Para avaliar os efeitos de angiotensina II (Ang II) ou endotelina-3 (ET-3), ratos Wistar foram organizados nos grupos: controle, tratados com Ang II ou ET-3 por 42 dias, tratados com losartan, atrasentan ou BQ788 ou co-tratados com Ang II e losartan ou ET-3 e atrasentan ou BQ 788. Foram avaliados: pressão arterial, concentrações plasmáticas e intrarrenais das Angs e ETs, morfologia e função renal. A Ang II induziu hipertensão arterial, aumentou as concentrações plasmáticas das ETs e das Angs e a expressão de RNAm para renina; induziu injuria glomerular e remodelamento das arteríolas renais. O tratamento com losartan reverteu a maioria dos efeitos da Ang II. A ET-3 induziu hipertensão arterial, injúria glomerular, alteração da função renal e aumento de RNAm intrarrenal para os componentes do SRA. O bloqueio do receptor ETA atenuou os efeitos de ET-3 na hipertensão, enquanto o bloqueio de ETB foi melhor nos parâmetros renais. Nossos resultados sugerem uma interação entre os sistemas SRA e endotelinas, induzindo mudanças na estrutura e função renal. / To evaluate the chronic effects of angiotensin II (Ang II) and /or losartan or endothelin-3 (ET-3) and /or atrasentan or BQ788, Wistar rats were organized as: control, treated with Ang II, or ET-3 for 42 days, losartan-treated, co-treated with Ang II and losartan. Treated with ET-3, treated with BQ788 or atrasentan, co-treated with ET-3 and antagonists. Were evaluated: blood pressure, plasma and intrarenal concentrations of Angs and ETs, protein expression, renal morphology and function. Ang II induced hypertension, increased plasma levels of ETs and Angs; increased mRNA for renin; induced glomerular injury and renal arterioles remodeling. Treatment with losartan restored most of the changes induced by Ang II. ET-3 induced hypertension, glomerular injury, renal dysfunction and increased intrarenal mRNA for SRA components. The ETA receptor blockage reverted the ET-3 effects on hypertension, while ETB blockage reverted renal parameters. Our results suggest a crosstalk of renin-angiotensin and endothelin systems, inducing renal structural and functional changes.

As mulheres na fase reprodutiva apresentam menor incidência de doenças cardiovasculares (DCV), em relação aos homens de mesma idade. Porém, essa vantagem desaparece na pós-menopausa, sugerindo que os hormônios sexuais femininos exercem algum efeito cardioprotetor. Um dos mecanismos propostos para explicar essa proteção é o fato dos estrógenos promoverem a produção de importantes fatores vasoativos pelo endotélio vascular, entre eles o óxido nítrico e a prostaglandina I2. Com a diminuição da quantidade de estrógenos circulante, as mulheres na pós-menopausa, estão mais suscetíveis à disfunção endotelial e a doenças cardiovasculares. Estudos têm demonstrado que a terapia de reposição hormonal (TRH) utilizada por mulheres na pós-menopausa combate os sintomas deste período, melhora o quadro de disfunção endotelial e o perfil lipídico e aumenta a síntese de fatores vasoativos, que auxiliam na prevenção da DCV. Entretanto a TRH vem sendo questionada por grandes estudos como o WHI (Writing Group for the Women\'s Health Initiative Investigators) e o HERS (Heart and Estrogen/Progestin Replacement Study), que mostraram um risco aumentado de desenvolvimento de câncer de mama e endometrial em mulheres fazendo uso da TRH. Entre as terapias alternativas para combater os sintomas indesejáveis da menopausa e as implicações mórbidas que acompanham esse período, sem expor as pacientes aos efeitos colaterais da TRH, a literatura aponta os fitoestrógenos, principalmente os extraídos da soja (Glycine max). O objetivo geral deste estudo é avaliar a ação das isoflavonas da soja, que vem sendo utilizadas por mulheres na pós-menopausa, na produção de óxido nítrico, prostaglandina E2 e endotelina-1, por células endoteliais, utilizando um modelo \"in vitro\", células endoteliais da linhagem ECV304. / During their reproductive years, women have a lower incidence of coronary heart disease (CHD) compared to men of similar age. However, this advantage disappears in post-menopause, suggesting that female sex hormones exert some cardio protective effect. One of the mechanisms proposed to explain this protection is the fact that estrogens promote the production of important vasoative factors by vascular endothelium, including nitric oxide and prostaglandin I2. By decreasing circulating estrogen, women in post-menopause are more susceptible of endothelial dysfunction and cardiovascular diseases. Studies have shown that the hormone replacement therapy (HRT) used by post-menopausal women in combating the symptoms of this period, improve endothelial dysfunction and lipid profile and increases the synthesis of vasoative factors, which help in the prevention of CHD. Meanwhile the HRT has been questioned by two large trials, the WHI (Writing Group for the Women\'s Health Initiative Investigators) and HERS (Heart and Estrogen/Progestin Replacement Study), which showed an increased risk of developing breast cancer and endometrial cancer in women using HRT. Among the alternative therapies to combat the symptoms of menopause and undesirable morbid implications that accompany this period, without exposing the patients to the side effects of HRT, the literature suggests the phytoestrogens, especially those from the soybean (Glycine max). The aim of this study is to evaluate the effect of isoflavones from soy, which are used by women in post-menopause, in the production of nitric oxide, prostaglandin E2 and endothelin-1 by endothelial cells, using an \"in vitro\" model: human endothelial cell line ECV304.

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Orientador: Marcos Renato de Assis / Resumo: A expectativa de vida diminui com artrite reumatoide (AR) devido ao aumento da mortalidade por doenças cardiovasculares. Isto se deve, possivelmente, à disfunção endotelial resultante da intensa atividade inflamatória relacionada à AR. Evidências tem apontado para um possível envolvimento do sistema renina-angiotensina (SRA) nos danos cardiovasculares inerentes à AR. Acredita-se que a participação do SRA agrave o comprometimento endotelial decorrente de inflamações sistêmicas através da ativação do receptor de angiotensina II tipo 1 (AT1) pela angiotensina II (Ang II). Por outro lado, a literatura também reporta a influência dos hormônios andrógenos, principalmente da testosterona, nas ações da Ang II sobre os tecidos vasculares. Assim, o objetivo do presente estudo é investigar os efeitos da artrite induzida por adjuvante (AIA) sobre o equilíbrio redox, a função endotelial e as respostas da aorta de ratos à Ang II, bem como, verificar se esses efeitos podem ser influenciados pela redução dos níveis circulantes de testosterona. Para isto, ratos Wistar machos adultos foram submetidos à falsa-castração e falsa-imunização (Controles), castração seguida de falsa-imunização (ORX), falsa-castração seguida de imunização (ORX) e castração seguida de imunização (ORX+AIA). Ao final do experimento, segmentos de aorta torácica foram desafiadas em cubas de órgãos isolados com acetilcolina (ACh), Ang II, KCl e nitroprussiato de sódio e, das curvas concentração resposta obtidas, calculou-se... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Life expectancy of patients with rheumatoid arthritis (RA) is lower due to increased mortality in consequence of cardiovascular diseases. Presumably, this occurs due to endothelial dysfunction resulting from severe inflammatory activity related to RA. Evidence has demonstrated a possible involvement of the renin-angiotensin system (RAS) in the cardiovascular injury inherent to RA. The RAS involvement is considered to worsen the endothelial impairment due to systemic inflammation through angiotensin II type 1 receptor (AT1) activation of Ang II. (Ang II). Additionally, previous studies also observed that androgen hormones, mainly the testosterone, modulate the Ang II actions in cardiovascular tissues. Thus, the aim of the present study is to investigate the effects of adjuvant-induced arthritis (AIA) on systemic redox balance, endothelial function and rat aorta responses to Ang II, as well as, whether these effects may be influenced by the reduction of circulating levels of testosterone. For this, adult male Wistar rats were submitted to false-castration and false-immunization (Controls), castration followed by false-immunization (ORX), false-castration followed by immunization (ORX) and castration followed by immunization (ORX + AIA) . At the end of the experiment, thoracic aorta segments were challenged in isolated organ bath with acetylcholine (ACh), Ang II, KCl and sodium nitroprusside and, from the concentrantion-response curves obtained were calculated pEC50 and maximal ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

As mulheres na fase reprodutiva apresentam menor incidência de doenças cardiovasculares (DCV), em relação aos homens de mesma idade. Porém, essa vantagem desaparece na pós-menopausa, sugerindo que os hormônios sexuais femininos exercem algum efeito cardioprotetor. Um dos mecanismos propostos para explicar essa proteção é o fato dos estrógenos promoverem a produção de importantes fatores vasoativos pelo endotélio vascular, entre eles o óxido nítrico e a prostaglandina I2. Com a diminuição da quantidade de estrógenos circulante, as mulheres na pós-menopausa, estão mais suscetíveis à disfunção endotelial e a doenças cardiovasculares. Estudos têm demonstrado que a terapia de reposição hormonal (TRH) utilizada por mulheres na pós-menopausa combate os sintomas deste período, melhora o quadro de disfunção endotelial e o perfil lipídico e aumenta a síntese de fatores vasoativos, que auxiliam na prevenção da DCV. Entretanto a TRH vem sendo questionada por grandes estudos como o WHI (Writing Group for the Women\'s Health Initiative Investigators) e o HERS (Heart and Estrogen/Progestin Replacement Study), que mostraram um risco aumentado de desenvolvimento de câncer de mama e endometrial em mulheres fazendo uso da TRH. Entre as terapias alternativas para combater os sintomas indesejáveis da menopausa e as implicações mórbidas que acompanham esse período, sem expor as pacientes aos efeitos colaterais da TRH, a literatura aponta os fitoestrógenos, principalmente os extraídos da soja (Glycine max). O objetivo geral deste estudo é avaliar a ação das isoflavonas da soja, que vem sendo utilizadas por mulheres na pós-menopausa, na produção de óxido nítrico, prostaglandina E2 e endotelina-1, por células endoteliais, utilizando um modelo \"in vitro\", células endoteliais da linhagem ECV304. / During their reproductive years, women have a lower incidence of coronary heart disease (CHD) compared to men of similar age. However, this advantage disappears in post-menopause, suggesting that female sex hormones exert some cardio protective effect. One of the mechanisms proposed to explain this protection is the fact that estrogens promote the production of important vasoative factors by vascular endothelium, including nitric oxide and prostaglandin I2. By decreasing circulating estrogen, women in post-menopause are more susceptible of endothelial dysfunction and cardiovascular diseases. Studies have shown that the hormone replacement therapy (HRT) used by post-menopausal women in combating the symptoms of this period, improve endothelial dysfunction and lipid profile and increases the synthesis of vasoative factors, which help in the prevention of CHD. Meanwhile the HRT has been questioned by two large trials, the WHI (Writing Group for the Women\'s Health Initiative Investigators) and HERS (Heart and Estrogen/Progestin Replacement Study), which showed an increased risk of developing breast cancer and endometrial cancer in women using HRT. Among the alternative therapies to combat the symptoms of menopause and undesirable morbid implications that accompany this period, without exposing the patients to the side effects of HRT, the literature suggests the phytoestrogens, especially those from the soybean (Glycine max). The aim of this study is to evaluate the effect of isoflavones from soy, which are used by women in post-menopause, in the production of nitric oxide, prostaglandin E2 and endothelin-1 by endothelial cells, using an \"in vitro\" model: human endothelial cell line ECV304.

nÃo hà / IntroduÃÃo: A neurotoxicidade cumulativa à uma toxicidade que pode advir da terapia à base de oxaliplatina (OXL), que à a 3 geraÃÃo de agentes platinos com amplo espectro de atividade antitumoral, incluindo cÃncer colorretal, ovariano e pulmonar. A neurotoxicidade associada à OXL gera uma toxicidade dose-limitante, crÃnica, a neuropatia sensitiva perifÃrica (NSP). Objetivo: Investigar o envolvimento da endotelina-1, de receptores TRPV1 e NMDA e da substÃncia P envolvidos na patogÃnese da neuropatia sensitiva perifÃrica induzida pelo agente antineoplÃsico oxaliplatina. Materiais e mÃtodos: O estudo foi aprovado pelo Comità de Ãtica em Pesquisa Animal da UFC (protocolo n 75/12). Camundongos Swiss machos (20g) foram prÃ-tratados com antagonistas de receptores de endotelina-1 (Bosentana 100mg/kg, VO; BQ-123 e BQ-788 30Âl, intraplantar) e antagonistas do receptor TRPV1 (capsazepina, 5mg/kg, IP), antagonista do receptor NK-1 da Substancia P (apreptanto, 1mg/kg, IP) e antagonista de receptores NMDA (MK-801, 0,5mg/kg, IP) 30 minutos antes da administraÃÃo de OXL (1mg/kg, IV) por 4 semanas e meia. Paralelamente foram realizados testes nociceptivos para avaliar o desenvolvimento da neuropatia sensitiva perifÃrica. A hipernocicepÃÃo foi avaliada pelo teste de imersÃo da cauda (TIC) em Ãgua fria (10ÂC) ou aquecida (43ÂC) e pelo teste Von Frey (HPM). Em seguida, foi realizado imunofluorescÃncia do segmento medular e gÃnglio da raiz dorsal e RT-PCR. Resultados: Como resultados observou-se que com o prÃ-tratamento ao uso de OXL que houve atenuaÃÃo da hiperalgesia da NSP induzida por OXL. Ao realizar a administraÃÃo de antagonistas seletivos de endotelina-1 intraplantar na pata direita observou-se reduÃÃo significativa na hiperalgesia na pata direita (tratada) em comparaÃÃo à pata esquerda (controle). Ao analisar a expressÃo gÃnica para cFos, NK-1 e o receptor de endotelina B, observou-se que houve reduÃÃo significativa da expressÃo dos marcadores no grupo prÃ-tratado com Bosentana ao comparar com o grupo OXL, que demonstrou a expressÃo aumentada para esses marcadores. ConclusÃo: Conclui-se no presente estudo que hà evidÃncias do papel da endotelina-1, de receptores (TRPV1 e NMDA) e da substÃncia P na patogÃnese da NSP induzida pelo agente antineoplÃsico OXL. / Introduction: The cumulative neurotoxicity is a toxicity that can result from oxaliplatin-based therapy (OXL), which is the 3rd generation platinum agent with broad spectrum of antitumor activity, including colorectal, ovarian and lung cancer. Neurotoxicity associated with OXL generates a dose-limiting toxicity, chronic, peripheral sensory neuropathy (NSP). Objective: To investigate the involvement of endothelin-1, TRPV1 receptors and NMDA and substance P involved in the pathogenesis of peripheral sensory neuropathy induced by oxaliplatin antineoplastic agent. Methods: Male Swiss mice (20g) were pre-treated with antagonists of endothelin-1 receptors (Bosentan 100mg / kg orally; BQ-123 and BQ-788 30μl, intraplantar) and TRPV1 receptor antagonists (capsazepine, 5mg / kg , IP), antagonist of NK-1 receptor for substance P (apreptanto, 1 mg / kg, IP), and a NMDA receptor antagonist (MK-801, 0.5mg / kg, IP) 30 minutes before administration of OXL (1mg / kg, IV) for 4.5 weeks. Parallel nociceptive tests performed to assess the development of peripheral sensory neuropathy. The hyperalgesia assessed by the tail immersion test (ICT) in cold water (10 C) or warm (43 C) and test Von Frey (HPM). Then it was performed spinal segment, and the dorsal root ganglion immunofluorescence and RT-PCR the Ethics Committee approved the study for Animal Research UFC (Protocol 75/12). Results: The results observed when using the antagonists, as a pretreatment to the use of OXL there was attenuation of the induced hyperalgesia (NSP) OXL. Upon administration of selective antagonists of endothelin in the right paw was significant reduction in paw hyperalgesia in the right (treated) compared to the left paw (control). By analyzing the gene expression of cFos, NK-1 and endothelin B receptor, it was observed that there was significant reduction of expression of the markers in pre-treated bosentan group versus OXL group that showed increased expression for these markers. Conclusion: It was concluded in this study that there is evidence of the role of endothelin-1 receptors (TRPV1 and NMDA) and substance SP in the pathogenesis of NSP induced antineoplastic agent OXL.

Para avaliar os efeitos de angiotensina II (Ang II) ou endotelina-3 (ET-3), ratos Wistar foram organizados nos grupos: controle, tratados com Ang II ou ET-3 por 42 dias, tratados com losartan, atrasentan ou BQ788 ou co-tratados com Ang II e losartan ou ET-3 e atrasentan ou BQ 788. Foram avaliados: pressão arterial, concentrações plasmáticas e intrarrenais das Angs e ETs, morfologia e função renal. A Ang II induziu hipertensão arterial, aumentou as concentrações plasmáticas das ETs e das Angs e a expressão de RNAm para renina; induziu injuria glomerular e remodelamento das arteríolas renais. O tratamento com losartan reverteu a maioria dos efeitos da Ang II. A ET-3 induziu hipertensão arterial, injúria glomerular, alteração da função renal e aumento de RNAm intrarrenal para os componentes do SRA. O bloqueio do receptor ETA atenuou os efeitos de ET-3 na hipertensão, enquanto o bloqueio de ETB foi melhor nos parâmetros renais. Nossos resultados sugerem uma interação entre os sistemas SRA e endotelinas, induzindo mudanças na estrutura e função renal. / To evaluate the chronic effects of angiotensin II (Ang II) and /or losartan or endothelin-3 (ET-3) and /or atrasentan or BQ788, Wistar rats were organized as: control, treated with Ang II, or ET-3 for 42 days, losartan-treated, co-treated with Ang II and losartan. Treated with ET-3, treated with BQ788 or atrasentan, co-treated with ET-3 and antagonists. Were evaluated: blood pressure, plasma and intrarenal concentrations of Angs and ETs, protein expression, renal morphology and function. Ang II induced hypertension, increased plasma levels of ETs and Angs; increased mRNA for renin; induced glomerular injury and renal arterioles remodeling. Treatment with losartan restored most of the changes induced by Ang II. ET-3 induced hypertension, glomerular injury, renal dysfunction and increased intrarenal mRNA for SRA components. The ETA receptor blockage reverted the ET-3 effects on hypertension, while ETB blockage reverted renal parameters. Our results suggest a crosstalk of renin-angiotensin and endothelin systems, inducing renal structural and functional changes.

Introdução: O Alcoolismo e o Diabetes são doenças bastante prevalentes em todos os continentes e seriam fatores de risco relacionados com a Disfunção Erétil. Dentre os muitos mecanismos relacionados com a ereção temos a Endotelina e seus receptores, causando intensa e sustentada contração da musculatura lisa dos corpos cavernosos penianos (CC). Acredita-se que poderia haver regulação das vias dos receptores de endotelina pelos microRNAs, que são RNAs não codificantes, regulam a expressão gênica e poderiam sofrer alteração pelos efeitos do álcool e / ou diabetes. Objetivos: Avaliar, experimentalmente com utilização de ratos, se há alteração nas vias dos receptores da endotelina devido ao efeito crônico do alcoolismo, do diabetes ou de sua associação e se existiria correlação com os microRNAs miR-155 e miR-199. Materiais e Métodos: Utilizaram-se 48 Ratos Wistar machos divididos em 4 grupos: Controle (GC), Alcoolizado (GA), Diabético (GD) e Diabético+Alcoolizado (GD+A). Foi utilizado PCR em tempo real e imunoistoquímica para estudar a expressão gênica e proteica dos receptores da endotelina ETA e ETB em corpos cavernosos e PCR em tempo real para avaliar a expressão gênica dos miR-155 e miR-199 no sangue e CC. Resultados: Análise imunohistoquímica encontrou baixa expressão dos receptores de endotelina no GC e elevada nos grupos experimentais, sendo que os receptores ETA estavam distribuídos de forma difusa e em maior concentração, enquanto os receptores de ETB localizavam-se na periferia dos CC. Análise por PCR em tempo real dos CC verificou: aumento não significativo de ETA no GD e de ETB no GD+A; hipoexpressão significativa do miR-199 no GD+A e hipoexpressão não significativa do miR-199 e miR-155 nos demais grupos experimentais em relação ao GC. Análise no sangue: hipoexpressão significativa do miR-155 no GA+D e não significativa nos demais grupos em relação ao GC, hipoexpressão significativa do miR-199 no GD e GD+A e não significativa no GA, todos em relação ao GC. Conclusões: Foi encontrado aumento dos receptores de endotelina como efeito do álcool, do diabetes e de sua associação, também identificou-se diminuição, principalmente, da expressão gênica do miR-199 nos corpos cavernosos dos grupos experimentais o que sugere a hipótese de que o aumento da endotelina poderia ser determinado pela diminuição da ação supressora do miR-199 que se encontra hipoexpresso em decorrência dos efeitos deletérios do álcool e diabetes. A descoberta de alterações em microRNAs associada ao desenvolvimento continuado da genômica pode propiciar novos diagnósticos e marcadores para inúmeras doenças, além de ajudar a identificar possíveis terapêuticas alvo moleculares. / Introduction: Alcoholism and Diabetes are very prevalent diseases in all the continents and are considered risk factors related to erectile dysfunction. Endothelin and its receptor are some of the mechanism related to erection, causing intense and sustained contracture of the penile corpus cavernosum (CC) smooth muscle. It\'s thought that micro-RNAs could regulate endothelin receptors pathways. Micro-RNAs are not coding RNAs that regulate gene expression and could be affected by alcohol and/or diabetes. Objectives: To experimentally evaluate, using rats, alterations in receptors pathways due to chronic effects of alcoholism, diabetes, alone or in association, and to correlate this alterations with miR-155 and miR-199 microRNAs. Materials and Methods: 48 male Wistar rats were used. They were divided in four groups: Control group (GC), Alcoholic group (GA), Diabetic group (GD) and Diabetic+Alcoholic group (GD+A). We used real time PCR and immunohistochemical study to evaluate gene and protein expression of endothelin ETA and ETB in corpus cavernosum tissue and real time PCR to evaluate gene expression of miR-155 and miR-199 in blood and CC. Results: Immunohistochemical analysis showed low expression of endothelin receptors in GC and high expression in experimental groups; ETA receptors were distributed in diffuse pattern and higher concentration although ETB receptors had a peripheral pattern in CC. Real time PCR analysis in CC showed: not significant ETA increase in DG and ETB increase in GD+A; significant miR-199 hypoexpression in GD+A and not significant miR-199 and miR-155 hypoexpression in other experimental groups compared to GC. Blood analysis showed significant miR-155 hypoexpression in GD+A and not significant in other experimental groups compared to CG, significant miR-199 hypoexpression in GD and GD+A and not significant in GA, compared to GC. Conclusions: We found endothelin receptors increase as an effect of alcohol abuse, diabetes and its association; we also found decrease, mainly in gene expression, of miR-199 in corpus cavernosum tissue of experimental groups, what suggests the hypothesis that endothelin increase could be determined by a decrease of suppress action of miR-199, that is hypo expressed because of deleterious effect of alcohol and diabetes. Finding microRNAs changes, associated to continuous development in genomics, could propitiates new diagnostic tools and markers to innumerous diseases and even help to identify possible new molecular target therapies.

Os ciclos claro-escuro (CE) são considerados importantes pistas para o ajuste de relógios biológicos. Alças de retroalimentação positiva e negativa de transcrição e tradução de genes de relógio são a base molecular subjacente tanto a relógios centrais como periféricos. A opsina não visual, melanopsina (Opn4), expressa na retina de mamíferos, é considerada o fotopigmento circadiano pois é responsável pelo ajuste do relógio biológico endógeno. Este fotopigmento também está presente nos melanóforos de Xenopus laevis, onde ele foi descrito pela primeira vez, mas seu papel nestas células ainda não está completamente esclarecido. Espécies de vertebrados não mamíferos expressam duas ou mais melanopsinas e, no caso de X. laevis, há dois genes, Opn4m and Opn4x. Melanóforos de X. laevis respondem à luz com dispersão dos grânulos de melanina, a resposta máxima sendo atingida no comprimento de onda correspondente àquele de excitação máxima da melanopsina. Entre vários hormônios, endotelinas também dispersam os melanossomos em melanóforos de Xenopus através de via similar àquela evocada pela luz. Tendo esses fatos em mente, decidimos investigar se a luz e a endotelina modulam a expressão de genes de relógio em melanóforos de Xenopus, usando PCR quantitativo para avaliar os níveis relativos de RNAm de Per1, Per2, Clock e Bmal1. Ciclos CE promoveram alterações temporais na expressão de Per1, Per2 e Bmal1. Pulsos de 10 min de luz azul aumentaram a expressão de Per1 e Per2, diminuíram a expressão de Opn4x, mas não tiveram efeito sobre Opn4m. Ainda mais, diferentes localizações foram mostradas para cada melanopsina: imunorreatividade para OPN4x foi vista principalmente na membrana celular, enquanto OPN4m foi imuno-localizada no núcleo. Estes resultados em conjunto apontam para funções diferenciais das duas melanopsinas neste modelo. A translocação de grânulos de melanina foi maior quando um pulso de luz azul foi aplicado na presença de endotelina ET-3. E os níveis de RNAm de Clock exibiram variação temporal em melanóforos submetidos a CE após tratamento com ET-3 10-9M, enquanto a expressão de Per1 não foi afetada pelo tratamento hormonal. Em adição, ensaios farmacológicos indicaram que as respostas de Per1 e Per2 à luz azul são evocadas através da ativação da via de fosfoinositídeos, com crosstalks com GMPc/proteina quinase G (PKG) para ativar os genes de relógio. Estes dados sugerem a participação de melanopsina na foto-ativação de genes de relógio, e apontam para uma participação menor de endotelina como sincronizador desta linhagem celular. Nossos resultados constituem uma importante contribuição ao campo emergente dos relógios periféricos os quais, em espécies de não mamíferos têm sido mais extensivamente estudados em Drosophila melanogaster e Danio rerio. Dentro deste contexto, nós mostramos que os melanóforos de Xenopus laevis representam um modelo ideal para a compreensão da modulação de ritmos circadianos por luz e hormônios / Light-dark cycles (LD) are considered important cues to entrain biological clocks. Positive and negative feedback loops of clock gene transcription and translation are the molecular basis underlying the mechanism of both central and peripheral clocks. The non-visual opsin, melanopsin (Opn4), expressed in the mammalian retina, is considered a circadian photopigment because it is responsible of entraining the endogenous biological clock. This photopigment is also present in the melanophores of Xenopus laevis, where it was first described, but its role in these cells is not fully understood. Non-mammalian vertebrate species express two or more melanopsins, and in X. laevis there are two melanopsin genes, Opn4m and Opn4x. X. laevis melanophores respond to light with melanin granule dispersion, the maximal response being achieved at the wavelength of melanopsin maximal excitation. Among various hormones, endothelins also disperse melanosomes in Xenopus melanophores through a similar pathway as light does. Therefore, we decided to investigate whether light and endothelin modulate clock gene expression in Xenopus melanophores, using quantitative PCR to evaluate the relative mRNA levels of Per1, Per2, Clock and Bmal1. LD cycles elicited temporal changes in the expression of Per1, Per2 and Bmal1. A 10 min pulse of blue light increased the expression of Per1 and Per2, decreased Opn4x expression, but had no effect on Opn4m. In addition, a different localization was shown for each melanopsin: immunoreactivity for OPN4x was mainly seen in the cell membrane, whereas OPN4m was immunolocalized in the nucleus. These results taken together point to a differential role for each melanopsin in this model. Melanosome translocation was greater when a blue light pulse was applied in the presence of endothelin ET-3. And mRNA levels of Clock exhibited temporal variation in melanophores under LD cycles after 10-9 M ET-3 treatment, whereas Per1 expression was not affected by the hormone treatment. In addition, pharmacological assays indicated that Per1 and Per2 responses to blue light are evoked through the activation of the phosphoinositide pathway, which crosstalks with cGMP/protein kinase G (PKG) to activate the clock genes. These data suggest the participation of melanopsin in the photo-activation of clock genes and point to a minor role of endothelin as synchronizer for this cell line. Our results add an important contribution to the emerging field of peripheral clocks, which in non-mammalian species have been mostly studied in Drosophila melanogaster and Danio rerio. Within this context, we show that Xenopus laevis melanophores represent an ideal model to understanding circadian rhythms modulation by light and hormone

LIMA, V.V. Papel da O-glicosilação com N-acetil-glucosamina (O-GlcNAc) nas alterações vasculares associadas a altos níveis de endotelina-1. 2012. 106 f. Tese (Doutorado) - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2012. A O-Glicosilação com N-acetilglucosamina (O-GlcNAc) é uma modificação pós-traducional altamente dinâmica que modula diversas vias de sinalização. O processo de O-GlcNAc é controlado por duas enzimas: UDP-NAc transferase (OGT) e O-GlcNAcase (OGA). A enzima OGT catalisa a adição de N-acetil-glucosamina no grupo hidroxila dos resíduos de serina ou treonina das proteínas alvo. Por outro lado, a OGA catalisa a remoção hidrolítica de O-GlcNAc das proteínas modificadas. Proteínas com importante papel na função vascular são alvos da O-GlcNAc, e recentemente demonstramos que a expressão de proteínas modificadas com O-GlcNAc está aumentada em artérias de ratos com hipertensão DOCA-sal. Considerando que a produção de endotelina-1 (ET-1) encontra-se aumentada na vasculatura de diferentes modelos de hipertensão sensível ao sal, nós investigamos a hipótese de que o aumento da resposta vascular contrátil induzida pela ET-1 é decorrente da hiperativação da via RhoA/Rho cinase, mediada pelo aumento dos níveis de proteínas O-GlcNAc. Durante a realização de nossos experimentos, demonstramos que a exposição de aortas ou células do músculo liso vascular (CMLV) à ET-1 (0,1 mol/L) aumenta a vasoconstrição para fenilefrina (PE) e serotonina, bem como os níveis de proteínas O-GlcNAc, além de modular a expressão das enzimas OGT e OGA. A infusão de ET-1 (2 pmol/Kg/min) por 14 dias também promoveu aumento dos níveis vasculares de proteínas O-GlcNAc e da resposta contrátil da aorta à PE. O tratamento de aortas ou CMLV com ST045849 (inibidor da OGT, 100 µMol/L) ou atrasentan (antagonista do receptor ETA, 1 mol/L), preveniu o aumento dos níveis de proteínas O-GlcNAc induzido pela ET-1. Além disso, o tratamento com atrasentan por cinco semanas (atrasentan - 5 mg/kg/dia, por via oral) normalizou os níveis vasculares de proteínas O-GlcNAc em ratos DOCA-sal e também diminuiu a resposta contrátil da aorta à PE. A transfecção de CMLV com siRNA para OGT aboliu o efeito da ET-1 sobre os níveis de proteínas O-GlcNAc. Considerando que o aumento nas contrações da aorta à PE, após o tratamento com PUGNAc (inibidor seletivo da OGA) ou ET-1, foi abolido pelo inibidor de Rho cinase (Y-27632, 1 mol/L) e que a ET-1 ativa a via de sinalização da RhoA/Rho cinase, decidimos investigar se aumento dos níveis de proteínas O-GlcNAc ativa/modula a via RhoA/Rho cinase. A incubação de CMLV com ET-1 não mudou a expressão protéica das formas totais de ROCK-, ROCK-, CPI-17, MYPT-1 ou MLC, porém aumentou a expressão das formas fosforiladas da MYPT-1 (Tre853), CPI-17 (Tre38) e MLC (Tre18/Ser19). Estes efeitos não foram observados quando CMLV foram tratadas com ST045849, atrasentan ou previamente transfectadas com o siRNA para OGT. Também observamos que a ET-1 aumentou a atividade e a expressão protéica da RhoA, assim como a expressão da PDZ-Rho GEF e p115-Rho GEF. Este efeito foi abolido, quando CMLV foram previamente transfectadas com siRNA para OGT, incubadas com o inibidor da OGT ou tratadas com o antagonista de receptores ETA. Em conclusão, nossos dados fornecem evidências de que a ET-1 aumenta os níveis vasculares de proteínas O-GlcNAc, resultando na ativação da via RhoA/Rho cinase e no aumento da reatividade vascular. É possível que o aumento de proteínas O-GlcNAc, induzido pela ET-1, possa representar um novo mecanismo para a disfunção vascular induzida por este potente peptídeo. / LIMA, V.V. O-GlcNAcylation contributes to the vascular effects of ET-1 via activation of RhoA/Rho-kinase pathway. 2012. 106 f. Ph.D. Thesis - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2012. Glycosylation with O-linked -N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) is a highly dynamic post-translational modification that plays a key role in signal transduction pathways. The cycling of O-GlcNAc is controlled by two enzymes: UDP-NAc transferase (OGT) and O-GlcNAcase (OGA). Whereas OGT catalyses the addition of O-GlcNAc to the hydroxyl group of serine and threonine residues of a target protein, OGA catalyses the hydrolytic cleavage of O-GlcNAc from post-translationally-modified target. Proteins with an important role in vascular function are targets for O-GlcNAcylation and we have recently shown that the vascular content of O-GlcNAc-proteins is augmented in arteries from DOCA-salt rats. Since endothelin-1 (ET-1) production is increased in the vasculature of salt-sensitive forms of hypertension, we tested the hypothesis that O-GlcNAc contributes to the vascular effects of ET-1, via activation of the RhoA/Rho-kinase pathway. Incubation of rat aortas or vascular smooth muscle cells (VSMCs) with ET-1 (0,1 mol/L) produced a time-dependent increase in O-GlcNAc levels, decreased expression of O-GlcNAc transferase (OGT) and -N-acetylglucosaminidase (OGA), key enzymes in the O-GlcNAcylation process. Overnight treatment of aortas with ET-1 increased phenylephrine (PE) vasoconstriction. ET-1 effects were not observed when vessels were previously instilled with anti-OGT antibody or after incubation with an OGT inhibitor (ST045849, 100 mol/L). Aortas from DOCA-salt rats, which exhibit increased pre-pro-ET-1 expression, displayed increased contractions to PE and augmented levels of O-GlcNAc proteins. Treatment of DOCA-salt rats with atrasentan (ETA antagonist) abrogated augmented vascular levels of O-GlcNAc and prevented increased PE vasoconstriction. Aortas from rats chronically infused with low rate of ET-1 (2 pmol/Kg/min, 14days) exhibited increased O-GlcNAc-proteins and enhanced PE responses. These changes are similar to those induced by PUGNAc (OGA inhibitor which increases O-GlcNAc levels). ET-1 as well as PUGNAc augmented contractions to PE in endothelium-denuded rat aortas, an effect that was abolished by the Rho kinase inhibitor Y-27632 (1 mol/L). Incubation of VSMCs with ET-1 did not change expression of ROCK-, ROCK-, CPI-17, MYPT-1 or MLC, but increased phosphorylation levels of MYPT-1 (Thr853), CPI-17 (Thr38) and MLC (Thr18/Ser19). The effects of ET-1 on MYPT-1, CPI-17 and MLC phosphorylation were prevented by the OGT inhibitor and OGT siRNA transfection, as well as by atrasentan. ET-1 increased RhoA expression and activity in VSMCs, and this effect was abolished by OGT siRNA transfection and OGT inhibition. ET-1 also augmented expression of PDZ-Rho GEF and p115-Rho GEF in VSMCs and this was prevented by OGT siRNA, OGT inhibition (ST045849) and ETA receptor blockade (atrasentan, 1 mol/L). In conclusion, our data strongly suggest that ET-1 augments O-GlcNAc levels and this modification contributes to increase vascular contractile responses, via activation of the RhoA/Rho-kinase pathway. We speculate that the modulatory effect of ET-1 on O-GlcNAcylation may represent a novel mechanism underlying the vascular effects of the peptide.