A aloimunização contra antígenos eritrocitários decorre normalmente de gestações ou transfusões prévias e torna-se um problema mais frequente entre pacientes submetidos à transfusão, até mesmo entre pacientes transfundidos de forma esporádica, como nos casos de pacientes com câncer de mama. A detecção de anticorpos irregulares deve ser realizada com técnica sensível, capaz de detectar os anticorpos de maior relevância clínica. A falha na detecção de um aloanticorpo pode levar a reação transfusional hemolítica aguda ou tardia de intensidade variável que podem agravar ainda mais a condição clínica do receptor. Atualmente no Hospital do Câncer III, a detecção de anticorpo irregular é realizada na técnica em gel-teste na fase de antiglobulina humana. O presente trabalho teve como objetivos avaliar o impacto da implantação da técnica enzimática na pesquisa de anticorpos irregulares (P.A.I) na rotina pré-transfusional em associação à técnica utilizada na rotina, e estudar o perfil de aloimunização em portadores do câncer de mama atendidos nesse serviço. Entre junho de 2015 e maio de 2016, 429 amostras de sangue de pacientes com câncer de mama coletadas para testes pré-transfusionais foram submetidas à P.A.I pelas metodologias em Liss\\AGH e Nacl\\Enzima. Quando a P.A.I resultava positiva, a identificação do anticorpo era realizada utilizando a técnica correspondente. A frequência de aloimunização encontrada pela técnica de Liss/AGH foi de 1,86% (8/429), enquanto a técnica enzimática revelou uma taxa de aloimunização de 7,6% (32/421) e com associação dos resultados de ambas técnicas obtivemos 9,32% (40/429). . Assim como na literatura, os anticorpos dos sistemas Rh foram os mais frequentes. A rotina institucional apresentou o Anti-D como predominante em 5 amostras (41,6%), seguido por 2 Anti-E (16,6%), 2 Anti-C (16,6%), 1 Anti-Lea (8,4%) , 1 Anti-Jka (8,4%) e 1 Anti-S (8,40). Enquanto que em enzima, o Anti-E foi o mais predominante em 13 amostras (35%), seguido por 9 (24%) autoanticorpos públicos quentes, 7 Anti-Lea (19%), 4 Anti-D (11%), 1 Anti-C (2,75%), 1 Anti-Cw (2,75%), 1 Anti-K (2,75%) e 1 Anti- Dia (2,75%). Para comparar proporções do perfil de aloimunização desses pacientes, foram utilizados os testes Qui-quadrado e Teste G, com valores de p<0,10 considerados significantes. Foram observadas diferenças significantes entre aloimunizados e não aloimunizados quanto à cor da pele, classificação RhD, histórico transfusional e tempo de incidência de aloanticorpo. Observamos que a aloimunização não está correlacionada ao número de transfusões de concentrados de hemácias na Instituição e sim pelo histórico transfusional. Antecedentes transfusionais foram identificados em 27,5% dos aloimunizados e 14% dos não aloimunizados (p) = 0.0398. O predomínio de RhD 7 positivo foi verificado tanto nos aloimunizados quanto nos grupos dos não aloimunizados com percentuais de 75% e 90%, respectivamente (p) = 0.0147. De acordo com a estimativa do tempo para geração de aloanticorpos, todas as aloimunizadas (100%) apresentaram resultado considerado longo, sendo superior a 72 horas. Dentre as não aloimunizadas o mesmo tempo apresentouse em 41 (82%) das pacientes (p) = 0.0583, demonstrando que a técnica enzimática pode ser utilizada com o intuito de se detectar aloanticorpos em reduzido intervalo de tempo pós-exposição a antígenos eritrocitários. Diante desses fatos, propomos a aplicação da fenotipagem eritrocitária para os antígenos dos sistemas Kell e Rh, para os indivíduos portadores do câncer de mama. Também propomos a ampliação deste projeto na rotina pré- transfusional sobre os demais grupos de pacientes oncológicos tratados pelo INCA. Tal medida certamente contribuirá para reduzir o risco de transfusões fenótipo imcompatíveis que poderiam acarretar reações transfusionais hemolíticas ou transfusões ineficazes. / The alloimmunization from erythrocyte antigens usually happens from previous pregnancies or transfusions and becomes a frequent problem among patients undergoing transfusion, even among those transfused sporadically, as in the cases of patients with breast cancer. The detection of irregular antibodies should be performed with sensitive technique capable of detecting the most clinically relevant antibodies. The failure of detecting an alloantibody can provoke acute or delayed hemolytic transfusion reaction of varying intensity that can further worsen the clinical condition of the recipient. Currently in the Cancer Hospital III, irregular antibody detection is performed in the gel-test technique at the stage of human antiglobulin. This study aimed to evaluate the impact of enzymatic technique implementation in irregular antibody screening (PAI) in the pre-transfusion routine in association with the technique used in routine, and study the alloimmunization profile in patients with breast cancer treated in this service. Between June 2015 and May 2016 XXX blood samples (serum? Plasma?) Of patients with breast cancer collected for pre-transfusion tests were submitted to the P.A.I methodologies Liss \\ AGH and NaCl \\ enzyme. When P.A.I resulted positive, identification of the antibody was carried out using the corresponding technique. The frequency of alloimmunization found by the technique Liss / AGH was 1.86% (8/429), whereas the enzymatic technique revealed an alloimmunization rate of 7.6% (32/421) and association of the results of both techniques was 9.32% (40/429). As found in literature, the antibodies of the Rh systems were the most frequent. The institutional routine presented anti-D as prevalent in 5 samples (41.6%), followed by anti-E 2 (16.6%) 2 Anti-C (16.6%) 1 Anti-Lea (8, 4%), anti-Jka 1 (8.4%) and anti-S 1 (8.40). While in enzyme technique, Anti-E was the most predominant in 13 samples (35%), followed by 9 (24%) hot public autoantibodies 7 Anti-Lea (19%) 4 Anti-D (11%), 1 Anti-C (2.75%), Anti-Cw 1 (2.75%) 1 Anti-K (2.75%) and Anti Day 1 (2.75%). To compare alloimmunization profile proportions of these patients, the Chi-square test and test G were used, with p <0.10 considered significant. Significant differences were observed between alloimmunized and not alloimmunized as ethnicity, RhD classification, transfusional historic and time of incidence of alloantibodies. We note that alloimmunization is not correlated to the number of red cell concentrate transfusions in the institution but by transfusional historic. Past transfusions have been identified in 27.5% of alloimmunized and 14% of non-alloimmunized (p) = 0.0398 patients. The prevalence of RhD positive was observed in both groups alloimmunized and non-alloimmunized with 75% and 90%, respectively (p) = 0.0147. According to the estimated time for the generation of alloantibodies, all isoimmunized (100%) had 9 results considered long, and more than 72 hours. Among the non-alloimmunized, 41 (82%) patients (p) = 0.0583 presented the same time, indicating that the enzymatic technique can be used in order to detect alloantibodies in a reduced post-exposure interval to erythrocyte antigens. Given these facts, we propose the application of phenotyping erythrocyte to the antigens of the Kell and Rh systems, for all individuals of breast cancer. We also propose the extension of this project in the pre-transfusion routine on other groups of cancer patients treated by INCA. This measure will certainly help to reduce the risk of transfusion incompatible phenotype that could cause hemolytic transfusion reactions or ineffective transfusions.

Sabe-se que as águas residuárias, contendo elevadas concentrações de lipídios, causam problemas às unidades convencionais de tratamento podendo gerar lodo altamente biodegradável e sistemas com baixos rendimentos na remoção da matéria orgânica. Com o intuito de estudar a possibilidade de se obter eficiências maiores de remoção de matéria orgânica no tratamento de águas residuárias com elevados teores de lipídios, empregou-se na presente pesquisa processo alternativo de tratamento denominado de sistema combinado, composto de um reator enzimático (R1) e de um reator de lodos ativados (R2). Visando realizar a pré-hidrólise dos lipídios afluentes, o reator enzimático, contendo a enzima lipase LIPOLASE 100T, imobilizada em suporte de polietileno, foi instalado antecedendo o reator de lodos ativados. Paralelamente, foi construída outra unidade de lodos ativados (Rc) similar a primeira, porém sem o reator enzimático acoplado, denominada sistema de controle, visando possibilitar a comparação dos resultados obtidos. A unidade experimental foi operada durante 94 dias, em regime contínuo com a temperatura em torno de 30ºC. Os reatores de lodos ativados, R2 e Rc, foram operados, cada, com TDH de 8 horas e vazão de 3,4 L/dia. As eficiências médias de remoção de DQO bruta obtidas foram respectivamente de 85% e 79% para os sistemas combinado e de controle. A eficiência média de remoção de óleos e graxas do sistema combinado foi de 91%, enquanto que para o sistema de controle a eficiência média foi de 84%. Assim, os resultados obtidos no presente trabalho, demonstraram que as vantagens obtidas com o emprego do sistema combinado proposto, sob as condições específicas da presente pesquisa, foram significativas. / The wastewaters containing high concentrations of lipids, cause problems to the conventional units of treatment being able to produce highly biodegradable sludge and systems with low organic matter removal. In order to study the possibility of obtaining high efficiencies of organic matter removal in the treatment of wastewater with high contents of lipids, it was used in the present research an alternative procedure of treatment named combined system, composed of an enzymatic reactor (R1) and an activated sludge reactor (R2). In order to achieve the pre-hydrolysis of the affluent lipids, the enzymatic reactor, containing the lipase enzyme LIPOLASE 100T immobilized in polyethylene support, was installed preceding the activated sludge. Parallely, it was built another unit of activated sludge (Rc) similar to the first, but without the enzymatic reactor coupled, named control system, in order to enable the comparisons of the results obtained. The experimental unit was operated during 94 d, in continuous operation, with the temperature around 30°C. The activated sludge reactors, R2 and Rc, were operated, respectively, with hydraulic time residence of 8 h and flow rate of 3,4 L/d. The average efficiencies of removal raw COD obtained were respectively, of 85% and 79% for the combined and control systems. The average efficiency of removal of oil and greases of the combined system was of 91%, while for the control system the average efficiency was of 84%. So, the results obtained in this present work, showed that the advantages obtained with the use of the proposed system, under the specific conditions of the present research, were significant.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-07-17T12:08:22Z No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 395672 bytes, checksum: 55b0954315e1bf5255745d2287b38934 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-17T12:08:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 395672 bytes, checksum: 55b0954315e1bf5255745d2287b38934 (MD5) Previous issue date: 2001-10-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A tecnologia de produção da Mussarela semi-fundida, adaptada da metodologia de fabricação do queijo “Doble Crema”, foi usada com o principal objetivo de produzir um queijo que atingisse características semelhantes à Mussarela tradicional. Foram realizados dois tratamentos, um tradicional (T1) – fermentação na massa e um modificado (T2) – fermentação no leite, com cinco repetições para cada tratamento, sendo os queijos embalados e armazenados em câmara fria a 10 0 C, para posterior análise. Utilizou-se cultura lática mesofílica tipo “O” para os dois tratamentos. No tratamento modificado, cerca de 20% do total do leite pasteurizado foi fermentado até atingir acidez titulável de 0,75% (expressa em ácido lático). Este leite foi padronizado com leite fresco pasteurizado, para uma acidez de 0,26%, antes de se iniciar o processamento. Os queijos foram avaliados após 5, 15, 25 e 35 dias de fabricação, para determinação de acidez, pH, nitrogênio solúvel a pH 4,6 e nitrogênio solúvel em TCA 12%, propriedades funcionais de “oiling-off”, derretimento por diâmetro, elasticidade e escurecimento não-enzimático, análise sensorial e análise microbiológica de Coliformes totais. A nova tecnologia diferiu do processamento tradicional em alguns pontos importantes do processamento como: temperaturas mais elevadas durante a fase de mexedura e filagem. A filagem foi realizada em tacho de vapor indireto e a salga foi feita diretamente na massa, logo após a dessoragem. Observou-se que a Mussarela semi-fundida apresentou composição físico- química semelhante à Mussarela tradicional, com exceção do teor de sal e proteína total que foram mais elevados. Houve um ligeiro decréscimo da % de ácido lático em função dos dias analisados para os dois tratamentos. No entanto, não houve variação do pH em nenhum dos tratamentos aplicados durante os dias de estabilização. O índice de maturação aumentou com o decorrer do tempo, para os dois tratamentos, porém, com menos expressão para o tratamento modificado. A profundidade de proteólise também aumentou durante o período de estabilização e não indicou diferença (P > 0,05) entre os dois tratamentos. Dentre as propriedades funcionais analisadas, não houve diferença (P > 0,05) entre os dois tratamentos para “oiling-off” e derretimento por diâmetro. A elasticidade da massa dos queijos atingiu as determinações impostas pelo teste, porém, a Mussarela semi-fundida apresentou estiramento mais frágil, com fios se rompendo mais facilmente que a Mussarela tradicional. O índice L* demonstrou não haver diferença (P > 0,05) entre as médias dos dois tratamentos. A análise sensorial indicou não haver diferença (P > 0,05) entre os dois tratamentos, a partir do 15 0 dia de estabilização. A ausência de Coliformes totais após 35 de fabricação indicou que a Mussarela semi-fundida possui ótima capacidade de conservação. / The technology of production of semi-melted Mozzarella, adapted from methodology of “Doble Crema” cheese production, was used with the main objective to produce a cheese similar to traditional Mozzarella cheese. Two treatments were accomplished, a traditional (T1) - fermentation in the mass and a modified (T2) - fermentation in the milk, with five repetitions for each treatment. Cheeses were wrapped and stored at 10 0 C in cold room for subsequent analysis. Type “O” mesofilic lactic culture was used in both treatments. In the modified treatment, about 20% of the pasteurized milk was fermented until titratable acidity of 0,75% (expressed as lactic acid) was achieved. The acidity of cheese milk was standardized to 0,26% with pasteurized fresh beginning of the process. Cheeses were evaluated for milk, before the titratable acidity, pH measurements, pH 4,6 soluble nitrogen and TCA 12% soluble nitrogen at 5, 15, 25 and 35 days of production. Cheeses were also evaluated for functional properties such as “oiling-off”, melting and elasticity properties, non-enzymatic browning and microbiological analysis (coliforms). A sensory panel was used to evaluated the product acceptance by consumers. Semi-melted Mozzarella cheese required traditional higher temperature manufacture. The chemical characteristics very during mixing semi-melted similar and stretching Mozzarella as compared presented to physical- to traditional Mozzarella, except for salt and protein content, which were greater in the former. There was a decrease in the lactic acid content along with the storage period for both treatments. However, pH measurements remained the same for both treatments during the days of stabilization. The maturation index increased with elapsing of time for both treatments, however with less expression for the modified treatment. The proteolysis depth also increased during the period of stabilization and presented no difference (P> 0,05) between treatments. Among the functional properties, no difference (P> 0,05) was found between treatments for “oiling-off” and melting properties. Cheese elasticity reached the determinations imposed by the test, however semi-melted Mozzarella presented more fragile stretching, with threads breaking up more easily than traditional Mozzarella. The index L* presented no difference (P> 0,05) between the averages of the two treatments. Sensory analysis indicated no difference (P> 0,05) between the two treatments, after 15 days of stabilization. Absence of coliforms after 35 days of productions indicated that semi-melted Mozzarella presented better conservation capacity. / Dissertação importada do Alexandria

Resíduos celulósicos por erem ricos em celulose e hemicelulose estão sendo apontados como promissoras fontes para a produção de etanol. Com isso, este trabalho tem como objetivo hidrolisar e fermentar resíduos celulósicos visando a produção de etanol. Para estudo da hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar, foram isolados 22 fungos da cidade de Araras-SP e estes testados para produção de endoglucanases (EG). Foram testadas temperatura e pH ótimos, diferentes tampões, estabilidade do coquetel e influência de sais, EDTA e ?-mercaptoetanol para lacase, xilanase, endo-?-1,4-glucanase, celobiohidrolase I, ?-glucosidase e glucoamilase. As condições padronizadas para aplicação do coquetel enzimático foi 55ºC, tampão citrato de sódio 50 mM e pH 5,0. Para elaboração do coquetel enzimático foi realizado um Plackett-Burman seguido de um delineamento composto central rotacional, em que as condições padronizadas para aplicação foram (U/g de bagaço de cana-deaçúcar): 0,122 de lacase; 7 de xilanase; 5 de endoglucanase; 14 de celobiohidrolase e 9 de ?-glucosidase. Foram liberados 4,405 µmol de açúcares redutores por mL, após 48 horas de hidrólise do bagaço a 55ºC, em tampão citrato de sódio 50 mM (7 mL), pH 5,0, agitação de 110 rpm. O hidrolisado obtido foi fermentado pelas leveduras Saccharomyces cerevisiae PE-2 e Meyerozyma guilliermondii 311 (CCT7783), separadamente e em cultivo misto, averiguando a necessidade de suplementação do meio, para a produção de etanol. Os resultados mostraram a necessidade de suplementação para aumento da viabilidade das leveduras. Observou-se que a suplementação manteve a viabilidade acima de 90%. A fermentação com Meyerozyma guilliermondii 311 (CCT7783), sem a necessidade de suplementação, possibilitou a produção de 12,66% de etanol; com a Saccharomyces cerevisiae a produção de etanol foi de 7,03%, quando o meio foi suplementado com 3 g/L de extrato de levedura. A fermentação com cultura mista produziu 0,53% e 1,18% de etanol em 24 e 48 horas de cultivo, respectivamente. Para aplicação enzimática na hidrólise do lodo branco foram utilizadas amilase de Aspergillus carbonarius e celulase comercial. Os produtos de hidrólise enzimática do lodo branco detectados HPLC mostraram a formação de glicose, xilose e traços de maltose. A viabilidade celular da levedura Saccharomyces cerevisiae durante a fermentação se manteve bastante elevada, acima de 95 %. A fermentação do lodo branco, quando o meio foi suplementado com 3g/L de extrato de levedura, foi considerada satisfatória, com 2,37 g/L de etanol. Foram realizadas análise de superfície por ion-tof e microscopia eletrônica de varredura nos resíduos celulósicos. Desta maneira, com este trabalho foi possível estudar a importância da aplicação de enzimas fúngicas para degradação de biomassa lignocelulósica para produção de etanol de segunda geração. / As cellulosic wastes are rich in cellulose and hemicellulose they have been pointed as promising sources for ethanol production. Thereby, this work aimed to hydrolyze and ferment cellulosic residues to produce ethanol. In order to study the hydrolyzes of sugar-cane bagasse and ferment the sugars obtained from this process, twenty-two fungi were isolated in the city of Araras-SP and tested for endoglucanase (EG) production. Aiming to optmize an enzyme cocktail, variables as temperature, optimum pH, different buffers, stability, salt influence, EDTA and ?-mercaptoethanol were tested for laccase, xylanase, endo- ?-1,4-glucanase, cellobiohydrolase I, ?-glucosidase and glucoamylase. The standard conditions for applying the enzyme cocktail were 55°C, sodium citrate buffer 50 mM pH 5.0. For the preparation of the enzyme cocktail a Plackett-Burman was made followed by a central composite design, in which the standard conditions for application were (U/g of sugarcane bagasse): 0.122 of laccase; 7 of xylanase; 5 of endoglucanase; 14 of cellobiohydrolase and 9 of ?-glucosidase per gram of sugarcane bagasse. After 48 hours of hydrolyzes in the following conditions, 55ºC, sodium citrate buffer 50 mM (7 mL), pH 7.0, 110 rpm, 4.405 µmol of reducing sugar per mL were released. The hydrolyzate obtained was separately fermented by the yeasts Saccharomyces cerevisiae PE-2, Meyerozyma guilliermondii 311 (CCT7783) and with both yeasts in a mixed cultivation, in order to investigate the need of medium supplementation for ethanol production. The results showed the need of supplementation to increase the viability of the yeasts. It was observed that this procedure kept the viability over 90%. The fermentation with Meyerozyma guilliermondii 311 (CCT7783), without supplementation, allowed the production of 12.66% of ethanol and with Saccharomyces cerevisiae the production was 7.03% with a supplementation of 3 g/L of yeast extract. The fermentation with mixed cultivation produced 0.53% and 1.18% in 24 and 48 hours of cultivation, respectively. Another objective of this work was the hydrolysis of paper sludge which was obtained by using amylases from Aspergillus carbonarius and commercial cellulases. The products of enzymatic hydrolysis of the white sludge detected in HPLC showed the formation of glucose, xylose and maltose traits. Cell viability counting of the yeast, analyzes of pH, reducing sugar and alcohol content were carried out. Cellular viability of Saccharomyces cerevisiae along the fermentation was kept over 95%. Paper sludge fermentation using Saccharomyces cerevisiae, in medium supplemented with yeast extract 3 g/L, was considered satisfactory, showing 2.37 g/L of ethanol. Surface analysis was performed by Ion-tof and scanning electron microscopy in the cellulosic waste. Thus, this work made possible to study the importance of fungal enzymes application in lignocellulosic biomass degradation for the production of second generation ethanol.

Lipídeos contidos em resíduos de laticínios além de representarem uma perda industrial importante, interferem negativamente nos sistemas de tratamento de efluentes inibindo a atividade microbiana do consórcio (Mendes, 2005). O objetivo do presente trabalho foi estudar a degradação anaeróbia de gorduras do leite hidrolisadas com duas enzimas: lipase comercial de Candida rugosa (éster-inespecífica), e preparado enzimático de Geotrichum candidum (lipase éster-específica). Determinaram-se condições ótimas de hidrólise de gorduras do leite no tocante a tempo e temperatura de processo. Após esta etapa, determinou-se a produção metanogênica advinda da estabilização de esterco bovino combinado com gorduras de laticínios hidrolisadas e in natura. As condições ótimas de ação de lipase comercial de C. rugosa em gorduras do leite foram obtidas com temperatura de 40ºC e pH de 6,5. As condições ótimas de ação de preparado enzimático de G. candidum foram obtidas com temperatura de 40ºC e pH de 7,5. Os tempos de processo hidrolítico para a produção máxima de ácidos graxos foram de 8 horas e 16 horas quando se utilizaram preparado enzimático de G. candidum e solução de lipase comercial de C. rugosa respectivamente. As velocidades de processo, bem como os valores de biodegradabilidade anaeróbia, produção metanogênica específica e coeficiente de conversão (Yp/s) indicaram ser muito mais eficiente a utilização lipase de C. rugosa na hidrólise das gorduras do leite, quando o objetivo do processo é a produção de biogás. Além disso, o preparado enzimático de G. candidum ocasionou inibição da atividade metanogênica acetoclástica. Quando se realizou um estudo variando-se a concentração de gordura no tratamento enzimático, obteve-se a maior produção de ácido oléico quando se utilizaram 42 gramas de gordura por grama de enzima. Por outro lado, o melhor fator de conversão entre produto e substrato foi verificado quando a relação entre a massa de gordura e a massa de enzima foi igual a 6g/g. / Lipids in dairy waste as well as representing an important industrial loss, interfere negatively in wastewater treatment systems by inhibiting microbial activity of the consortium. The aim of this work was to study the anaerobic degradation of hydrolyzed milk fats using two enzymes: lipase from Candida rugosa, which is an ester unspecific enzyme; and other specific lipase obtained from Geotrichum candidum. Optimal conditions for hydrolysis of milk fat regarding pH, time and temperature were determined. After that, the methanogenic production from the stabilization of cattle manure combined with fats (hydrolyzed and in nature) was evaluated. The optimum conditions for the action of commercial C. rugosa lipase were obtained at 40ºC and pH 6.5. The optimum conditions for the action of G. candidum preparation were obtained at 40ºC and pH 7.5. Maximum product concentrations were obtained within 8 hours and 16 hours when preparation of G. candidum and C. rugosa lipase were used, respectively. The initial methanogenic production rate, the values of anaerobic biodegradation, the specific methanogenic production and the methane yield as well, showed that the use of C. rugosa lipase in the hydrolysis of fats is more efficient when the goal of the process is the production of biogas. The use of the enzymatic preparation of G. candidum did not cause any benefits, and in addition, caused bigger inhibition of acetoclastic methanogenic activity. When the initial concentration of substrate was varied for the enzymatic treatment, it was possible to verify higher oleic acid accumulated production when 42 grams of fat where used per gram of enzyme. On the other hand, the higher conversion factor between product and substrate was obtained when the relation between the mass of fat and the mass of enzyme was 6g/g.

Ministerio de Ciencia y Tecnología y Fondos Europeos de Desarrollo Regional (FEDER), proyectos AGF99-0396, BIO-2002-03100 y BIO-2005-00332

Dada la importancia del aceite de girasol en el comercio nacional e internacional, surge la necesidad de realizar investigaciones para incentivar la incorporación de alternativas tecnológicas “amigables” con el medio ambiente que logren reducir las pérdidas y perfeccionar el procesamiento. El uso de enzimas en el proceso de extracción acuosa o la utilización de enzimas como tratamiento previo a la extracción alcohólica, pueden estar consideradas dentro de las “tecnologías limpias” y puede dar como resultado una mejor calidad de los productos, un aumento en la competitividad frente a otros aceites en crecimiento y una mejora de la rentabilidad, debido a que se podría eliminar algunas etapas del refinado. Dentro de este marco se planteó como objetivo general de la presente tesis estudiar el uso de enzimas en el proceso extractivo de aceite de collets de girasol, utilizando solventes no convencionales y la obtención de otros derivados a escala laboratorio, promoviendo el desarrollo de tecnologías alternativas. Dentro de los objetivos específicos se pueden identificar dos grandes áreas en el uso de enzimas, por un lado se plantea su uso en la extracción acuosa de aceite de collets de girasol, estudiando variables operativas a través de diseño de experimentos para optimizar dicha extracción y por otro lado, el uso de enzimas como pre-tratamiento para la posterior extracción de aceite de collets de girasol con alcoholes de cadenas cortas como etanol e isopropanol. En el Capítulo 1 se presenta el complejo oleaginoso argentino y la relevancia del girasol en el mercado interno y externo. Se describe su localización en Argentina y sus productos, detallando la composición química del aceite, los subproductos y sus aplicaciones. Además, se realiza una breve reseña sobre la extracción de aceite con proceso convencional y no convencional, como la extracción acuosa, extracción asistida por enzimas y extracción alcohólica. En el Capítulo 2 se especifican los materiales y las técnicas analíticas utilizadas en el trabajo de tesis. A su vez, se detalla la caracterización de la materia prima principal utilizada y la caracterización de su aceite. En el Capítulo 3 analiza la extracción acuosa y acuosaenzimática a través de un diseño de experimentos robusto para definir variables generales del proceso extractivo. El estudio se complementa con la optimización de la extracción acuosa-enzimática empleando un diseño de experimentos más amplio y detallado que incluye otras variables necesarias, su significancia y el efecto de las interacciones entre las mismas. En el Capítulo 4 se evalúa la extracción alcohólica con pretratamiento enzimático, utilizando como solventes alternativos etanol e isopropanol. Se analiza la eficiencia del proceso extractivo para ambos alcoholes y se compara con la extracción convencional con nhexano. Además se realiza una caracterización de los aceites obtenidos según su contenido de fosfolípidos y tocoferoles. Finalmente, en el Capítulo 5, se exponen las conclusiones generales y se proponen trabajos futuros continuando las líneas de investigación de esta tesis, en base a los conocimientos adquiridos. / Given the importance of sunflower oil in national and international trade, there is a need to research for the incorporation of eco-friendly technological alternatives that reduce losses and improve processing. Use of enzymes in the aqueous extraction process or the use of enzymes as pre-treatment to alcoholic extraction, can be considered within the "clean technologies" and can result in a better quality products, an increase competitiveness compared with other growing oils and improvement in profitability, due to the fact that some stages of refining could be eliminated. Within this framework, the overall objective of this thesis was aimed to study the use of enzymes in the extractive oil process of sunflower collets, using non-conventional solvents and obtaining other derivatives at a laboratory scale, promoting the development of alternative technologies. Among specific objectives, enzyme use in the aqueous extraction of oil from sunflower collets was considered, studying operational variables through the design of experiments to optimize performance and on the other hand, its use in the pre-treatment to oil extraction from sunflower collets with short-chain alcohols such as ethanol and isopropanol Chapter 1 presents the Argentine oilseed complex and the relevance of sunflower in the internal and external market. Its location in Argentina and its products are described, detailing the chemical composition of the oil, the by-products and their applications. In addition, a brief review is made on the conventional and non conventional oil extraction process, such as aqueous extraction, enzyme-assisted extraction and alcoholic extraction. Chapter 2 specifies the materials and analytical techniques used in the thesis work. At the same time, the characterization of the main raw material used and the characterization of its oil are detailed. In Chapter 3, it analyzes aqueous extraction and enzyme-aided aqueous extraction through a robust design of experiments to define general variables of the extractive process. The study is complemented with the optimization of the enzyme-aided aqueous extraction using a broader and more detailed design of experiments that includes other necessary variables, their significance and the effect of the interactions among them. In Chapter 4, alcohol extraction with enzymatic pretreatment is evaluated, using ethanol and isopropanol as alternative solvents. The efficiency of the extractive process for both alcohols is analyzed and compared with conventional extraction with nhexane. In addition, a characterization of the oils obtained according to their content of phospholipids and tocopherols is carried out. Finally, Chapter 5 presents overall conclusions and future studies are proposed continuing the research lines of this thesis, based on the knowledge acquired.

[EN] During the rippening of ham and dry sausages, biochemical changes are produced, the main changes are proteólisys, lipolisys, and glucolisys, that are going to define the quality that is normal in this type of products. The evaluation of certain components that are derivates of this reactions, can be used as markers of the process. This is the case of free amino acids like lysine, that is a marker of proteólisys, another example lactic acid, a product of glycogen fermentation, like a marker of correct fermentation carried out by lactic acid bacteria. Another way to assure the food quality is the addition of some ingredients like salt or additives like nitrate. Thus, nitrate after its trasformation in nitrite during the process has the capacity of inhibition of Clostridium botulinum, and its a helpers in the development of sensorial characteristcs like flavor, color and texture, specially in ferment meat. Although the nitrate is an necessary ingredient for assure food safety, must be according allowed levels, because can be potencially harmeful for health. There are different techniques for the analysis of those market of the process, being High Performance Liquid Chromatography (HPLC) the most used. However, this technique is expensive and not accesible for a food laboratory. The development of biosensors that use enzyme like and element of birecognition has achieved a great expansión in farmaceutical and sanitary industries. Those sensors combined the selectivity of enzymes with the selectivity of electrochemical detection. In addition are economic, easy to use and the measurement are fast and do not require specialized people. In this thesis our main objective is the possibility to use amperometric biosensors, comformed by an oximeter and an oxide reductase enzyme selected in function of the interest component that is going to be analyzed for monitoring the process. Thus, by the determination of lisine it has been choose the L-lisine alpha oxidase, for the determination of lactic acid, the lactate oxidase have been chosen and for the determination of nitrate, the nitrate reductase have been selected. Sensors have been optimized, for been used in a soluble and immobilized form. (For acid lactic sensor, just a soluble form has been developed) in all cases, the results of biosensor was compared with HPLC like reference method. Those sensors have been applied in real samples of ham and dry sausages allowing reliable determination of lysine, nitrate and lactic acid, with their respective enzymes. / [ES] Durante el proceso de curado del jamón y de los embutidos fermentados se producen cambios a nivel bioquímico entre los que destacan la proteólisis, la lipolisis y la glucolisis, y que van a definir la calidad que se espera en este tipo de productos. La evaluación de ciertos compuestos derivados de dichas reacciones, pueden servir como marcadores del proceso. Es el caso de los aminoácidos libres y en concreto la lisina como marcador de proteólisis, o el ácido láctico, producto de la fermentación de los carbohidratos como marcador de una fermentación adecuada de embutidos por bacterias acidolácticas. Por otro lado, la adición de algún ingrediente como la sal o aditivos como son los nitratos, van a asegurar la higiene del producto. Así, los nitratos tras su transformación en nitritos durante el proceso, tienen la capacidad de inhibir al Clostridium botulinum pero también colaboran en el desarrollo de las características sensoriales, aroma y color fundamentalmente, de los productos curados. Sin embargo, en este caso concreto, y a pesar de ser un ingrediente indispensable para asegurar sanitariamente el producto, debe mantenerse en niveles permitidos por ser potencialmente perjudicial para la salud. Existen diversas técnicas para el análisis de estos compuestos marcadores del proceso, siendo la más utilizada la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Sin embargo, esta técnica es cara, conlleva tiempo y no siempre resulta accesible para un laboratorio de una industria alimentaria. El desarrollo de biosensores en los que se utilizan enzimas como elemento de bioreconocimiento, ha alcanzado una gran expansión en algunos sectores como son la industria sanitaria y farmacéutica. Estos sensores combinan la selectividad de las enzimas con la sensibilidad de la detección electroquímica. Además, son de manejo sencillo, los análisis son rápidos, no requiere personal especializado, y es económico. En esta tesis nos planteamos pues la posibilidad de utilizar un biosensor amperométrico simple compuesto por un oxímetro y una enzima, que se seleccionará en función del compuesto clave que se quiera analizar para monitorizar los procesos. Así, para la determinación de lisina se ha elegido la lisina-¿-oxidasa, para la determinación de nitrato la nitrato reductasa, y para la determinación de ácido láctico la lactato oxidasa. Los sensores se han optimizado tanto para su uso con la enzima libre como inmovilizada en una membrana (en el caso del sensor de ácido láctico se desarrolló únicamente para la enzima libre) y en todos los casos se compararon los resultados de los biosensores con la cromatografía líquida de alta resolución como método de referencia. Estos sensores han sido aplicados a muestras reales de jamón y embutido curados permitiendo una determinación fiable de lisina, nitrato y ácido láctico con las respectivas enzimas. / [CA] Durant el procés de curat del pernil i dels embotits fermentats es produïxen canvis a nivell bioquímic entre els que destaquen la proteólisi, la lipolisi i glucòlisi, i que definiran la qualitat que s'espera en este tipus de productes. L'avaluació de certs compostos derivats de les dites reaccions, poden servir com a marcadors del procés. És el cas dels aminoàcids lliures i en concret la lisina com a marcador de proteólisi, o l'àcid làctic, producte de la fermentació dels carbohidrats com a marcador d'una fermentació adequada d'embotits per bacteris acidolácticas. D'altra banda, l'adició d'algun ingredient com la sal o aditius com són els nitrats, asseguraran la higiene del producte. Així, els nitrats després de la seua transformació en nitrits durant el procés, tenen la capacitat d'inhibir al Clostridium botulinum però també col·labora en el desenvolupament de les característiques sensorials, aroma i color fonamentalment, dels productes curats. No obstant això, en este cas concret, i a pesar de ser un ingredient indispensable per a assegurar sanitàriament el producte, ha de mantindre's en nivells permesos per ser potencialment perjudicial per a la salut. Hi ha diverses tècniques per a l'anàlisi d'estos compostos marcadors del procés, sent la més utilitzada la cromatografia líquida d'alta resolució (HPLC) . No obstant això, esta tècnica és cara, comporta temps i no sempre accessible per a un laboratori d'una indústria alimentària. El desenvolupament de biosensors en què s'utilitzen enzims com a element de biorecoeixement, ha aconseguit una gran expansió en alguns sectors com són la indústria sanitària i farmacèutica. Estos sensors combinen la selectivitat dels enzims amb la sensibilitat de la detecció electroquímica. A més, són de maneig senzill, les anàlisis són ràpides, no requerix personal especialitzat, i és econòmic. En esta tesi ens plantegem la possibilitat d'utilitzar un biosensor amperométrico simple compost per un oxímetre i un enzim, que se seleccionarà en funció del compost clau que es vullga analitzar per a monitoritzar els procesos. Així, per a la determinació de lisina s'ha triat la lisina-oxidasa, per a la determinació de nitrat la nitrat reductasa, i per a la determinació d'àcid làctic la lactat oxidasa. Els sensors s'han optimitzat tant per al seu ús amb l'enzim lliure com immobilitzada en una membrana (en el cas del sensor d'àcid làctic es va desevolupar únicament per a l'enzim lliure) i en tots els casos es van comparar els resultats dels biosensors amb la cromatografia líquida d'alta resolució com a mètode de referència. Estos sensors han sigut aplicats a mostres reals de pernil i embotit curats permetent una determinació fiable de lisina, nitrat i àcid làctic amb els respectius enzims. / Jadán Piedra, FA. (2015). SENSORES ENZIMATICOS COMO HERRAMIENTAS PARA EL CONTROL RAPIDO DE LA CALIDAD DE LA CARNE Y PRODUCTOS CARNICOS [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/58992

Na constante busca de novas estratégias para melhorar a atividade catalítica, foi que a começos do século passado, a síntese de nanopartículas de formato controlado, tornou-se em um dos acontecimentos que revolucionaram a abordagem catalítica da Química, criando assim a linha da nanociência, onde com a síntese de nanopartículas de formato ao nível nano, é possível controlar as propriedades catalíticas dos materiais a nível macroscópico. O presente trabalho apresenta, a síntese de nanopartículas de óxido cuproso (NPs-Cu2O) com faces cristalográficas controladas. Foi possível sintetizar estruturas cúbicas, esféricas, e octaédricas, sendo os cubos e octaedros os que possuem faces cristalográficas de tipo (100) e (111), respectivamente. Entretanto, as esferas possuem uma mistura entre ambas das faces. As propriedades catalíticas das NPs-Cu2O foram testadas eletroquimicamente mediante uma reação modelo de detecção de glicose. As NPs-Cu2O, foram sintetizadas em médio básico com cloreto de cobre (CuC12) como percursor, posteriormente com concentrações diferentes de cloridrato de hidroxilamina (NH2OHoHCI) foram obtidas NPs-Cu2O com estrutura cúbica, octaédrica e esférica. Posteriormente, foram imobilizadas numa superfície de eletrodo de carbono vítreo, mediante a técnica de casting. A oxidação catalítica da glicose, permitiu observar que o desempenho da estrutura cúbica fossesuperior, com uma sensibilidade de 442 ± 7 &#181;A mM-1 cm-2, enquanto as estruturas esféricas e octaédricas foram de 165 ± 3 &#181;A mM-1 cm-2 e 38 ± 1 &#181;A mM-1 cm-2, respectivamente. Seguido as NPs-Cu2O, foram testadas na presença de Ácido Ascórbico (AA) e Ácido Úrico (UA), foi observado que os cubos possuem uma seletividade única, comparada com as outras estruturas. Dito comportamento foi estudado com Analise computacional (DFT), onde foi possível de observar que a distribuição entre átomos de Cobre e Oxigênio, determina a seletividade do material. Numa segunda etapa, para entender a importância da conservação estrutural e integridade morfológica, foram testadas as NPs-Cu2O, aos diferentes dias após de ser sintetizadas, observando claramente uma relação entre estrutura e atividade catalítico. Foi observado que nas estruturas cúbicas o deterioro foi maior em comparação com as outras estruturas, isto acompanhado mediante DFT, foi determinado que estrutura cúbica apresenta uma maior interação com o oxigênio, provocando assim, que a rápida transformação de Cu(I) para Cu(II), como CuO. Por último as NPs-Cu2O, foram testadas por espectroscopia de fotoelétrons excitados por raios X (XPS), este analise ajudou a compreender que o desempenho catalítico, não estava relacionado com a formação de Cu (III). Estes resultados foram apoiados pelos resultados obtidos pela espectroscopia de infravermelho in situ (FTIR), já que nessa análise foi possível de observar como o estabilizante (SDS), foi determinante em cada estrutura. / In the constant search for new strategies by advance of catalytic activities, was that at the beginning of the last century the synthesis of nanoparticles in a controlled format, became one of the events that revolutionized the catalytic approach of Chemistry, thus creating a line of nanoscience, where with the synthesis of nanoparticles of format at the nano level, it is possible to control catalytic properties of materiais at the macroscopic level. Consequently, the present work the synthesis of cuprous oxide nanoparticles (Cu2O-NPs), with crystallography faces welldefined. It was possible synthesize cubic, spherical and octahedral structure, the cubes and octahedrons being those having crystallographic faces of type (100) and (111), respectively. Meanwhile, the spheres have a mixture between both faces. The catalytic properties of Cu2O-NPs were electrochemically tested by a model glucose detection reaction. The Cu2O-NPs were synthetized in basic solution with cooper chlorate (CuCl2) like precursor, after with different concentration of hydroxylamine hydrochloride (NH2OH&#183; HCl) were obtain cubic, spheres and octahedral structure. Posteriorly, were immobilized in a glassy carbon surface, through the technique of casting. The catalyst oxidation of glucose allowed observe that the performance of cubic structure was superior, with a sensibility of 442 ± 7 &#181;A mM-1 cm-2, while the spheres and octahedral structure were 165 ± 3 &#181;A mM-1 cm-2 e 38 ± 1 &#181;A mM-1 cm-2, respectively. Following the Cu2O-NPs, they were tested in the presence of Ascorbic Acid (AA) and Uric Acid (UA), it was observed that the cubes have a unique selectivity compared to the other Cu2O-NPs structure. This behavior was studies with com putational analysis (DFT), where it was possible to observed that the distribution between copper and oxygen atoms determines the selectivity of material. In a second step, to understand the importance of structure conservation and morphological integrity, Cu2O-NPs were tested at different days after being synthesized, noting clearly a relation between structure and catalytic activity. It was observed that cubic structure the deterioration was greater in comparation with the other structures, this being accompanied by DFT, it was determinate that cubic structure show a greater interaction with the oxygen, thus provoking that rapid transformation of Cu (I) to Cu(II), like CuO. Finally, the Cu2O-NPs were tested by x-ray excited photoelectron spectroscopy (XPS), this analysis helped to understand the catalytic activity was not related to Cu (III) formation. These results were supported by those obtained by in situ (FTIR), since in this analysis it was possible to observe how the stabilizer (SDS) was determinant in each structure.

A doença de Chagas, uma infecção parasitária amplamente distribuída na América Latina, é um problema grave de saúde pública com consequências devastadoras em termos de morbidade e mortalidade humana. O arsenal terapêutico contra a doença é bastante limitado e insuficiente em todos os aspectos clínicos. Visando o desenvolvimento de novos agentes antichagásicos, várias proteínas do parasita têm sido exploradas como alvos terapêuticos. Neste contexto, a enzima cruzaína, uma cisteíno protease envolvida nos estágios de desenvolvimento e diferenciação do Trypanosoma cruzi, foi selecionada para os nossos estudos, visando a identificação de inibidores através do uso do método de planejamento de fármacos baseado na estrutura do receptor (SBDD, do inglês, structure-based drug design). Esta metodologia engloba uma diversidade de estratégias, empregando estruturas cristalográficas de proteínas alvo, disponíveis usualmente no Protein Data Bank (PDB). Entre as técnicas modernas utilizadas no SBDD, destaca-se a triagem virtual baseada na estrutura do receptor (SBVS, do inglês, structure-based virtual screening), que possibilita a seleção de novos candidatos a ligantes de proteínas alvo, a partir de grandes bases de dados de compostos. No presente trabalho de dissertação, a seleção de 19 estruturas da enzima cruzaína, em complexo com ligantes, permitiu a aplicação de métodos de SBDD. Um conjunto com cerca de 3,4 milhões de compostos, com característica líder-similar (do inglês, lead-like), e outro conjunto com aproximadamente 450.000 compostos, com característica fragmento-similar (do inglês, fragment-like), foram coletados da base de dados ZINC. O programa DOCK 3.5.54 foi empregado na triagem virtual das bases de dados utilizando-se a estrutura cristalográfica PDB ID: 3KKU. Um subconjunto com 35.000 moléculas foi selecionado para estudos posteriores com os programas GOLD e Surflex. As 500 melhores moléculas selecionadas por cada um dos programas foram analisadas visualmente considerando-se diversas características estruturais dos subsítios da enzima cruzaína e dos ligantes (e.g., complementaridade molecular, flexibilidade, lipofilia do subsítio S2, presença de doadores e aceptores de hidrogênio entre os subsítios S2 e S1). Desta forma, um conjunto final de 18 compostos foi priorizado para os ensaios bioquímicos frente a enzima cruzaína. Destes 18 compostos, 6 apresentaram atividade inibitória frente a cruzaína, com destaque para os 2 mais promissores, com valores de IC50 (concentração de inibidor necessária para reduzir em 50% a atividade enzimática) de 20 &micro;M e 580 nM. O inibidor mais potente da série foi selecionado da base fragmento-similar e apresentou um valor de eficiência do ligante (EL) de 0,53 kcal/mol/átomo, considerado significativo para otimização em química medicinal. A integração de técnicas computacionais e experimentais permitiu a descoberta de ligantes com inovação estrutural, abrindo novas perspectivas para o planejamento de inibidores mais potentes e seletivos da enzima cruzaína de T. cruzi. / Chagas disease, a parasitic infection widely distributed in Latin America, is a serious public health problem with devastating consequences in terms of human morbidity and mortality. The therapeutic arsenal against the disease is very limited and insufficient in all clinical aspects. This has led to a new paradigm for the discovery of new agents that act on specific enzymes or metabolic pathways. The enzyme cruzain, a cysteine protease essential for the survival of the parasite Trypanosoma cruzi, has been selected in this work as an attractive target for the development of new inhibitors through the use of structure-based drug design (SBDD). This approach brings together a diversity of strategies, which employs crystal structures of target proteins, usually available in the Protein Data Bank (PDB). Structure-based virtual screening (SBVS), one of the most important techniques used in SBDD, allows the selection of new ligands of target proteins from large libraries of compounds. In this work, 19 crystal structures of the cruzain enzyme, in complex with ligands, allowed the application of SBDD methods. A data set of about 3.4 million compounds, with lead-like characteristics, and a second data set, with approximately 450,000 compounds, with fragment-like characteristics, were collected from the ZINC data base. The docking program DOCK 3.5.54 was employed in the virtual screening of the data sets using the crystal structure PDB ID: 3KKU. A subset of 35,000 compounds was selected for further studies with the programs GOLD and Surflex. The 500 top ranked molecules for each of the programs were visually inspected considering a number of structural characteristics of the subsites of the cruzain enzyme, as well as of the ligands (e.g., molecular complementarity, flexibility, the hydrophobic S2 subsite, and the presence of hydrogen donors and acceptors between the subsites S2 and S1). Thus, a final subset of 18 compounds was prioritized for the biochemical assays against the cruzain enzyme. Six out of 18 compounds exhibited enzyme inhibition, with the most two promising inhibitors having IC50 values (IC50 refers to the concentration of compound required for 50% inhibition of cruzain) of 20 &micro;M e 580 nM. The most potent inhibitor of the series was selected from the fragment-like data set and showed a ligand efficiency of 0,53 kcal/mol/atom, which is considered significant in drug design. The integration of computational and experimental approaches allowed the discovery of compounds with innovative structures, providing new perspectives for the design of inhibitors of T.cruzi cruzain having increased potency and selectivity.