<p>miRNAs therapeutics have emerged as a potential cancer therapeutics due to their unique ability to target multiple genes, allowing a single miRNA to act as a multi-drug cocktail. However, toxicity associated with current delivery vehicles as well as the sensitivity of the miRNA to serum nucleases are critical hurdles that stand against their clinical utility. Ligand-targeted delivery approaches such as small molecules, aptamers, antibodies or glycoconjugates provide a promising strategy to achieve specific delivery of the therapeutic cargo to the intended targeted cells without any toxicity. We hypothesized that combining both ligand targeted approach along with modifying the miRNA would provide a perfect delivery system which does not only achieve specific delivery but also reduce the therapeutic dose. The data presented in this dissertation shows (i) that miR-34a delivered using a combination of targeting ligand (DUPA) and an endosomal escape agent (nigericin) enables selective delivery of miR-34a to prostate cancer cells, (ii) that the use of full chemical modification approach enhances miR-34a stability and activity both in vitro and in vivo. Overall, these results provide an advancement in the miRNA delivery field and will help the development of miRNA based therapeutics against cancer.</p>

Les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMH II) sont exprimées exclusivement à la surface des cellules présentatrices d'antigènes et servent à stimuler les cellules CD4+ initiant une réponse immunitaire. Le chargement peptidique sur HLA-DR se produit dans les endosomes tardifs et les lysosomes sous l'action de HLA-DM. Cette molécule de classe II non-classique enlève les fragments peptidiques de la chaîne invariante (Ii) restés associés aux molécules de classe II (CLIP) et édite leur répertoire d'antigènes présentés. En utilisant une forme mutante de HLA-DM (HLA-DMy) qui s'accumule à la surface plasmique, nous avons observé que HLA-DMy augmente les chargements de peptides exogènes et aussi la réponse des cellules T en comparaison avec HLA-DM sauvage. Il a été démontré que des molécules chimiques, comme le n-propanol, pouvait avoir le même effet que HLA-DM en remplaçant les peptides associés aux molécules de classe II de la surface cellulaire. De plus, HLA-DMy et le n-propanol ont présenté un effet additif sur la présentation de peptides exogènes. Certaines protéines de la voie endocytique, comme HLA-DR, HLA-DM, HLA-DO et Ii sont ciblés aux compartiments multivésiculaires (MVB) et peuvent être ciblées aux exosomes. Suite à une fusion entre les MVB et la membrane plasmique, les exosomes sont relâchés dans le milieu extracellulaire. Nous avons déterminé que le motif tyrosine de HLA-DMβ et son interaction avec HLA-DR n'affectaient pas le ciblage aux exosomes, sauf la molécule HLA-DO. Cette étude nous a permis de démontrer que HLA-DMy augmente la quantité de peptides exogènes chargés sur les CPA et que HLA-DM et HLA-DMy sont incorporés dans les exosomes. / Major histocompatibility class II (MHC II) molecules are expressed exclusively on the surface of antigen presenting cells and serve to stimulate CD4+ cells to initiate an immune response. Peptide loading on MHC II molecules occurs in late endosomal and lysosomal compartments by the catalytic action of HLA-DM. This non-classical class II molecule removes class-II-associated invariant-chain peptide (CLIP) from class II molecules and edits their repertoire of antigenic peptides loaded. Using a mutant form of HLA-DM (HLA-DMy) that is targeted to the plasma membrane, we observed in the case of HLA-DMy, there is an increase of the loading of exogenous peptides and also significantly increased T cell response in comparison with HLA-DM wild-type. It was found that some chemical molecules, like n-propanol, could mimic the effect of HLA-DM by removing peptides from cell surface class II molecules. Interestingly, HLA-DMy and n-propanol seem to have an additive effect on the exogenous peptide loading. Some proteins of the endosomal pathway, like HLA-DR, HLA-DM, HLA-DO and Ii are targeted to microvesicules-containing compartments called MVB and they can be introduced into exosomes. Following the fusion between MVB and plasma membrane, exosomes are released in extracellular environment. We have determined that tyrosine motif of HLA-DMβ and interaction with HLA-DR does not affect HLA-DM targeting to exosomes, except for the HLA-DO molecule. In conclusion, we showed that HLA-DMy increases the quantity and the quality of exogenous peptides loading on APC and HLA-DM and HLA-DMy are incorporated to exosomes.

Les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMH II) sont exprimées exclusivement à la surface des cellules présentatrices d'antigènes et servent à stimuler les cellules CD4+ initiant une réponse immunitaire. Le chargement peptidique sur HLA-DR se produit dans les endosomes tardifs et les lysosomes sous l'action de HLA-DM. Cette molécule de classe II non-classique enlève les fragments peptidiques de la chaîne invariante (Ii) restés associés aux molécules de classe II (CLIP) et édite leur répertoire d'antigènes présentés. En utilisant une forme mutante de HLA-DM (HLA-DMy) qui s'accumule à la surface plasmique, nous avons observé que HLA-DMy augmente les chargements de peptides exogènes et aussi la réponse des cellules T en comparaison avec HLA-DM sauvage. Il a été démontré que des molécules chimiques, comme le n-propanol, pouvait avoir le même effet que HLA-DM en remplaçant les peptides associés aux molécules de classe II de la surface cellulaire. De plus, HLA-DMy et le n-propanol ont présenté un effet additif sur la présentation de peptides exogènes. Certaines protéines de la voie endocytique, comme HLA-DR, HLA-DM, HLA-DO et Ii sont ciblés aux compartiments multivésiculaires (MVB) et peuvent être ciblées aux exosomes. Suite à une fusion entre les MVB et la membrane plasmique, les exosomes sont relâchés dans le milieu extracellulaire. Nous avons déterminé que le motif tyrosine de HLA-DMβ et son interaction avec HLA-DR n'affectaient pas le ciblage aux exosomes, sauf la molécule HLA-DO. Cette étude nous a permis de démontrer que HLA-DMy augmente la quantité de peptides exogènes chargés sur les CPA et que HLA-DM et HLA-DMy sont incorporés dans les exosomes. / Major histocompatibility class II (MHC II) molecules are expressed exclusively on the surface of antigen presenting cells and serve to stimulate CD4+ cells to initiate an immune response. Peptide loading on MHC II molecules occurs in late endosomal and lysosomal compartments by the catalytic action of HLA-DM. This non-classical class II molecule removes class-II-associated invariant-chain peptide (CLIP) from class II molecules and edits their repertoire of antigenic peptides loaded. Using a mutant form of HLA-DM (HLA-DMy) that is targeted to the plasma membrane, we observed in the case of HLA-DMy, there is an increase of the loading of exogenous peptides and also significantly increased T cell response in comparison with HLA-DM wild-type. It was found that some chemical molecules, like n-propanol, could mimic the effect of HLA-DM by removing peptides from cell surface class II molecules. Interestingly, HLA-DMy and n-propanol seem to have an additive effect on the exogenous peptide loading. Some proteins of the endosomal pathway, like HLA-DR, HLA-DM, HLA-DO and Ii are targeted to microvesicules-containing compartments called MVB and they can be introduced into exosomes. Following the fusion between MVB and plasma membrane, exosomes are released in extracellular environment. We have determined that tyrosine motif of HLA-DMβ and interaction with HLA-DR does not affect HLA-DM targeting to exosomes, except for the HLA-DO molecule. In conclusion, we showed that HLA-DMy increases the quantity and the quality of exogenous peptides loading on APC and HLA-DM and HLA-DMy are incorporated to exosomes.

La délivrance intracytoplasmique de petites molécules hydrophiles et de gènes (ADN, ARN) est un défi majeur pour l’industrie pharmaceutique, puisque ces composés sont incapables de franchir les membranes biologiques par eux-mêmes. L’utilisation de nanovecteurs lipidiques permet de surmonter les étapes d’instabilité sanguine du gène thérapeutique, de pénétration cellulaire et d’échappement endosomal. Nous reportons dans cette thèse l’élaboration de nouveaux vecteurs lipidiques pH-sensibles, basés sur une bascule moléculaire capable de changer de conformation et déstabiliser le nanovecteur après protonation à pH acide, favorisant ainsi l’échappement endosomal du fragile contenu thérapeutique. Ce mécanisme de pH-sensibilité est non reporté dans la littérature jusqu’alors. Dans un premier temps, l’élaboration de lipides bascules pH-sensibles non-cationiques destinés à la délivrance liposomale de principes actifs hydrophiles est reportée. Ce premier travail introduit les lipides bascules, valide l’implication de la bascule moléculaire pH-sensible et apporte une première preuve de concept in vitro de faisabilité. Dans un second temps est introduit l’utilisation de nouveaux lipides bascules cationiques pH-sensibles pour la thérapie génique (délivrance in vitro et in vivo de siRNA), validant encore une fois l’implication de la bascule moléculaire dans l’efficacité de délivrance intracytoplasmique des siRNA. A l’issue de cette thèse sont identifiés deux lipides bascules (2 et CSL3) capables d’être introduits dans des nanoparticules lipidiques pour la délivrance de drogues et de gènes respectivement. De telles formulations permettraient la délivrance intracytoplasmique de composés hydrophiles thérapeutiques (drogues, gènes) pour le traitement du cancer ou pour des applications d’édition génomique. / Intracytoplasmic delivery of small hydrophilic molecules and genes (DNA, RNA) is a major challenge for the pharmaceutical industry, since these compounds are unable to cross biological membranes by themselves. Use of lipid nanocarriers enables overcoming the stages of blood instability of the therapeutic gene, cellular penetration, and endosomal escape. In this thesis, we report the development of new pH-sensitive lipid carriers, based on a molecular switch capable of changing its conformation upon protonation and destabilizing the nanocarrier, thus favoring endosomal escape of the therapeutic content. This pH-sensitivity mechanism has not been reported in the literature to date. Firstly, we report the elaboration of non-cationic pH-sensitive switchable lipids for liposomal delivery of hydrophilic active ingredients. This initial work introduces switchable lipids, validates the involvement of the pH-sensitive molecular switch, and provides early evidence of in vitro concept feasibility. Secondly, we present the use of pH-sensitive cationic switchable lipids for gene therapy (siRNA delivery in vitro and in vivo), again validating the involvement of the molecular switch in the effectiveness of intracytoplasmic delivery of siRNA. The two lead compounds identified during this thesis (2 and CSL3) can be included into lipid nanoparticles for drug and gene delivery, respectively. Such formulations allow intracytoplasmic delivery of therapeutic hydrophilic compounds (drugs, genes) and could be used to treat diseases such as cancer or for genome editing applications.

Les récepteurs marqués pour la voie de dégradation lysosomale sont retienu à la membrane endosomale par addition d'ubiquitine. L'invagination de la membrane endosomale incorpore ces récepteurs dans les vésicules intralumenal (ILVs) et mène à leur dégradation au lysosome. AMSH (Associated Molecule of the SH3 domain of STAM) contient un domaine métalloprotéase JAMM au niveau de sa partie C-terminale. Celui-ci a montré, in vitro, la capacité d'hydrolyser les chaînes d'ubiquitine de liaison K-63, laissant supposer une fonction d'élimination des ubiquitines par AMSH avant l'incorporation des récepteurs dans les ILVs. AMSH interagit aussi avec les protéines CHMP (Charged Multivesicular body Protein) d'ESCRT-III (Endosomal Sorting Complex Required for Transport-III) via un N-terminal AMSH MIT domaine. De plus, la liaison d'AMSH avec un domaine C-terminal autoinhibitoire des protéines CHMP a impliqué AMSH dans l'activation de la polymérisation des protéines CHMP, occasionnant un remodelage membranaire suivi de la formation des vésicules. Ce travail montre que AMSH se lie à deux formes de CHMP3; la forme ouverte et active, et la forme fermée et autoinhibée. L'interaction du domaine N-terminal d'AMSH avec ces deux formes de CHMP3 fut évaluée à l'échelle nanomolaire par isothermal titration calorimetry. La structure cristallographique du complexe AMSH domaine N-terminal CHMP3 fut résolue à 1.7Å. Celle-ci présente un mode de liaison CHMP différent des structures déjà déterminées et dévie de l'architecture classique du domaine MIT. On montre que les domaines N-terminal et JAMM d'AMSH interagissent entre eux, et que cette interaction stimule l'activité déubiquitinase du domaine JAMM.

My thesis concerns spectroscopic studies (NMR, CD and fluorescence) of peptides with functions in biotechnology and biology, and their interactions with a model membrane (large unilamellar phospholipid vesicles). The resorufin-based arsenical hairpin binder (ReAsH) bound to a short peptide is a useful fluorescent tag for genetic labeling of proteins in living cells. A hairpin structure with some resemblance to type II β-turn was determined by NMR structure calculations (Paper I). Cell-penetrating peptides (CPPs) are short (30-35 residues), often rich in basic amino acids such as Arg. They can pass through the cell membrane and deliver bioactive cargoes, making them useful for biotechnical and pharmacological applications. The mechanisms of cellular uptake and membrane translocation are under debate. Understanding the mechanistic aspects of CPPs is the major focus of Papers II, III, and IV. The effect of the pyrenebutyrate (PB) on the cellular uptake, membrane translocation and perturbation of several CPPs from different subgroups was investigated (Paper II). We concluded that both charge and hydrophobicity of the CPP affect the cellular uptake and membrane translocation efficiency. Endosomal escape is a crucial challenge for the CPP applications. We modeled the endosome and endosomal escape for different CPPs to investigate the corresponding molecular mechanisms (Papers III and IV). Hydrophobic CPPs were able to translocate across the model membrane in the presence of a pH gradient, produced by bacteriorhodopsin proton pumping, whereas a smaller effect was observed for hydrophilic CPPs. Dynorphin A (Dyn A) peptide mutations are associated with neurodegenerative disorders, without involvement of the opioid receptors. The non-opioid activities of Dyn A may involve membrane perturbations. Model membrane-perturbations by three Dyn A mutants were investigated (Paper V). The results showed effects to different degrees largely in accordance with their neurotoxic effects. / <p>At the time of the doctoral defense, the following paper was unpublished and had a status as follows: Paper 4: Manuscript.</p>

No description available.

Adaptor proteins, like Tollip and Tom1, facilitate cellular cargo sorting through their ubiquitin-binding domains. Tollip and Tom1 bind to each other through their TBD and GAT domains, respectively, whereas Tollip interacts with phosphatidylinositol-3-phosphate (PtdIns(3)P)-containing endosomal membranes. Tom1 and Tollip interaction and association with endosomes is proposed to be involved in the lysosomal degradation of polyubiquitinated cargo. Through cellular, biochemical, and biophysical techniques, we have further characterized the association of Tom1 with Tollip. Mutations in the binding interface of the Tom1 GAT and Tollip TBD complex leads to a subcellular mis-localization of both proteins, indicating that Tom1 may serve to direct Tollip to specific cellular pathways. It was determined that Tom1 inhibits the binding of Tollip to PtdIns(3)P and inhibition was reversed when mutations in the binding interface of the Tom1 GAT and Tollip TBD were present. Furthermore, it was established that, upon the binding of Tollip TBD to Tom1 GAT, ubiquitin is inhibited from binding to Tom1 GAT. It was also demonstrated that Tom1 GAT, but not Tollip TBD, can weakly bind to PtdIns(3)P. Consequently, we propose that association of Tom1 may serve to direct Tollip for involvement in specific cell signaling pathways. Gaining insight into the function of Tom1 and Tollip may lead to their use as therapeutic targets for increasing the efficiency of cargo trafficking and also for patients recovering from various cardiac injuries. / Master of Science

L’autophagie est une voie catabolique durant laquelle des constituants cytoplasmiques sont engloutis dans des vésicules à double membrane nommées autophagosomes. Elle sert à éliminer les protéines mal repliées ou les agrégats protéiques, à détruire les organites défectueux comme les mitochondries, le réticulum endoplasmique et les peroxysomes mais aussi des pathogènes intracellulaires. Le matériel séquestré dans les autophagosomes est ensuite envoyé, pour dégradation, vers le lysosome. La dégradation du matériel séquestré génère des nucléotides, des acides aminés et des acides gras qui seront recyclés en vue de la synthèse de macromolécules et de la génération d’ATP.Dans cette étude nous explorons l’aspect cellulaire et fonctionnel de la voie de l’autophagie chez Caenorhabditis elegans. Nous montrons que le génome du nématode contient deux homologues du gène autophagique de levure Atg8. Ces homologues codent pour les protéines LGG-1 et LGG-2 qui sont des protéines des membranes des autophagosomes. Ces protéines agissent de façon synergique dans les processus physiologiques impliquant l’autophagie, en l’occurrence, la longévité et la formation des larves dauer.Nous montrons également que l’autophagie est impliquée dans le maintien de l’homéostasie cellulaire chez les mutants ESCRT. Les complexes ESCRT sont impliqués dans l’adressage des protéines ubiquitinées vers les corps multi vésiculaires pour les dégrader. Les mutants ESCRT se caractérisent par des altérations cellulaires et développementales. Nos résultats indiquent que l’inactivation des ESCRT cause une augmentation du flux autophagique. L’inactivation de l’autophagie dans ces mutants exacerbe les défauts cellulaires alors que son induction protège de la dégradation. / Macroautophgagy is a catabolic process involved in the clearance of cellular components in the lysosome when cells face starvation conditions. This eukaryotic process requires the formation of double membrane vesicles named autophagosomes. Autophagy is implicated in the elimination of misfolded proteins, protein aggregates and long-lived or damaged organelles such as mitochondria, endoplasmic reticulum and peroxysomes. It is alos required for the clearance of intracellular pathogens. The material enclosed inside autophagososmes in degraded in the lysosome: nucleotides, amino-acids and fatty-acids are generated and reused for neosynthesis of macromolecules and ATP.In the present study, we are exploring the cellular and functional aspects of the autophagic pathway in Caenorhabditis elegans. We show that the genome of the worm contain two homologues of the Yeast autophagic gene, Atg8. These homlogues encode for two proteins namely, LGG-1 and LGG-2, which localize to the autophagosomal membranes. We have shown that this two proteins act synergistically in dauer formation and longevity.We have also shown that autophagy play an important role in maintaining cell homeostasis in endosomal maturation mutans. These latter mutants show defects in the ESCRT coplexes (Endosomal Sorting Complex Required for Transport). ESCRT complexes are required the recycling of cell surface receptors and for the sorting of ubiquitinated prtoteins into the multivesicular bodies. Mutations in the ESCRTs cause cellular et developmental defects. In our study, we show that autophagy is induced in these mutants and play a beneficial role in correcting cellular defects.

Peroxisome biogenesis is complex, involving a diverse array of intracellular pathways and mechanisms that mediate their biogenesis and cellular functions. Relevant to our understanding of peroxisome biogenesis is the utilization of peroxisomal membranes for viral genome replication as observed in plant cells infected by several members of the Tombusviridae family of positive-strand RNA viruses. Tomato Bushy Stunt Virus (TBSV), for instance, usurps an array of host factors that facilitate the transformation of peroxisomes into peroxisomal multivesicular bodies (pMVB) the sites of viral RNA replication. In this study, pMVB topology and biogenesis was investigated using transmission electron and epifluorescence microscopy of tobacco and wildtype or mutant budding yeast that were transformed with TBSV replicase proteins and a defective interfering viral RNA. Overall, the results suggest that host-virus interactions specifically associated with Endosomal Sorting Complex Required for Transport (ESCRT) and lipid metabolism are involved in TBSV replication and pMVB biogenesis.