Des membranes biodégradables en polycaprolactone pour la régénération osseuse guidée, obtenues par electrospinning, incorporés avec différents rapports de nanocomposites de nanocristaux de cellulose et du Biosilicate®, ont été fabriquées, avec propriétés mécaniques et ostéogéniques améliorés. En tant que stratégie de vascularisation rapide, un greffon biomimétique suturable obtenue par fusion de membranes électrofilées a été fabriqué, avec des motifs poreux obtenus par micro- usinage au laser pour permettre la migration des cellules endothéliales vers le greffon osseux. Les motifs poreux créés sur les greffes suturables ont permis aux cellules endothéliales migrer vers la culture 3D des ostéoblastes dans des hydrogels en gélatine méthacryloyl (GelMA), et des structures 3D ont été observées. Par conséquent, cette stratégie peut être utilisée pour améliorer la taille et la survie des implants osseux biofabriqués, en accélérant la traduction clinique de l'ingénierie du tissu osseux. / Biodegradable membranes for guided bone regeneration, made of polycaprolactone, obtained by electrospinning, incorporated with different nanocomposite ratios of cellulose nanocrystals and Biosilicate®, have been manufactured, with improved mechanical and osteogenic properties. As fast vascularization strategy, a suturable biomimetic graft obtained by fusion of electrospun membranes was fabricated, with porous patterns obtained by laser micromachining to allow migration of endothelial cells to the bone graft. The porous patterns created on the suturable grafts allowed the endothelial cells to migrate to the 3D culture of the osteoblasts in gelatin methacryloyl (GelMA), and 3D structures were observed. Therefore, this strategy can be used to improve the size and survival of biofabricated bone implants, accelerating the clinical translation of bone tissue engineering.

La technologie des cellules souches et les sciences de biomatériaux ont obtenu des grands progrès au cours des dernières décennies et sont devenues plus populaires dans le monde. Les chercheurs cherchent à étudier et à évaluer les différentes sources de cellules et de biomatériaux qui, en combinaison, peuvent fournir une plateforme d’ingénierie tissulaire produite à grande échelle et à bas prix, pour être utilisée aux tests de médicaments, aux thérapies cellulaires et transplantations, dans le but de fournir un soutien thérapeutique aux blessures et à la régénération des tissus endommagés. En général, les trois constituants les plus importants de l’ingénierie tissulaire sont : le choix du type cellulaire, la source du biomatérial (charpente), la création et le maintien d’un lieu favorable à la formation des tissus. Lorsque ces trois constituants sont gérés avec succès, le microenvironnement cellulaire in vitro est plus similaire à ce que la cellule est exposée in vivo, en permettant que la croissance et la différenciation cellulaire survient de façon plus fiable et efficace. Le placenta bovin décellularisé a démontré avoir une riche matrice extracellulaire, des vaisseaux bien développés, étant un biomatérial à haute disponibilité et à bas prix. Mais, on ne sait pas si les charpentes placentaires ont le potentiel d’être repeuplés avec des cellules souches mésenchymateuses (MSC) dérivées du tissu adipeux, et ce processus s’appelle recelularisation. Encore, on ne sait pas si les charpentes placentaires ont la capacité d’offrir, après recelularisation, un ambient approprié pour différencier ces cellules en différentes lignées. Ainsi, afin de fournir des informations sur la capacité du complexe MSC – charpente placentaire à être utilisé avec succès dans l’ingénierie tissulaire, les objectifs de cette thèse ont été : étudier le potentiel des charpentes placentaires bovins en offrir un soutien à la recelularisation par des cellules dérivées du tissu adipeux bovin, et aussi bien qu’évaluer la capacité de différenciation cellulaire en lignées ostéogéniques et chondrogéniques. Le premier article de cette thèse c’est une revue de la littérature qui aborde la nature des cellules souches mésenchymateuses, leurs applications en médicine régénérative, l’importance de la technologie des cellules souches dans l’industrie de l’élevage et l’utilisation de l’espèce bovine en médicine translationnelle. Le deuxième article aborde l’évaluation de la recelularisation et la différenciation cellulaire. Les placentas bovins ont été décellularisés par perfusion de SDS du vaisseau ombilical et les lignées cellulaires établies après la digestion enzymatique du tissu adipeux de six vaches et la sélection par adhésion rapide à la plaque de culture. Ensuite, les cellules ont été cultivées avec les charpentes dans un système d’agitation 2D pendant 21 jours en milieu de différenciation ou de maintenance. Lorsqu’elles sont cultivées sur la plaque de culture, les cellules isolées ont présenté morphologie similaire au fibroblaste, l’expression de CD90, CD73 et CD105, tandis qu’elles n’ont pas exprimé les marqueurs CD34 et CD45. Par ailleurs, les cellules ont été capables de se différencier en lignées chondrogéniques et ostéogeniques, en fournant des preuves de leur nature mésenchymateuse. Ensuite, quand elles ont été cultivées avec les charpentes, les cellules y ont adhéré par des projections cellulaires, établies une communication cellule-charpente et se sont proliférées, fait mis en évidence par l’analyse histologique et microscopie électronique à balayage (MEB). Après, le potentiel des cellules à se différencier en lignées ostéogéniques a été exploré, lorsqu’elles ont été cultivées avec charpente. Au cours d’une période de culture de 21 jours en milieu ostéogénique, les cellules ont proliféré et se sont différenciées de façon dépendante du temps, c’est-à-dire, à chaque semaine, la plus grande abudance de cellules a été observée, fait en évidence par la coloration des noyaux cellulaires et l’augmentation de l’intensité de la coloration pour COLLAGEN 1 (COL1), qui a aussi été exprimée par réaction quantitative en chaîne de la polymérase en temps réel (qRT-PCR). Le standard a été observé par l’analyse histologique, les accumulations généralisées de calcium a aussi été plus abondantes dans les charpentes au cours de la troisième semaine de culture, demontré par la coloration de Von Kossa. L’analyse MEB a montré que les cellules ont sécrété des structures globulaires lorsqu’elles ont été cultivées sur conditions d’induction ostéogénique, cohérentes avec la sécrétion observée par l’analyse histologique. Sur la différenciation chondrogénique, les colorants Safranine et Vert Solide ont démontré succès à la différenciation, grâce à la coloration des protéoglycanes, des cellules similaires aux chondrocytes et aux collagène type II. L’analyse MEB a montré que les cellules ont changé leur morphologie de fibroblastes en globulaires quand elles ont été cultivées avec milieu d’induction chondrogène pendant 21 jours. De plus, les complexes de cellules-charpentes ont exprimé un marqueur de la lignée cartilagineuse, COLLAGEN 2 (COL2), qui est cohérent avec les observations histologiques et MEB. Face aux résultats obtenus, cette étude a démontré que les charpentes placentaires cultivés avec des cellules dérivées du tissu adipeux ont le potentiel d’être utilisés dans l’ingénierie de tissus osseux et cartilagineux. / A tecnologia de células-tronco e as ciências de biomateriais obtiveram um grande avanço nas últimas décadas e se tornaram mais populares em todo o mundo. Pesquisadores buscam investigar e avaliar diferentes fontes de células e de biomateriais que, em combinação, possam fornecer uma plataforma de engenharia tecidual de baixo custo e produzida em larga escala, para serem utilizadas em testes de drogas, terapias celulares e transplantes, com objetivo de fornecer suporte terapêutico à lesões e regeneração de tecidos danificados. Em geral, os três componentes mais importantes da engenharia de tecidos são: a escolha do tipo de célula, a fonte do biomaterial (scaffold), criação e manutenção de um ambiente propício à formação tecidual. Quando esses três componentes são gerenciados com sucesso, o microambiente celular in vitro é mais semelhante ao que a célula está exposta in vivo, permitindo que o crescimento e diferenciação celular ocorra de maneira mais fidedigna e eficiente. A placenta bovina descelularizada demonstrou ter uma rica matriz extracelular, vasos bem desenvolvidos, sendo um biomaterial com alta disponibilidade e baixo custo. No entanto, não há informação sobre o potencial dos scaffolds placentários em serem repovoados com células-tronco mesenquimais (MSC) derivadas do tecido adiposo, processo chamado recelularização. Ainda, também não há informação sobre a capacidade dos scaffolds placentários, de após recelularização, oferecer um ambiente adequado para diferenciação dessas células em diferentes linhagens. Assim, a fim de fornecer informações sobre a capacidade do complexo MSC - scaffold placentário em ser usado com sucesso na engenharia tecidual, os objetivos desta tese foram: estudar o potencial dos scaffolds placentários bovinos em oferecer suporte para recelularização por células-tronco derivadas do tecido adiposo bovino, bem como avaliar a capacidade de diferenciação celular em linhagens osteogênica e condrogênica. O primeiro artigo desta tese trata-se de uma revisão de literatura, que discute a natureza das células-tronco mesenquimais, suas aplicações na medicina regenerativa, a importância da tecnologia com células- tronco na indústria pecuária e o uso da espécie bovina na medicina translacional. O segundo artigo consiste na avaliação da recelularização e da diferenciação celular. As placentas bovinas foram decelularizadas por perfusão de SDS do vaso umbilical e as linhas celulares estabelecidas após digestão enzimática do tecido adiposo de seis vacas e seleção por adesão rápida à placa de cultivo. Em seguida, as células foram cultivadas com os scaffolds em um sistema de agitação 2D por 21 dias em meio de diferenciação ou manutenção. Quando cultivadas na placa de cultivo, as células isoladas exibiram morfologia semelhante ao fibroblasto, expressão de CD90, CD73 e CD105, enquanto não expressaram os marcadores CD34 e CD45. Além disso, as células foram capazes de se diferenciar em linhagens condrogênicas e osteogênicas, fornecendo evidências de sua natureza mesenquimal. Posteriormente, quando cultivadas com os scaffolds, as células aderiram-se aos mesmos por projeções celulares, estabeleceram comunicação célula-scaffold e se proliferaram, fato evidenciado por análise histológica e microscopia eletrônica de varredura (SEM). Em seguida, o potencial das células em se diferenciarem em linhagem osteogênica quando cultivadas com scaffold foi avaliado. Durante um período de cultivo de 21 dias no meio osteogênico, as células se proliferaram e diferenciaram de maneira dependente do tempo, ou seja, a cada semana pode ser observado maior abundância de células, evidenciada pela coloração dos núcleos celulares e aumento da intensidade da coloração para COLAGENO 1 (COL1), que também foi expresso por reação quantitativa em cadeia da polimerase em tempo real (qRT-PCR). O mesmo padrão foi observado pela análise histológica; acúmulos generalizados de cálcio também foram mais abundantes nos scaffolds na terceira semana de cultivo, evidenciado pela coloração de Von Kossa. A análise SEM revelou que as células secretaram estruturas globulares quando cultivadas sob condições de indução osteogênica, condizente com a secreção observada pela análise histológica. Em relação à diferenciação condrogênica, os corantes Safranina e Fast Green revelaram sucesso na diferenciação, através da coloração de proteoglicanos, células semelhantes aos condrócitos e colágeno tipo II. A análise SEM mostrou que as células mudaram sua morfologia de fibroblastos para globulares quando cultivadas com meio de indução condrogênica por 21 dias. Além disso, os complexos células-scaffold expressaram um marcador de linhagem cartilaginosa, COLAGENO 2 (COL2), condizente com as observações histológicas e SEM. Considerando os resultados, este estudo demonstrou que os scaffolds placentários bovinos cultivados com células-tronco derivadas de tecido adiposo bovino possuem potencial para serem utilizados na engenharia de tecidos ósseos e cartilaginosos. / Stem cell technologies and biomaterial sciences have advanced and grown more popular all over the world. The researchers aim to investigate and evaluate different sources of cells and biomaterials that, in combination, could provide a low cost, highly scalable tissue engineering platform that could be used in drug tests, cell therapies and cell transplantation. The three most important components of tissue engineering systems in general are cell source, biomaterial source (scaffolding system), and the creation and maintenance of an environment that is conducive to tissue formation. When these three components are successfully managed, the tissue engineering treatment achieves a faithful imitation of the in vivo environment, allowing for the differentiation of cells into the desirable cell types. Decellularized bovine placenta has been demonstrated to be rich in extracellular matrix (ECM) and to have well-developed vasculature, representing a highly available, low cost, practically scalable biomaterial. However, it is not known if placental scaffolds have the potential to support recellularization with adipose-derived cells and their subsequent differentiation into different lineages. Thus, in order to provide information on the ability of the mesenchymal stem cell (MSC) - placental scaffold complex to be used in tissue engineering approaches, the objectives of this thesis were: to study the potential of bovine placental scaffolds to support adipose-derived cell recellularization and their differentiation into osteogenic and chondrogenic lineages. The first article of this thesis is a literature review that discusses the nature of mesenchymal stem cells, their applications in regenerative medicine, the importance of stem cell technologies to the livestock industry and the use of bovine species for translational medicine. The second article consists of an evaluation of scaffold recellularization and the differentiation of cells on the scaffolds. The bovine placentae were decellularized by umbilical vessel sodium dodecyl sulfate (SDS) perfusion and cell lines were established after the enzymatic digestion of adipose tissue from six cows and cell selection by rapid adherence to the culture plate. Then, cells were seeded onto the scaffolds and cultured in a 2D rocker system for 21 days in either differentiation or maintenance medium. The isolated cells, when cultured in the plastic dish, exhibited fibroblast-like morphology, CD90, CD73 and CD105 expression, and lacked CD34 and CD45 expression. Moreover, the cells were able to undergo differentiation into chondrogenic and osteogenic lineages, providing evidence of their mesenchymal nature. 8 Subsequently, the cells adhered to the scaffolds by cell projections, established cell-scaffold communication, and proliferated while maintaining cell-cell communication, which was evidenced by histological and scanning electron microscopy (SEM) assays. Throughout a 21- day culture period in the osteogenic medium, the cells exhibited proliferation and differentiation in a time-dependent manner, which can be observed by the greater abundance of cells in later periods, evidenced by cell nuclei staining (4′,6-diamidino-2- phenylindole - DAPI) and increased intensity of staining for COLLAGEN 1 (COL1) in the immunohistochemical assay, and by its expression as measured by real time polymerase chain reaction (qRT-PCR). This same pattern was observed by histological analysis. Widespread calcium accumulations were also more abundant on the scaffolds as time progressed, as evidenced by Von Kossa staining. The SEM analysis revealed that cells secreted globular/round structures when seeded under osteogenic induction conditions, in accordance with histological findings. Regarding chondrogenic differentiation, Safranin O and Fast Green staining revealed successful differentiation through staining of proteoglycans, chondrocyte-like cells and type II collagen on the scaffold. The SEM analysis showed that the cells changed morphology from fibroblast-like to globular when cultured with chondrogenic induction medium for 21 days. Additionally, cell-scaffold complexes expressed a cartilage marker, COLLAGEN 2 (COL2), which is conducive to the histological and SEM observations. Considering the results as a whole, this study demonstrated that placental scaffolds seeded with adipose-derived cells have the potential to be used in bone and cartilage tissue- engineering applications

A utilização de Células-tronco e técnicas da Engenharia Tecidual representa um grande avanço tecnológico e beneficiará muitos pacientes com suas conquistas. A descoberta de germes dentários como uma fonte confiável de células-tronco possibilitou diversas pesquisas nesta área. Duailibi et al. (2011) sugeriram uma nova classificação de desenvolvimento dentário baseada pela quantidade de material biológico coletado indicando a necessidade de métodos de diagnóstico por imagem para esta nova classificação. Na literatura diversos trabalhos indicam métodos de classificação dentária e métodos para estimar a idade fisiológica de indivíduos. O presente estudo tem o objetivo de adaptar alguns destes métodos para estimar o estágio de desenvolvimento proposto por Duailibi et al. (2011) consequentemente indicando a quantidade de células-tronco esperadas nas amostras. Para tanto, submeteu-se uma coleção de 67 dentes previamente classificados por Duailibi et al. (2011) à técnica rpcl e à tcfc para a obtenção de imagens e a aplicação de técnicas de estimativas por proporções lineares e volumétricas. Os resultados por análises lineares indicaram valores de R2 para o método de proporção de comprimento CDCP de 0,14050; CCCP de 0,65369; CCCR de 0,5408; CDCR de 0,54074; o método de proporção de área APAD de 0,23925; e método de proporção de volume VPVD de 0,08553, com valor de p menor ou igual à 0,05. Concluindo este estudo indica-se o método de rpcl utilizando a análise do comprimento entre coroa e polpa como o mais indicado para estimar o estágio de desenvolvimento. / The usage of human dental stem cells and tissue engineering technics represents a huge tecnological development and it may benefits many patients in a promissing future. The discovery of suitable source of human dental stem cells were made using tooth buds. Duailibi et al. 2011 indicated a new tooth classification on a stem cell harvesting based research, sugesting new methods for diagnosis these stages. Several method were developed for dental age assesement. The presente study aims to evaluate some of these dental age technics and make adaptations for estimating Duailibi et al. 2011 tooth stages. A 67 tooth sample previoulsy classificated by Duailbi et al. 2011 were submited through periapical parallel long cone X-rays and CBCT analysis. Age estimation ratio methods were applied by measuring tooth/root lenth, crown/root lenth, tooth/pulp lenth, crown/pulp lenth, tooth/poulp área and tooth/pulp volume. Results indicated by linear regression analisys a R2 value of tooth/pulp lenth 0,14050; crown/pulp lenth 0,65369; crown/root lenth 0,5408; tooth/root lenth 0,54074; pulp/tooth volume 0,23925; e tooth/pulp volume de 0,08553, with p value of 0,005. In conclusion , the best method for estimating Duailibi et al. 2011 tooth classification techinic is made by using periapical long cone X-rays using crown/pulp lenth ratio.

Made available in DSpace on 2016-01-26T12:51:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 heloisacaldas_tese.pdf: 13961449 bytes, checksum: adc041656d053c466bd2f0851119388c (MD5) Previous issue date: 2011-07-26 / Chronic renal failure (CRF) is characterized by progressive and irreversible loss of renal function and its treatment generates significant public spending for maintenance and care of patients on dialysis. Stem cell (SC) therapy, in its potential for treatment of chronic diseases, may be a promising strategy for repairing the damage from or slowing the progression of CRF. There are questions about cell type, quantity of cells, method and ideal place for deployment of SC and the role it plays in the repair of renal parenchyma. Objective: 1) To evaluate the effect of infusion of bone marrow derived cells (BMDC) in the treatment of experimental CRF; 2) Evaluate the combined effect of SC and biomaterial (BM) in the progression of CRF and study the effect of this therapy in different stages of CRF; 3) Evaluate the development of techniques for isolation and cultivation of human umbilical cord blood (HUCB) mesenchymal cells. Methods: Article 1: We used the 5/6 mass reduction model to induce experimental CRF. Kidney function was measured at the beginning of the experiment and 60 and 120 days after the surgery; Article 2: Animals were subdivided as to the amount of renal parenchyma injured (5/6 or 2/3), the use of BM as a scaffold to cell implantation, and cell type used (mononuclear or mesenchymal cells). Renal function was evaluated on days 0, 45, and 90 after surgery. Histological and immunohistochemical analyses were done in all groups at the end of the study; Article 3: Ten samples of HUCB were used and two different procedures for cultivation of mesenchymal stem cells (MSC) were tested: without Ficoll-Paque density gradient, to obtain nucleated cells; with Ficoll-Paque density gradient, for obtaining mononuclear cells. Results: Article 1: CRF progression analysis showed that treatment with BMDC significantly reduced the rate of decline of creatinine clearance (Clcr) when compared with the control group; Article 2:Treated animals showed significantly lower increases in serum creatinine and 24 hour proteinuria, and higher increases in Clcr after 90 days when compared to control animals in both models of CRF; Article 3: The MSC in culture from the method without Ficoll-Paque density gradient maintained growth forming confluent cell foci. Conclusions: Article 1: Progression of CRF can be delayed by injection of BMDC in the renal parenchyma; Article 2: a) Use of SC combined with BM can be an alternative way to administer BMDC; b) Cell therapy seems to be most effective when administered in less severe stages of CRF; Article 3: Nucleated cells without using Ficoll-Paque density gradient showed more efficiency in the cultivation of MSC from HUCB when compared with the procedure employing Ficoll-Paque density gradient / A insuficiência renal crônica (IRC) é caracterizada pela perda progressiva e irreversível da função renal e seu tratamento gera um gasto público significativo para manutenção de pacientes em tratamento dialítico. A terapia com células-tronco (CT), pelo seu potencial de tratamento das doenças crônicas, pode ser uma estratégia promissora para reparar ou retardar a progressão da IRC. Existem dúvidas sobre o tipo celular, a quantidade de células, o método e local ideal para implantação das CT e o papel por elas desempenhado na reparação do parênquima renal. Objetivos: 1) avaliar o efeito da infusão de células derivadas da medula óssea (CDMO) no tratamento da IRC experimental; 2) avaliar o efeito combinado das CT e biomaterial (BM) na progressão da IRC e estudar o efeito dessa terapia em diferentes estágios da IRC; 3) Avaliar o desenvolvimento de técnicas de isolamento e cultivo de células mesenquimais do sangue de cordão umbilical humano (SCU). Métodos: artigo 1: usamos o modelo de redução de massa 5/6 para induzir a IRC experimental. Função renal foi medida no início do experimento e 60 e 120 dias depois da cirurgia; artigo 2: animais foram subdivididos conforme a quantidade de parênquima renal lesado (5/6 ou 2/3), o uso de BM como arcabouço para o implante celular e o tipo de células utilizado (célula mononuclear ou mesenquimal). A função renal foi avaliada nos dias 0, 45 e 90 após cirurgia. Análise histológica e imunohistoquimica foram realizadas em todos os grupos ao final do estudo; artigo 3: Foram utilizadas dez amostras de SCU e testados dois diferentes procedimentos para cultivo de células-tronco mesenquimal (CTM): sem gradiente de densidade Ficoll-Paque, para obtenção de células nucleadas; por gradiente de densidade Ficoll-Paque, para obtenção de células mononucleares. Resultados: artigo 1: Análises da progressão da IRC mostraram que o tratamento com CDMO reduziu significativamente a taxa de declínio do clearance ( Clcr) quando comparados com o grupo controle; artigo 2: animais tratados apresentaram aumentos significativamente menores de creatinina sérica, proteinúria e Clcr maiores após 90 dias, quando comparado aos animais controles em ambos os modelos de IRC; artigo 3: as CTM em cultura provenientes do método sem gradiente de densidade Ficoll- Paque mantiveram o crescimento formando focos confluentes de células. Conclusões: artigo 1: a progressão da IRC pode ser retardada pela injeção de CDMO no parênquima renal; artigo 2: a) utilização da CT combinada com o BM pode ser uma via alternativa para administrar a CTMO; b) terapia celular parece ser mais eficaz quando administrada em estágios menos graves da IRC; artigo 3: As células nucleadas sem uso do gradiente de densidade Ficoll-Paque mostraram mais eficiente para o cultivo de CTM do SCU quando comparado ao procedimento com gradiente de densidade Ficoll-Paque.

Atualmente, existe uma grande necessidade médica por enxertos vasculares de pequeno calibre (< 6 mm), que possam ser utilizados em cirurgias de reconstrução vascular. Nesse trabalho, dois tipos de biomateriais vasculares foram desenvolvidos pela técnica de electrospinning: biomateriais de policaprolactona (PCL) e biomateriais de poli(carbonato de trimetileno – co – ácido lático) (PTMCLLA). Os biomateriais de PCL foram funcionalizados com heparina e com VEGF (PCL/Hep/VEGF). Os biomateriais de PTMCLLA foram desenvolvidos a partir de três razões de carbonato de trimetileno/ ácido lático: 20/80, 30/70 e 40/60. Os biomateriais de PCL apresentaram taxa de degradação lenta e alta elasticidade. A funcionalização dos biomateriais preveniu a coagulação do sangue e também favoreceu o crescimento de células-tronco mesenquimais (CTMs) e de células progenitoras endoteliais (CPEs) nessas estruturas. A análise de PCR demonstrou que o VEGF adsorvido aos biomateriais não foi suficiente para diferenciar as CTMs em células endoteliais. O cultivo das CPEs sobre os biomateriais aumentou a expressão de VE-caderina e a presença de VEGF nas estruturas manteve o nível de expressão de CD31 e CD34 nessas células. Após essas análises, os biomateriais de PCL/Hep/VEGF foram fabricados em formato tubular. As CPEs foram semeadas no lúmen do biomaterial, através de biorreatores de parede rotatória (BPR), e mantidas em cultivo, por biorreatores de perfusão (BP). O BPR favoreceu a distribuição homogênea das CPEs na parede luminal dos biomateriais enquanto que o BP estimulou seu crescimento e otimizou seu metabolismo energético. Os biomateriais produzidos a partir dos copolímeros de PTMCLLA 30/70 e 40/60 exibiram uma alta flexibilidade. Porém, os biomateriais de PTMCLLA 40/60 tiveram um grande enrugamento. Os biomateriais de PTMCLLA 30/70 suportaram a adesão e o crescimento de CTMs, de CPEs e de células musculares lisas. Os resultados obtidos no presente estudo demonstram que biomateriais de PCL/Hep/VEGF apresentam características físico-químicas compatíveis para o uso vascular. Ainda, previnem a formação de trombos em sua superfície e propiciam o desenvolvimento da camada endotelial em seu lúmen. Os biomateriais de PTMCLLA 30/70 exibem alta flexibilidade e suportam o desenvolvimento de células vasculares e de células-tronco mesenquimais. De acordo com esses resultados, é possível concluir que biomateriais de PCL/Hep/VEGF e de PTMCLLA 30/70 são candidatos promissores para aplicação como enxertos vasculares. / Currently, there is a great medical need for small caliber vascular grafts (<6 mm), which can be used in vascular replacement surgeries. In this work, two types of vascular biomaterials were developed by the electrospinning technique: biomaterials of polycaprolactone (PCL) and biomaterials of poly(trimethylene carbonate-co-L-lactide) (PTMCLLA). PCL biomaterials were functionalized with heparin and VEGF (PCL / Hep/VEGF). The PTMCLLA biomaterials were developed from three ratios of trimethylene carbonate/lactide: 20/80, 30/70 and 40/60. The PCL biomaterials presented a slow degradation rate and high elasticity. The functionalization of the biomaterials prevented the blood from clotting and also favored the growth of mesenchymal stem cells (MSCs) and endothelial progenitor cells (EPCs) in these structures. PCR analysis demonstrated that VEGF adsorbed by the biomaterials was not sufficient to differentiate the MSCs into endothelial cells. The cultivation of CPEs on the biomaterials increased their expression of VE-cadherin and the presence of VEGF in the structures maintained the cell expression of CD34 and CD31. After these analyzes, the PCL/Hep/VEGF biomaterials were produced in a tubular geometrical form. The CPEs were seeded into their lumen by rotating bioreactors (RB) and maintained in culture by perfusion bioreactors (PB). The RB favored the homogeneous distribution of the CPEs in the luminal wall of the biomaterials while the BP stimulated their growth and optimized their energetic metabolism. The biomaterials produced from the PTMCLLA 30/70 and 40/60 copolymers exhibited high flexibility. However, the PTMCLLA 40/60 biomaterials exhibited substantial wrinkling. The PTMCLLA 30/70 biomaterials supported the adhesion and growth of MSCs, CPEs and smooth muscle cells. This study has demonstrated that PCL/Hep/VEGF biomaterials have physicochemical characteristics compatible with vascular use. Furthermore, they prevent thrombus formation on their surfaces and promote the development of the endothelial layer in their lumen. Biomaterials of PTMCLLA 30/70 exhibit high flexibility and support the development of vascular and mesenchymal stem cells. According to these results, it can be concluded that PCL/Hep/VEGF and PTMCLLA 30/70 biomaterials are promising candidates for use as vascular grafts.

A utilização de Células-tronco e técnicas da Engenharia Tecidual representa um grande avanço tecnológico e beneficiará muitos pacientes com suas conquistas. A descoberta de germes dentários como uma fonte confiável de células-tronco possibilitou diversas pesquisas nesta área. Duailibi et al. (2011) sugeriram uma nova classificação de desenvolvimento dentário baseada pela quantidade de material biológico coletado indicando a necessidade de métodos de diagnóstico por imagem para esta nova classificação. Na literatura diversos trabalhos indicam métodos de classificação dentária e métodos para estimar a idade fisiológica de indivíduos. O presente estudo tem o objetivo de adaptar alguns destes métodos para estimar o estágio de desenvolvimento proposto por Duailibi et al. (2011) consequentemente indicando a quantidade de células-tronco esperadas nas amostras. Para tanto, submeteu-se uma coleção de 67 dentes previamente classificados por Duailibi et al. (2011) à técnica rpcl e à tcfc para a obtenção de imagens e a aplicação de técnicas de estimativas por proporções lineares e volumétricas. Os resultados por análises lineares indicaram valores de R2 para o método de proporção de comprimento CDCP de 0,14050; CCCP de 0,65369; CCCR de 0,5408; CDCR de 0,54074; o método de proporção de área APAD de 0,23925; e método de proporção de volume VPVD de 0,08553, com valor de p menor ou igual à 0,05. Concluindo este estudo indica-se o método de rpcl utilizando a análise do comprimento entre coroa e polpa como o mais indicado para estimar o estágio de desenvolvimento. / The usage of human dental stem cells and tissue engineering technics represents a huge tecnological development and it may benefits many patients in a promissing future. The discovery of suitable source of human dental stem cells were made using tooth buds. Duailibi et al. 2011 indicated a new tooth classification on a stem cell harvesting based research, sugesting new methods for diagnosis these stages. Several method were developed for dental age assesement. The presente study aims to evaluate some of these dental age technics and make adaptations for estimating Duailibi et al. 2011 tooth stages. A 67 tooth sample previoulsy classificated by Duailbi et al. 2011 were submited through periapical parallel long cone X-rays and CBCT analysis. Age estimation ratio methods were applied by measuring tooth/root lenth, crown/root lenth, tooth/pulp lenth, crown/pulp lenth, tooth/poulp área and tooth/pulp volume. Results indicated by linear regression analisys a R2 value of tooth/pulp lenth 0,14050; crown/pulp lenth 0,65369; crown/root lenth 0,5408; tooth/root lenth 0,54074; pulp/tooth volume 0,23925; e tooth/pulp volume de 0,08553, with p value of 0,005. In conclusion , the best method for estimating Duailibi et al. 2011 tooth classification techinic is made by using periapical long cone X-rays using crown/pulp lenth ratio.

Submitted by Maria Anália Conceição (marianaliaconceicao@gmail.com) on 2016-06-23T11:30:40Z No. of bitstreams: 1 Publico-NOVO-03.pdf: 1761339 bytes, checksum: 1ec50dfc6d5850f1b16cf857655b8101 (MD5) / Approved for entry into archive by Maria Anália Conceição (marianaliaconceicao@gmail.com) on 2016-06-23T11:32:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Publico-NOVO-03.pdf: 1761339 bytes, checksum: 1ec50dfc6d5850f1b16cf857655b8101 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-23T11:32:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Publico-NOVO-03.pdf: 1761339 bytes, checksum: 1ec50dfc6d5850f1b16cf857655b8101 (MD5) Previous issue date: 2014 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Introdução: A Engenharia Tecidual (ET) tem como objetivo a fabricação de órgãos e tecidos. Preconiza-se o uso de células autólogas para evitar a incompatibilidade imunológica, porém, pela escassez do número de células obtidas na fonte celular, muitas passagens se tornam necessárias para atingir um número adequado de células. As culturas primárias freqüentemente sofrem diferenciação indesejada, modificando o comportamento e o destino celular. O uso de enzimas proteolíticas durante as passagens celulares é potencialmente lesivo à fisiologia celular, todavia pouca relevância tem sido dada a este aspecto na ET. Essas enzimas, ao digerir a matriz extracelular (MEC), também alteram proteínas de superfície (PS), interferindo na interação célula-célula (ICC). Consequentemente podem alterar a sinalização celular, a expressão gênica, o comportamento e o destino. Objetivo: Avaliar a expressão gênica na via de sinalização TGFβ/BMP, em matriz extracelular e em moléculas de adesão, das células tronco mesenquimais de polpa dental humana (hDPSC) obtidas diretamente do tecido e sob cultura primária até a terceira passagem. Métodos: Foi analisada a expressão gênica por qRT-PCR array da via de sinalização TGFβ/BMP, matriz extracelular e moléculas de adesão após três passagens celulares na cultura primária de hDPSC. Resultados: Os genes COL16A1(p=0,045), TIMP1(p=0,003), THBS1(p=0,027), TGFBI(p=0,001), ITGA8(p=0,002), FN1(p=0,035), CD44(p=0,046),TSC22D1(p=0,026) e RPL13A(p=0,017) tiveram sua expressão aumentada e os genes NCAM1(p=0,047), BGLAP(p=0,037) e ID1(p=0,027) tiveram sua expressão diminuída em relação às células de tecido de origem. Conclusão: Houve alteração da expressão gênica na cultura celular de hDPSC após três passagens. Porém, um gene solitariamente pode não exercer função chave na diferenciação de células, influenciada pela relação com a MEC e com o ambiente extracelular. O controle por modulação da diferenciação celular representa um aspecto importante no desenvolvimento da ET. / Introduction: Tissue Engineering (TE) aims to manufacture organs and tissues and advocates the use of autologous cells to avoid immune incompatibility. However, a longer culture time is necessary to achieve that purpose. Primary cultures often suffer undesirable differentiation, modifying behavior and cell fate. The use of proteolytic enzymes during cell passages is potentially harmful to cell physiology, but little importance has been given to this aspect in ET. These enzymes which digest the extracellular matrix (ECM) also alter surface proteins (SP) and interfere with cell-cell interactions (ICC). Consequently, may alter cell signaling by modifying gene expression, behavior and cell fate. Objective: To assess gene expression in the signaling TGFβ / BMP pathway, in extracellular matrix and in adhesion molecules, of mesenchymal human dental pulp cells from tissue and cultured until third passage. Methods: We had evaluated gene expression by qRT-PCR array of signaling TGFβ / BMP pathway, in extracellular matrix and in adhesion molecules, of mesenchymal cells from primary and third passage cultured human dental pulp Results: COL16A1(p=0,045), TIMP1(p=0,003), THBS1(p=0,027), TGFBI(p=0,001), ITGA8(p=0,002), FN1(p=0,035), CD44(p=0,046),TSC22D1(p=0,026) and RPL13A(p=0,017) genes had their expression increased and NCAM1(p=0,047), BGLAP(p=0,037) and ID1(p=0,027) genes had reduced expression compared to primary cells. Conclusion: There were modifications in gene expression after three passages. However, a single gene could not be enough to exert a key role in cell differentiation that is broadly affected by its relationship with the ECM and extracellular environment. The control by modulation of cellular differentiation, is an important aspect in the development of ET. / FAPESP: 2013/00288-4

Atualmente, existe uma grande necessidade médica por enxertos vasculares de pequeno calibre (< 6 mm), que possam ser utilizados em cirurgias de reconstrução vascular. Nesse trabalho, dois tipos de biomateriais vasculares foram desenvolvidos pela técnica de electrospinning: biomateriais de policaprolactona (PCL) e biomateriais de poli(carbonato de trimetileno – co – ácido lático) (PTMCLLA). Os biomateriais de PCL foram funcionalizados com heparina e com VEGF (PCL/Hep/VEGF). Os biomateriais de PTMCLLA foram desenvolvidos a partir de três razões de carbonato de trimetileno/ ácido lático: 20/80, 30/70 e 40/60. Os biomateriais de PCL apresentaram taxa de degradação lenta e alta elasticidade. A funcionalização dos biomateriais preveniu a coagulação do sangue e também favoreceu o crescimento de células-tronco mesenquimais (CTMs) e de células progenitoras endoteliais (CPEs) nessas estruturas. A análise de PCR demonstrou que o VEGF adsorvido aos biomateriais não foi suficiente para diferenciar as CTMs em células endoteliais. O cultivo das CPEs sobre os biomateriais aumentou a expressão de VE-caderina e a presença de VEGF nas estruturas manteve o nível de expressão de CD31 e CD34 nessas células. Após essas análises, os biomateriais de PCL/Hep/VEGF foram fabricados em formato tubular. As CPEs foram semeadas no lúmen do biomaterial, através de biorreatores de parede rotatória (BPR), e mantidas em cultivo, por biorreatores de perfusão (BP). O BPR favoreceu a distribuição homogênea das CPEs na parede luminal dos biomateriais enquanto que o BP estimulou seu crescimento e otimizou seu metabolismo energético. Os biomateriais produzidos a partir dos copolímeros de PTMCLLA 30/70 e 40/60 exibiram uma alta flexibilidade. Porém, os biomateriais de PTMCLLA 40/60 tiveram um grande enrugamento. Os biomateriais de PTMCLLA 30/70 suportaram a adesão e o crescimento de CTMs, de CPEs e de células musculares lisas. Os resultados obtidos no presente estudo demonstram que biomateriais de PCL/Hep/VEGF apresentam características físico-químicas compatíveis para o uso vascular. Ainda, previnem a formação de trombos em sua superfície e propiciam o desenvolvimento da camada endotelial em seu lúmen. Os biomateriais de PTMCLLA 30/70 exibem alta flexibilidade e suportam o desenvolvimento de células vasculares e de células-tronco mesenquimais. De acordo com esses resultados, é possível concluir que biomateriais de PCL/Hep/VEGF e de PTMCLLA 30/70 são candidatos promissores para aplicação como enxertos vasculares. / Currently, there is a great medical need for small caliber vascular grafts (<6 mm), which can be used in vascular replacement surgeries. In this work, two types of vascular biomaterials were developed by the electrospinning technique: biomaterials of polycaprolactone (PCL) and biomaterials of poly(trimethylene carbonate-co-L-lactide) (PTMCLLA). PCL biomaterials were functionalized with heparin and VEGF (PCL / Hep/VEGF). The PTMCLLA biomaterials were developed from three ratios of trimethylene carbonate/lactide: 20/80, 30/70 and 40/60. The PCL biomaterials presented a slow degradation rate and high elasticity. The functionalization of the biomaterials prevented the blood from clotting and also favored the growth of mesenchymal stem cells (MSCs) and endothelial progenitor cells (EPCs) in these structures. PCR analysis demonstrated that VEGF adsorbed by the biomaterials was not sufficient to differentiate the MSCs into endothelial cells. The cultivation of CPEs on the biomaterials increased their expression of VE-cadherin and the presence of VEGF in the structures maintained the cell expression of CD34 and CD31. After these analyzes, the PCL/Hep/VEGF biomaterials were produced in a tubular geometrical form. The CPEs were seeded into their lumen by rotating bioreactors (RB) and maintained in culture by perfusion bioreactors (PB). The RB favored the homogeneous distribution of the CPEs in the luminal wall of the biomaterials while the BP stimulated their growth and optimized their energetic metabolism. The biomaterials produced from the PTMCLLA 30/70 and 40/60 copolymers exhibited high flexibility. However, the PTMCLLA 40/60 biomaterials exhibited substantial wrinkling. The PTMCLLA 30/70 biomaterials supported the adhesion and growth of MSCs, CPEs and smooth muscle cells. This study has demonstrated that PCL/Hep/VEGF biomaterials have physicochemical characteristics compatible with vascular use. Furthermore, they prevent thrombus formation on their surfaces and promote the development of the endothelial layer in their lumen. Biomaterials of PTMCLLA 30/70 exhibit high flexibility and support the development of vascular and mesenchymal stem cells. According to these results, it can be concluded that PCL/Hep/VEGF and PTMCLLA 30/70 biomaterials are promising candidates for use as vascular grafts.

Atualmente, existe uma grande necessidade médica por enxertos vasculares de pequeno calibre (< 6 mm), que possam ser utilizados em cirurgias de reconstrução vascular. Nesse trabalho, dois tipos de biomateriais vasculares foram desenvolvidos pela técnica de electrospinning: biomateriais de policaprolactona (PCL) e biomateriais de poli(carbonato de trimetileno – co – ácido lático) (PTMCLLA). Os biomateriais de PCL foram funcionalizados com heparina e com VEGF (PCL/Hep/VEGF). Os biomateriais de PTMCLLA foram desenvolvidos a partir de três razões de carbonato de trimetileno/ ácido lático: 20/80, 30/70 e 40/60. Os biomateriais de PCL apresentaram taxa de degradação lenta e alta elasticidade. A funcionalização dos biomateriais preveniu a coagulação do sangue e também favoreceu o crescimento de células-tronco mesenquimais (CTMs) e de células progenitoras endoteliais (CPEs) nessas estruturas. A análise de PCR demonstrou que o VEGF adsorvido aos biomateriais não foi suficiente para diferenciar as CTMs em células endoteliais. O cultivo das CPEs sobre os biomateriais aumentou a expressão de VE-caderina e a presença de VEGF nas estruturas manteve o nível de expressão de CD31 e CD34 nessas células. Após essas análises, os biomateriais de PCL/Hep/VEGF foram fabricados em formato tubular. As CPEs foram semeadas no lúmen do biomaterial, através de biorreatores de parede rotatória (BPR), e mantidas em cultivo, por biorreatores de perfusão (BP). O BPR favoreceu a distribuição homogênea das CPEs na parede luminal dos biomateriais enquanto que o BP estimulou seu crescimento e otimizou seu metabolismo energético. Os biomateriais produzidos a partir dos copolímeros de PTMCLLA 30/70 e 40/60 exibiram uma alta flexibilidade. Porém, os biomateriais de PTMCLLA 40/60 tiveram um grande enrugamento. Os biomateriais de PTMCLLA 30/70 suportaram a adesão e o crescimento de CTMs, de CPEs e de células musculares lisas. Os resultados obtidos no presente estudo demonstram que biomateriais de PCL/Hep/VEGF apresentam características físico-químicas compatíveis para o uso vascular. Ainda, previnem a formação de trombos em sua superfície e propiciam o desenvolvimento da camada endotelial em seu lúmen. Os biomateriais de PTMCLLA 30/70 exibem alta flexibilidade e suportam o desenvolvimento de células vasculares e de células-tronco mesenquimais. De acordo com esses resultados, é possível concluir que biomateriais de PCL/Hep/VEGF e de PTMCLLA 30/70 são candidatos promissores para aplicação como enxertos vasculares. / Currently, there is a great medical need for small caliber vascular grafts (<6 mm), which can be used in vascular replacement surgeries. In this work, two types of vascular biomaterials were developed by the electrospinning technique: biomaterials of polycaprolactone (PCL) and biomaterials of poly(trimethylene carbonate-co-L-lactide) (PTMCLLA). PCL biomaterials were functionalized with heparin and VEGF (PCL / Hep/VEGF). The PTMCLLA biomaterials were developed from three ratios of trimethylene carbonate/lactide: 20/80, 30/70 and 40/60. The PCL biomaterials presented a slow degradation rate and high elasticity. The functionalization of the biomaterials prevented the blood from clotting and also favored the growth of mesenchymal stem cells (MSCs) and endothelial progenitor cells (EPCs) in these structures. PCR analysis demonstrated that VEGF adsorbed by the biomaterials was not sufficient to differentiate the MSCs into endothelial cells. The cultivation of CPEs on the biomaterials increased their expression of VE-cadherin and the presence of VEGF in the structures maintained the cell expression of CD34 and CD31. After these analyzes, the PCL/Hep/VEGF biomaterials were produced in a tubular geometrical form. The CPEs were seeded into their lumen by rotating bioreactors (RB) and maintained in culture by perfusion bioreactors (PB). The RB favored the homogeneous distribution of the CPEs in the luminal wall of the biomaterials while the BP stimulated their growth and optimized their energetic metabolism. The biomaterials produced from the PTMCLLA 30/70 and 40/60 copolymers exhibited high flexibility. However, the PTMCLLA 40/60 biomaterials exhibited substantial wrinkling. The PTMCLLA 30/70 biomaterials supported the adhesion and growth of MSCs, CPEs and smooth muscle cells. This study has demonstrated that PCL/Hep/VEGF biomaterials have physicochemical characteristics compatible with vascular use. Furthermore, they prevent thrombus formation on their surfaces and promote the development of the endothelial layer in their lumen. Biomaterials of PTMCLLA 30/70 exhibit high flexibility and support the development of vascular and mesenchymal stem cells. According to these results, it can be concluded that PCL/Hep/VEGF and PTMCLLA 30/70 biomaterials are promising candidates for use as vascular grafts.

A odontologia, atualmente, conta com uma nova abordagem terapêutica no campo da regeneração tecidual. Essa abordagem baseia-se no uso de moléculas bioativas, mais especificamente as BMPs (Bone Morphogenetic Proteins). A presente revisão propõe-se a apresentar alguns relatos, existentes na literatura, do uso das BMPs como medicamento, dando embasamento para realização de novos experimentos que possam sugerir abordagens terapêuticas inovadoras na área da regeneração tecidual. As BMPs são proteínas pleiotrópicas, que estão envolvidas no desenvolvimento de vários órgãos do corpo humano, e, também, estão presentes nas várias fases da morfogênese dentária, controlando e modulando as atividades celulares. As BMPs têm o potencial de serem usadas, tanto para a regeneração do complexo dentina-polpa quanto para a regeneração do periodonto (osso, cemento, ligamento, gengiva), podem ser empregadas em cirurgias craniofacial para correção de anomalias adquiridas ou herdadas, correção de seqüelas de trauma craniano, seqüelas de câncer, defeitos ósseos e reparo da cartilagem têmporomandibular. Deste trabalho pode-se concluir que a BMP: (1) tem importância na regeneração tecidual como elemento chave na engenharia de tecido; (2) oferece a vantagem de ser uma abordagem mais biológica, gerando um tecido idêntico ao perdido; (3) tem sido bem estudada em vários experimentos clínicos, com muito sucesso, inclusive em humanos; e (4) poderá estar disponível como uma alternativa de terapia a ser empregada no consultório odontológico. / Nowadays, odontology counts on a new therapeutic approach in the field of tissue regeneration. This approach is based in the use of bioactive molecules, specifically the BMPs (Bone Morphogenetic Proteins). The present revision has in view to know the BMPs and its applications as medicines, offering support to the accomplishment of experiments that could suggest new proposes of treatment in the field of tissue regeneration. The BMPs are pleiotropic proteins that are involved in the development of many organs of the human body and they are also present in the several phases of dental morphogenesis, controlling and modulating the cellular activities. The BMPs have the potential to be used to the regeneration of the dentin-pulp complex as much as to the regeneration of the periodontium (bone, cementum, ligament and gingiva), and can be used in facial and cranial surgeries to the correction of acquired or inherited anomalies, correction of cranial trauma consequences, bone defects and repair of the temporal- mandible cartilage. From this review, we can conclude some topics about the BMP: (1) it has importance in the tissue regeneration as a key element in tissue engineering; (2) the BMP offers the advantage of being a more biologic approach, generating a new tissue that is identic to the lost one; (3) it has been studied in several clinic experiments, with great success, even including humans; (4) it probably will be available as an alternative of therapy, that may be used in odontologic rooms in the future.