Frutose e Ácido Glicônico são produtos importados empregados em diferentes setores nas áreas química, farmacêutica e alimentícia, representando um mercado de dois milhões de dólares (US$ 2,0 milhões) por ano. Por sua vez, a sacarose pode ser empregada como matéria-prima para a obtenção destes produtos através de conversão enzimátiva empregando invertase e glicose-oxidase. O uso de biorreatores com membrana (MBR) mostra-se interessante em processos enzimáticos, pois, ao serem empregados em processos contínuos permitem, simultaneamente, produção e separação dos produtos, reduzindo a formação de subprodutos e, eventual, inibição da enzima por excesso de substrato ou produtos. A sacarose é convertida em xarope de açúcar invertido (solução equimolar de frutose e glicose) pela invertase (Bioinvert®, enzima comercial), seguido pela oxidação da glicose em ácido glicônico pela ação da glicose oxidase (GO). O processo de conversão multi-enzimático da sacarose foi obtido através da alimentação de sacarose (50 mM) em reator com membrana (MBR) contendo invertase (24 U/mL), glicose-oxidase (0,5 U/mL) e catalase (470 U/mL) e operando com vazão específica de 6,0 h-1, 35ºC e pH 5,5. As condições operacionais otimizadas possibilitaram a conversão completa da sacarose (X = 100 %) e da glicose resultante (Y = 100%) com velocidades específicas de reação de 4,2 mmol/U.h, 0,60 mmol/U.h e 0,00062 mmol/U.h, respectivamente, para a invertase, glicose oxidase e catalase. A respeito da oxidação da glicose, a adição de catalase no meio reacional se fez necessária para minimizar os efeitos inibitórios sobre a GO através do peróxido de hidrogênio formado. / The fructose and gluconic acid are products of great application in chemical, pharmaceutical and food industry. The actual Brazilian market for these compounds is about US$ 2 millions, here as the sucrose, the raw-material used for their production, represents about 2.4% of the Brazil\'s GNP. This conversion increases the value added to the sugarcane, usually marketed as a commodity, because the fructose and gluconic acid are more valuable products than sucrose. The use of membrane bioreactor (MBR), which operates under mild conditions regarding internal pressure, temperature and pH, has been growing along the years for enzyme catalyzed processes. Moreover, in the MBR the reaction and separation of the products occur simultaneously, avoiding the formation of by-products and the eventual inhibition of the enzyme caused by excess of substrate or products. The sucrose is converted to the inverted syrup (an equimolar solution of fructose and glucose) by invertase (in this work was employed Bioinvert®, a commercial invertase) followed by the oxidation of glucose in gluconic acid by the glucose oxidase (GO). The multi-enzymatic conversion of sucrose was attained when carried out under initial substrate of 50mM and invertase, glucose oxidase and catalase concentrations, respectively, of 24.0 U/mL, 0.5 U/mL and 470 U/mL in a membrane reactor utilizing a dilution rate of 6.0 h-1, 35ºC and pH 5.5. The optimized operational conditions led to a conversion yield of 100% for sucrose hydrolysis and glucose oxidation steps resulting in enzyme productivity of 4.2 mmol/U.h, 0.60 mmol/U.h and 0.00062 mmol/U.h, respectively, to invertase, glucose oxidase and catalase. In regard to the glucose oxidation, the addition of catalase in the reaction medium was necessary, in order to minimize the inhibition of the GO by the hydrogen peroxide formed.

A estrongiloidíase é uma infecção intestinal causada pelo nematódeo Strongyloides stercoralis. A maioria dos casos evolui para um quadro crônico benigno; entretanto pode haver hiperinfecção e disseminação, sobretudo em pacientes imunodeprimidos. Os métodos parasitológicos convencionais apresentam baixa sensibilidade e, com isso, os testes sorológicos podem representar uma boa alternativa para o diagnóstico dessa helmintíase. O presente trabalho tem como objetivo avaliar as técnicas de RIFI, ELISA e WB para o diagnóstico da estrongiloidíase em pacientes candidatos a transplante. Para validação dos testes, foram utilizadas amostras de soros de pacientes imunocompetentes (positivos para S. stercoralis, positivos para outras parasitoses e negativos). Foram utilizadas amostras de fezes e soros de pacientes candidatos a transplante, a saber: 50 para transplante renal; 50 para transplante de fígado; 50 para transplante de medula óssea. As amostras fecais de todos os pacientes foram analisadas pelas técnicas de sedimentação espontânea, Rugai, e cultura em placa de ágar. Para a execução das técnicas sorológicas foram utilizadas como fonte de antígeno larvas filarioides de S. venezuelensis. Para a RIFI, os soros foram diluídos a 1:40 em tampão PBS-TM e o conjugado anti-IgG humano marcado com fluoresceína diluído 1:500 em PBS acrescido de 4% de azul de Evans, sendo realizada a leitura em microscópio de imunofluorescência, utilizando as objetivas de 20X e 40X. Para a técnica ELISA foram utilizadas placas poliestireno sensibilizadas com 10?g de antígeno (frações solúveis salina e alcalina), soro dos indivíduos diluídos a 1:200 em PBS 0,05% Tween 3% de leite (PBS-TM) e conjugado (anti-IgG humana peroxidase) em PBS-TM. As amostras foram consideradas positivas quando o índice ELISA foi maior que 1. Para a técnica de WB, os soros foram diluídos 1:100 em Tris-HCl 5% de leite (TM) e o conjugado (anti IgG-humana peroxidase) em PBS-TM. Dos 150 pacientes candidatos a transplante analisados, 9,3% (n=14) foram positivos pelas técnicas parasitológicas, sendo que a cultura em placa de ágar detectou 6,6% (n=10). Na RIFI a soropositividade para detecção da infecção por S. stercoralis foi de 16,6% (n=25), sendo, 22% transplante renal, 18% hepático e 10% medula óssea. Pela técnica ELISA a soropositividade foi de 11,3% (n=17), sendo 14% nos pacientes candidatos a transplante renal, 14% hepático e 3% medula óssea, utilizando o antígeno alcalino, e 24,6% (n=37), sendo 18% nos pacientes candidatos a transplante renal, 50% hepático e 6% medula óssea, utilizando o antígeno salino. Pela técnica WB a soropositividade foi de 20,6% (n=31), sendo 18% nos pacientes candidatos a transplante renal, 32% hepático e 12% medula óssea, utilizando o antígeno alcalino, e 18,6% (n=28) sendo 10% nos pacientes candidatos a transplante renal, 14% hepático e 32% medula óssea, utilizando o antígeno salino. A utilização de técnicas imunodiagnósticas pode ser indicada na triagem de pacientes em fila de transplante, devendo-se levar em conta as limitações de reações sorológicas em pacientes imunodeprimidos / Strongyloidiasis is an intestinal infection caused by the nematode Strongyloides stercoralis. Most cases progress to a benign chronic condition; however hyperinfection and dissemination may occur, especially in immunocompromised patients. Conventional parasitological methods have low sensitivity and, thus, serological tests may be a good alternative for the diagnosis of this helminthiasis. The aim of this study was to evaluate RIFI, ELISA and WB techniques for the diagnosis of strongyloidiasis in patients candidates for transplants. In order to validate the tests samples of sera from immunocompetent patients (positive for S. stercoralis, positive for other parasitosis, and negatives) were used. Feces and sera samples of patients candidates for transplants were used as follows: 50 for renal transplant, 50 for liver transplant, 50 for bone marrow transplant. Fecal samples of all patients were analyzed by spontaneous sedimentation, Rugai and Agar plate culture techniques. Filarioid larvae of S. venezuelensis were used as source of antigen for serological tests. For RIFI, sera were diluted 1:40 in PBS-TM buffer and human anti-IgG conjugate labeled with fluorescein was diluted 1:500 in PBS with 4% Blue Evans, reading being performed in immunofluorescence microscope using 20X and 40X objectives. For ELISA technique polystyrene plates sensitized with 10?g of antigen (saline and alkaline soluble fractions), individual sera diluted at 1:200 in PBS 0.05% Tween 3% of milk (PBS-TM) and conjugate (human anti-IgG peroxidase) in PBS-TM were used. Samples were considered positive when ELISA index was higher than 1. For WB technique, sera were diluted in Tris-HCl 5% of milk (TM) and conjugate (human anti-IgG peroxidase) in PBS-TM. From 150 patients candidates for transplants analyzed 9.3% (n=14) were positive by parasitological techniques, agar plate culture detected 6.6% (n=10). In RIFI seropositivity for S. stercoralis infection detection was 16.6% (n=25) being 22% renal transplant, 18% hepatic and 10% for bone marrow. By ELISA technique seropositivity was 11.3% (n=17), being 14% in patients candidates for renal transplant, 14% hepatic and 3% bone marrow, using alkaline antigen and 24.6% (n=37), being 18% in patients candidates for renal transplant, 50% hepatic and 6% bone marrow, using saline antigen. By WB technique seropositivity was 20.6% (n=31), being 18% in patients candidates for renal transplant, 32% hepatic and 12% bone marrow, using alkaline antigen, and 18.6% (n=28) being 10% in patients candidates for renal transplant, 14% hepatic and 32% bone marrow, using saline antigen. Application of immunodiagnostic techniques could be indicated in screening of patients in transplant waiting list, however limitations of serological reactions in immunodepressed patients should be considered

Submitted by Cleide Dantas (cleidedantas@ufpa.br) on 2014-02-10T11:19:25Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AvaliacaoTesteElisa.pdf: 2869174 bytes, checksum: 2611f924ea4fe9cceee7f2edeb3abdf3 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva (arosa@ufpa.br) on 2014-03-31T15:37:08Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertacao_AvaliacaoTesteElisa.pdf: 2869174 bytes, checksum: 2611f924ea4fe9cceee7f2edeb3abdf3 (MD5) license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-03-31T15:37:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertacao_AvaliacaoTesteElisa.pdf: 2869174 bytes, checksum: 2611f924ea4fe9cceee7f2edeb3abdf3 (MD5) license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Previous issue date: 2006 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A TTM (Malária Transmitida por Transfusão) ocorre através de qualquer componente de sangue que contenha eritrócitos que possam abrigar parasitas viáveis, porém, casos envolvendo plaquetas, leucócitos e plasma congelado têm sido reportado. As principais causas de relatos de TTM é a presença de baixa parasitemias em pacientes assintomáticos. O objetivo deste trabalho foi verificar a eficiência do ELISA-Malaria Antigen Test, que faz a captura do antígeno pLDH (Lactato Desidrogenase Plasmodial), como método de triagem de malária em doadores de sangue. Para a realização deste estudo selecionamos 1670 amostras das Unidades de Coleta e Transfusão (UCTs) das cidades do interior Estado do Pará: Altamira, Castanhal, Marabá, Santarém e Tucuruí e da capital Belém, sendo que desta tivemos amostras de um outro grupo, os de doadores que estiveram em zonas endêmicas 30 dias antes da doação. As amostras foram coletadas em duas estações (seca e chuva). Observou-se que o ELISA-Malaria Antigen Test é um teste sensível e prático, porém ajustes ainda devem ser feitos no ponto de corte estabelecido pelo fabricante, pois de acordo com a sua faixa só foi possível a detecção de 0,42% de amostras positivas e quando o ponto de corte foi ajustado com amostras do grupo controle, esse número passou para 4,37%. Não foi encontrada diferença sazonal no número de casos positivos e negativos, mas quando analisamos os ΔDO/Cutoff das amostras de todas as cidades, observamos diferenças significativas, o que demonstrou que a cidade de Belém possuía a menor possibilidade de encontro de casos de malária do que nas amostras das cidades de Altamira, Santarém e nas da Zona Endêmica. Os casos de TTM, embora não sejam comuns dentro de áreas não endêmicas, podem ocorrer, pois os doadores implicados em TTM invariavelmente apresentam baixas parasitemia, o que dificulta a detecção dos parasitas pelos métodos disponíveis. Assim, para uma boa triagem de doadores, estratégias efetivas devem ser criadas, incluindo triagens clínico-epidemiológicas, associadas a ferramentas sorológicas eficazes para assegurar a qualidade do sangue disposto à doação. / The TTM (Transfusion-Transmitted Malaria) happens through any component of blood that contains erythrocytes that can shelter viable parasites, even so, cases involving platelets, leukocites and frozen plasma have been reported. The main causes of reports of TTM is the presence of low parasitemias in patients without signs. The objective of this work was, initially, to verify the efficiency of the ELISA-Malaria Antigen Test, that makes the capture of the antigen pLDH (Lactate Dehydrogenase Plasmodial), to be used in the future as malaria screen in donors of blood. For the accomplishment of this study we selected 1670 samples of the Units of Collection and Transfusion (UCTs) of the cities of the interior of Pará: Altamira, Castanhal, Marabá, Santarém, Tucuruí and Belém, and of this last city, capital of the State, we had samples of another group, the one of donors that were in endemic zones 30 days before the donation. All the samples had its collection divided in two periods (dryness and rain). It was observed that ELISA-Malaria Antigen Test is a sensible and practical test, even so, repairs still should be done in the court point established by the maker, because in agreement with its strip it was only possible the detection of 0,42% of positive samples and when the court point was adjusted with samples of the group it controls, that number passed for 4,37%. It was not found seasonal difference in the number of positive and negative cases, but when an analysis was made with ΔDO/Cutoff of the samples of all the cities, we noticed that they presented significant differences in its results, demonstrating that the city of Belém possesses the smallest probability of meeting cases of malaria than in the samples of the cities of Altamira, Santarém and in the one of the Endemic Zone. The cases of TTM although they are not common inside non endemic areas, they can happen, because the donors invariably implied in TTM possess low parasitemias, wich make difficult the detection of the parasites for the available methods. Thus, for a good screen of donors, effective strategies should be created, including clinical-epidemic screens, associated to effective tools serological enough to assure the quality of the blood arranged to the donation.

Submitted by Fabíola Silva (fabiola.silva@famerp.br) on 2016-09-29T20:17:35Z No. of bitstreams: 1 josehenriquemferreira_dissert.pdf: 1670640 bytes, checksum: 3707d57cc4f4e98d8edb6594786c1b7e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-29T20:17:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 josehenriquemferreira_dissert.pdf: 1670640 bytes, checksum: 3707d57cc4f4e98d8edb6594786c1b7e (MD5) Previous issue date: 2014-10-20 / Introduction: Mammary neoplasms are the most common type of tumor in dogs. Some proteins play an important role in tumor progression, thus are candidate prognosis markers. During tumor growth, the transcription factor induced by hypoxia (HIF-1α) activates the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), promoting angiogenesis. Interleukin-8 (IL-8) is a pro-inflammatory and pro-angiogenic cytokine and has been associated with tumor progression. Objectives: To evaluate the prognostic value of HIF-1α, VEGF and IL-8 proteins in tumor tissue in dogs with mammary tumors, correlating them with clinicopathological parameters, clinical outcome and survival. Material and Methods: The concentrations of HIF-1α, VEGF and IL-8 proteins were evaluated by ELISA (Enzyme-linked immunosorbent) in macerated tumor of 25 bitches with mammary tumors and control samples and compared statistically. Results: The levels of HIF-1α, VEGF and IL-8 were higher in dogs over the age of 10 years and that had died (p <0.05). Moreover, HIF-1α concentrations were elevated in the tumors of dogs who developed metastases (p = 0.04), while VEGF levels were highest in tumors with clinical stages III and IV (p = 0.03) and IL-8 tumors in tumor with development greater than six months (p = 0.03). Still, high levels of HIF-1α, VEGF and IL-8 were also related to shorter overall survival (p <0.05). Conclusions: High levels of HIF-1α, VEGF and IL-8 are associated with features of poor prognosis, suggesting that the assessment of these proteins in tumor macerated has important prognostic value. / Introdução: As neoplasias mamárias são o tipo mais comum de tumor na espécie canina. Algumas proteínas exercem importante papel na progressão tumoral e portanto, são candidatos marcadores de prognóstico. Durante o crescimento tumoral, o fator de transcrição induzido por hipóxia (HIF-1α) ativa a expressão do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), promovendo a angiogênese. A interleucina-8 (IL-8) é uma citocina pró-inflamatória e pró-angiogênica e tem sido associada à progressão tumoral. Objetivos: Avaliar o valor prognóstico das proteínas HIF-1α, VEGF e IL-8 no tecido tumoral em cadelas com neoplasia mamária, relacionando-os com os parâmetros clínico-patológicos, evolução clínica e sobrevida. Material e Métodos: As concentrações das proteínas HIF-1α, VEGF e IL-8 foram avaliadas pelo método de ELISA (Enzyme-linked immunosorbent Assay) no macerado tumoral de 25 cadelas com neoplasia mamária e amostras controle e comparadas estatisticamente. Resultados: Os níveis de HIF-1α, VEGF e IL-8 foram maiores em cadelas com idade superior a 10 anos e que vieram a óbito (p < 0,05). Além disso, concentrações de HIF-1α foram elevadas nos tumores de cadelas que desenvolveram metástase (p = 0,04), enquanto os níveis de VEGF foram maiores em tumores com estadiamento clínico III e IV (p = 0,03), e de IL-8 em tumores com evolução tumoral maior que seis meses (p = 0,03). Ainda, níveis elevados de HIF-1α, VEGF e IL-8 também foram relacionados com menor tempo de sobrevida global (p < 0,05). Conclusões: Altas concentrações de HIF-1α, VEGF e IL-8 estão associadas com características de pior prognóstico, sugerindo que a avaliação dessas proteínas no macerado tumoral possui importante valor prognóstico.

Sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. acumulam suas reservas de carbono no endosperma na forma de um polissacarídeo de parede celular, o galactomanano. Os galactomananos são polissacarídeos constituídos de uma cadeia principal de resíduos de D-manose ligadas &beta;-1,4, ramificada por resíduos de D-galactose &alpha;-1,6 ligados. A mobilização deste ocorre após a germinação e envolve três enzimas hidrolíticas (&alpha;-galactosidase, endo-&beta;-mananase e exo-&beta;-manosidase). A &alpha;-galactosidase é a primeira enzima atuar sobre o galactomanano hidrolisando as ligações &alpha;-1,6 das galactoses ramificadas a cadeia principal de manano (ligados &beta;-1,4), permitindo a ação da endo-&beta;-mananase, que hidrolisará o polissacarídeo a oligossacarídeos, onde a &beta;-manosidase atuará (ligações &beta;-1,4), transformando oligossacarídeos a monossacarídeos a serem utilizados no desenvolvimento do embrião. Buscando a compreensão das características da &alpha;-galactosidase e modo de ação sobre o galactomanano, procedeu-se com a purificação, em três etapas,e caracterização bioquímica (pH ótimo, temperatura ótima e aspectos cinéticos) da &alpha;-galactosidase de sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. Além disso, visando evidenciar a modulação da enzima endo-&beta;-mananase pela distribuição de ramificações de galactose no galactomanano (estrutura fina do galactomanano), procedeu-se com hidrólises enzimáticas do galactomanano de Sesbania virgata (Cav.) Pers. utilizando a enzima endo-&beta;-mananase de Aspergillus niger (Megazyme&reg;) somente ou em conjunto com a &alpha;-galactosidase semipurificada de Sesbania virgata (Cav.) Pers. (Capítulo 1) ou com a &alpha;-galactosidase comercial de Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme&reg;), seguido de análise dos oligossacarídeos por HPAEC-PAD (High Performance Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection). Também procedeu-se com hidrólises enzimáticas de galactomananos de 6 espécies com razão manose:galactose variando de 1:1 a 150:1 com endo-&beta;-mananase de Aspergillus niger (Megazyme&reg;) e análise dos oligossacarídeos produzidos por HPAEC-PAD. A &alpha;-galactosidase semipurificada possui, aproximadamente, 42 kDa de peso molecular em condições desnaturantes e, aproximadamente 72 kDa de peso molecular na forma nativa, sugerindo que a enzima assuma estrutura quartenária. A temperatura ótima apresentada se encontra na faixa de 50°C a 55°C, pH ótimo na faixa de 4,4 a 5,4, Km= 1,8276 mM e a velocidade máxima de 0,5024 &mu;molGal.min-1.mgprot-1. A espectrometria de massas gerou os fragmentos: ALADYV-HSK-RMPGSLGHEE-QDAK-TT-GDIEDNWNSM-TSIADS NDKW-ASYAGPGGWN-DPDMLEVGNG-GMTTEEYR-AP-LLVGCDIR-VAVIL-WNR, estando a proteína referente a esta sequência relacionada à mobilização de reserva. Durante a purificação e sequenciamento interno da &alpha;-galactosidase e demais proteínas foram detectadas isoformas da &alpha;-galactosidase de pesos moleculares variados (42 kDa a 20 kDa). Sugere-se que estas isoformas encontradas inicialmente na purificação estejam relacionadas com outras funções da &alpha;-galactosidase, enquanto as isoformas encontradas após todas as etapas de purificação e identificação por espectrometria de massas estejam relacionadas com ativação e adaptação da &alpha;-galactosidase durante todo o processo de mobilização de reservas. Os dados gerados das comparações dos oligossacarídeos produzidos em cada hidrólise sugerem que as ramificações do galactomanano podem modular o reconhecimento de sítios de clivagem pela endo-&beta;-mananase: (1) existe a produção de oligossacarídeos limites de digestão F1, F2 e F3 após hidrólise do galactomanano com endo-&beta;-mananase, como demonstrado para xiloglucanos; (2) os oligossacarídeos F1 possuem proporções distintas quando da hidrólise do galactomanano com endo-&beta;-mananase em diferentes concentrações (ExP I e EXP IV), evidenciando preferência por sítios com menor grau de galactosilação; (3) a presença da &alpha;-galactosidase diminui a produção dos oligossacarídeos F2 e F3, mostrando que estes não possuem resistência intrínseca a hidrólise e que a reação atinge o equilíbrio mesmo quando ainda existem sítios de clivagem ainda disponíveis (EXP III); (4) polissacarídeos com estruturas diferentes, razão manose:galactose variando entre 150:1 a 1:1, são digeridos em diferentes taxas de hidrólise pela mesma enzima, evidenciando que a ramificação com galactose dificulta a ação da endo-&beta;-mananase. Dessa forma, sugere-se que a estrutura do polissacarídeo galactomanano também contenha, pelo menos, parte da informação requerida para seu próprio metabolismo, código para a sua degradação, estando esta informação contida na distribuição das ramificações com resíduos de D-galactose. Sendo assim, sugere-se que as diferentes isoformas da &alpha;-galactosidase relacionadas à degradação da reserva de galactomanano de sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. seriam produto da ação proteolítica da própria enzima a fim de melhorar a afinidade da &alpha;-galactosidase ao substrato durante o processo de mobilização de reserva. O aumento da afinidade da &alpha;-galactosidase ao substrato durante todo o processo de mobilização garantiria a liberação das ramificações com galactose de forma contínua, permitindo e aumentando a eficiência da ação da enzima endo-&beta;-mananase aos sítios de clivagem, garantindo a degradação do polissacarídeo a oligossacarídeos de forma regulada, passível de bloqueio, pelo acúmulo de oligossacarídeos e galactose livre que inibem a ação das enzimas endo-&beta;-mananase e &alpha;-galactosidase, respectivamente, e dificultando a ação de microorganismos, propiciando ao embrião a maior quantidade de açúcares para o seu desenvolvimento, aumentando as chances de sucesso no estabelecimento da plântula / The seeds of Sesbania virgata (Cav.) Pers. have an endosperm which accumulates galactomannan as a storage polysaccharide in the cell walls. Galactomannans are composed of a linear backbone of &beta;-(1,4)-linked D-mannose residues with D-galactose &alpha;-(1,6)-linkages substitutions. The galactomannans are hydrolysed after protrusion of the radicle. This process is perfomed by three enzymes (&alpha;-galactosidase, endo-&beta;-mannanase and exo-&beta;-manosidase). The &alpha;-galactosidase is the first enzyme to cleave the polysaccharides, removing the D-galactose residues, allowing the performance of the endo-&beta;-mannanase, which hydrolyses the mannan backbone to mannan oligosaccharides. The last part of the process includes exo-&beta;-manoside, that cleaves the mannan oligosaccharides to mannose residues, which could be used by the embryo during growth. Aiming at understanding the function of ?-galactosidase in the process of galatomanannan degradation, we studied its mode of action on mannans and galactomannans. The &alpha;-galactosidase of Sesbania virgata (Cav.) Pers. was purified and characterized (pH and temperature optimum and the enzyme kinetics). We found that the semipurified &alpha;-galactosidase molecular weight was 42kDa at denaturating conditions, but in native conditions was 72kDa, suggesting that the enzyme has a quaternary structure. The enzyme optimum pH was between 4,4-5,4, optimum temperature between 50°C-55°C, Km= 1,8276 mM and Vmáx= 0,5024 &mu;molGal.min-1.mgprot-1. Mass spectrometry measures resulted the following fragments: ALADYV-HSK-RMPGSLGHEE-QDAK-TT-GDIEDNWNSMTSIADS-NDKW-ASYAGPGGWN-DPDMLEVGNG-GMTTEEYR-AP-LLVGCDIR-VAVIL-WNR, being the protein from this sequence related with storage mobilization. Possible &alpha;-galactosidase isoforms were detected during the purification, suggesting other functions for the enzyme. The &alpha;-galactosidase isoforms detected after all purification steps and with measured mass spectrometry (from 42kDa to 20kDa) should be related to the storage mobilization. We suggest that the &alpha;-galactosidase isoforms in Sesbania virgata (Cav.) Pers. seeds represents products of the enzyme self-digestion, this process being correlated with the enzyme/polysaccharide affinity and at last, correlated to the galactomannan mobilization. An extract semipurified from Sesbania virgata (Cav.) Pers. and enriched with &alpha;-galactosidase activity, was used along with endo-&beta;-mannanase from Aspergillus niger (Megazyme&reg;) or both endo-&beta;-mannanase and &alpha;-galactosidase (semipurified from Sesbania virgata seeds - Chapter 1- or commercial enzyme from Cyamopsis tetragonoloba - Megazyme&reg;) were used to study the fine structure of galactomannans. Hydrolysis of galactomannans from six species with different mannose:galactose (1:1 to 150:1) ratio were performed with endo-&beta;-mananase from Aspergillus niger. The oligosaccharides from all hydrolysis were analyzed by HPAEC-PAD (High Performance Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection). The hydrolysis fragments data (HPAEC-PAD) suggest that the side-chains of the polysaccharides can modulate the hydrolytic sites recognition on the galactomannan by the endo-&beta;-mannanase. This conclusion is supported by: (1) the presence of limited digest oligosaccharides F1 and dimmers (F2) and trimers (F3) of the F1 oligosaccharides; (2) the presence of different F1 oligosaccharides proportions after hydrolysis with endo-&beta;-mannanase at different concentrations, showing preference on less-branched hydrolytic sites; (3) the &alpha;-galactosidase digestion avoided the accumulation of oligosaccharides F2 and F3, showing that these oligosaccharides do not present intrinsic resistance to hydrolysis and that the reaction reaches an equilibrium even when sites of hydrolysis are still available; (4) polymers with different fine structure (ratio mannose:galactose 1:1 to 150:1) were hydrolysed at different rates by the endo-&beta;-mannanase, showing that galactose branching interferes on the enzyme action. Considering that, the branching pattern of the polysaccharide seems to have direct influence on the interaction of the enzyme with substrate; we suggest that the structure of the galactomannan holds part of information required for its own degradation. The higher enzyme x substrate affinity, ensure the galactose branches digestion, improving the endo-&beta;-mannanase action, ensuring the degradation of the polysaccharides to oligosaccharides. This highly regulated degradation process prevents microorganisms predation and increases the plantlet establishement

A estrongiloidíase é uma infecção intestinal causada pelo nematódeo Strongyloides stercoralis. A maioria dos casos evolui para um quadro crônico benigno; entretanto pode haver hiperinfecção e disseminação, sobretudo em pacientes imunodeprimidos. Os métodos parasitológicos convencionais apresentam baixa sensibilidade e, com isso, os testes sorológicos podem representar uma boa alternativa para o diagnóstico dessa helmintíase. O presente trabalho tem como objetivo avaliar as técnicas de RIFI, ELISA e WB para o diagnóstico da estrongiloidíase em pacientes candidatos a transplante. Para validação dos testes, foram utilizadas amostras de soros de pacientes imunocompetentes (positivos para S. stercoralis, positivos para outras parasitoses e negativos). Foram utilizadas amostras de fezes e soros de pacientes candidatos a transplante, a saber: 50 para transplante renal; 50 para transplante de fígado; 50 para transplante de medula óssea. As amostras fecais de todos os pacientes foram analisadas pelas técnicas de sedimentação espontânea, Rugai, e cultura em placa de ágar. Para a execução das técnicas sorológicas foram utilizadas como fonte de antígeno larvas filarioides de S. venezuelensis. Para a RIFI, os soros foram diluídos a 1:40 em tampão PBS-TM e o conjugado anti-IgG humano marcado com fluoresceína diluído 1:500 em PBS acrescido de 4% de azul de Evans, sendo realizada a leitura em microscópio de imunofluorescência, utilizando as objetivas de 20X e 40X. Para a técnica ELISA foram utilizadas placas poliestireno sensibilizadas com 10?g de antígeno (frações solúveis salina e alcalina), soro dos indivíduos diluídos a 1:200 em PBS 0,05% Tween 3% de leite (PBS-TM) e conjugado (anti-IgG humana peroxidase) em PBS-TM. As amostras foram consideradas positivas quando o índice ELISA foi maior que 1. Para a técnica de WB, os soros foram diluídos 1:100 em Tris-HCl 5% de leite (TM) e o conjugado (anti IgG-humana peroxidase) em PBS-TM. Dos 150 pacientes candidatos a transplante analisados, 9,3% (n=14) foram positivos pelas técnicas parasitológicas, sendo que a cultura em placa de ágar detectou 6,6% (n=10). Na RIFI a soropositividade para detecção da infecção por S. stercoralis foi de 16,6% (n=25), sendo, 22% transplante renal, 18% hepático e 10% medula óssea. Pela técnica ELISA a soropositividade foi de 11,3% (n=17), sendo 14% nos pacientes candidatos a transplante renal, 14% hepático e 3% medula óssea, utilizando o antígeno alcalino, e 24,6% (n=37), sendo 18% nos pacientes candidatos a transplante renal, 50% hepático e 6% medula óssea, utilizando o antígeno salino. Pela técnica WB a soropositividade foi de 20,6% (n=31), sendo 18% nos pacientes candidatos a transplante renal, 32% hepático e 12% medula óssea, utilizando o antígeno alcalino, e 18,6% (n=28) sendo 10% nos pacientes candidatos a transplante renal, 14% hepático e 32% medula óssea, utilizando o antígeno salino. A utilização de técnicas imunodiagnósticas pode ser indicada na triagem de pacientes em fila de transplante, devendo-se levar em conta as limitações de reações sorológicas em pacientes imunodeprimidos / Strongyloidiasis is an intestinal infection caused by the nematode Strongyloides stercoralis. Most cases progress to a benign chronic condition; however hyperinfection and dissemination may occur, especially in immunocompromised patients. Conventional parasitological methods have low sensitivity and, thus, serological tests may be a good alternative for the diagnosis of this helminthiasis. The aim of this study was to evaluate RIFI, ELISA and WB techniques for the diagnosis of strongyloidiasis in patients candidates for transplants. In order to validate the tests samples of sera from immunocompetent patients (positive for S. stercoralis, positive for other parasitosis, and negatives) were used. Feces and sera samples of patients candidates for transplants were used as follows: 50 for renal transplant, 50 for liver transplant, 50 for bone marrow transplant. Fecal samples of all patients were analyzed by spontaneous sedimentation, Rugai and Agar plate culture techniques. Filarioid larvae of S. venezuelensis were used as source of antigen for serological tests. For RIFI, sera were diluted 1:40 in PBS-TM buffer and human anti-IgG conjugate labeled with fluorescein was diluted 1:500 in PBS with 4% Blue Evans, reading being performed in immunofluorescence microscope using 20X and 40X objectives. For ELISA technique polystyrene plates sensitized with 10?g of antigen (saline and alkaline soluble fractions), individual sera diluted at 1:200 in PBS 0.05% Tween 3% of milk (PBS-TM) and conjugate (human anti-IgG peroxidase) in PBS-TM were used. Samples were considered positive when ELISA index was higher than 1. For WB technique, sera were diluted in Tris-HCl 5% of milk (TM) and conjugate (human anti-IgG peroxidase) in PBS-TM. From 150 patients candidates for transplants analyzed 9.3% (n=14) were positive by parasitological techniques, agar plate culture detected 6.6% (n=10). In RIFI seropositivity for S. stercoralis infection detection was 16.6% (n=25) being 22% renal transplant, 18% hepatic and 10% for bone marrow. By ELISA technique seropositivity was 11.3% (n=17), being 14% in patients candidates for renal transplant, 14% hepatic and 3% bone marrow, using alkaline antigen and 24.6% (n=37), being 18% in patients candidates for renal transplant, 50% hepatic and 6% bone marrow, using saline antigen. By WB technique seropositivity was 20.6% (n=31), being 18% in patients candidates for renal transplant, 32% hepatic and 12% bone marrow, using alkaline antigen, and 18.6% (n=28) being 10% in patients candidates for renal transplant, 14% hepatic and 32% bone marrow, using saline antigen. Application of immunodiagnostic techniques could be indicated in screening of patients in transplant waiting list, however limitations of serological reactions in immunodepressed patients should be considered

A mandioquinha-salsa (Arracacia xanthorrhiza Bancroft.) possui um período de conservação pós-colheita de cerca de uma semana, que contrasta com o seu ciclo de cultivo, em torno de 10 meses. Os mecanismos de deterioração das raízes ainda não são conhecidos e tampouco foram estudadas as principais vias enzimáticas de degradação do amido, sua principal reserva energética. O objetivo deste trabalho foi de identificar e caracterizar bioquimicamente o extrato enzimático dessas raízes, que possuem atividade amilolítica. Os resultados mostraram que as enzimas apresentam pH e temperatura ótimos de atividade enzimática em torno de 6,2 e 46&#176;C, respectivamente, confirmados por Análise de Superfície de Resposta. Foram detectadas três bandas com atividade amilolítica em gel de poliacrilamida. Os valores de Ea, Km e Vmáx aparentes encontrados para o extrato enzimático foram de 7,53 kcal/mol, 0,41 mg/mol e 1,11 mg/mL/min, respectivamente. A hidrólise do amido aumenta 95% na presença de Ca+2 e a enzima mantém apenas cerca de 47% da sua atividade original na presença de EDTA. Os resultados mostraram a presença de duas possíveis isoformas de &#945;-amilase e uma &#946;-amilase no extrato enzimático in vitro, podendo estar ativas na raiz íntegra. Um ensaio de acompanhamento da atividade amilásica das raízes durante o armazenamento por 9 dias mostrou um aumento na atividade de água acompanhado de perda de textura e de oscilação na atividade hidrolítica. No entanto, tais alterações devem ocorrer também devido a ação de enzimas exógenas de mofos, que participam do processo de deterioração da mandioquinha-salsa. / Roots of Peruvian carrot (Arracacia xanthorrhiza Brancroft) have a post-harvest conservation time of approximately one-week, a very short period related to its long cultivation cycle, around 10-11 months. The mechanisms of post-harvest deterioration of the roots are unknown as well as the main enzymatic pathways such as the starch degradation, have not been studied. The purpose of this investigation was to identify and characterize the amylolitic activity of this root. The results showed that the optimum enzymatic conditions for the maximum activity are 46&#176;C and pH 6.2 confirmed by Surface Ternary Plots. Three bands with amylolitic activity were detected in native PAGE. The kinetic values were Ea 7.53 kcal/mol, Km 0.41 mg/mol and Vmáx 1.11 mg/mL/min. The starch hydrolysis speed increases almost twice when Ca+2 is present and remained only 20% on the presence of EDT A. The results showed two possible isoforms of &#945;-amylase and one &#946;-amylase in the crude extract. An essay following the amylolitic activity during a 9-day storage period showed an increase of water activity associated to a loose of texture and a oscillating starch hydrolytic activity, although these behavior may have the contribution of exogenous enzymes from molds on the deteriorative process of the Peruvian carrots.

Esta tese apresenta o desenvolvimento de metodologias analíticas em sistemas de solução em fluxo com detecção amperométrica e espectrofotométrica explorando a utilização de tecidos vegetais como fonte enzimática para a biocatálise de reações. Desempenhos satisfatórios foram obtidos com a utilização do mesocarpo fibroso do coco (Cocus nucifera, L.) e com a casca e/ou polpa de frutos da palmeira leque (Latania sp), fontes de polifenol oxidase. Uma metodologia, simples e rápida, para a determinação dos parâmetros bioquímicos da polifenol oxidase foi desenvolvida ao longo do presente trabalho com a enzima naturalmente imobilizada no tecido do coco, pela eliminação das etapas de extração e de purificação e associando-se análise em fluxo e espectrofotometria. Parâmetros cinéticos importantes como o efeito do pH, a constante de Michaelis-Menten (Km), a velocidade máxima (Vmax),a energia de ativação (Ea) e os parâmetros térmicos (valores D, z e Q10)foram determinados utilizando como substrato o catecol. A atividade relativa junto a diferentes substratos e o efeito de inibidores foram também avaliados. Aplicações envolvendo estes tecidos vegetais em reatores empacotados (associados com FIA) ou incorporados em eletrodos de pasta de carbono (medidas realizadas em batelada) para a determinação de produtos fenólicos como catecol, fenol e dopamina, inibidores da atividade enzimática como o sulfito, bem como para a quantificação do conteúdo de água, demonstram a sua versatilidade. Os produtos fenólicos foram quantificados com boa sensibilidade (na faixa de &#181;mol L-1) pela redução amperométrica das respectivas quinonas, produzidas pela oxidação enzimática. Aplicações com amostras reais, dentre as quais água de rio e resíduos de uma fábrica de papel puderam ser implementadas. A determinação do conteúdo de água em meio aquo-restrito explorou a estimulação, pela água, da atividade catalitica da polifenoI oxidase naturalmente imobilizada no mesocarpo fibroso do coco na presença de catecol. Esta propriedade foi utilizada para a determinação rápida e reprodutível do conteúdo de água em amostras comerciais de álcool, utilizando acetonitrila como carregador. A quantificação de sulfito baseou-se no seu efeito inibidor sobre a polifenol oxidase naturalmente imobilizada em relação à catálise oxidativa do catecol. Diversos interferentes comumente presentes em amostras de vinho foram também investigados. Durante este trabalho, foi desenvolvida uma simples e interessante maneira de conservar o mesocarpo fibroso do coco como fonte de polifenol oxidase naturalmente imobilizada. O tecido desta fruta foi desidratado e moído. O pó deste tecido, estocado a mais de dois anos à temperatura ambiente, ainda apresenta boa atividade enzimática. / The development of analytical methodologies exploring plant tissues as enzymatic source for biocatalysis of many reactions is presented in this thesis. Amperometry and spectrophotometry was associated with flow analysis for analytical purposes and for biochemical characterization of naturally immobilized polyphenol oxidase. Good performance was achieved with tissues from the fruits of two palm trees: the fibrous mesocarp of green coconut fruits, Cocus nucifera, L., and the skin and the pulp of green fruits from Latania sp. Both tissues are very effective in the biotransformation of o-diphenols to the corresponding o-quinones. A simple, fast, and new methodology for the determination of the biochemical parameters of the poyphenol oxidase naturally immobilized on the fibrous tissue was developed (eliminating the extraction and purification of enzymes) by association of flow injection analysis and spectrophotometry. For coconut tissue, cinetic parameters like pH effect, Michaelis-Menten constant (Km) and maximum rate (Vmax), activation energy (Ea) and thermal parameters (D, z and Q10values) on catechol biotransformation were determined. Also the response for several substrates as too for various inhibitors was explored. Amperometric quantification of phenolic compounds was made using the vegetal tissue in form of packed reactors (associated with FIA) or incorporated in carbon paste electrodes (measurements in batch). Very good response for catechol, phenol and dopamine was registered for this compounds, with very high sensitivity (&#181;mol L-1 range). Applicability to real samples as for river water and for a paper plant waste water was verified. The same amperometry-FIA system was employed for enzymology in non-aqueous medium. The activity of the polyphenol oxidase contained in coconut tissues are strongly dependent of water. The strategy involves the stimulation by the content of water on the biocatalytic activity of the enzyme in the presence of catechol substrate. This strategy was used for the determination of water content in alcohol samples, in medium of dry acetonitrile. The inhibition of the enzymatic activity produced by many compounds can be explored for an indirect quantification of the inhibitor. A flow injection amperometric procedure was developed for the determination of sulphite ion based in its inhibitory effect on the activity of polyphenol oxidase on the oxidation of catechol. The effect on the bioreactor performance of potential interferents commonly present in wine samples were also investigated. During this work, it was developed a simple and interesting way to preserve coconut tissue. The mesocarp of this fruit can be dried and grounded. These tissues still with very good activity after more than two years in \"shelf temperature\".

Frutose e Ácido Glicônico são produtos importados empregados em diferentes setores nas áreas química, farmacêutica e alimentícia, representando um mercado de dois milhões de dólares (US$ 2,0 milhões) por ano. Por sua vez, a sacarose pode ser empregada como matéria-prima para a obtenção destes produtos através de conversão enzimátiva empregando invertase e glicose-oxidase. O uso de biorreatores com membrana (MBR) mostra-se interessante em processos enzimáticos, pois, ao serem empregados em processos contínuos permitem, simultaneamente, produção e separação dos produtos, reduzindo a formação de subprodutos e, eventual, inibição da enzima por excesso de substrato ou produtos. A sacarose é convertida em xarope de açúcar invertido (solução equimolar de frutose e glicose) pela invertase (Bioinvert&#174;, enzima comercial), seguido pela oxidação da glicose em ácido glicônico pela ação da glicose oxidase (GO). O processo de conversão multi-enzimático da sacarose foi obtido através da alimentação de sacarose (50 mM) em reator com membrana (MBR) contendo invertase (24 U/mL), glicose-oxidase (0,5 U/mL) e catalase (470 U/mL) e operando com vazão específica de 6,0 h-1, 35&#186;C e pH 5,5. As condições operacionais otimizadas possibilitaram a conversão completa da sacarose (X = 100 %) e da glicose resultante (Y = 100%) com velocidades específicas de reação de 4,2 mmol/U.h, 0,60 mmol/U.h e 0,00062 mmol/U.h, respectivamente, para a invertase, glicose oxidase e catalase. A respeito da oxidação da glicose, a adição de catalase no meio reacional se fez necessária para minimizar os efeitos inibitórios sobre a GO através do peróxido de hidrogênio formado. / The fructose and gluconic acid are products of great application in chemical, pharmaceutical and food industry. The actual Brazilian market for these compounds is about US$ 2 millions, here as the sucrose, the raw-material used for their production, represents about 2.4% of the Brazil\'s GNP. This conversion increases the value added to the sugarcane, usually marketed as a commodity, because the fructose and gluconic acid are more valuable products than sucrose. The use of membrane bioreactor (MBR), which operates under mild conditions regarding internal pressure, temperature and pH, has been growing along the years for enzyme catalyzed processes. Moreover, in the MBR the reaction and separation of the products occur simultaneously, avoiding the formation of by-products and the eventual inhibition of the enzyme caused by excess of substrate or products. The sucrose is converted to the inverted syrup (an equimolar solution of fructose and glucose) by invertase (in this work was employed Bioinvert&#174;, a commercial invertase) followed by the oxidation of glucose in gluconic acid by the glucose oxidase (GO). The multi-enzymatic conversion of sucrose was attained when carried out under initial substrate of 50mM and invertase, glucose oxidase and catalase concentrations, respectively, of 24.0 U/mL, 0.5 U/mL and 470 U/mL in a membrane reactor utilizing a dilution rate of 6.0 h-1, 35&#186;C and pH 5.5. The optimized operational conditions led to a conversion yield of 100% for sucrose hydrolysis and glucose oxidation steps resulting in enzyme productivity of 4.2 mmol/U.h, 0.60 mmol/U.h and 0.00062 mmol/U.h, respectively, to invertase, glucose oxidase and catalase. In regard to the glucose oxidation, the addition of catalase in the reaction medium was necessary, in order to minimize the inhibition of the GO by the hydrogen peroxide formed.

As L-asparaginases bacterianas (L-asparaginase amidohidrolase, E.C.3.S.1.1) são enzimas de alto valor terapêutico devido ao seu uso no tratamento de leucemia linfocítica aguda. A L-asparaginase da Escherichia coli por ser uma enzima periplásmica com alta afinidade, é particularmente efetiva em certas terapias de câncer infantil. Muitos agentes terapêuticos recentes são proteínas e peptídeos que surgiram do design molecular de drogas e tecnologia de DNA recombinante. Numerosos estudos têm demonstrado que aditivos preservam a estrutura e a atividade biológica de cada molécula destas proteínas. Entretanto, o mecanismo de proteção, pelo qual estes aditivos funcionam, não tem sido totalmente elucidado. O objetivo do presente trabalho é investigar detalhadamente o efeito da liofilização sobre a estrutura e a atividade enzimática da L-asparaginase, tanto em células íntegras de Escherichia coli, como na enzima purificada. Até recentemente a maneira para se avaliar o comportamento de um aditivo e o comportamento da água na estabilização de uma proteína durante a liofilização consistia na medida dos parâmetros de atividade após a reidratação, porém atualmente modernas técnicas de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de baixa resolução são utilizadas para se entender o comportamento da água nas interações com proteínas. E a Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier apresenta grande potencial no estudo de estabilização de proteínas durante a liofilização. Utilizou-se o cálculo de porcentagem de retenção de atividade para expressar os valores de atividade enzimática estudados. Estes cálculos foram realizados para os sistemas congelados e para os sistemas congelados e liofilizados. Os sistemas foram tratados em velocidades de congelamento diferentes (20°C/min, SOC/min e 2°C/min), sendo em seguida liofilizados por 24 horas. São apresentados resultados sobre o efeito das diferentes velocidades de congelamento e o efeito da liofilização nos diferentes sistemas aditivo-enzima e aditivo-célula. Utilizaram-se os aditivos: sacarose, maltose, lactose, inositol, manitol e trealose testados em diferentes concentrações (30, 90 e 150mM). Para identificar quais as condições e os aditivos que apresentaram uma crioproteção satisfatória. Nos sistemas maltose-enzima e trealose-enzima observou-se um aumento da crioproteção com o aumento da concentração de aditivo. Para os sistemas maltose-enzima, congelados lentamente, os resultados de retenção de atividade foram: 8,67%, 14,02% e 30,80% respectivamente para 30, 90 e 150mM. O sistema enzima-maltose (150mM) congelado rapidamente e liofilizado apresentou a maior retenção de atividade (111,11 %) e também o maior valor de T2 (81&#181;s) nos resultados referentes a RMN. Nos sistemas trealose-enzima nas concentrações de 90 e 150mM apresentaram retenção de atividade 89,93% e 79,74%, respectivamente. / Bacterial L-asparaginase (L-asparaginase amidohydrolase, E.C. 3.5.1.1) are enzymes of high therapeutic value due to their use in the treatment of lymphocytic acute leukemia. Escherichia coli L-asparaginase is a periplasmic enzyme of high affinity, particularly effective in some kinds of childhood cancer therapies. Several studies have showed that there are specific stabilizing additives preserve the structure and the biological activity of protein molecules (lyoprotectant). However, the protection mechanism for these excipients has not been totally elucidated yet. The aim of this work was investigate the effect of freeze-drying on the enzymatic activity of L-asparaginase using both the purified enzyme as well as intact cells of Escherichia coli. Until recently the way to evaluate the behavior of an addictive one and the behavior of the water in the stabilization of a protein during the freeze-drying consisted of the measure of the activity parameters after the reidratação, even so now modem techniques of the Nuclear Magnetic Resonance of low resolution have been used to understand the behavior of the water in the interactions with proteins. It is Infrared Spectroscopy for Fourier Transformed it presents a great potential in the study of stabilization of proteins during the freeze-drying. The calculation of percentage of activity retention was used to express the studied values of enzymatic activity. These calculations were accomplished for the frozen systems and for the frozen systems and freeze-dryied. The systems were treated in three speeds of different freezing (20°C/min, 5°C/min and 2°C/min), being the freeze-drying for 24 hours. Results are presented on the effect of the freeze-drying in the different systems addictive-enzyme and addictive-cell. The addictive ones were used: sucrose, maltose, lactose, inositol, manitol and trehalose tested in different concentrations (30, 90 and 150mM), to identify which the conditions and the addictive ones that presented a satisfactory cryoprotection. For the systems enzyme-maltose, frozen slowly, the results of activity retention were: 8,67%, 14,02% e 30,80% to 30,90 e 150mM,respectively . The system enzyme-maltose (150mM) frozen quickly and freeze-dryied presented the largest activity retention (111,11 %) and also the largest value of T2 (81 &#181;s) in the referring results NMR. The systems enzyme-trealose in the concentrations of 90 and 150mM they presented retention of activity 89,93% and 79,74%, respectively.