A aloimunização contra antígenos eritrocitários decorre normalmente de gestações ou transfusões prévias e torna-se um problema mais frequente entre pacientes submetidos à transfusão, até mesmo entre pacientes transfundidos de forma esporádica, como nos casos de pacientes com câncer de mama. A detecção de anticorpos irregulares deve ser realizada com técnica sensível, capaz de detectar os anticorpos de maior relevância clínica. A falha na detecção de um aloanticorpo pode levar a reação transfusional hemolítica aguda ou tardia de intensidade variável que podem agravar ainda mais a condição clínica do receptor. Atualmente no Hospital do Câncer III, a detecção de anticorpo irregular é realizada na técnica em gel-teste na fase de antiglobulina humana. O presente trabalho teve como objetivos avaliar o impacto da implantação da técnica enzimática na pesquisa de anticorpos irregulares (P.A.I) na rotina pré-transfusional em associação à técnica utilizada na rotina, e estudar o perfil de aloimunização em portadores do câncer de mama atendidos nesse serviço. Entre junho de 2015 e maio de 2016, 429 amostras de sangue de pacientes com câncer de mama coletadas para testes pré-transfusionais foram submetidas à P.A.I pelas metodologias em Liss\\AGH e Nacl\\Enzima. Quando a P.A.I resultava positiva, a identificação do anticorpo era realizada utilizando a técnica correspondente. A frequência de aloimunização encontrada pela técnica de Liss/AGH foi de 1,86% (8/429), enquanto a técnica enzimática revelou uma taxa de aloimunização de 7,6% (32/421) e com associação dos resultados de ambas técnicas obtivemos 9,32% (40/429). . Assim como na literatura, os anticorpos dos sistemas Rh foram os mais frequentes. A rotina institucional apresentou o Anti-D como predominante em 5 amostras (41,6%), seguido por 2 Anti-E (16,6%), 2 Anti-C (16,6%), 1 Anti-Lea (8,4%) , 1 Anti-Jka (8,4%) e 1 Anti-S (8,40). Enquanto que em enzima, o Anti-E foi o mais predominante em 13 amostras (35%), seguido por 9 (24%) autoanticorpos públicos quentes, 7 Anti-Lea (19%), 4 Anti-D (11%), 1 Anti-C (2,75%), 1 Anti-Cw (2,75%), 1 Anti-K (2,75%) e 1 Anti- Dia (2,75%). Para comparar proporções do perfil de aloimunização desses pacientes, foram utilizados os testes Qui-quadrado e Teste G, com valores de p<0,10 considerados significantes. Foram observadas diferenças significantes entre aloimunizados e não aloimunizados quanto à cor da pele, classificação RhD, histórico transfusional e tempo de incidência de aloanticorpo. Observamos que a aloimunização não está correlacionada ao número de transfusões de concentrados de hemácias na Instituição e sim pelo histórico transfusional. Antecedentes transfusionais foram identificados em 27,5% dos aloimunizados e 14% dos não aloimunizados (p) = 0.0398. O predomínio de RhD 7 positivo foi verificado tanto nos aloimunizados quanto nos grupos dos não aloimunizados com percentuais de 75% e 90%, respectivamente (p) = 0.0147. De acordo com a estimativa do tempo para geração de aloanticorpos, todas as aloimunizadas (100%) apresentaram resultado considerado longo, sendo superior a 72 horas. Dentre as não aloimunizadas o mesmo tempo apresentouse em 41 (82%) das pacientes (p) = 0.0583, demonstrando que a técnica enzimática pode ser utilizada com o intuito de se detectar aloanticorpos em reduzido intervalo de tempo pós-exposição a antígenos eritrocitários. Diante desses fatos, propomos a aplicação da fenotipagem eritrocitária para os antígenos dos sistemas Kell e Rh, para os indivíduos portadores do câncer de mama. Também propomos a ampliação deste projeto na rotina pré- transfusional sobre os demais grupos de pacientes oncológicos tratados pelo INCA. Tal medida certamente contribuirá para reduzir o risco de transfusões fenótipo imcompatíveis que poderiam acarretar reações transfusionais hemolíticas ou transfusões ineficazes. / The alloimmunization from erythrocyte antigens usually happens from previous pregnancies or transfusions and becomes a frequent problem among patients undergoing transfusion, even among those transfused sporadically, as in the cases of patients with breast cancer. The detection of irregular antibodies should be performed with sensitive technique capable of detecting the most clinically relevant antibodies. The failure of detecting an alloantibody can provoke acute or delayed hemolytic transfusion reaction of varying intensity that can further worsen the clinical condition of the recipient. Currently in the Cancer Hospital III, irregular antibody detection is performed in the gel-test technique at the stage of human antiglobulin. This study aimed to evaluate the impact of enzymatic technique implementation in irregular antibody screening (PAI) in the pre-transfusion routine in association with the technique used in routine, and study the alloimmunization profile in patients with breast cancer treated in this service. Between June 2015 and May 2016 XXX blood samples (serum? Plasma?) Of patients with breast cancer collected for pre-transfusion tests were submitted to the P.A.I methodologies Liss \\ AGH and NaCl \\ enzyme. When P.A.I resulted positive, identification of the antibody was carried out using the corresponding technique. The frequency of alloimmunization found by the technique Liss / AGH was 1.86% (8/429), whereas the enzymatic technique revealed an alloimmunization rate of 7.6% (32/421) and association of the results of both techniques was 9.32% (40/429). As found in literature, the antibodies of the Rh systems were the most frequent. The institutional routine presented anti-D as prevalent in 5 samples (41.6%), followed by anti-E 2 (16.6%) 2 Anti-C (16.6%) 1 Anti-Lea (8, 4%), anti-Jka 1 (8.4%) and anti-S 1 (8.40). While in enzyme technique, Anti-E was the most predominant in 13 samples (35%), followed by 9 (24%) hot public autoantibodies 7 Anti-Lea (19%) 4 Anti-D (11%), 1 Anti-C (2.75%), Anti-Cw 1 (2.75%) 1 Anti-K (2.75%) and Anti Day 1 (2.75%). To compare alloimmunization profile proportions of these patients, the Chi-square test and test G were used, with p <0.10 considered significant. Significant differences were observed between alloimmunized and not alloimmunized as ethnicity, RhD classification, transfusional historic and time of incidence of alloantibodies. We note that alloimmunization is not correlated to the number of red cell concentrate transfusions in the institution but by transfusional historic. Past transfusions have been identified in 27.5% of alloimmunized and 14% of non-alloimmunized (p) = 0.0398 patients. The prevalence of RhD positive was observed in both groups alloimmunized and non-alloimmunized with 75% and 90%, respectively (p) = 0.0147. According to the estimated time for the generation of alloantibodies, all isoimmunized (100%) had 9 results considered long, and more than 72 hours. Among the non-alloimmunized, 41 (82%) patients (p) = 0.0583 presented the same time, indicating that the enzymatic technique can be used in order to detect alloantibodies in a reduced post-exposure interval to erythrocyte antigens. Given these facts, we propose the application of phenotyping erythrocyte to the antigens of the Kell and Rh systems, for all individuals of breast cancer. We also propose the extension of this project in the pre-transfusion routine on other groups of cancer patients treated by INCA. This measure will certainly help to reduce the risk of transfusion incompatible phenotype that could cause hemolytic transfusion reactions or ineffective transfusions.

As dietas de vacas em lactação são compostas principalmente por carboidratos que não estão totalmente disponíveis para fermentação microbiana no rúmen, o que pode ser um fator crítico para a obtenção de energia em ruminantes. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da adição de enzima fibrolítica (Fibrozyme&reg;, Alltech Inc., Springfield, KY) e amilolítica (Amaize, Alltech Inc., Springfield, KY) nas dietas sobre o consumo de nutrientes, índice de seleção de partículas, digestibilidade aparente total, fermentação ruminal, metabolismo de nutrientes, produção e composição do leite de vacas em lactação. Para o experimento, 32 vacas multíparas da raça Holandesa com 181.3 &#177; 35.3 (média &#177; SD) dias em lactação (DEL), 571 &#177; 72.7 kg de peso vivo (PV) e 29.6 &#177; 5.24 kg/d de produção de leite (PL), foram distribuídas em 8 quadrados Latinos 4×4. Os tratamentos foram obtidos por esquema fatorial 2×2 pela combinação de enzima fibrolítica e amilolítica, como segue: 1) Controle (CONT): dieta basal sem adição de enzimas exógenas; 2) Enzima fibrolítica (FIB): dieta basal com adição de 1 g/kg de Fibrozyme&#177; no concentrado da dieta (51 UI de atividade xilanase/kg de matéria seca (MS) da dieta; Alltech, Nicholasville, KY, USA; batch#: 417990-2); 3) Enzima amilolítica (AMI): dieta basal com adição de 0,66 g/kg de Amaize no concentrado da dieta (203 FAU/kg MS da dieta; Alltech Nicholasville, KY, USA; batch: 432715-1); e 4) FIB+AMI: adição de 1 e 0,66 g/kg de Fibrozyme® e Amaize, respectivamente. As enzimas foram aplicadas para atender um consumo de 12 g/dia de Fibrozyme&reg; e 8 g/dia de Amaize, de acordo com as recomendações do fabricante. A enzima foi adicionada ao concentrado durante a preparação na fábrica de ração (toda semana). Não foram observados efeitos das enzimas sobre o consumo e digestibilidade dos nutrientes. Contudo, houve efeito de interação entre FIB e AMI para o consumo de partículas entre 19 e 8 mm. A enzima amilolítica aumentou o consumo de partículas entre 19 e 8 mm nos animais que não recebiam FIB. Além disso, AMI reduziu o consumo de partículas maiores que 19 mm. Outro efeito observado foi a interação entre FIB e AMI sobre a concentração de butirato ruminal. A enzima amilolítica aumentou a concentração de butirato apenas nos animais tratados com FIB. Houve tendência de interação entre enzimas sobre a excreção de nitrogênio (N) no leite, em que FIB reduziu a excreção de N no leite apenas nos animais não tratados com AMI. Ainda, AMI reduziu a excreção de N na urina. Ainda, houve interação entre os efeitos de enzima fibrolítica e amilolítica sobre a concentração de colesterol e a atividade enzimática da aspartato aminotransferase (AST) e gama glutamiltransferase (GGT). A enzima fibrolítica reduziu a concentração de colesterol e aumentou a atividade da enzima GGT nos animais não tratados com enzima amilolítica. No entanto, a enzima amilolítica aumentou a concentração de colesterol e a atividade da AST nos animais alimentados com enzima fibrolítica. Houve interação entre enzimas exógenas sobre a produção de proteína e lactose no leite. A enzima fibrolítica reduziu a produção de proteína e lactose nos animais não alimentados com AMI. Não houve mudanças na produção de leite com a suplementação de enzimas exógenas. Em nosso estudo foram encontrados efeitos no consumo de partículas, fermentação ruminal, excreção de N e mudanças na composição do leite, contudo não foram observadas alterações no desempenho produtivo dos animais. / Lactating cows diets are comprised mostly of carbohydrates which are not fully available for microbial fermentation in the rumen, critical factor for to obtain energy in ruminants. The aimed of this study was to evaluate the effect of fibrolytic enzyme (Fibrozyme&reg;, Alltech Inc., Springfield, KY) on nutrient intake, sorting index, total tract digestion, ruminal fermentation, nitrogen utilization, metabolic profile, milk yield and composition in diets with or without amylolytic enzyme (Amaize, Alltech Inc., Springfield, KY) of mid-lactating dairy cows. Thirty-two multiparous Hostein cows with 181.3 &#177; 35.3 (mean &#177; SD) days in milk (DIM), 571 &#177; 72.7 kg of body weight (BW) and 29.6 &#177; 5.24 kg/d of milk yield, were blocked and randomly allocated to a sequence of treatments in a 4 × 4 Latin square experimental design. Treatments were obtained in a 2 × 2 factorial arrangement, as follows: 1) Control (CONT), basal diet without exogenous enzymes; 2) Fibrolytic enzyme (FIB), provision of Fibrozyme&reg; (batch#: 417990-2; Alltech, Nichollasvile, KY) at 1 g/kg of concentrate (51 IU of xylanase activity/kg diet DM); 3) Amylolytic enzyme (AMY), provision of AmaizeTM (batch#: 432715-1; Alltech) at 0.66 g/kg of concentrate (203 FAU/kg diet DM); and 4) Fibrolytic enzyme plus amylolytic enzyme (FIB+AMY), enzymes added at the same rate in FIB and AMY treatments. The enzymes were applied to meet the intake of 12 and 8 g/cow/day of Fibrozyme&reg; and AmaizeTM, respectively. Enzymes products were added to concentrate during its preparation (once a week). Enzymes no effects on intake and digestibility of nutrients. However, there was FIB and AMY interaction effect on selection index of particle size between 19 and 8 mm. Amylolytic enzyme increase selection index of particles with 19 and 8 mm, only treatments without FIB. Furthermore, AMY decreased the sorting for feed with particle size greater than 19 mm. There was FIB and AMY interaction effect on butyric acid concentration. Amylolytic enzyme increased on butyrate concentrations in cows treated with fibrolytic enzyme. Fibrolytic and amylolytic enzyme interaction effect tended on N excreted in milk, in which FIB decrease N excreted in milk only on animals non-treated with AMY. Whereas AMY reduced urinary N excretion. There was interaction effects of fibrolytic and amylolytic enzymes on cholesterol concentration and the enzymatic activity of AST and GGT. The fibrolytic enzyme reduced cholesterol concentration and increased GGT enzyme activity in animals not treated with amylolytic enzyme. There was FIB and AMY interaction effect on lactose and protein production. Fibrolytic enzyme decreased lactose and protein production, only on animals non-treated with AMY. Exogenous enzymes had no impact on milk production of dairy cows. Enzymes exogenous affected on particle size greater, ruminal fermentation and milk composition. This study did not show evidences that fibrolytic and amylolytic enzymes can alter total tract nutrient digestibility and performance of mid-lactating cows.

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Polyphenoloxidase is an enzyme that catalyzes the conversion of a phenolic compound to a quinone, which can be reduced electrochemically and thus allows the detection (quantification) of the analyte of interest. This enzyme is widely distributed in plants and is widely used in the production of biosensors and the selective evaluation of phenolic drugs in pharmaceutical formulations and total phenols in industrial effluents. The polyphenoloxidases in this specific work were extracted from the fruit of Jurubeba (Solanum paniculatum L.) and used in the development of carbon paste electrochemical biosensors in the determination of phenolic drugs, such as paracetamol, ascorbic acid, salicylic acid and or methyldopa. Under experimental conditions the effect of the amount of enzymatic extract in the carbon paste ranging from 50 to 200 μL and the optimum pH of 3.0 to 9.0 using the differential pulse voltammetry technique was investigated. After optimization, the intermediate precision of the biosensor was tested through its reproducibility through the tests of repeatability, time of conditioning, stability and linearity. Soon after, used in the determination of the drugs, obtaining a better response in the detection of paracetamol, in this way, the calibration curve was realized and consequently applied in the determination of paracetamol of commercial samples in tablets. The biosensor had a linearity in the range of 5 to 245 μM, with a detection limit of 3 μM. The polyphenoloxidase extracted from the fruit of Jurubeba showed peculiar characteristics that it provided in the technological development of biosensors with application in the quality control of phenolic drugs, exhibiting high sensitivity, satisfactory selectivity, good repeatability and adequate stability. / O uso de enzimas vegetais para fins analíticos vem aumentando a cada dia, principalmente no ramo da biotecnologia ligada ao desenvolvimento de novos instrumentos de análises cada vez mais específicos. Desta forma, o desenvolvimento de biossensores vem crescendo, já que estes permitem que a medida do analito de interesse seja realizada pela transdução seletiva de um parâmetro da reação analito-alvo passível de ser monitorado. Por este motivo, o elemento biológico que compõe o instrumento, torna-se um componente essencial para a sua construção. A polifenoloxidase é uma enzima que catalisa a conversão de um composto fenólico a uma quinona, que pode ser reduzida eletroquimicamente e permite assim a detecção (quantificação) do analito de interesse. Esta enzima é amplamente distribuída nos vegetais e bastante utilizada na produção de biossensores e na avaliação seletiva de fármacos fenólicos em formulações farmacêuticas e de fenóis totais em efluentes industriais. As polifenoloxidases, neste trabalho em específico, foram extraídas do fruto da Jurubeba (Solanum paniculatum L.) e utilizadas no desenvolvimento de biossensores eletroquímicos de pasta de carbono na determinação de fármacos fenólicos, tais como o paracetamol, o ácido ascórbico, o ácido salicílico e o metildopa. Sob condições experimentais foram investigados o efeito da quantidade de extrato enzimático na pasta de carbono que variou-se de 50 a 200 μL e o pH ótimo de 3,0 a 9,0, utilizando a técnica de voltametria de pulso diferencial. Após otimizado, foi testado a precisão intermediária do biossensor através de sua reprodutibilidade por meio dos teste de repetibilidade, tempo de condicionamento, estabilidade e linearidade. Logo em seguida, empregado na determinação dos fármacos, obtendo uma melhor resposta na detecção do paracetamol, dessa forma, foi realizado a curva de calibração e consequentemente aplicado na determinação do paracetamol de amostras comerciais em comprimidos. O biossensor apresentou uma linearidade na faixa de 5 a 245 μM, com um limite de detecção de 3 μM. Frente aos resultados alcançados foi evidenciado que a polifenoloxidase extraída do fruto da jurubeba apresentou características peculiares que proporcionou no desenvolvimento tecnológico dos biossensores com aplicação no controle de qualidade dos fármacos fenólicos, exibindo alta sensibilidade, seletividade satisfatória, boa repetibilidade e estabilidade adequada.

Made available in DSpace on 2015-04-22T22:17:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SALOMAO ROCHA.pdf: 785933 bytes, checksum: 2a406f595cf4495ac889e48923ddd00c (MD5) Previous issue date: 2012-08-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / During the freezing of fruits pulps, the enzyme activity is not finished completely. Sensory, nutritional and coloring changes may occur on fruits due to the action of oxidative enzymes such as peroxidase and polyphenoloxidase. The frozen cupuaçu pulps, sold in Brazil, have a shelf life of one year and become browned during this period. The aim of this study was to evaluate the effect of frozen storage on the physicochemical characteristics, polyphenoloxidase activity and soluble and ionically bound peroxidases presented in the pulps of four new cupuaçu genotypes over twelve months. The cupuaçu genotypes developed by the West Amazonian Agroforestry Research Center (EMBRAPA) were pulped, frozen and stored at 30 °C. The polyphenoloxidase of the four cupuaçu genotypes showed an increase in activity according to the storage time with peaks in the sixth, ninth and tenth months, but the peroxidases exhibited oscillations in the enzyme activity. The physicochemical properties of the pulps showed variations during the twelve months of storage under freezing. The vitamin C content of D 28-10 and P 3-10 genotypes decreased from the fourth and tenth months, respectively. Moreover P 9-8 e B 28-7 genotypes remained stable. In relation the acidity of citric acid, the B-28-7, D 28-10 and P 9-8 samples were not different, but P 3-10 genotype presented a reduction. The pH and total soluble solids of all genotypes decreased over the study period. There was an increase in sugar concentration of B 28-7, P 3-10 and P 9-8 genotypes, except for D 28-10 sample which remained unchanged. All genotypes were in accordance with physical-chemicals standards required by legislation, except for P 3-10 genotype that showed a lower acidity. In respect of the enzymatic parameters, there were variations in the activity of peroxidase and polyphenoloxidases of all genotypes. / No congelamento de polpas de frutas a atividade enzimática não é completamente cessada. Podem ocorrer mudanças sensoriais, nutricionais e de coloração devido à ação de enzimas oxidativas, como a peroxidase e a polifenoloxidase. Considerando que as polpas de cupuaçu congeladas, comercializadas no Brasil, têm um prazo de validade de um ano e tornam-se escurecidas ao longo deste período, objetivou-se neste estudo avaliar o efeito do tempo de congelamento nas características físico-químicas e nas atividades da polifenoloxidase e peroxidases solúvel e insolúvel presentes nas polpas de quatro novos genótipos de cupuaçu, durante doze meses. Os frutos dos genótipos de cupuaçu, desenvolvidos pela Embrapa Amazônia Ocidental, foram despolpados, congelados e armazenados à temperatura de -30 ºC. A polifenoloxidase das polpas dos quatro genótipos apresentou aumento na sua atividade com picos no sexto, nono e décimo mês e as peroxidases apresentaram oscilações na atividade enzimática. As propriedades físico-químicas das polpas apresentaram variações durante os doze meses de armazenamento sob congelamento. O teor de vitamina C dos genótipos D 28-10 e P 3-10 diminuiu a partir do 4º e 10º mês, respectivamente. Por outro lado os genótipos B 28-7 e P 9-8 permaneceram estáveis. Em relação à acidez em ácido cítrico, as amostras B-28-7, D 28-10 e P 9-8 não diferiram, havendo redução no genótipo P 3-10. O valores de pH e sólidos solúveis totais de todos os genótipos diminuíram ao longo do período avaliado. Houve aumento na concentração de açúcares das polpas dos genótipos B 28-7, P 3-10 e P 9-8, com exceção da amostra D 28-10 que permaneceu inalterada. Todos os genótipos apresentaram-se dentro dos padrões físico-químicos exigidos pela legislação, com exceção do genótipo P 3-10 que apresentou acidez inferior. Em relação aos parâmetros enzimáticos, houve variações na atividade das peroxidases e polifenoloxidases de todos os genótipos avaliados.

Os micro-organismos apresentam uma imensa diversidade genética e desempenham funções únicas e cruciais na manutenção de ecossistemas. Uma dessas funções é a produção de enzimas extracelulares, que ajudam na degradação da matéria orgânica e são cada vez mais procuradas e exploradas pela indústria. Essa propriedade aumenta a busca por enzimas que possam ser utilizadas nos diversos setores industriais com maior aproveitamento e baixo custo. A celulase pertence a essa classe de enzimas e é formada por um complexo multienzimático capaz de hidrolisar celulose por meio da quebra da ligação &beta;,1-4. A partir dessa característica da celulase, foi realizada uma expressão heteróloga relacionada com a hidrólise da celulose em biblioteca metagenômica de solo da Caatinga. Foram realizados testes de produção enzimática por meio dos quais selecionamos os clones 283/A8 e 307/E11 como melhores produtores de endoglicanases. Com o objetivo de analisar a cinética de produção de celulases pelos clones, estes foram inoculados em diferentes fontes de celulose, pH e temperatura. A faixa ideal de pH foi 5,0 e de temperatura, 50º C, verificada para as enzimas Celulase Total, Endoglicanase e &beta;-glicosidase. Quanto à termoestabilidade, as enzimas presentes mantiveram mais de 60% da atividade inicial após 2 horas de incubação a 50º C. O perfil de proteínas analisado por SDS-PAGE demonstrou que os clones secretam um conjunto de enzimas celulolíticas com 25 a 100 KDa, quando cultivado em farelo de trigo, e 30 a 60 KDa, quando cultivados em CMC. No ensaio de cromatografia para o clone 307/E11, foram selecionadas 5 frações que obtiveram melhores resultados na dosagem enzimática e testados frente ao pH e à temperatura. O resultado obtido foi que o complexo enzimático bruto, extraído do sobrenadante produzido pelo clone, possui melhor atividade frente ao pH e à temperatura do que as frações parcialmente purificadas. / Microorganisms are distinguished by a wide genetic diversity and they perform unique and crucial functions concerning the maintenance of ecosystems. One of those functions is the production of extracellular enzymes, which help in the degradation of organic matter and which are increasingly wanted and explored by industry. Such feature boosts the search of enzymes that can be exploited in several industrial sectors with improved full use and low cost. Cellulase belongs to such class of enzymes and it is composed of a multi-enzymatic complex which is able to hydrolyse cellulose through the breaking of the chemical bond &beta;,1-4. Considering such attribute of the cellulase, a heterologous expression, related to cellulose hydrolysis in a metagenomic inventory of the soil of Caatinga, was realized. Tests of enzymatic production were performed, and through them, we could elect the clones 283/A8 and 307/E11 as the best endoglicanase producers. Those clones were inoculated in different cellulose sources, pH and temperature, so that we could analyse the kinetic of cellulase production between them. The ideal pH range was 5.0 and the ideal temperature range was 50º C (122º F), verified for the enzymes Total Cellulase, Endoglicanase and &beta;-glucosidase. With regard to thermostability, the present enzymes kept more than 60% of the initial activity after 2 hours of incubation at 50º C (122º F). The proteins profile analysed with the help of SDS-PAGE proved that the clones secrete a group of cellulolytic enzymes with a weight average of 25 to 100 KDa, when cultivated in wheat bran, and of 30 to 60 KDa, when cultivated in CMC. Five fractions with the best results, regarding enzymatic dosage and tested before pH and temperature, were chosen by the chromatography research for the clone 307/E11. The achieved result proved that the raw enzymatic complex, extracted from the supernatant produced by the clone, develops a better activity before pH and temperature than the fractions partially purified.

La primera parte de esta Tesis de Maestría consiste en entender las propiedades catalíticas y de carácter no enzimático de nanopartículas magnéticas (NPM) de óxido de hierro sintetizadas por el método de descomposición térmica en la creación de sensores que permiten detectar analitos tales como el peróxido de hidrógeno (H2O2) y ácido cítrico. La creación del sensor de H2O2 es llevado a cabo mediante la deposición capa por capa [Layer-by-Layer (LbL)] de las NPM suspendidas y funcionalizadas en medio acuoso con la amina cuaternaria y a su vez surfactante Bromuro de cetiltrimetilamonio (Cetyltrimethylammonium bromide-CTAB) y con el polímero poli-aniónicosodio 4-estireno-sulfonato (sodium 4-styrenesulfonate PSS) vía interacción electrostática sobre el sustrato conductor óxido de estaño dopado con flúor (Fluorine doped Tin Oxide-FTO). La sensibilidad del sensor es estudiada en base a su dependencia con las concentraciones aplicadas de H2O2 y ácido cítrico utilizando técnicas electroquímicas como Voltametría Cíclica (VC) y Cronoamperometría. Por otro lado, andamios (scaffolds) que actúen como nexo entre los tejidos conectivos dañados en la matriz ósea es un tema actual de gran impacto. La componente inorgánica principal de los huesos Hidroxiapatita (HAp) en estado macroscópico o bulk ha sido elegida ya desde unos 30 años atrás como un candidato que mimetiza las propiedades de los tejidos óseos, más al parecer el desarrollo de la Nanotecnología, como fuente de nuevas y maravillosas propiedades no solo mejora la viabilidad de estas nano partículas en los análisis biológicos sino que al incorporar vía funcionalización otros nanomateriales como Fe3O4 (magnetita) y su forma oxidada γ-Fe2O3 (maghemita) a la HAp ayuda rotundamente a la proliferación y degeneración de células osteoformadoras u osteoblastos. La segunda parte de este trabajo reside en la comprensión de la aplicación mencionada previamente en el párrafo anterior debido a que es primordial comprender cómo se lleva a cabo el proceso de ligación o funcionalización de una estructura sólida (HAp) a una nanopartícula, tema de gran interés y relevancia en la física-química de superficies, pues en la mayoría de casos son moléculas o ligandos las que se adhieren a través de enlaces covalentes o no covalentes a la superficie de las nanopartículas mediante transferencia de fase discutida posteriormente. Inmediatamente, el análisis citotóxico, e.d., la viabilidad que adquiera este nuevo nanomaterial en las células óseas de SAOS-2 (Sarcoma osteogénico) será evaluado vía el protocolo de cristal violeta, viabilidad celular y análisis ROS, así como el efecto sobre la morfología de las células durante el tiempo de exposición de esta nueva línea de nanomateriales. / --- This Master thesis has two main parts, the first one resides in the understanding of the catalytic properties and non-enzymatic nature of magnetic nanoparticles in order to create sensors that detect analytes such as peroxide hydrogen (H2O2) and citric acid. The creation of H2O2 sensor is carried out by Layer-by-layer (LbL) deposition of the magnetic nanoparticles suspended and functionalized in aqueous medium with the quaternary amine and surfactant cetyltrimethylammonium bromide (cetyltrimethylammonium bromide- CTAB) sodium 4-styrenesulfonate PSS via electrostatic interaction on the conductive substrate fluorine doped tin Oxide-FTO. The sensitivity of the sensor is studied based on their dependence on the applied concentrations of H2O2 using electrochemical techniques such as cyclic voltammetry (CV) and chronoamperometry. On the other hand, scaffolds, who act as a link between the connective tissue damaged in bone matrix is a current issue of great impact and importance. The main inorganic component of bone hydroxyapatite (HAp) on macroscopic or bulk state has been chosen around 30 years ago as the perfect candidate that mimics the properties of bone tissues. Additionally, as part of a new source of wonderful properties nanohydroxyapatite has captured the attention by incorporating inside its structure other nanomaterials such as Fe3O4 (magnetite) and its oxidized form γ-Fe2O3 (maghemite) which strongly support the proliferation and degeneration of bone-forming cells or osteoblasts. However the rol that nanoparticles play in this processes has not been explained yet. For that, the second part of this Master thesis explained at first how to carry out the process of functionalization of a solid structure (HAp) to a nanoparticle, a subject of great interest and relevance in the physical-chemical surfaces, because in most cases are molecules or ligands which are attached by covalent or noncovalent bounds to the surface of the nanoparticles linked by phase transfer discussed in the preliminary concepts section later on. As a complement for the characterization studies, cytotoxic analysis, i.e., feasibility to acquire this new nanomaterial in SAOS-2 bone cells will be evaluated using crystal violet protocol; besides cell viability, analysis ROS and the effect on cells morphology during time exposure of this new line of nanomaterials will be studied. Keywords: non-enzymatic sensor, magnetic nanoparticles, H2O2, hydroxyapatite, SAOS-2 cells, tissue regeneration. / Tesis

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-05-29Bitstream added on 2014-06-13T20:30:22Z : No. of bitstreams: 1 santos_irc_me_arafcf.pdf: 1670522 bytes, checksum: 94cf024bcd75478eee1c840ef55cc77f (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A família das anonáceas é composta por muitos gêneros e espécies; dentre essas, a atemóia (Annona cherimola Mill. X Annona squamosa L.), resultante do cruzamento entre a fruta-do-conde (Annona squamosa L.) e a cherimóia (Annona cherimola Mill.). No Brasil, a atemóia vem despertando grande interesse na produção/comercialização dos seus frutos; no entanto um dos obstáculos enfrentados é a facilidade de escurecimento enzimático que a fruta apresenta. Esse tem como responsável a polifenoloxidase (PPO, E.C. 1.14.18.1); que sob diferentes condições de armazenamento e processamento de vegetais na sua fase póscolheita pode atuar sob substratos naturais e resultar na formação de compostos escuros, acarretando diminuição do valor nutricional, modificação das propriedades organolépticas e sensoriais, com consequente rejeição. Os objetivos desse trabalho foram isolar, purificar e caracterizar algumas propriedades da polifenoloxidase de atemóia. Condições de extração para a PPO foram estabelecidas e a enzima foi isolada por precipitação com sulfato de amônio e eluição em Sephadex G-100. Somente um pico de atividade foi eluído no processo de purificação com um fator de purificação de 7,12. O peso molecular determinado foi 82 kDa com valores ótimos de pH 6,0 e 7,0 para 4-metil catecol e catecol, respectivamente; sendo estável por 12 e 24 horas à incubação na faixa de pH 4,0-8,0. A temperatura ótima de atividade foi 35°C e 28°C para 4-metil catecol e catecol, respectivamente. Os valores calculados de energia de ativação (Ea) para esses substratos foram 87,29 cal/mol-1 e 180,97 cal/mol-1. As constantes cinéticas Km e Vmax foram 5,52mmol/L e 1428,57 UA/mL, para 4-metil catecol, e 79,3 mmol/L e 5000 UA/mL, para catecol. A relação Km/Vmax determinou uma maior afinidade da enzima pelo primeiro substrato. A enzima mostrou desprezível atividade... / The family of annonaceae is composed of many genus and species, among these, the atemoya (Annona cherimola Mill. X Annona squamosa L.), resulting from a cross between custard apple (Annona squamosa L.) and cherimoya (Annona cherimola Mill.). In Brazil, the atemoya is attracting great interest in the production / marketing of its fruits, however one of the obstacles faced is the ease of enzymatic browning that gives the fruit. This is as responsible for polyphenoloxidase (PPO, EC 1.14.18.1), which under different conditions of storage and processing plant in its post-harvest can act on natural substrates and result in the formation of dark compounds, causing decrease in nutritional value, modification of the organoleptic and sensory properties, with consequent rejection. The objectives of this study were to isolate, purify and characterize some properties of polyphenoloxidase from atemoya. Conditions for the extraction of PPO were established and the enzyme was isolated by precipitation with ammonium sulfate and elution on Sephadex G-100. Only one peak of activity was eluted in the process of purification with a purification factor of 7.12. The molecular weight of 82 kDa was determined with the optimum values of pH 6.0 and 7.0 for 4-methylcatechol and catechol, respectively. The enzyme was stable for 12 and 24 hours incubation in the pH range 4.0-8.0. The optimum temperatures for activity were 35 °C and 28 °C for 4-methylcatechol and catechol, respectively. The values of activation energy (Ea) for these substrates cal/mol-1 were 87.29 and 180.97 cal/mol-1. The kinetic constants Km and Vmax were 5.52 mmol/L and 1428.57 UA/mL for 4-methylcatechol, and 79.3 mmol/L and 5000 AU / mL for catechol. The Km/Vmax determined a higher affinity of the enzyme by the first substrate. The enzyme showed negligible activity for caffeic acid and chlorogenic as any for L-DOPA, catechin... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-10-04Bitstream added on 2014-06-13T21:01:12Z : No. of bitstreams: 1 varella_sd_dr_arafcf.pdf: 406128 bytes, checksum: 731423647cfb057752f7d36b74cee720 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A exposição ocupacional a solventes orgânicos é um sério problema para milhares de trabalhadores. A literatura demonstra a ocorrência de um elevado risco de danos no material genético desses indivíduos, no entanto, os efeitos da mistura dos solventes orgânicos não são bem conhecidos. As diferenças genéticas (polimorfismos enzimáticos) também têm um importante papel na capacidade de ativação e de detoxificação de xenobióticos, incluindo os solventes orgânicos. As mutações causadas por agentes ambientais associadas aos diferentes genótipos, são fatores relacionados ao desenvolvimento de neoplasias e outras doenças degenerativas. O ensaio de mutagenicidade urinária indica a ocorrência de possíveis lesões préclínicas enquanto que a determinação dos polimorfismos enzimáticos mostra um perfil genético de risco. Assim, os profissionais da saúde envolvidos com a qualidade de vida do trabalhador, podem ter subsídios para o controle da exposição ocupacional e conseqüentemente evitar o aparecimento de doença (lesão clínica), principalmente o câncer. O trabalho diário num laboratório de pesquisa onde são utilizados vários tipos de solventes é igualmente preocupante. Diante disso, este estudo teve os seguintes objetivos: caracterizar a atividade mutagênica na urina de 30 indivíduos ocupacionalmente expostos a solventes orgânicos e indivíduos sem essa exposição (controles); identificar o polimorfismo constitucional desses indivíduos para os genes GSTM1, GSTT1 e CYP2E1 ; e tentar correlacionar a influência desses genótipos com a atividade mutagênica urinária. A coleta da urina foi realizada em frascos de polietileno durante o dia de trabalho, até a obtenção de aproximadamente 1000mL. Para a concentração e extração dos compostos presentes na urina foi usada a resina XAD-2 e o solvente acetona. Diferentes concentrações... / The occupational exposure to organic solvents is a serious problem to millions of workers. The reports shows a high risk of genetic damage on these workers. However, the effects of mixtures of solvents are not well known. The genetic differences (enzimatic polymorphisms) are very important for the capacity of activating and detoxifying carcinogens, such as organic solvents. Mutations caused by environmental agents associated with the different genotypes are related to cancer development and other degenerative diseases. The urinary mutagenicity assay shows pre-clinical damages while the enzimatic polymorphisms show a genetic risk profile. In this way, the health professionals can have subsity to occupational exposure control in order to avoid disease development (clinical damage), cancer especially. The work in a research laboratory that uses several types of solvents is equaly preocupating. In this way, in this study the genotyping approach was used to study the influence of the metabolic polymorphisms CYP2E1, GSTM1 and GSTT1 on urinary mutagenicity, detected with Salmonella/microsome assay, in 30 subjects exposed to solvents, and 30 subjects without occupational exposure (controls). Urine samples were collected in polyethylene containers at the end of the work shift. For the concentration and extraction of urine samples was used the XAD-2 resin and acetone as eluting agent. Different doses of extract (1.5; 3.0; 6.0 and 12.0 mL equivalents per plate) were tested on Salmonella typhimurium strains TA100 and YG1024, with and without metabolic activation. Genomic DNA was extracted from blood and the GSTM1, GSTT1 and CYP2E1-PstI genotypes were deternined using a PCR method. The mutagenic activity of urine samples from exposed workers shows a significant difference (p£ 0.05) when compared to those in the control group in the Salmonella typhimurium YG1024 with S9 mix... (Complete abstract, click electronic access below)

Resumo não disponível

Made available in DSpace on 2016-02-26T13:26:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 113.pdf: 1347460 bytes, checksum: 80440e5ca82280d37d179e0e683ccf9d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Antimoniais pentavalentes são considerados medicamentos de primeira linha no tratamento das diferentes formas de leishmaniose. O perfil de segurança dos medicamentos à base de antimônio (Sb), entretanto, ainda não foi completamente elucidado. O objetivo deste conjunto de estudos que constam desta tese foi fornecer informações adicionais sobre a segurança de um curso de tratamento com o antimoniato de meglumina (AM). O primeiro estudo investigou o acúmulo e eliminação do Sb do sangue e órgãos de ratos machos adultos tratados com uma dose diária de AM, por um período de 21 dias consecutivos. Foi observado que o antimônio é lentamente eliminado. O segundo estudo avaliou o desenvolvimento pós-natal da prole nascida e amamentada por ratas tratadas na gestação e lactação até o desmame com AM. A transferência de Sb através da placenta e via leite materno para a prole foi determinada. Os resultados mostraram, em geral, que o desenvolvimento pós-natal e a fertilidade dos ratos expostos não foram alterados. Os dados também sugerem que o Sb passa facilmente para o leite e está presente nesta matriz biológica em uma forma química que o torna bem absorvido pelos lactentes. Além disso, nós também investigamos se as atividades das enzimas citocromo P450 hepáticas (CYP), que participam do metabolismo de endo- e xenobióticos, foram alteradas pelo tratamento. Os resultados mostraram que um curso de tratamento de 24 dias com AM causou um consistente declínio das atividades de CYP1A no fígado de camundongos SW e DBA-2, e uma diminuição nas atividades de CYP2B9/10 nas fêmeas de SW, mas não em DBA-2 de ambos os sexos. / Não foram observadas outras alterações de atividade de CYPs (CYP2A5, 2E1, 3A11). Em síntese, os estudos aqui reunidos mostram que, após tratamento com antimoniais pentavalentes, níveis residuais de Sb persistem no fígado e outros órgãos por longo tempo. Os níveis de Sb são muito baixos no cérebro o que é consistente com a ausência de efeitos sobre o desenvolvimento neuromotor. O Sb é transferido para o leite materno e encontra-se nesta matriz biológica em forma que torna este metalóide biodisponível por via oral. Os resultados também mostraram que o acúmulo de Sb residual no fígado, exceto por discreto efeito depressor sobre CYP1A, não altera a atividade de monooxigenases. Este conjunto de dados amplia a base de dados disponível para avaliar a cinética de eliminação do Sb e a segurança do tratamento da leishmaniose com antimoniais pentavalentes. / Pentavalent antimony compounds are considered as first choice drugs to treat different clinical manifestations of leishmaniasis. The safety profile of antimony-based anti-leishmanial drugs, however, has not been entirely elucidated so far. The objective of the set of experimental studies presented in this thesis was to provide additional information on the safety of a course of treatment with meglumine antimoniate (MA). The first study was an investigation of the accumulation and clearance of antimony (Sb) in the blood and organs of adult male rats treated with a 21-day course of MA. It was observed that residual Sb is slowly eliminated from rat s organs and blood. The second study evaluated the postnatal development of the offspring born to and nursed by rats treated during gestation and lactation until weaning with MA. The transfer of Sb via placenta and mothers milk to the offspring was determined as well. Results showed that offspring postnatal development and fertility remained virtually unaltered after treatment with MA. Data suggested that Sb is transferred into breast milk and is present there in a chemical form that makes this metalloid bioavailable to suckling pups. Furthermore, we investigated whether activities of liver cytochrome P450 enzymes that take part in the metabolism of endogenous and exogenous substances were altered after a course of treatment with MA. It was found that a 24-d course of treatment with MA caused a consistent decline in CYP1A activity in the mouse liver. A decrease of CYP2B9/10 activity was noted in SW females but not in SW males and in DBA-2 of either sex.^ien / No other change of CYP activity (CYP2A5, 2E1, 3A11) was noted. In summary, data presented here showed that, after treatment with pentavalent antimonial drugs, residual levels of Sb remain in the liver and other tissues for a long time. Sb levels are low in the brain a finding that is consistent with the absence of effects of MA on the neuromotor development. Sb was transferred into breast milk and is found in this biological matrix in a chemical form that makes this metalloid bioavailable by the oral route. Results also showed that accumulation of residual levels of Sb in the liver, except for a mild depression of CYP1A, did not alter the activity of monooxygenases. The comprehensive set of experimental data presented adds to the database currently available for assessing the Sb elimination kinetics and the safety of pentavalent antimonial drugs used to treat leishmaniases. (AU)^ien