Orientador: Marcelo Palma Sircili / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T04:50:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franzin_FernandaMaria_D.pdf: 6490379 bytes, checksum: facd90d2115a20d8eccb498865503103 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Escherichia coli enteropatogênica atípica (aEPEC) faz parte de um grupo de patógenos capazes de formar um tipo de lesão em células epiteliais denominada Attaching and Effacing (A/E). Os genes requeridos para a formação da lesão A/E estão localizados em uma ilha de patogenicidade denominada Locus of Enterocyte Effacement (LEE). A regulação da expressão dos genes de LEE é um processo complexo e envolve inúmeros fatores e vias regulatórias, incluindo o sistema de quorum sensing AI- 3/Epinefrina/Norepinefrina. O sensor histidina-quinase QseC é responsável por detectar AI-3 produzido por outras bactérias e epinefrina/norepinefrina produzidas pelo hospedeiro e iniciar uma cascata regulatória que induz a expressão de genes de virulência. Para avaliar o papel desse sistema na regulação de fatores de virulência de aEPEC, um mutante para o gene qseC foi gerado e analisado a nível transcricional e fenotípico quanto a sua motilidade, capacidade de secretar proteínas e induzir lesão A/E, na presença e/ou ausência do sinal epinefrina. Ensaios de qRT-PCR demonstraram níveis transcricionais diminuídos para LEE e para os genes flhD, fliC e nleA no mutante, sugerindo que QseC regula a expressão desses fatores de virulência. Ensaios de motilidade, proteínas secretadas e FAS evidenciaram que a motilidade, a secreção de proteínas e a formação da lesão A/E estavam diminuídas no mutante, comprovando a participação de QseC na regulação desses fenótipos em aEPEC. Os mesmos ensaios realizados na presença de epinefrina demonstraram que esse sinal tem papel importante na regulação dos genes de LEE de aEPEC e que essa regulação não ocorre exclusivamente via QseC, mas envolve outro receptor para esse hormônio. Epinefrina regula a expressão dos genes de LEE, porém, parece não ser um sinal importante na regulação da expressão de NleA e flagelo/motilidade. A análise do transcriptoma da linhagem mutante demonstrou que, além de ter uma importância central na regulação da virulência de aEPEC, QseC age também como um importante regulador global da expressão gênica nessa linhagem, regulando, direta ou indiretamente, a expressão de, aproximadamente, 1505 genes, entre eles genes relacionados ao metabolismo, transporte, quimiotaxia, captação de íons, resistência à stress, formação de biofilme, regulação transcricional, etc. Um modelo geral simplificado da regulação gênica da virulência de aEPEC através do sistema AI-3/Epi/NE e seu sensor QseC foi proposto. Esse trabalho descreve pela primeira vez a regulação do tipo quorum sensing na modulação da expressão da virulência em uma EPEC atípica / Abstract: Atypical enteropathogenic Escherichia coli (aEPEC) is part of a group of pathogens capable of forming a characteristic lesion in epithelial cells called Attaching and Effacing (A/E). Genes required for A/E lesion formation are located on a pathogenicity island called Locus of Enterocyte Effacement (LEE). The regulation of LEE gene expression is a complex process and involves several factors and regulatory pathways, including the quorum sensing system AI-3/Epinephrine/Norepinephrine. The histidine kinase sensor QseC is responsible for detecting AI-3 produced by other bacteria and epinephrine/norepinephrine produced by the host, starting a regulatory cascade that induces the expression of virulence genes. In order to evaluate the influence of this system in the regulation of virulence factors of aEPEC, a qseC mutant has been generated, and transcriptional and phenotypical analyses were performed. Motility, ability to secrete proteins and induce A/E lesion, in the presence and/or absence of the epinephrine signal were analysed. qRT-PCR assays demonstrated reduced transcriptional levels of the LEE operons, and flhD, fliC and nleA genes in the mutant strain, suggesting that QseC regulates the expression of these virulence factors. Motility assays, secreted proteins and FAS have shown that motility, protein secretion and A/E lesion formation were decreased in the mutant, confirming the participation of QseC regulating these phenotypes in aEPEC. The same tests were performed in the presence of epinephrine, and demonstrated that this signal plays an important role in LEE gene regulation of aEPEC and this regulation does not occur exclusively via QseC, but involves other receptor for this hormone. Epinephrine regulates the expression of LEE genes, however, does not seem to be an important signal in the regulation of NleA and flagella/motility gene expression. Transcriptome analysis of the mutant strain has shown that, besides having a central role in the regulation of aEPEC virulence, QseC also acts as an important global regulator of gene expression in this strain, regulating, directly or indirectly, the expression of approximately 1505 genes, including genes related to metabolism, transport, chemotaxis, ion uptake, resistance to stress, biofilm formation, transcriptional regulation, and other. We proposed a simplified general model of virulence gene regulation of aEPEC through the AI-3/Epi/NE system and its sensor QseC. This is the first work describing the quorum sensing gene regulation modulating the virulence expression in atypical EPEC / Doutorado / Microbiologia / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Um estudo prévio descreveu uma cepa de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) do sorotipo O142:H34 (Ec48/66) que apresentava o padrão de adesão agregativa (AA), característico de E. coli enteroagregativa (EAEC), e os genes eae e aatA. O objetivo deste estudo foi avaliar o papel de fímbrias no padrão AA dessa cepa. A mesma aderiu no padrão AA nas linhagens HeLa, HEp-2, HT-29 e T84, além de causar a lesão A/E em células HeLa e HT-29. Foi detectada a presença dos genes que compõem o operon da fímbria AAF/I de EAEC e da fímbria E. coli common pilus (ECP). Ambos os operons foram sequenciados mostrando alta identidade com os operons presentes em EAEC (agg) e EPEC (ecp). Mutantes nos genes aggC e ecpC mantiveram o padrão AA e a capacidade de causar a lesão A/E em células HeLa. O mutante em aggC apresentou diminuição significativa da adesão. Análises filogenéticas posicionaram essa cepa em um grupo constituído por EPEC. A cepa Ec48/66 é uma EPEC atípica que expressa o padrão AA, o qual é parcialmente dependente de uma variante de AAF/I, mas não de ECP. / A previous study described a strain of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC), serotype O142:H34 (Ec48/66), presenting the aggregative adherence pattern (AA), typical of enteroaggregative E. coli (EAEC), and the eae and aatA genes. The aim of this study was to evaluate the role of fimbriae in the AA pattern of Ec48/66. This strain presented the AA pattern in HeLa, HEp-2, HT-29 and T84 cells, and the ability to cause the A/E lesion in HeLa and HT-29 cells. The presence of the genes comprising the operons of AAF/I fimbriae and E. coli common pilus (ECP) was detected. Both operons were sequenced showing high identity with the operons present in EAEC (agg) and EPEC (ecp). Mutants in the aggC and ecp genes maintained the AA pattern and the ability to cause the A/E lesion in HeLa cells. The aggC mutation significantly reduced the adherence. Phylogenetic analyzes located the strain in the group consisting of EPEC. The Ec48/66 strain is an atypical EPEC expressing the AA pattern, which is partially dependent on a variant of AAF/I, but not on ECP.

Introdução. A pesquisa de Escherichia coli em alimentos é relevante para a Saúde Pública porque indica a contaminação fecal e a qualidade do produto oferecido ao consumidor. A determinação do grupo filogenético e de fatores de virulência de E. coli permite identificar a existência de cepas patogênicas que poderiam causar doença. Objetivos: Determinar o grupo filogenético e fatores de virulência de isolados de E. coli pertencentes aos patotipos ETEC, EIEC, EPEC, STEC e EAEC usando métodos moleculares, obtidos de amostras de queijo Minas, discutir a presença dos patotipos nas amostras e o significado para Saúde Pública. Métodos. 250 isolados de Escherichia coli provenientes de 10 amostras de queijo Minas foram utilizados para a realização do estudo. O DNA genômico foi extraído e neste foi realizado a reação de PCR multiplex. Resultados. Os resultados demonstraram que dos 250 isolados, 93,2% foi classificado como grupo filogenético A, 3,2% como B1, 2,8% como B2 e 0,8% como D. Dos 250 isolados estudados, em 96,8% (242) foram encontrados fatores de virulência, sendo 91,6% de marcadores para ETEC, 0,4% para EPEC e 4,8% para EAEC. Conclusões. Houve predominância de fatores de virulência do patotipo ETEC e do grupo filogenético A. A presença de fatores de virulência indica que as amostras de queijo estavam contaminadas e poderiam causar doença, evidenciando a necessidade de medidas de controle efetivas por parte das autoridades sanitárias, bem como campanhas educativas / Introduction. The search of Escherichia coli in foods is relevant for the Public Health because it indicates the fecal contamination and the product quality offered to the consumer. The determination of phylogenetic group and virulence factors of E. coli, allows the identification of the existence of pathogenic strains that could cause disease. Objectives: Determine the phylogenetic group and the pathogenic of Escherichia coli belonging to the patotipos isolated occurrence ETEC, EIEC, EPEC, STEC and EAEC using molecular methods obtained from Minas cheese samples, to discuss the presence of the patotipos in the samples and the meaning for Public Health. Methods. 250 isolates of Escherichia coli from 10 Minas cheese samples was used for the accomplishment of the study. Genomic DNA was extracted and in this the multiplex reaction PCR was accomplished. Results. The results demonstrated that the isolates 250, 93.2% were classified as phylogenetic group A, 3.2% as B1, 2.8% as B2 and 0.8% as D. Of the isolates 250 studied, in 96.8% (242) were found virulence factors, being 91.6% of markers for ETEC, 0.4% for EPEC and 4.8% for EAEC. Conclusions. There was predominance to virulence factors of the patotipo ETEC and the phylogenetic group A. The presence of virulence factors indicates that the cheese samples were contaminated and they could cause disease, 11 put in evidence the need of effective control measures on the part of the sanitary authorities, as well as educational campaigns.

A serinoprotease Pic é uma proteína autotransportadora que apresenta papel importante na colonização da mucosa intestinal por E. coli enteroagregativa (EAEC). Uma cepa de E. coli enteropatogênica atípicas (aEPEC) albergando o gene pic foi detectada em um estudo prévio. O presente estudo teve como objetivo caracterizar a proteína Pic produzida por essa cepa de aEPEC (BA589). O gene pic em BA589 está presente em um plasmídeo de alto peso molecular (~98 kb) e o sequenciamento desse gene mostrou identidade de 99% com pic de EAEC 042. Pic da cepa BA589 (Pic589) foi capaz de clivar mucina bovina, hemaglutinar eritrócitos de coelho e clivar moléculas das três vias sistema complemento. O mutante BA589Dpic todas essas atividades in vitro. A cepa selvagem foi capaz de colonizar o intestino de camundongos tratados com estreptomicina, o que não foi observado com o mutante BA589Dpic. Desta forma, a serinoprotease Pic representa um fator de virulência adicional na cepa de aEPEC BA589, relacionada às etapas de adesão, colonização e evasão do sistema imune inato. / The serine protease Pic is an autotransporter protein that plays an important role in the colonization of the intestinal mucosa by enteroaggregative E. coli (EAEC). An atypical enteropathogenic E. coli (aEPEC) strain harboring the pic gene has been detected in a previous study. The present study aimed to characterize the protein Pic produced by that aEPEC strain (BA589). In BA589 pic is located in a high molecular weight plasmid (~98 kb), and sequencing of this gene showed 99% identity with pic from EAEC 042. Pic from BA589 (Pic589) was able to cleave bovine mucin, hemagglutinate rabbit erythrocytes and cleave molecules of the three complement system pathways. The mutant BA589Dpic lost all these capacities. The wild type strain was able to colonize the intestine of streptomycin treated mice, which was not observed with the mutant BA589Dpic. Thus, the serine protease Pic represents an additional virulence factor in aEPEC strain BA589, associated with adherence, colonization and evasion of innate immune system.

Introdução. A pesquisa de Escherichia coli em alimentos é relevante para a Saúde Pública porque indica a contaminação fecal e a qualidade do produto oferecido ao consumidor. A determinação do grupo filogenético e de fatores de virulência de E. coli permite identificar a existência de cepas patogênicas que poderiam causar doença. Objetivos: Determinar o grupo filogenético e fatores de virulência de isolados de E. coli pertencentes aos patotipos ETEC, EIEC, EPEC, STEC e EAEC usando métodos moleculares, obtidos de amostras de queijo Minas, discutir a presença dos patotipos nas amostras e o significado para Saúde Pública. Métodos. 250 isolados de Escherichia coli provenientes de 10 amostras de queijo Minas foram utilizados para a realização do estudo. O DNA genômico foi extraído e neste foi realizado a reação de PCR multiplex. Resultados. Os resultados demonstraram que dos 250 isolados, 93,2% foi classificado como grupo filogenético A, 3,2% como B1, 2,8% como B2 e 0,8% como D. Dos 250 isolados estudados, em 96,8% (242) foram encontrados fatores de virulência, sendo 91,6% de marcadores para ETEC, 0,4% para EPEC e 4,8% para EAEC. Conclusões. Houve predominância de fatores de virulência do patotipo ETEC e do grupo filogenético A. A presença de fatores de virulência indica que as amostras de queijo estavam contaminadas e poderiam causar doença, evidenciando a necessidade de medidas de controle efetivas por parte das autoridades sanitárias, bem como campanhas educativas / Introduction. The search of Escherichia coli in foods is relevant for the Public Health because it indicates the fecal contamination and the product quality offered to the consumer. The determination of phylogenetic group and virulence factors of E. coli, allows the identification of the existence of pathogenic strains that could cause disease. Objectives: Determine the phylogenetic group and the pathogenic of Escherichia coli belonging to the patotipos isolated occurrence ETEC, EIEC, EPEC, STEC and EAEC using molecular methods obtained from Minas cheese samples, to discuss the presence of the patotipos in the samples and the meaning for Public Health. Methods. 250 isolates of Escherichia coli from 10 Minas cheese samples was used for the accomplishment of the study. Genomic DNA was extracted and in this the multiplex reaction PCR was accomplished. Results. The results demonstrated that the isolates 250, 93.2% were classified as phylogenetic group A, 3.2% as B1, 2.8% as B2 and 0.8% as D. Of the isolates 250 studied, in 96.8% (242) were found virulence factors, being 91.6% of markers for ETEC, 0.4% for EPEC and 4.8% for EAEC. Conclusions. There was predominance to virulence factors of the patotipo ETEC and the phylogenetic group A. The presence of virulence factors indicates that the cheese samples were contaminated and they could cause disease, 11 put in evidence the need of effective control measures on the part of the sanitary authorities, as well as educational campaigns.

A serinoprotease Pic é uma proteína autotransportadora que apresenta papel importante na colonização da mucosa intestinal por E. coli enteroagregativa (EAEC). Uma cepa de E. coli enteropatogênica atípicas (aEPEC) albergando o gene pic foi detectada em um estudo prévio. O presente estudo teve como objetivo caracterizar a proteína Pic produzida por essa cepa de aEPEC (BA589). O gene pic em BA589 está presente em um plasmídeo de alto peso molecular (~98 kb) e o sequenciamento desse gene mostrou identidade de 99% com pic de EAEC 042. Pic da cepa BA589 (Pic589) foi capaz de clivar mucina bovina, hemaglutinar eritrócitos de coelho e clivar moléculas das três vias sistema complemento. O mutante BA589Dpic todas essas atividades in vitro. A cepa selvagem foi capaz de colonizar o intestino de camundongos tratados com estreptomicina, o que não foi observado com o mutante BA589Dpic. Desta forma, a serinoprotease Pic representa um fator de virulência adicional na cepa de aEPEC BA589, relacionada às etapas de adesão, colonização e evasão do sistema imune inato. / The serine protease Pic is an autotransporter protein that plays an important role in the colonization of the intestinal mucosa by enteroaggregative E. coli (EAEC). An atypical enteropathogenic E. coli (aEPEC) strain harboring the pic gene has been detected in a previous study. The present study aimed to characterize the protein Pic produced by that aEPEC strain (BA589). In BA589 pic is located in a high molecular weight plasmid (~98 kb), and sequencing of this gene showed 99% identity with pic from EAEC 042. Pic from BA589 (Pic589) was able to cleave bovine mucin, hemagglutinate rabbit erythrocytes and cleave molecules of the three complement system pathways. The mutant BA589Dpic lost all these capacities. The wild type strain was able to colonize the intestine of streptomycin treated mice, which was not observed with the mutant BA589Dpic. Thus, the serine protease Pic represents an additional virulence factor in aEPEC strain BA589, associated with adherence, colonization and evasion of innate immune system.

Orientador: Marcelo Palma Sircili / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T01:00:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Culler_HebertFabricio_D.pdf: 4509234 bytes, checksum: 996664e9d72f80df8f43076b618a7f73 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: As Escherichia coli enteropatogênicas atípicas são capazes de formar biofilme em superfícies abióticas e bióticas. Diversos mecanismos em E. coli são regulados por Quorum Sensing, incluindo a expressão de fatores de virulência e formação de biofilme. Quorum Sensing é um sistema de sinalização que confere às bactérias a habilidade de responder à moléculas químicas denominadas autoindutores (AI). SdiA e QseC são receptores de quorum sensing encontrados em diversas bactérias, entre elas EPECa. SdiA detecta moléculas autoindutoras do tipo 1 (AI-1) denominadas N-acil homoserina lactonas (AHLs). Entretanto as Escherichia coli não possuem a sintase para estas moléculas e, deste modo, SdiA detecta AHLs produzidas por outras bactérias. O receptor QseC detecta moléculas autoindutoras do tipo 3, além dos hormônios humanos adrenalina e noradrenalina. Neste estudo verificamos a influência da deleção de sdiA e qseC na formação e arquitetura do biofilme, formação de película, anel e também na transcrição de alguns dos genes envolvidos nestes fenótipos (bcsA, csgA, csgD, fliC, fimA e rpoS) em duas amostras de EPECa, sendo uma do sorotipo O55:H7 e outra do sorotipo ONT:H25. Os resultados das análises nas duas amostras de EPECa foram distintos, confirmando a grande heterogeneidade reportada em outros estudos em amostras deste patótipo. A amostra ONT:H25?sdiA formou espesso biofilme em placas de 96 poços e espessa estrutura (em anel) como anéis na parede do tubo de ensaio em relação às amostras selvagem e complementada. Além disso, o mutante sdiA desta amostra foi capaz de formar película na superfície do meio enquanto as amostras selvagem e complementada foram negativas. A amostra O55:H7?sdiA não apresentou diferença significativa na formação (das estruturas analisadas) destas estruturas em relação às amostras selvagem e complementada. Análises de qRT-PCR demonstraram (maiores níveis de transcrição de) um aumento na transcrição de csgA, csgD e fimA na amostra ONT:H25 deletada em sdiA, possivelmente indicando que o aumento na formação de biofilme por esta amostra esteja relacionado ao aumento da expressão das fímbrias tipo 1 e curli. A adição de AHLs à amostra selvagem ONT:H25 diminuiu a formação de biofilme e os níveis transcricionais de csgD e fimA, enquanto na amostra deletada não houve diferença, indicando que sdiA participa da regulação da formação de biofilme em EPECa e que as AHLs aumentam os efeitos repressores deste receptor nos genes relacionados à formação de biofilme. Quanto às amostras deletadas em qseC foi possível verificar uma diminuição da formação de biofilme em relação às amostras selvagens e complementadas, mas não houve diferença na formação de película na interface ar-líquido e também na formação de anel na parede dos tubos. A amostra ONT:H25?qseC foi negativa para expressão de fímbria curli em placas contendo vermelho congo e apresentou aumento da transcrição de bcsA e fimA, enquanto teve a transcrição de csgA, csgD e fliC diminuída em relação à amostra selvagem. A adição de adrenalina aumentou a formação de biofilme e motilidade nas duas amostras mutantes indicando a possível presença de outro receptor em EPECa responsável pela detecção destes hormônios na ausência de QseC. Portanto, conclui-se que estes dois receptores de quorum sensing estão relacionados, direta ou indiretamente, à formação de biofilme em EPECa / Abstract: Atypical enteropathogenic Escherichia coli are capable to form biofilm on biotic and abiotic surfaces. Several E. coli mechanisms are regulated by Quorum Sensing, including expression of virulence factors and biofilm formation. Quorum Sensing is a signaling system that confers bacteria the ability to respond to chemical molecules known as autoinducers. SdiA and QseC are Quorum Sensing receptors found in several bacteria, including aEPEC. SdiA detects type 1 autoinducer molecules (AI-1) known as N-acil homoserin lactones. However, Escherichia coli do not produce this kind of molecules and SdiA detects AHLs produced by other bacteria. QseC receptor detects type 3 autoinducer molecules and the human hormones adrenalin and noradrenaline. In this study the influence of the sdiA and qseC deletion in the biofilm formation and architecture, pellicle and ring-like structure formation and transcription of some genes (bcsA, csgA, csgD, fliC, fimA and rpoS) in two strains of aEPEC (O55:H7 and ONT:H25) was verified. The results of the analysis of the two aEPEC strains were distinct, confirming the heterogeneity reported by other studies in the same patotypes. The strain ONT:H25?sdiA formed a thick biofilm in 96-well plates and thick ring-like structure on the tube wall compared with the wild type and complemented strains. Furthermore, the sdiA mutant strain was capable to form pellicle on both surfaces, while the wild type and complemented strains were negative. The strain O55:H7?sdiA did not show a significant difference on the formation of these structures compared to the wild type and complemented strains. qRT-PCR analysis demonstrated an enhance on the transcription of csgA, csgD and fimA in the deleted sdiA ONT:H25 strain, suggesting that a relative increase of biofilm formation in ONT:H25 strain could be related to the increase of the expression of type 1 and curli fimbriae. The addition of AHLs to the wild type strain ONT:H25 decreased the biofilm formation and the transcriptional levels of csgD and fimA, but not in the mutant strain, indicating that sdiA plays a role in the regulation of biofilm formation in aEPEC. AHLs also increased the repressor efects of this receptor in biofilm related genes. The mutant qseC strains showed a decrease in biofilm formation when compared to wild type and complemented strains, but there was no difference in the pellicle formation in the air-liquid interface, as in the ring-like structure formation in the tube wall. The ONT:H25?qseC strain was negative to curli fimbriae expression in congo red plates and displayed an increase in the transcription of bcsA and fimA genes, while a decrease was verified in the csgA, csgD and fliC genes compared to the wild type strain. The addition of adrenalin increased the biofilm formation and motility in both mutant strains, possibly indicating the presence of other receptor in aEPEC involved in the detection of these hormones in the absence of QseC. In conclusion, these two Quorum Sensing receptors are related with biofilm formation in aEPEC / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

A Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) é um dos principais agentes etiológicos da diarréia infecciosa tanto em crianças no primeiro ano de vida, como em adultos. As infecções por EPEC são prevalentes nos países em desenvolvimento, principalmente nas populações de baixo nível sócio-econômico, como as encontradas no Brasil. A resposta imune na infecção por EPEC permanece pobremente caracterizada. O uso das novas tecnologias no desenvolvimento de vacinas vem reforçar à importância de se levar em consideração a via natural de infecção do patógeno e utilizá-la como tema de estudo, quando se pretende estudar a resposta imune a um determinado agente infeccioso. O objetivo deste trabalho foi efetuar o estudo da resposta imune em animais inoculados com bactérias vivas ou mortas, por meio de diferentes vias de imunização. As bactérias em estudo foram: a cepa de E. coli O86:H34 e a cepa protótipo de E. coli O127:H6. A cepa de E. coli pertencente ao sorotipo O86:H34 foi isolada de fezes de crianças com diarréia. Foram empregadas as cepas : E2348/69, DH5α e as mutantes E2348/69 flic-, E2348/69 Δtir, E2348/69 EscN-, CVD 206 ΔeaeA, UMD 872 ΔEspA, UMD 864 ΔEspB, UMD 870 ΔEspD. No presente estudo os camundongos BALB/c foram inoculados pela via intragástrica com a cepa de E. coli O86:H34 viva ou cepas O86:H34 e O127:H6 mortas por formol, que foram utilizadas nas imunizações pela via intragástrica e pela via intramuscular. Por meio de ELISA foram determinados os níveis de anticorpos específicos dos isotipos IgG, IgA e IgM, assim como o direcionamento da resposta imune para importantes antígenos que participam do mecanismo de patogenicidade da bactéria. De acordo com o perfil de reatividade no Immunoblot foi avaliada a especificidade dos anticorpos presentes nos soros imunes obtidos, frente aos antígenos de \"whole cells\" ou complexo de membrana externa bacteriana, empregados na técnica de \"immunoblotting\". A resposta imune a proteínas, como EspA, EspB, Tir, intimina, flagelos e BFP observada em camundongos, tem um importante papel no esclarecimento da infecção por este patógeno .Pela primeira vez foi realizado um estudo utilizando diferentes vias de imunização por EPEC em camundongos. Este estudo permitiu a análise de antígenos de E. coli reconhecidos pelos anticorpos produzidos pelas inoculações de bactérias vivas ou mortas por meio de vias intragástrica e intramuscular em camundongos, em comparação com aqueles reconhecidos na infecção natural ou experimental humana. Por conseguinte, os dados obtidos poderão auxiliar no esclarecimento desse complexo mecanismo de patogenicidade e orientar na seleção de peptídeos a serem utilizados no preparo de produtos vacinais específicos. / Enteropathogenic Escherichia coli is one of the major ethiologic agent that causes infectious diarrhoea in both infants and adults individuals. EPEC infections are prevalent in developing countries, mainly in low social-economic populations, as those found in Brazil. The immune response of this infection is still insufficiently known. Use of new technologies in the development of vaccines has been reinforced the importance of taking in account the natural route of infeccion of pathogens and use of it in investigation on immune response to be elicited against a certain to infectious agent. The aim of the present investigation was to study the immune response in mice inoculated with dead or alive bacteria, by means of diverse immunization routes. E. coli O86:H34 strain and E. coli O127:H6 prototype were employed for immunization. E. coli strain belonging to O86:H34 serotype was isolated from faeces from infants with diarrhoea. The strains: E2348/69, DH5 α and the mutants strains E2348/69 flic-, E2348/69 Δtir, E2348/69 EscN-, CVD 206 ΔeaeA, UMD 872 ΔEspA, UMD 874 ΔEspB, UMD 870 ΔEspD were employed. BALB/c mice were inoculated by intragastric route with alive E. coli O86:H34 strain or formalin-killed O86:H34 and O127:H6 strains intragastric and intramuscular immunization routes. The specific antibodies of isotypes IgA, IgG and IgM were determinated by means of ELISA and the course of the immune response for important antigens that participate in the patogenicity mechanism of bacteria could be analysed. By means of reactivity profile on immunobloting, the specificity of antibodies present in obtained sera against whole cells or the outer membrane complex of the bacteria were analysed. Immune response to proteins like EspA, EspB, Tir, intimin, flagelin and BFP in immunized mice may have an important meaning for elucidation of infection in this pathogen At the first time a research using different routes of immunization with EPEC strains in mice has been conducted. This study allowed to compare antigens from E. coli recognized in natural or experimental human infection, and consequentently these data may help in the elucidation of this complex mechanism of pathogenicity, and also to orientate the selection of peptides to be used in preparation of specific vaccines.

Orientador: Marcelo Palma Sircili / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T15:41:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Higa_JulianaSuyama_M.pdf: 2740628 bytes, checksum: 20ced0f2848628f2541d4313632cfc0b (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Escherichia coli (E.coli) enteropatogênica (EPEC), é um dos agentes causadores de diarreia em crianças, principalmente em países em desenvolvimento. EPEC pode ser dividida em típica (tEPEC) ou atípica (aEPEC) pela presença ou ausência do plasmídeo EAF, respectivamente e, mais precisamente pela expressão da fímbria Bfp. Uma característica de EPEC é a capacidade de causar uma lesão histopatológica denominada "attaching and effacing" (lesão A/E) no epitélio intestinal e os genes responsáveis pela formação da lesão A/E estão localizados na ilha de patogenicidade LEE (locus of enterocyte effacement). Outra característica de EPEC é a formação de microcolônias que possibilitam a formação de biofilme. Um dos mecanismos de regulação da formação de biofilme envolve a molécula sinalizadora Bis-(3'-5')-monofosfato de guanosina cíclico (c-di-GMP), um mensageiro secundário universal em bactérias que está envolvido na regulação de uma grande variedade de processos celulares. Para exercer sua função, c-di-GMP precisa se ligar e alterar alostericamente a estrutura de uma molécula efetora. Um dos receptores conhecidos para c-di-GMP é YcgR, uma proteína de domínio PilZ que possui um sítio de ligação para c-di-GMP e está envolvida diretamente na regulação do movimento flagelar através da ligação do complexo YcgR-c-di-GMP às proteínas da base do motor flagelar. Existem poucos dados na literatura sobre as funções de YcgR, todos focados apenas no seu papel na regulação da motilidade. Assim, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência de YcgR na motilidade, formação de biofilme, adesão e formação de lesão A/E em um amostra de aEPEC do sorotipo O55:H7. O gene ycgR foi deletado da amostra selvagem através da técnica de recombinação homóloga proposta por Datsenko e Wanner (2000). A complementação da amostra mutante foi realizada através da clonagem do gene ycgR no plasmídeo de expressão pBAD Myc HisA. Os resultados obtidos indicam que a deleção do gene ycgR reduz a motilidade e aumenta a formação do biofilme inicial na amostra O55:H7. Além disso, a adesão em células epiteliais e a formação da lesão A/E também foram reduzidas em comparação à amostra selvagem. Os resultados fenotípicos corroboram os observados na análise transcricional dos genes eae, ler e espA, que participam da formação da lesão A/E, e dos genes bscA, fimA e csgD, envolvidos na formação do biofilme inicial. Com exceção do gene csgD que apresentou um aumento na transcrição na amostra mutante, todos os outros genes avaliados apresentaram uma menor transcrição em relação à amostra selvagem. Poucos trabalhos na literatura demonstram o papel do mensageiro secundário em amostras de E. coli patogênicas, assim, estes resultados são os primeiros descritos para uma amostra de aEPEC e possibilitam que no futuro novos estudos possam analisar com mais detalhes a participação de c-di-GMP na regulação de fatores de virulência não só de aEPEC mas também de outras E.coli patogênicas / Abstract: Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) is a causative agent of diarrhea in children, especially in developing countries. EPEC can be categorized in 2 subgroups termed typical (tEPEC) or atypical (aEPEC) by the presence or absence of the EAF plasmid respectively, and more precisely by the expression of the Bfp fimbriae. One characteristic of EPEC is the ability to cause a histopathological lesion on epithelial cells called "attaching and effacing" (A/E lesion). The genes responsible for the production of the A/E lesion are encoded in a pathogenicity island named "locus of enterocyte effacement" (LEE). Another feature of EPEC is the formation of microcolonies, which allow biofilm formation. One of the regulation mechanisms of biofilm formation involves the signaling molecule bis- (3'-5') cyclic guanosine monophosphate (c-di-GMP), a ubiquitous second messenger in bacteria that participates in the regulation of a wide variety of cellular processes. To perform its function, c-di-GMP needs to bind and alter allosterically the structure of an effector molecule. One of the known (many?) receptors for c-di-GMP is YcgR, a Pilz domain protein that has a c-di-GMP binding site and is involved directly in the regulation of flagellar movement through the binding of the YcgR-c-di-GMP complex to flagellar motor proteins. There are few published data on the YcgR functions and they focus mainly on the role of the YcgR in motility regulation. The aim of this study was to evaluate the influence of YcgR in motility, biofilm formation, adhesion and A/E lesion formation in an aEPEC strain serotype O55:H7. ycgR gene deletion was performed by homologous recombination as proposed by Datsenko and Wanner (2000). Complementation of O55:H7 mutant strain was achieved by cloning ycgR in pBAD/Myc-HisA plasmid. The results indicate that the deletion of ycgR gene decreases the motility and increases the formation of initial biofilm on O55:H7 strain. Moreover, the adhesion on epithelial cells and the A/E lesion formation were also diminished in comparision to the wild type strain. The phenotypic results are consistent with the transcriptional analysis of eae, ler and espA genes involved in A/E lesion formation, and of bcsA, fimA and csgD genes involved in the initial steps of biofilm formation. With the exception of csgD gene that showed an increased transcription level in the mutant strain, all other analysed genes showed a decrease in transcription when compared to the wild type strain. Few studies demonstrate the role of a second messenger molecule in Escherichia coli pathogenic samples, and therefore, these results are the first report in this regard for an aEPEC strain. This work should encourage further studies in order to analyze in more detail the involvement of c-di GMP in the regulation of virulence factors not only in aEPEC, but also in other pathogenic Escherichia coli pathotypes / Mestrado / Microbiologia / Mestra em Genética e Biologia Molecular

A Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) é um dos principais agentes etiológicos da diarréia infecciosa tanto em crianças no primeiro ano de vida, como em adultos. As infecções por EPEC são prevalentes nos países em desenvolvimento, principalmente nas populações de baixo nível sócio-econômico, como as encontradas no Brasil. A resposta imune na infecção por EPEC permanece pobremente caracterizada. O uso das novas tecnologias no desenvolvimento de vacinas vem reforçar à importância de se levar em consideração a via natural de infecção do patógeno e utilizá-la como tema de estudo, quando se pretende estudar a resposta imune a um determinado agente infeccioso. O objetivo deste trabalho foi efetuar o estudo da resposta imune em animais inoculados com bactérias vivas ou mortas, por meio de diferentes vias de imunização. As bactérias em estudo foram: a cepa de E. coli O86:H34 e a cepa protótipo de E. coli O127:H6. A cepa de E. coli pertencente ao sorotipo O86:H34 foi isolada de fezes de crianças com diarréia. Foram empregadas as cepas : E2348/69, DH5α e as mutantes E2348/69 flic-, E2348/69 Δtir, E2348/69 EscN-, CVD 206 ΔeaeA, UMD 872 ΔEspA, UMD 864 ΔEspB, UMD 870 ΔEspD. No presente estudo os camundongos BALB/c foram inoculados pela via intragástrica com a cepa de E. coli O86:H34 viva ou cepas O86:H34 e O127:H6 mortas por formol, que foram utilizadas nas imunizações pela via intragástrica e pela via intramuscular. Por meio de ELISA foram determinados os níveis de anticorpos específicos dos isotipos IgG, IgA e IgM, assim como o direcionamento da resposta imune para importantes antígenos que participam do mecanismo de patogenicidade da bactéria. De acordo com o perfil de reatividade no Immunoblot foi avaliada a especificidade dos anticorpos presentes nos soros imunes obtidos, frente aos antígenos de \"whole cells\" ou complexo de membrana externa bacteriana, empregados na técnica de \"immunoblotting\". A resposta imune a proteínas, como EspA, EspB, Tir, intimina, flagelos e BFP observada em camundongos, tem um importante papel no esclarecimento da infecção por este patógeno .Pela primeira vez foi realizado um estudo utilizando diferentes vias de imunização por EPEC em camundongos. Este estudo permitiu a análise de antígenos de E. coli reconhecidos pelos anticorpos produzidos pelas inoculações de bactérias vivas ou mortas por meio de vias intragástrica e intramuscular em camundongos, em comparação com aqueles reconhecidos na infecção natural ou experimental humana. Por conseguinte, os dados obtidos poderão auxiliar no esclarecimento desse complexo mecanismo de patogenicidade e orientar na seleção de peptídeos a serem utilizados no preparo de produtos vacinais específicos. / Enteropathogenic Escherichia coli is one of the major ethiologic agent that causes infectious diarrhoea in both infants and adults individuals. EPEC infections are prevalent in developing countries, mainly in low social-economic populations, as those found in Brazil. The immune response of this infection is still insufficiently known. Use of new technologies in the development of vaccines has been reinforced the importance of taking in account the natural route of infeccion of pathogens and use of it in investigation on immune response to be elicited against a certain to infectious agent. The aim of the present investigation was to study the immune response in mice inoculated with dead or alive bacteria, by means of diverse immunization routes. E. coli O86:H34 strain and E. coli O127:H6 prototype were employed for immunization. E. coli strain belonging to O86:H34 serotype was isolated from faeces from infants with diarrhoea. The strains: E2348/69, DH5 α and the mutants strains E2348/69 flic-, E2348/69 Δtir, E2348/69 EscN-, CVD 206 ΔeaeA, UMD 872 ΔEspA, UMD 874 ΔEspB, UMD 870 ΔEspD were employed. BALB/c mice were inoculated by intragastric route with alive E. coli O86:H34 strain or formalin-killed O86:H34 and O127:H6 strains intragastric and intramuscular immunization routes. The specific antibodies of isotypes IgA, IgG and IgM were determinated by means of ELISA and the course of the immune response for important antigens that participate in the patogenicity mechanism of bacteria could be analysed. By means of reactivity profile on immunobloting, the specificity of antibodies present in obtained sera against whole cells or the outer membrane complex of the bacteria were analysed. Immune response to proteins like EspA, EspB, Tir, intimin, flagelin and BFP in immunized mice may have an important meaning for elucidation of infection in this pathogen At the first time a research using different routes of immunization with EPEC strains in mice has been conducted. This study allowed to compare antigens from E. coli recognized in natural or experimental human infection, and consequentently these data may help in the elucidation of this complex mechanism of pathogenicity, and also to orientate the selection of peptides to be used in preparation of specific vaccines.