Leishmania é um protozoário parasito flagelado responsável pela Leishmaniose, doença que afeta 88 países, distribuídos em 4 continentes, e que causa um risco a aproximadamente 350 milhões de pessoas. Estudos recentes em tripanosomatídeos, utilizando Trypanosoma brucei como modelo, sugerem que as enzimas fumarato hidratase, enzimas que catalisam a hidratação reversível da molécula de fumarato em S-malato, são essenciais para sobrevivência de tripanossomatídeos. O presente projeto visou a clonagem, expressão, purificação e caracterização cinética e biofísica da enzima fumarato hidratase codificada pelo gene LmjF24.0320 de Leishmania major. A proteína foi expressa em bactéria e purificada por cromatografia de afinidade. Os ensaios de cinética enzimática mostram que a enzima segue o modelo de cinética de Michaelis-Menten com Km e Vmax de 2,7 ± 0,5 mM e 35,2 ± 5,8 micromol/min/mg para fumarato e 5,2 ± 0,4 mM e 11,8 ± 0,6 micromol/min/mg para S-malato, respectivamente. Para os estudos de localização celular foram produzidos e purificados anticorpos policlonais para as isoformas LmFH-1 e LmFH-2 de Leishmania major através de imunização de coelhos. A combinação de técnicas de imunofluorescência por microscopia confocal, western blotting e controle da atividade enzimática através fracionamento celular com digitonina nos permitiu concluir que a isoforma LmFH-1 se encontra localizada na mitocôndria do parasito, enquanto que a isoforma LmFH-2 possue dupla localização, sendo encontrada tanto no citosol quanto no glicossomo. A presença das isoformas LmFH-1 e LmFH-2 nos três compartimentos celulares: citosol, glicossomo e mitocôndria reforçam a importância da molécula de fumarato em diferentes processos celulares, e fortalecem a idéia de que a enzima fumarato hidratase pode ser considerada um potencial alvo para planejamento de fármacos anti-leishmaniose. / Leishmania parasites are the casual agent of leishamaniasis, a group of disease that affects 88 countries, distributed in four continents, with 350 million people at risk of infection. Recent studies in trypanosomatids, using Trypanosoma brucei as a model suggest that the fumarate hydratase enzymes, which catalyze the stereospecific hydration of fumatare to malate, are essential for trypanosomatid survival. The present project focused the cloning, expression, purification and both kinetic and biophysical characterization of fumarate hydratase encoded by gene LmjF24.0320 of Leishmania major. The protein has been expressed in bacteria and purified by affinity chromatography. The kinetic experiments reveal that the enzyme follow the Michaelis-Menten classic model with Km and Vmax of 2,7 ± 0,5 mM and 35,2 ± 5,8 micromol/min/mg for fumarate and 5,2 ± 0,4 mM and 11,8 ± 0,6 micromol/min/mg for S-malate, respectively. For the subcellular localization studies, polyclonal antisera against both isoforms LmFH-1 e LmFH-2 of Leishmania major were obtained after immunization of rabbits. The combination of confocal microscopy, western blotting and enzymatic activity through cell fractionation by selective permeabilization of membranes with digitonin suggest that LmFH-1 isoform is localized to mitochondria, while the LmFH-2 isoform is found to both cytosol and glycossome. The presence of LmFH-1 and LmFH-2 isoforms at the three cell compartments: cytosol, glycosome and mitochondria strongly supports the premise that fumarate is important for many cell processes and suggests that fumarate hydratase enzyme can be considered an attractive target for the development of anti-leishmaniasis drugs.

A possível escassez dos recursos fósseis, juntamente com o aumento imprevisível dos respectivos preços, levou, nas últimas décadas, a um aumento considerável de iniciativas dedicadas não só à procura de fontes alternativas de produtos químicos e polímeros a partir de fontes renováveis, mas também de fontes alternativas de energia - em particular a biomassa vegetal. O estudo desenvolvido no presente trabalho está inserido neste contexto. A despolimerização de celulose de sisal pode ocorrer via hidrólise, ácida ou enzimática, podendo resultar nos açúcares fermentescíveis necessários para a produção do chamado etanol celulósico e, em etapas intermediárias do processo, em micro e nanopartículas, que podem atuar como reforço de matriz polimérica baseada, por exemplo, em quitosana. O estudo aqui relatado está relacionado à análise do material celulósico não reagido durante a hidrólise, e do licor que contém principalmente glicose. As reações de hidrólise ácida e enzimática de polpa de sisal (constituída de celulose e hemicelulose) foram exploradas. Uma importante característica que envolve a hidrólise ácida de biomassa é a possibilidade de utilização de diversos ácidos, pois a princípio, necessita-se apenas de uma fonte de prótons no meio aquoso para que a reação ocorra. Neste contexto, em uma primeira etapa, uma série de reações de hidrólise ácida de polpa de sisal, previamente tratada com solução alcalina (mercerizada) ou não, foi feita com ácido sulfúrico (0,9 - 4,6 molL-1, 100°C, 6h de reação). Em uma segunda etapa, o ácido sulfúrico foi substituído por ácido oxálico, e os tempos de reação foram maiores (18h) que aqueles considerados para o ácido sulfúrico, tendo em vista o menor valor do pKa do ácido oxálico. Reações de hidrólise enzimática foram realizadas com o uso de um complexo enzimático comercial (Accellerase 1500 - Genencor), e dois diferentes pré-tratamentos, ambos visando à eliminação de hemiceluloses, foram avaliados, sendo: mercerização e tratamento com solução de ácido oxálico 0,9 molL-1. Para acompanhar os processos, em determinados intervalos de tempo, foram retiradas alíquotas do meio reacional, sendo que os licores foram analisados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), a fim de avaliar a natureza e o teor dos produtos da hidrólise. As polpas residuais (não hidrolisadas), suspensas no licor, foram avaliadas por microscopia eletrônica de varredura, massa molar média por viscosimetria capilar, índice de cristalinidade por difração de raios X e tamanhos médios das fibras a partir de um analisador de fibras (MorFi - analisador de tamanho médio de fibras por imagem), e espalhamento de luz (FOQELS). Para todas as reações de hidrólise ácida estudadas, as massas molares médias das polpas residuais diminuíram até dez vezes logo nos primeiros minutos de reação e os valores de índice de cristalinidade mostraram que as regiões não cristalinas da celulose são primeiramente hidrolisadas, sendo as regiões cristalinas uma grande barreira frente à hidrólise. Os resultados mostraram que o aumento da concentração do catalisador ácido elevou consideravelmente a porcentagem de hidrólise, principalmente no caso do ácido oxálico que, quando usado na concentração de 0,9 molL-1, não foi capaz de hidrolisar com eficiência as cadeias de celulose, mas apenas eliminou as hemiceluloses presentes na polpa, motivo que levou à sua aplicação como agente de pré-tratamento para a polpa frente à hidrólise enzimática. Os rendimentos das reações mostraram que o ácido sulfúrico chega a ser aproximadamente 25% mais eficiente que o ácido oxálico em termos de produção de glicose. Entretanto, o ácido oxálico possui a grande vantagem de ser proveniente de fontes renováveis e, se usado nas concentrações adequadas, pode ser uma excelente opção como pré-tratamento da polpa de celulose para as reações de hidrólise. Os resultados de hidrólise enzimática mostraram que a polpa que passou pelo pré-tratamento da mercerização foi mais eficiente como material de partida do que aquela tratada com ácido oxálico, já que a primeira levou a concentrações de glicose até 2,5 vezes maiores, nas mesmas condições de concentração de enzima, temperatura e tempo de reação. As reações de hidrólise ácida e enzimática de material lignocelulósico são de grande importância no que diz respeito à produção de etanol de segunda geração e micro/nanofibras que podem ser incorporadas em materiais. Filmes de matriz de quitosana foram produzidos com a inserção de fibras de celulose sem tratamento, mercerizada, e residuais das reações de hidrólise ácida e enzimática, em diferentes concentrações (2,5, 7,5 e 15% em massa). Os filmes foram submetidos à solicitação de tração, e a morfologia foi acessada por microscopia eletrônica de varredura de emissão de campo (FEG-MEV). Os resultados mostraram que, no geral, o filme de quitosana (69 MPa), assim como os baseados em quitosana/celulose (75 MPa), apresentam resistência à tração superior ou no mesmo patamar de filmes similares descritos na literatura. Este trabalho forneceu resultados promissores e está largamente inserido no interesse atual de utilização de materiais provenientes de fontes renováveis preferencialmente àqueles de fontes fósseis. / The possible shortage of crude oil and the unpredictable increase in its prices have led to an impressive expansion of initiatives in the last decades dedicated not only to the search of alternative sources of chemicals and polymers, but also to suppliers of energy, both from vegetal biomass. The depolymerization of sisal cellulose may occur via acid or enzymatic hydrolysis, resulting in the fermentable sugars used in the production of the so-called cellulosic ethanol and also at the intermediate steps of the process, in micro and nanoparticles that may act as reinforcement in polymeric matrices, including those derived from cellulose. The study here reported is related to the analysis of the unreacted cellulosic material and to the liquor containing mainly glucose, from acid and enzymatic hydrolysis of sisal pulp formed by cellulose and hemicellulose. An important characteristic that involves the acid hydrolysis of biomass is the possibility of utilization of different acids, since only a source of protons in the media is required for the reaction to occur, in principle. In this context, a series of reactions of acid hydrolysis of sisal pulp was carried out under varying concentrations of sulfuric acid, from 0,9 to 4,6 molL-1, at 100°C as a first step. In a second step, the acid catalyst was replaced by oxalic acid, and the reaction lengths were bigger than those considered for sulfuric acid due to the lower value of pKa of oxalic acid. The reactions of enzymatic hydrolysis were carried out with a commercial enzymatic complex (Accellerase 1500 - Genencor), and two different pretreatments, both aiming at the elimination of hemicelluloses, were essayed as follows: mercerization and treatment with oxalic acid 0,9 molL-1. To follow the processes of acid and enzymatic hydrolysis in determined time intervals, aliquots were withdrawn from the reaction media so as to be analyzed by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) aiming at the evaluation of the nature and content of the hydrolysis products. The unreacted cellulose suspended in the liquor was characterized by Scanning Electron Microscopy, capillary viscometry, X ray diffraction, and average size of fibers by using a fiber analyzer and light scattering. For all acid hydrolysis reactions studied, the average molar mass of the unreacted cellulose decreased up to ten times in the first minutes of reaction, and the values of crystallinity index showed that the non-crystalline regions of cellulose are firstly hydrolyzed, and the crystalline regions act as barriers to the hydrolysis. The results of HPLC showed that an increase in concentration considerably increases the yield of hydrolysis, mainly in the case of oxalic acid as a catalyst, which was not able to hydrolyze the chains of cellulose when in low concentrations (0,9 molL-1). It only eliminated the hemicellulose present in the pulp, reason why this acid was used as a pretreatment agent in enzymatic hydrolysis at this concentration. The reaction yields showed that the sulfuric acid can be up to 25% more efficient than the oxalic acid in terms of glucose production. However, the oxalic acid has the great advantage of possibly being produced from natural resources as well as being an excellent choice as a pretreatment agent for the lignocellulosic biomass to be used in hydrolysis reactions if used in the adequate concentrations. The results of enzymatic hydrolysis showed that the mercerized pulp was more efficient as raw material than the one treated with oxalic acid, as the first led to higher glucose content at the same conditions of concentration, temperature and time of reaction. The reactions of acid and enzymatic hydrolysis of lignocellulosic materials are of great importance to the production of second generation ethanol and micro and nanofibers, which may be incorporated into biocomposites. Films of chitosan matrix were prepared with the addition of cellulose fibers (untreated, mercerized and residual from the acid and enzymatic hydrolysis reactions) under various concentrations (2,5, 7,5 e 15% wt%). The films were subjected to traction analysis and its morphology was accessed by field emission scanning electron microscopy (SEM-FEG). The results showed that, in general, chitosan films (69 MPa), just like films based on chitosan-cellulose (75 MPa) presented tensile strength values that are superior or the same as similar films described in literature. Therefore, the study here reported produced promising results and is widely inserted in the current interest of utilization of materials from renewable resources instead of those from fossil resources.

Esse estudo avaliou o efeito da glicose sobre a atividade da PKA e sua interação com o SGLT1 e os trocadores Na+/H+ (NHE1 e NHE3). As células HEK-293 foram transfectadas com hSGLT1 wild type (WT) ou mutante (S418H) e tratadas 20 dias com DMEM contendo glicose 5 mM ou 25 mM. Foi avaliada a expressão de hSGLT1, hSGLT1+GFP, NHE1, NHE3 e PKA. Foi avaliada a expressão de hSGLT1+GFP e SGLT2 na membrana, com ou sem H-89, Manose, Sucrose e Filipina. Foi avaliada a velocidade de recuperação do pH intracelular (dpHi/dt), onde a solução de NH4Cl foi substituída por uma solução de glicose 5 ou 25 mM ou ambas as soluções na vigência de H-89 ou S3226. Esses dados indicam que o aumento do AMPc pela glicose altera a expressão e atividade dos SGLTs e NHEs. Nossos experimentos utilizando a transfecção do SGLT1 demonstraram que as células regulam a distribuição de SGLT1 e 2 na membrana, frente ao aumento extracelular desse substrato e que as vias ativadas pela glicose afetam a capacidade de recuperação do pH intracelular (pHi), através do NHE3. / This study evaluated the effect of glucose on the PKA activity and its interaction with SGLT1 and the Na+/H+ exchanger (NHE1 and NHE3). The HEK-293 cells were transfected with hSGLT1 wild type (WT) or mutant (S418H) and treated 20 days with DMEM containing glucose 5 mM or 25 mM. The hSGLT1, hSGLT1+GFP, NHE1, NHE3 and PKA expression was analyzed. The surface hSGLT1+GFP and SGLT2 expression with or without H-89, Manose, Sucrose and Filipina was evaluated. The pHi recovery rate (dpHi/dt) was analyzed replacing the NH4Cl solution to glucose 5 or 25 mM solution or both with H-89 or S3226. These data indicate that the glucose increases the cAMP concentration and alters the expression and activity of SGLTs and NHEs. Our experiments using SGLT1 transfection demonstrated that, in the treatment with high glucose concentration, HEK-293 cells regulate the SGLT1 and 2 cellular distribution and that the pathways activated by glucose impair the pHi recovery rate, through the NHE3.

O gênero Piper pertencente à família Piperaceae, encontra-se distribuído nas regiões tropicais e subtropicais do globo. Estudos químicos têm demonstrado diversidade de metabólitos secundários com atividade biológica. Os alcalóides são metabólitos característicos. A piplartina, (E)-1-(3-(3,4,5-trimetoxifenil)acriloil)-5,6- diidropiridin-2(1H)-ona, é um alcalóide encontrado em muitas espécies. Tem atividade citotóxica contra células de linhagem tumoral, ansiolítica, antidepressiva, antifúngica e antiagregação plaquetária, sendo dessa forma, uma molécula candidata a um novo fármaco. O conhecimento do metabolismo de um candidato a fármaco é um fator importante na avaliação da sua segurança e eficácia. Ensaios in vitro estão crescentemente sendo utilizados como screening e os microssomas hepáticos representam o sistema in vitro mais utilizado. Dessa forma, o presente trabalho tem como objetivo determinar os parâmetros cinéticos enzimáticos in vitro da piplartina utilizando microssomas de fígado de ratos, bem como a determinação dos possíveis metabólitos formados. Para tanto, foi desenvolvido um método de quantificação da piplartina utilizando cromatografia líquida de alta eficiência. Como condição de análise, empregou-se uma coluna C18, fase móvel acetonitrila:água (40:60, v/v) e vazão de 1 mL min-1. Para extração da piplartina dos microssomas hepático de ratos foi empregado a extração líquido-líquido utilizando 4,0 mL de hexano como solvente extrator. Após otimização da extração, o método foi validado, mostrando-se linear na faixa de 2,4-157,7 ?M, obtendo-se uma equação da reta y= 0,0934x + 0,0027, (r= 0,99) e limite de quantificação de 2,4 ?M. A recuperação média foi de 85%. A precisão e exatidão apresentaram resultados dentro do recomendável pela ANVISA. A piplartina manteve-se estável até 50 minutos em condições de incubação, e até 6h sob a bancada. Após validação da metodologia, estabeleceram-se as condições lineares para a quantidade de proteínas microssomais: 0,28 mg mL-1 e para o tempo de incubação: 16 minutos no consumo da piplartina no meio microssomal, e então efetuou-se a determinação dos parâmetros cinéticos enzimáticos da piplartina empregando as condições de V0. Nesse estudo foi observado um Vmax= 4,74 ± 0,26 ?M/?g mL-1/min, h= 2,53 ± 0,37, S50= 44,69 ± 0,32 ?M e CLmax= 0,054 ?L/min/mg proteina, um perfil cinético indicativo de cooperatividade. Um estudo qualitativo para determinação dos possíveis metabólitos foi feito utilizando-se a espectrometria de massas, por meio da qual foi possível identificar a formação de dois produtos hidroxilados. Deste modo, os microssomas mostraram-se uma ferramenta útil, rápida e simples para determinação da cinética enzimática, e na condução dos estudos preliminares de metabolismo in vitro. / The genus Piper belongs to the Piperaceae family and includes species that are widely distributed throughout the tropical and subtropical regions of the world. Chemical studies have shown diversity of secondary metabolites with biological activity. The alkaloids are characteristic metabolites. The piplartine, (E)-1-(3-(3,4,5- trimethoxyphenyl)acryloyl)-5,6-diidropiridin-2(1H)-one is an alkaloid found in many species. It shows cytotoxic activity against tumor cell lines, anxiolytic, antidepressant, antifungal, and antiplatelet therapy, thus being a drug candidate. The knowledge regarding the oxidative metabolism is an important tool in assessing the safety and efficacy of a drug candidate. In vitro assays are increasingly being used as a screening tool and liver microsomes represent the most widely in vitro system used for that. This study aims to determine the in vitro enzymatic kinetic parameters for piplartine by cytochrome P450 enzymes (CYP) present in the rat liver microsomes, and the determination of possible metabolites. To accomplish, it was developed a method to quantify the piplartine using high performance liquid chromatography. The analysis was carried out employing a C18 column, mobile phase: acetonitrile: water (40:60, v/v) at a flow rate of 1 ml min-1. To extract piplartine from rat liver microsomes it was employed the liquid-liquid extraction (4.0 mL of hexane). The method was validated and proved to be linear in the range of 2.4 to 157.7 ?M, the equation for calibration curve was: y= 0.0934x + 0.0027 (r = 0.99), and a limit of quantification of 2.4 ?M. The mean recovery was 85%. The precision and accuracy were in agreement with ANVISA guidelines. The piplartine remained stable until 50 minutes of incubation conditions, and until 6 hours under the bench. Once validated, it was set the conditions for the linear amount of microsomal protein: 0.28 mg mL-1 and to the incubation time: 16 minutes, then it was performed the determination of enzymatic kinetic parameters, that revealed a sigmoidal profile with Vmax = 4.74 ± 0.26 ?M/mg mL-1/min, h = 2.53 ± 0.37, S50 = 44.69 ± 0.32 ?M, and CLmax = 0.054 ?L/min/mg protein, indicating a cooperativity behavior. A qualitative study to determine possible metabolites carried out using mass spectrometry, through which it was possible to identify the formation of two hydroxylated products. To conclude, the microsomes showed to be a useful, fast and simple tool to determination of enzymatic kinetics and in vitro metabolism studies.

Os isômeros de posição do triterpeno pentacíclico amirina (alfa e beta), estão presentes em várias espécies de plantas, como a Protium spruceanum. Estas moléculas vêm mostrando várias propriedades farmacológicas importantes, como efeitos anti-inflamatórios, efeito gastroprotetor, efeito antipruriginoso, efeito antitumoral, entre outros, sendo, dessa forma, uma candidata a um novo fármaco. No entanto, o comportamento destas substâncias frente as enzimas do citocromo P450 (CYP 450) ainda não foram estudadas. Portanto, o presente trabalho tem como objetivo realizar um estudo de metabolismo in vitro com esses triterpenos, caracterizar os parâmetros cinéticos enzimáticos assim como possíveis metabólitos que possam surgir empregando microssomas hepático de ratos. Para isto, foi desenvolvido e validado um método bioanalítico para análise desses triterpenos em microssomas de ratos e análise por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM). Como técnica de preparação das amostras foi empregado a extração liquido-liquido utilizando hexano como solvente extrator. A metodologia para quantificação dos triterpenos em microssomas hepático foi validada de acordo com a legislação vigente para análise de fármacos em fluidos biológicos, avaliando os seguintes parâmetros: linearidade, sensibilidade, seletividade, precisão, exatidão, estabilidade e recuperação. Todos os parâmetros avaliados corroboraram com as exigências da legislação. Após validação, iniciou-se os estudos para determinação dos parâmetros cinéticos enzimáticos avaliando a variação do tempo de incubação e da concentração de proteínas microssomais no consumo dos subtratos. Utilizando a faixa linear destes experimentos foi determinada a concentração de 0,25 mg mL-1 e o tempo de incubação de 20 min, respeitando as condições de Velocidade Inicial. Em seguida, ao avaliar a variação da concentração do substrato observou-se que a cinética obtida é do tipo sigmoidal. Dessa forma, para os cálculos dos parâmetros cinéticos foi utilizado a equação de Hill, obtendo Vmax = 0,698 ± 0,022 ?mol/mg proteína/min, S50 = 55,1 ± 10,5 ?M e o coeficiente de Hill 2,7 ± 0,17, já os parâmetros da beta amirina foram: Vmax = 0,775 ± 0,034 ?mol/mg proteína/min, S50 = 130,4 ± 42,8 ?M e coeficiente de Hill 2,5 ± 0,21. A partir destes dados obteve-se o clearance intrínseco para a beta e a alfa amirina de 3,05 mL/min/kg e 6,55 mL/min/kg, respectivamente. Apesar das amirinas serem metabolizadas pelas enzimas da CYP 450, nenhum metabólito foi encontrado. Nesse trabalho, foi demostrando pela primeira vez, o comportamento das enzimas das CYP 450 de ratos frente aos produtos naturais alfa e beta amirina, no qual foi verificado um comportamento atípico, que não segue a cinética michaeliana. / The isomers of pentacyclic triterpene amyrins (alpha and beta) occurring in a variety of plants, as Protium spruceanum. These molecules have showed significant pharmacological effects, as anti-inflammatory, gastroprotective and antitumor effects. Based on that, these substances have demonstrated great potential to become new drugs. However, the metabolic behavior by employing CYP enzymes (CYP450) has not been studied yet. The aim of this work was to perform an in vitro metabolism study by using these triterpenes and to determine the enzymatic kinetic parameters and possible metabolites by employing rat liver microsomes. To perform that, a bioanalytical method was developed and validated to analysis amyrins in rat microsomes. Gas chromatography coupled with mass spectrometer (GC-MS) was applied in the analysis. Liquid-liquid extraction was used to clean the sample and hexane was used as extraction solvent. Before metabolism studies, the method was validated according to current legislation to analysis of drugs in biological fluids. The following parameters were evaluated: linearity, sensitivity, selectivity, precision, accuracy, stability and recovery. All parameters evaluated were in agreement to legislation guidelines. After validation, enzymatic kinetic parameters were determined through variation of incubation time and concentration of microsomal proteins. By using linear range, the incubation time of 20 min and microsomal protein concentration of 0.25 mg mL-1 were determined to respect V0 conditions. The enzymatic kinect results showed a sigmoidal profile. Thus, to calculate the kinetic parameters it was used the Hill equation. It was observed a Vmax = 0.698 ± 0.022 ?mol/mg protein/min, S50 = 55.18 ± 10.5 ?M and Hill coefficient of 2.7 ± 0.17 to alpha amyrin and a Vmax = 0.775 ± 0.034 ?mol/mg protein/min, S50 = 130.4 ± 42.8 ?M and Hill coefficient of 2.5 ± 0.21 to beta amyrin. The intrinsic clearance to beta and alpha amyrin was 3.05 mL/min/kg e 6.55 mL/min/kg, respectively. In spite of amyrins were metabolized by the CYP 450 enzymes, none metabolite was found. In this work, it was demonstrated, for the first time, the behavior of rat liver microsomes front to alpha and beta amyrin, in which it was observed an atypical behavior, that it does not follow the Michaelis-Menten kinetics.

Na última década, a análise da estrutura proteica baseada em teoria de redes/grafos tem emergido. A abstração da estrutura tridimensional proteica em forma de uma rede, leva em consideração os resíduos de aminoácidos e suas interações através do espaço, e apresenta um conjunto de conexões e propriedades mais complexas do que aquelas visualizadas apenas com a estrutura covalente. A análise da estrutura proteica identificou que as proteínas pertencem às redes de classes de \"mundo pequeno\" (small-world) e \"sem escala\" (scale-free), o que significa que seus resíduos de aminoácidos são altamente agregados e que existem poucas conexões entre 2 resíduos quaisquer da proteína. A identificação dos resíduos com alto grau de conexão, chamados centrais (\"resíduos hubs\"), é feita pela determinação do caminho mais curto que conecta um dado resíduo aos demais compreendidos nesta rede. A remoção destes resíduos centrais (hubs) afeta a integridade da rede de forma mais contundente diferentemente da remoção de resíduos que não são centrais. Até o momento estes \"resíduos hubs\" ainda não foram experimentalmente correlacionados com as propriedades enzimáticas de proteínas. Para tal finalidade, a estrutura terciária de uma β-glicosidase de Spodoptera frugiperda (Sfβgli) foi analisada como uma rede. Após calcular-se os caminhos médios entre todos os pares de aminoácidos da β-glicosidase, encontrou-se 11 resíduos centrais (\"resíduos hubs\"). Alinhamento de sequências e comparações estruturais indicaram alta conservação destes \"resíduos hubs\". Nosso objetivo foi produzir esta β-glicosidase mutando-se a maioria dos \"resíduos hubs\" e 3 aminoácidos não centrais (\"não hubs\"), expressar estes mutantes em E. coli, determinar suas propriedades enzimáticas como atividade catalítica e preferência pelo substrato e verificar a estabilidade destes mutantes em experimentos de inativação térmica. Os resultados obtidos sugerem que mutações nos \"resíduos hubs\" não afetam as propriedades catalíticas, contudo as enzimas com mutações nos \"resíduos hubs\" apresentaram uma menor estabilidade térmica. Estes resultados sugeriram que os \"resíduos hubs\" são relevantes na difusão da energia cinética (vibração) introduzida na estrutura desta β-glicosidase pelo seu aquecimento / In recent years, graph-theoretic approaches have established that protein structures can be modeled as complex networks of interacting residues. Proteins structures can be represented as small-world and scale-free networks that are usually highly clustered with few links connecting any pair of nodes. The identification of nodes with high connection degrees, called hubs, is made by determining the shortest path linking one amino acid to the further nodes comprising the network. Targeted removal of the hubs has greater affect on the integrity of the network structure in contrast to a random removal of amino acid residues comprising the network. Nevertheless these hubs had not previously been correlated with enzymatic properties. The tertiary structure of β-glycosidase from S. furgiperda (Sfβgly) was analyzed as a network. After calculating the averaged paths between all pairs of amino acid residues of Sfgly, we defined 11 hubs, which have the highest centrality on the network. Sequence alignment and structural comparison showed that these hubs residue are conserved among β-glycosidases. Our goal was to mutate most hubs and 3 ´non-hubs´ residues from Sfβgly, express these mutant enzymes in E. coli, test their enzymatic properties as catalytic efficiency and substrate preference, and verify the thermal stability of these mutants. The results implied that mutations in these hubs do not cause changes in catalytic properties although enzymes containing mutations in hubs showed lower thermal stability. Based on that, it was suggested that hub residues are important in the diffusion of kinetic energy (vibrations) introduced in the Sfβgly structure by heating

O Brasil é considerado o maior produtor mundial de cana-de-açúcar, voltada para a produção de açúcar, etanol e derivados. O aproveitamento de resíduos da usina, como torta de filtro e vinhaça no condicionamento do solo pode contribuir com a manutenção da sua fertilidade. Por outro lado, a cada operação agrícola necessária para o cultivo da cana-de-açúcar está associada uma emissão de GEE que deve ser contabilizada. O objetivo desta pesquisa foi estimar a emissão dos principais GEE (CO2, N2O e CH4) pela torta de filtro, e avaliar as alterações de alguns atributos das comunidades microbianas durante o processo de decomposição. Após avaliação de uma enquete sobre o modo de utilização da torta de filtro por diversas usinas, um estudo foi desenvolvido na Usina Costa Pinto localizada em Piracicaba (SP). A torta aplicada no sulco de plantio da cana foi monitorada quanto à emissão dos gases, sendo que as concentrações dos mesmos nas amostras foram determinadas por cromatografia gasosa. Os atributos microbiológicos examinados foram a biomassa, a atividade enzimática (fosfatase ácida, alcalina e ?-glicosidase) e a estrutura da comunidade através do polimorfismo de fragmento de restrição terminal (T-RFLP). Foi observada emissão significativa dos principais GEE predominantemente da torta quando aplicada nos sulcos de plantio, com destaque para o N2O, com uma proporção doze vezes maior em massa do que o CH4, em 56 dias de experimento. Quanto aos aspectos microbiológicos, o maior valor encontrado de carbono e nitrogênio da biomassa microbiana para a dose usualmente aplicada (25 Mg ha-1), foi com dois meses de experimento, com respectivamente 484,89 ?g C g solo seco-1 e 62,95 ?g N g solo seco-1, e correlacionado pelo coeficiente de Pearson com a atividade enzimática no material. Pela técnica de T-RFLP foi possível avaliar a estrutura dos Domínios de Archaea, Bacteria e Fungi na comunidade microbiana da torta de filtro. Não houve modificação dessa estrutura ao longo do tempo analisado. Os resultados obtidos reforçam a importância dos atributos microbiológicos aliados a fatores químicos e físicos e a influência dos mesmos sobre as emissões de GEE. / Brazil is the greatest worldwide producer of sugarcane with production of sugar, ethanol and derived. Usually applied to soil as fertirrigation, filter cake and vinasse on soil conditioning have contributed to the maintenance of fertility. On the contrary, each agricultural operation is associated to GHG emissions that must be accounted for the balance of products. This work aims evaluate GHG emissions (CO2, N2O and CH4) from the filter cake, as well as evaluate the main differences in the microbiological community available within the decomposition process. After evaluation of a survey about to use the filter cake by industries, the study has been developed at Usina Costa Pinto located in Piracicaba (SP). The filter cake applied to the row of sugarcane planting have been monitored by taking regular samples of the emissions. The concentration of the three gases in the samples has been determined by gas chromatography. The microbiological aspects has been evaluated by biomass, enzymatic activity (acid phosphatase, alkaline phosphatase, and beta-glycosidase) and the community structure through terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP). Significant GHG emission has been observed; mainly from the filter cake applied to the row of sugarcane planting especially N2O, with ratio twelve times greater than CH4 in 56 days of experiment. For microbiological aspects, the maximum of carbon and nitrogen from the microbial biomass for the treatment usually applied (25 Mg ha-1), within two months of experimentation, with respectively 484,89 ?g C g dry soil-1 e 62,95 ?g N g dry soil-1, and correlated by the coefficient of Pearson with the enzymatic activity existent in the material. The T-RFLP analysis has allowed evaluate the community structures of Archaea, Bacteria e Fungi in the microbiological community of the filter cake. Modification in the community structures was not observed over this time examined. The results obtained reinforce the importance of microbiological aspects combined with chemical and physical factors and their influence on GHG emissions.

As células glias de Müller são capazes de gerar novos neurônios retinianos em resposta a lesões, atuando como uma possível fonte para regeneração retiniana. Nesse contexto, as GTPases Rho podem ter um papel interessante, visto que regulam múltiplas vias de sinalização que controlam, por exemplo, a transcrição gênica, sobrevivência e proliferação celular. No presente estudo analisamos a participação de um dos membros dessa família (Rac1) na proliferação de células gliais de Müller da retina de galinhas após lesão excitotóxica com N-Metil-D-Aspartato (NMDA). A injeção intraocular de NMDA promoveu extensa proliferação de células gliais de Müller. A inibição de Rac1 com NSC23766 não alterou a quantidade de células que entraram no ciclo celular, mas, provocou um retardo em sua progressão. Esses resultados sugerem um importante papel para a GTPase Rac1 na regulação da proliferação de células gliais de Müller em resposta a lesões retinianas. / Müller glial cells may generate new neurons in response to retinal injury, acting as a potential source for retinal regeneration. In this context, Rho GTPases may have an interesting role, since they regulate multiple signaling pathways that control, for example, gene transcription, cell proliferation and survival. This study analyzed the involvement of a member of this family (Rac1) in the proliferation of Müller glial cells of chick retina after excitotoxic injury with N-methyl-D-aspartate (NMDA). Intraocular injection of NMDA promoted extensive Müller glia proliferation. Rac1 inhibition with NSC23766 did not affect the cell cycle entry, but a delay in cell cycle progression was observed. These results suggest an important role for Rac1 in the regulation of Müller glial cells proliferation in response to retinal injury.

Existe uma grande preocupação com relação aos efeitos a longo prazo que muitos poluentes químicos possam ter sobre a saúde e o ambiente. Tal é o número de diferentes poluentes e a complexidade de suas interações que seus efeitos não podem ser prontamente definidos em programas de monitoramento que determinam a presença de poluentes no ambiente. Recentemente, pesquisas identificaram um grupo de enzimas conhecidas coletivamente como proteínas antioxidantes, que são induzidas em resposta aos poluentes, como os metais pesados e parecem proteger as células contra os possíveis danos causados por estes agentes. É possível que a análise da indução e acumulação de proteínas antioxidantes e/ou de defesa, possa fornecer um sistema biológico versátil de monitoramento dos efeitos da poluição. E assim, o estudo da atividade enzimática poderá vir a se configurar como um critério de avaliação da fitotoxicidade de metais pesados em plantas. Com esse propósito, foi desenvolvido um trabalho com o objetivo de estudar as alterações de crescimento e bioquímicas causadas pelo efeito do Cádmio (Cd) em arroz. Experimentos foram montados utilizando 8 diferentes genótipos de arroz da espécie Oryza sativa: F222, IAC202, Caipó, J199, IAC165, J79, F133, F35 e mais duas espécies: Arg2 (Oryza latifolia) e Oryza glumaepapulo nos quais foram submetidas a diferentes concentrações de Cd em solução nutritiva (0mM, 0,05mM, 0,5mM) durante um período de 3 e 7 dias para avaliação do efeito desse metal pesado no comprimento do sistema radicular. Foi realizado um segundo ensaio utilizando a cultivar IAC165, submetida a diferentes concentrações de CdCl2 (0mM, 0,01mM, 1,0mM). Nestas concentrações, coletas de folhas e raízes foram feitas em períodos de tratamentos constituídos de 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72horas. Com relação ao crescimento radicular do 1° ensaio foram identificados três padrões de resposta: um primeiro, cuja resposta à menor dosagem (0,05 mM de CdCl2) é significativa e esta se mantém na dosagem seguinte (0,5 mM); um segundo, onde também é significativa a resposta à menor dosagem, mas esta se intensifica significativamente com o aumento da dosagem e um terceiro, no qual as linhagens mostraram-se resistentes às dosagens testadas, não sendo afetadas em seu padrão de crescimento de raízes no tempo desse estudo. O parâmetro bioquímico analisado no 2° ensaio foi relativo aos níveis de atividade de enzimas antioxidantes, como Catalase e Glutationa Redutase. que mostraram padrões semelhantes de resposta tanto para Catalase como para Glutationa Redutase, observando-se elevação das atividades dessas enzimas antioxidantes em folhas e raízes, sendo o aumento de atividade da Glutationa Redutase nas raízes altamente significativo, sugerindo que a síntese de Glutationa reduzida possa estar estimulada para subseqüente síntese de fitoquelatinas. / The response of a group of rice genotypes to cadmium exposure was tested using the root growth as a parameter during the time length of the treatment. Three distinct response patterns were identified: a significant initial (0.01 mM) dosage effect, which was maintained with the increase of CdCl2 concentration to 1 mM; a significant initial effect, which was intensified with the increase of CdCl2 concentration, and a group of varieties resistant ot the CdCl2 concentration tested. Significant interactions between dosage and varieties were observed. Enzymatic assays for catalase and gluthatione reductase were also carried out for in plants exposed to CdCl2. Similar response patterns for both enzymes were observed. The activities of catalase and gluthatione reductase in leaves and roots were increased and in the case of gluthatione reductase in roots, such an increase was highly significant, suggesting that the synthesis of reduced gluthatione may be stimulated for subsequent synthesis of phytochelatins.

Orientadores: Maricilda Palandi de Mello, Fernanda Caroline Soardi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T09:56:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lusa_AnaLeticiaGori_D.pdf: 4582728 bytes, checksum: a14d0d0453e90b4a59cb02532b21d83b (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A Hiperplasia congênita da Adrenal (HCA) é uma das doenças mais comuns com herança autossômica recessiva. Uma das causas é a deficiência da 21-hidroxilase que surge por mutações no gene CYP21A2. O desequilíbrio na síntese de cortisol causa um estímulo excessivo das glândulas adrenais pelo hormônio adrenocorticotrópico (ACTH) e, consequentemente, à hiperplasia da glândula e ao aumento na síntese de andrógenos. O presente trabalho teve por objetivo clonar e expressar variantes do gene CYP21A2 e, avaliar as variantes enzimáticas da 21-hidroxilase quanto à atividade residual, comparando suas formas nativa e mutantes. Foi também realizado o estudo in silico para se comparar as estruturas das enzimas 21-hidroxilase e 3?-hidroxiesteróide desidrogenase tipo 2 (HSD3B2) avaliando o impacto das alterações provocadas por mutações sobre a estrutura da proteína nativa. Para a enzima 21-hidroxilase, as mutações analisadas quanto à atividade foram: p.Ser113Phe, p.Pro267Leu, p.Val358Ile, p.Arg426Cis e, as combinações p.Ile172Asn+p.Val358Ile e p.Val281Leu+p.Arg426Cis. Nos testes de atividade enzimática, as enzimas com as mutações p.Val358Ile e as combinações p.Ile172Asn+p.Val358Ile e p.Val281Leu+p.Arg426Cis apresentaram valores de atividade residual compatíveis com a forma perdedora de sal. Por outro lado, a enzima com a mutação p.Pro267Leu apresentou atividade residual maior que 50%, compatível com mutações da forma não clássica. As mutações p.Ser113Phe e p.Arg426Cis, por sua vez, apresentaram atividade residual entre 2 e 7% que, em relação aos controles utilizados, foram correspondentes à forma clássica virilizante simples. Os modelos estruturais gerados para as enzimas 21-hidroxilase portadoras da deleção p.(Gln389_Ala391del) e das mutações individuais ou combinadas acima citadas foram comparados ao da enzima nativa. Estudo similar foi realizado com enzimas HSD3B2 nativa e portadoras de duas mutações, p.Pro222Gln e p.Pro222Thr, relacionadas à forma perdedora de sal da deficiência de HSD3B2. Esse estudo demonstrou boa correlação das mutações encontradas nos pacientes com os seus fenótipos tanto no que diz respeito à atividade enzimática quanto às alterações estruturais. Assim, ficou demonstrado que este tipo de abordagem é eficaz para a avaliação dos aspectos funcionais de mutações inéditas / Abstract: Congenital adrenal hyperplasia (CAH) is one of the most common hereditary autosomal recessive diseases. 21-hydroxylase deficiency is one important cause of the disease and results from mutations in CYP21A2 gene. The unbalance in cortisol synthesis leads to excessive stimulation of adrenal glands by adrenocorticotropic hormone (ACTH), consequently, to adrenal hyperplasia and excessive androgen synthesis. The present study aimed to obtain and express CYP21A2 clones carrying sequence variations and to evaluate 21-hydroxylase enzymatic residual activities of variant enzymes in comparision to the wild-type. In silico studies were also performed to compare the structure of 21-hydroxylase and 3?-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 (HSDB2) evaluating the impact of mutations upon the native structure of the enzymes. Residual activity analyses for 21-hydroxylase enzyme comprised the mutations p.Ser113Phe, p.Pro267Leu, p.Val358Ile and the combined mutations p.Ile172Asn+p.Val358Ile and p.Val281Leu+p.Arg426Cys. The assays indicated that p.Val358Ile and p.Ile172Asn+p.Val358Ile and p.Val281Leu+p.Arg426Cys reduced CYP21A2 activity to levels corresponding to the salt wasting form. Whereas the enzyme bearing p.Pro267Leu mutation showed residual activity higher than 50% indicating a nonclassic mutation. Conversely, p.Ser113Phe and p.Arg426Cys mutations showed residual activities that varied between 2% and 7% that, compared to controls, corresponded to simple virilizing form. Structural models generated for 21-hydroxylase enzyme with p.(Gln389_Ala391del) and each individual or combined mutations cited above have been compared to the native enzime. Similar study was performed with HSD3B2 enzyme in its native and mutated formas with p.Pro222Gln e p.Pro222Thr that are related to the salt wasting form of HSD3B2 deficiency. This study demonstrated a good genotype-phenotype correlation in patients either for residual activities or for structural changes. Therefore, it has been demonstrated that such analyses are effective to evaluate functional aspects for novel mutations / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutora em Genética e Biologia Molecular