilação mostrou-se importante para a manifestação de diferenças bioquímicas relacionadas às interações com ambiente eletrolítico adjacente, visto as mudanças das curvas de pH e alterações de comportamento frente a sais de íons metálicos, tão bem como para a manutenção do funcionamento das enzimas. Também foi verificado que as diferentes formas glicosiladas periplásmicas são produzidas em meios distintos (xilana e xilose), cujos pH finais corresponderam aos pH das enzimas encontradas. Por meio de zimogramas, verificou-se que estas não eram produzidas de imediato, mas selecionadas ao longo do tempo de cultivo. Esta seleção foi inicialmente independente do pH, visto este, mesmo tamponado, ser corrigido pelo fungo, de modo a se apresentar, ao final de 48h, correlato com o da enzima selecionada. Exame cromatográfico em Concanavalina-A das enzimas deglicosiladas por EndoH mostraram que a oriunda de xilana tem aporte maior de ramificações biantenárias, que são ricas em galactose. Ambas apresentaram mapas trípticos iguais. A ß-xilosidase induzida por xilana apresentou proporções de manose, galactose e glucose iguais a 69,68 : 30,25 : 0,056 %, respectivamente, enquanto que ß-xilosidase induzida por xilose apresentou proporções iguais a 85,35 : 14,54 : 0,094%, respectivamente, resultado que corrobora com a resultado anterior. Duas ß-glucosidases de superfície micelial foram purificadas por meio de DEAE-Sephacel e DEAE-celulose. Ambas mostraram-se mais semelhantes entre si que as ß-xilosidases, e independentes de fonte de carbono ou pH. No entanto, apresentaram diferenças frente à inibição por celobiose (acentuada a partir de 10mM para ß-glucosidase I e 20mM para B-glucosidase II) e, embora sutis, a pH. Após serem submetidas a 45 ºC por 30min (temperatura que induziu segunda conformação estável) mostraram curvas de pH muito distintas, que foram eliminadas nas enzimas submetidas ao mesmo experimento após deglicosilação por PNGaseF. Ambas apresentaram mapas trípticos iguais. A ß-glucosidase I mostrou-se constituída de Man:Gal:Glu em proporções iguais a 78,36%:21,61%:0,033% do carboidrato total, respectivamente, e a ß-glucosidase II, Man:Gal:Glu iguais a 83,59%:16,38%:0,028%, respectivamente. Ambas também apresentaram sinergismo quando juntas. Sobre celobiose, foi verificado apenas em pH acima de 5.5. Sobre celooligossacarídeos, manifestou-se em pH 5,25. A ß-glucosidase I foi menos ativa que a ß-glucosidase II quando em ausência de glucose e celobiose na solução de reação inicial, situação na qual o contrário foi verdadeiro. O sinergismo foi drasticamente eliminado após deglicosilação por PNGaseF. Não se sabe se este resultado foi oriundo de mudanças cinéticas provocadas pela deglicosilação ou de uma possível eliminação de agregação anteriormente existente entre glicosiladas. O componente ß-glicosidásico extracelular foi purificado por meio de DEAE-Sephacel e Octyl-Sepharose, e se revelou um heteroagregado de fosfatase ácida com ß-glicosidase, que se mostrou estável e ativo em ampla gama de temperaturas e pH, com ótimos de 55ºC e 5,5, respectivamente. Entretanto, os perfis das curvas foram distintos entre as enzimas componentes. Somente concentrações superiores a 0,8mM de cloreto de cobalto apresentaram efeito desagregador, podendo ser empregado em conjunto com DEAE-celulose para purificação das enzimas isoladas. Quando separadas, fosfatase mostrou-se 260% mais ativa e ß-glicosidase, 50% menos ativa. Nesta condição, as faixas de pH se restringiram, acidificando-se, localizando-se entre pH 4,0 e 5,5. Aparentemente, a agregação reforça a atividade celobiásica. Fosfatase foi ativa sobre farelo de trigo e fitato de sódio e adsorveu fortemente em farelo de trigo. ß-glicosidase apresentou atividade sobre farelo de trigo, xilana e Avicel (liberando apenas glicose desta última), revelando-se enzima com atividade celobioidrolásica inespecífica, embora ávida por celobiose. As atividades foram determinadas como oriundas do mesmo sítio catalítico. ß-glicosidase não foi seqüestrada por farelo de trigo quando desagregada, resultado invertido quando reagregada. O seqüestro por farelo de trigo, aparentemente, deveu-se a interações entre sítio catalítico da fosfatase e substrato. / This study explored enzyme multiplicity on hemicelllulose and cellulose degrading systems. It first demonstrates the differences of PNGaseF deglycosylation and EndoH deglycosylation on forms of two ß-glicosidase activities present on surface of mycelia from Aspergillus versicolor grown on several carbon sources. Aspergillus versicolor produces ß-xylosidases with different biochemical properties and different degree of glycosylation, when grown on xylan or xylose. Were investigated the biochemical properties of these ß-xylosidases after deglycosylation. The purified enzymes were deglycosylated with endo-H or PNGase F. After this treatment both enzymes migrated faster in PAGE exhibiting the same Rf. On SDS-PAGE both enzymes showed similar migration. The optima temperature of xylan-induced and xylose-induced ß-xylosidases was 45 ºC and 40 ºC, respectively, and of 35 ºC after deglycosylation. The xylan-induced enzyme was more active at acidic pH than the xylose-induced enzyme. After deglycosylation the optimum pH of both enzymes was 6.0. The thermal resistance of the enzymes at 55 ºC showed a half-life of 15 min and 9 min for xylose-and xylan-induced enzymes, respectively. After deglycosylation both exhibited half-lives of 7.5. Native enzymes exhibited different response to ions, while deglycosylated enzymes exhibited identical sensitivity to ions. Limited proteolysis yielded coincident profiles in SDS-PAGE for both deglycosylated enzymes. All data suggest that the two A.versicolor ß-xylosidases share a common polypeptide core with differential glycosylation, apparently responsible for their biochemical and biophysical differences. Aspergillus versicolor also produced ß-glucosidases with different biochemical properties and different degree of glycosylation independently of carbon source. ß-Glucosidase I differed from ß-glucosidase II principally considering the amount and composition of carbohydrate, sensitivity to ions and pH. The purified enzymes shared the same tripitic maps and molecular masses after deglycosylations. All results showed that the biochemical differences observed for two enzymes were directly linked to PNGaseF- deglycosylation. Considering that Rfs, elution profiles on Con-A and residual glycosylation of both enzymes treated with EndoH or PNGaseF were the same, but differed on the mannose/galactose ratio, we inferred differences on proportion of hybrid-type/high-mannose-type glycans. The significance of this glycoform diversity was stressed in analysis of the action of mixture of both ß-glucosidases on celooligosoccharides and on cellobiose. This synergism was abolished after PNGaseF deglycosylation. These results are the first to show synergism between glycoforms of glycosil-hydrolases, representing a new class of synergistic type. The work also described a new form of aggregation between enzymes. Generally, ß-glycosidases are described as soluble components, attached to cell wall or free in the culture medium. This work verified that it could be extracelular adsorbed to wheat straw when aggregated with an acid phosphatase. The results strongly suggested that phosphatase is the component responsible for the process of adsorption on the substrate. The disaggregation was cobalt mediated, being not observed for another ions. The aggregation state has positive effects on glycosidase activity, extending pH ratio and increasing hydrolysis velocity. The opposite was found to phosphatase activity.

Orientador: Osvaldo Magro Filho / Banca: Eleonor Álvaro Garbin Júnior / Banca: Idelmo Rangel Garcia Júnior / Banca: Francisley Ávila Souza / Banca: Jamil Awad Shibli / Resumo: O osso homógeno fresco congelado tem sido utilizado no intuito de substituir o osso autógeno. No entanto as suas propriedades de osteoindução e até mesmo osteocondução não estão bem conceituadas na literatura científica. Esse trabalho teve por objetivo avaliar amostras de tecido ósseo homógeno enxertados em humanos através das análises qualitativas histológica e imunoistoquímica. Para tal, dez pacientes previamente selecionados foram submetidos à cirurgia de reconstrução de defeitos ósseos em espessura, usando enxerto ósseo homógeno em bloco fresco congelado estabilizado e fixado por meio de parafusos bicorticais. Após período de integração de seia meses foi realizado procedimento de reabertura para instalação dos implantes osseointegráveis. Neste momento cirúrgico, amostras do enxerto ósseo foram removidas por meio de broca trefina. As amostras foram fixadas em formol 10%, levadas ao processamento para corte descalcificado em parafina e coradas por hematoxilina e eosina. Realizou-se processamento imunoistoquímico para a expressão da enzima Caspase 3. As lâminas foram levadas à microscopia óptica para realização das análises histológica e imunoistoquímica qualitativas. Os resultados mostraram tecido ósseo não vital, com poucas áreas de deposição de osso neoformado sobre a matriz amorfa, presença de infiltrado inflamatório com áreas de osteomielite e imunomarcação expressiva da enzima Caspase 3. Diante da metodologia empregada e dos resultados obtidos concluiu-se que o enxerto homógeno apresentou somente a propriedade biológica de osteocondução durante a fase de incorporação de seis meses / Abstract: Allogeneic bone has been used fresh frozen in order to replace bone autograft. However, the properties of osteoinduction and osteoconduction are not even well-regarded in the scientific literature. This work aimed to evaluate samples of homogenous bone grafts in humans by qualitative histological analysis and immunohistochemistry. For this ten pre-selected patients underwent surgical reconstruction of bone defects in thick, homogenous bone graft using fresh frozen block stabilized and fixed by bicortical screws. After integration period of six months reopening procedure was performed for installation of osseointegrated implants. At this surgical time bone graft samples were removed by means of drill trephine. The samples were fixed in formalin 10%, taken to court for processing decalcified paraffin, and stained with hematoxylin and eosin. Immunohistochemistry was performed processing for the expression of the enzyme Caspase 3. The slides were brought to light microscopy to carry out the qualitative histology and immunohistochemistry. The results showed non-vital bone tissue, with few areas of deposition of new bone formation on the amorphous matrix, presence of chronic inflammatory infiltrate with areas of osteomyelitis, and immunostaining expressive of the enzyme Caspase 3. Given the methods employed and the results obtained it was concluded that the graft showed only a homogenous biological property of osteoconduction, during the incorporation of six months / Doutor

Durante a maturação da semente, a partir da fertilização do óvulo, há alterações inerentes à formação da semente, com destaque para as variações do tamanho, do teor de água, das massas da matéria fresca e seca e da germinação das sementes. Paralelamente, para os frutos carnosos há alterações visíveis nos frutos relacionados à forma, à cor e à senescência. Não há, todavia, relatos de quais mudanças (morfológica, anatômica, fisiológica e bioquímica) ocorrem nas sementes que se desenvolvem no interior de frutos carnosos mantidos em repouso por diferentes períodos de tempo. O objetivo dessa pesquisa foi avaliar a fase final da formação das sementes de pimentão, considerando as variações da morfologia externa dos frutos e do parâmetro fisiológico, da morfologia interna, da enzima endo-?-mananase, da anatomia e do acúmulo de substâncias de reservas e do ciclo celular das sementes, visando verificar se essas mudanças explicam as alterações fisiológicas das sementes de pimentão após o repouso pós-colheita do fruto e durante o armazenamento das sementes. As sementes foram extraídas de frutos em diferentes estádios de maturação, (cores verde, verde-avermelhada e vermelha), mantidos em repouso por 3, 7 ou 14 dias ou sem repouso, e avaliadas logo após a colheita e durante o armazenamento. Os frutos foram avaliados quanto à coloração, dimensões e massa. As sementes foram avaliadas quanto ao teor de água, massa de matéria seca, massa de 1000 sementes, germinação e vigor, além da avaliação de imagens de raios X para o estudo da morfologia interna das sementes, da atividade da enzima endo-?-mananase pelo método da difusão em gel, análises histoquímicas para o estudo da anatomia e de substâncias de reserva e a avaliação do ciclo celular. A colheita das sementes de pimentão pode ser caracterizada pela coloração dos frutos. Em função do repouso há alteração da cor do fruto, do ciclo celular das sementes hidratadas, da atividade da enzima endo-?-mananase e de algumas substâncias de reserva, interferindo positivamente na qualidade das sementes de pimentão. Entretanto, o repouso de frutos, que estão em estágio avançado de desenvolvimento, causa redução da qualidade das sementes. O teor de água, a massa de matéria seca e a morfologia interna da semente, a anatomia das células do endosperma e a presença de substâncias de reservas das sementes não são alterados durante o repouso do fruto, mas estão relacionados ao estádio de formação das sementes. Na medida em que há a deterioração natural das sementes durante o armazenamento, há redução da germinação e do vigor, da atividade da endo-?-mananase, da quantidade de lipídios, proteínas e polissacarídeos das células do embrião e do endosperma. Durante o repouso do fruto por 14 dias, as sementes extraídas de frutos verdes têm tolerância à desidratação, caracterizada principalmente pelo aumento da germinação após a secagem das sementes. A maturidade fisiológica das sementes é caracterizada pela coloração verde-avermelhada dos frutos e também pela estabilização do teor de água das sementes (30%), pela quantidade de matéria seca e pelo conteúdo de DNA 4C; não há coincidência entre maturidade fisiológica e máxima germinação. / During seed maturation there are some significant alterations in seed size, moisture content, fresh and dry matter and germination. Furthermore, for fleshy fruits, visible alterations occur as the fruit shape, color and senescence. There are not reports about which morphological, anatomical, physiological and biochemical alterations occur in seeds that develop inside fleshy fruits during the rest of them, for different periods of time. The objective of this research was to evaluate the final stage of the bell pepper seed formation and it was considered the variations of the external morphology of the fruit, and the physiological parameter, internal morphology, activity of endo-?-mannanase, anatomy and the reserve substances accumulation, and cell cycle of the seeds to verify if these changes explain the physiological changes of the bell pepper seeds after the fruit resting and during the seed storage. The seeds were extracted from fruits at different maturation stages (colors green, reddish-green and red), with (3, 7 or 14 days) or without fruit resting, and during the seed storage. The fruits were evaluated by color, and the measurements and weight. The seeds were evaluated for moisture content, dry mass, mass of 1000 seeds, germination and vigor and X-ray imaging to study the internal morphology of the seeds, endo-?-mannanase activity by gel diffusion assay, histochemical analyzes to study seed anatomy and reserve substances, and flow cytometry to assess the cell cycle. The harvest of bell peppers seeds can be made by the color of the fruits. The fruit resting alters the fruit color, germination, vigor, endo-?-mannanase activity, some storage substances and cell cycle improving bell pepper seed quality. However it has a negative role when the fruits are in advanced stage of development (red fruits and resting time more than 7 days). The moisture content, dry matter and the internal morphology of the seeds do not change by the fruit resting, but because of the seed maturation stage. It was observed reduction of all the physiological parameters, including the amount of lipids in the cells and endo-?-mannanase activity. During fruit resting, the endo-?-mannanase activity and the 4C DNA content of the cells decrease and there is an increased rate of germination and vigor. The water content, dry matter, internal morphology and anatomy of the cells of the endosperm and the presence of reserves substances in the seeds are not changed due to the rest of the fruit, but are related to the seed formation stage. There is natural seed deterioration during storage and a reduction of germination and vigor, endo-?-mannanase activity, amount of lipids, proteins and polysaccharides in the embryo and endosperm cells. During the fruit resting (14 days), the seeds extracted from green fruits have desiccation tolerance, characterized by increased of the seed germination after drying. The physiological maturity is reached when the fruits are reddish-green, characterized by stabilizing the water content of the seeds (30 %), amount of dry matter and the 4C DNA content. There is not a coincidence between physiological maturity and maximum germination.