Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-08-08T13:33:11Z No. of bitstreams: 2 Tese - Márcia J. M. Maciel.pdf: 1847164 bytes, checksum: f13a405f00aadce7e4e1f61be4858081 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-08-08T13:33:52Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Márcia J. M. Maciel.pdf: 1847164 bytes, checksum: f13a405f00aadce7e4e1f61be4858081 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-08-08T13:34:08Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Márcia J. M. Maciel.pdf: 1847164 bytes, checksum: f13a405f00aadce7e4e1f61be4858081 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-08T13:34:08Z (GMT). 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The use of this residue needs to pre-treatment so that their structure need to be broken and the cellulose, hemicellulose and lignin are exposed to hydrolysis, and the sugars available for fermentation. lignocellulosic enzymes are the most efficient in degrading wood and lignocellulosic materials, among them: laccase, lignin peroxidase and manganese peroxidase, all produced by fungi basidiomycetes. This work aimed to verify the production of ethanol by wild yeast taken from ruminant animals and verify the genes of lignocellulosic enzymes of fungi basidiomycetes for the hydrolysis of sugarcane bagasse. To evaluate the fermentative capacity of the CBA-524 yeast and CBA-519 and Pichia stipitis, they were first inoculated in synthetic media containing D-xylose and D-glucose, and then hydrolyzed through sugarcane bagasse, produced by acid hydrolysis 1% H2SO4. The basidiomycete fungi Hexagonia glabra, Pycnoporus sanguineus, Trametes sp. and Pleurotus sp. had their lignocellulosic enzymes genes sequenced and compared in GenBank. The CBA-524 and CBA-519 yeasts were identified as Meyerozyma guilliermondii and Pichia kudriavzevii, respectively, they produced ethanol from sugarcane bagasse hydrolysate. The four fungi (Hexagonia glabra UEA, Pycnoporus sanguineus UEA, Trametes sp. UEA and Pleurotus sp. UEA) amplified the laccase gene, but with low similarity. The identified yeasts showed good production of second generation bioethanol. / O Brasil é o maior produtor de cana-de-açúcar do mundo e chega a produzir toneladas por ano, e cada tonelada gera aproximadamente 140 kg de bagaço no processo. Parte deste bagaço é queimado para gerar energia elétrica nas usinas. O excesso deste resíduo causa problemas ambientais e de armazenamento. O bagaço de cana-de-açúcar pode ser uma das matérias-primas para a produção do etanol de segunda geração, devido à sua disponibilidade e composição lignocelulósica. O uso deste resíduo necessita de pré-tratamento para que sua estrutura seja quebrada e a celulose, e a hemicelulose fiquem expostas para fermentação. Para transformar os açúcares em etanol é necessária a seleção apropriada de leveduras. As enzimas lignocelulolíticas são as mais eficientes em degradar madeira e materiais lignocelulósicos dentre elas: lacase, lignina peroxidase e manganês peroxidase, todas produzidas por fungos basidiomicetos. Assim, este trabalho teve como objetivo verificar a produção de etanol por leveduras selvagens isoladas de animais ruminantes e verificar os genes das enzimas lignocelulósicas de fungos basidiomicetos para a hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar. Para avaliar a capacidade fermentativa das leveduras CBA-524 e CBA-519 e Pichia stipitis CBS6054, foram inoculadas primeiro em meios sintéticos contendo D-xilose e D-glicose, e depois em meio hidrolisado de bagaço de cana de açúcar, produzido pela hidrólise ácida de H2SO4 a 1%. A levedura CBA-524 foi identificada como Meyerozyma guilliermondi e CBA-519 como Pichia kudriavzevii, e produziram 3.01 g/L e 3,05 g/L etanol a partir de hidrolisado de bagaço de cana respectivamente. As leveduras identificadas mostraram uma boa produção de bioetanol de segunda geração. Os fungos basidiomicetos Hexagonia glabra, Pycnoporus sanguineus, Trametes sp. e Pleurotus sp. tiveram seus genes produtores de enzimas lignocelulolíticas sequenciados e comparados no GenBank. Os quatro fungos (Hexagonia glabra UEA, Pycnoporus sanguineus UEA, Trametes sp UEA e Pleurotus sp UEA) amplificaram o gene de lacase, mas com baixa similaridade. Foi possível identificar dois genes de lignina peroxidase nos fungos Trametes sp UEA Pleurotus sp UEA.

Devido à praticidade do uso de enzimas na transformação de produtos, o desenvolvimento de tecnologias dos processos enzimáticos e sua utilização vêm crescendo na indústria devido às inúmeras aplicações em vários setores de importância econômica e saúde. Os fungos do gênero Pleurotus, conhecidos por fungos da podridão branca, sintetizam uma variedade de enzimas lignocelulolíticas que tem potencial para degradar/transformar diversos compostos poliméricos, entre eles a vinhaça oriunda da indústria sucroalcooleira. A proposta deste trabalho foi a de avaliar as enzimas lignocelulolíticas como lacase, peroxidase e manganês peroxidase, sintetizadas pelos fungos P. sajor-caju CCB 020, P. ostreatus e P. albidus CCB 068, cultivados em vinhaça e/ou bagaço de cana-de-açúcar umedecidos com vinhaça. A atividade dessas enzimas extracelulares foram avaliadas, a cada três dias, durante 30 dias, quanto a estabilidade com relação ao tempo, e relacionadas a capacidade de degradação do corante índigo. O cultivo dos fungos foi realizado a 28°C em incubadoras, com agitação para vinhaça in natura, e estacionária para o meio sólido. Após o cultivo, o sobrenadante ou a solução enzimática extraída, do meio sólido, com tampão citrato, foram utilizados. A descoloração do corante índigo foi testada em solução à 0,02%, a pH 4,5 e temperatura 35°C. As atividades variaram com o meio de cultivo e com as linhagens. A lacase teve picos de atividades entre 12º e 15º dias com valores variando de 384 a 1.463 UI L-1, no meio líquido e no meio sólido, picos ao 6° dia de cultivo, com valores de 4 a 40 UI L-1. A atividade da peroxidase teve pico aos, 12°, 15° e 21° dia de cultivo, conforme a linhagem do fungo e atividades entre 356 a 975 UI L-1. A atividade de MnP teve pico aos 12° e 18° dia e atividades de pico entre 2,24 a 174 UI L-1. Quanto a atividade específica P. sajor-caju produziu lacase e MnP com maior eficiência comparado com as outras linhagens, enquanto que P. albidus CCB 068, produziu peroxidases com maior eficiência. O cultivo em vinhaça in natura foi mais eficiente que em meio sólido com bagaço. As estabilidades das atividades enzimáticas variaram conforme a linhagem do fungo, tempo de cultivo e com o tempo de estocagem, de 1, 2 e 24 h na temperatura ambiente. A descoloração do índigo foi relacionada com a atividade enzimática de lacase e MnP para a linhagem do fungo P. sajor-caju CCB 020. Entretanto, como foi mostrado no estudo, os basidiomicetos P. sajor-caju CCB 020, P. ostreatus, P. albidus CCB 068 apresentaram uma descoloração da vinhaça foi possível observar que o fungo P. sajor-caju CCB 020 apresentou maior potencial de descoloração da vinhaça de aproximadamente 70%, em relação ao P. ostreatus e P. albidus CCB 068 tiveram resultado inferior. A descoloração da vinhaça com relação à absorbância é lida a 680 nm. Ambos fungos inoculados em meio contendo vinhaça + bagaço teve melhor resultado nos 3º, 6º, 9º, 12º, 21º e 30º dias, exceto aos 15º e 18º dias, onde o meio só com vinhaça teve melhor resultado, em ambos os comprimentos de onda (\'lâmbda\'). O P. sajor-caju CCB 020 inoculado em meio de vinhaça + bagaço foi melhor aos 9º e 12º dias, na eficiência da descoloração do corante com 83,56% a 77,56% dos resultados, para P. ostreatus foi melhor aos 6º e 12º dias, na descoloração do corante com 46,09% a 46,18% respectivamente, já para P. albidus CCB 068 resultado foi nos dias 6º e 9º dias (56,23% e 57,42%) / Due to the convenience of using enzymes in the processing of products, technology development of enzymatic processes and its use are growing in the industry because of numerous applications in various sectors of economic and health importance. The fungi of the genus Pleurotus synthesize a variety of lignocellulolytic enzymes that has the potential to degrade / transform various polymeric compounds, including vinasse originating from the sugar industry. The proposal is to evaluate lignocellulolytic enzymes such as laccase, peroxidase and MnP, synthesized by the fungi P. sajor-caju CCB 020, P. ostreatus and P.albidus CCB 068 cultivated in vinasse and /or sugarcane bagasse moistened with vinasse. The activity of these extracellular enzymes was evaluated every three days for 30 days with regard to stability in relation to time and related to the degradation ability of the indigo dye. The cultivation of the fungi was performed at 28°C in incubators, with stirring of vinasse in nature, and the solid medium was stationary. After culturing, the supernatant or the enzyme solution extracted from the solid medium with citrate buffer was used. Decolorization of the indigo dye was tested in solution at 0.02% at pH 4.5 and 35 °C temperature. The activities varied according to the culture medium and the strains. Laccase had peaks of activity between the 12th and 15th days with values ranging from 384 to 1463 UI L-1, in the liquid and solid medium with peaks at the 6th day of culture, with values ranging from 4 a 40 UI L-1. Peroxidase activity peaked at the 12th, 15th and 21st days of cultivation, according to the strain of the fungus and activities from 356 to 975 UI L-1. The MnP activity peaked at the 12th and 18th days and had peak activities from 2.24 to 174 IU L-1. The specific activity P. sajor-caju CCB 020 produced laccase and MnPmore efficiently when compared with the other strains, whereas P. albidus, produced peroxidases more efficiently. Cultivation in vinasse in nature was more efficient than cultivation in solid medium with sugar cane bagasse. The stabilities of the enzymaticactivities varied with the strain of the fungus, cultivation time and the storage time of 1, 2 and 24 h at room temperature. The indigo decolorization was related to the enzymatic activity of laccase and MnP for the strain of the fungus P. sajor-caju CCB 020. However, Pleurotus showed decolorization of vinasse, and it was noticed that P. sajor-caju CCB 020 showed greater potential for vinasse decolorization, about 70%, compared to the others that had lower results. The vinasse decolorization with respect to the absorbance is read at 680 nm. Both fungi inoculated in medium containing vinasse + bagasse had better results on the 3rd ,6th, 9th, 12th, 21st and 30th days, except on the 15th and 18th days when the medium with vinasse alone had better results in both wavelengths (\'lâmbda\'). The P. sajorcaju CCB 020 inoculated in the vinasse + bagasse medium was better on the 9thand 12th days, in the efficiency of decolorization of the dye with 83.56% to 77.56% of the results, for P. ostreatus it was better on the 6th and 12th days in decolorization of the dye with 46.09% and 46.18% respectively, while for P. albidus CCB 068 the result was on the 6th and 9th days (56.23% and 57.42%)

Devido à praticidade do uso de enzimas na transformação de produtos, o desenvolvimento de tecnologias dos processos enzimáticos e sua utilização vêm crescendo na indústria devido às inúmeras aplicações em vários setores de importância econômica e saúde. Os fungos do gênero Pleurotus, conhecidos por fungos da podridão branca, sintetizam uma variedade de enzimas lignocelulolíticas que tem potencial para degradar/transformar diversos compostos poliméricos, entre eles a vinhaça oriunda da indústria sucroalcooleira. A proposta deste trabalho foi a de avaliar as enzimas lignocelulolíticas como lacase, peroxidase e manganês peroxidase, sintetizadas pelos fungos P. sajor-caju CCB 020, P. ostreatus e P. albidus CCB 068, cultivados em vinhaça e/ou bagaço de cana-de-açúcar umedecidos com vinhaça. A atividade dessas enzimas extracelulares foram avaliadas, a cada três dias, durante 30 dias, quanto a estabilidade com relação ao tempo, e relacionadas a capacidade de degradação do corante índigo. O cultivo dos fungos foi realizado a 28°C em incubadoras, com agitação para vinhaça in natura, e estacionária para o meio sólido. Após o cultivo, o sobrenadante ou a solução enzimática extraída, do meio sólido, com tampão citrato, foram utilizados. A descoloração do corante índigo foi testada em solução à 0,02%, a pH 4,5 e temperatura 35°C. As atividades variaram com o meio de cultivo e com as linhagens. A lacase teve picos de atividades entre 12º e 15º dias com valores variando de 384 a 1.463 UI L-1, no meio líquido e no meio sólido, picos ao 6° dia de cultivo, com valores de 4 a 40 UI L-1. A atividade da peroxidase teve pico aos, 12°, 15° e 21° dia de cultivo, conforme a linhagem do fungo e atividades entre 356 a 975 UI L-1. A atividade de MnP teve pico aos 12° e 18° dia e atividades de pico entre 2,24 a 174 UI L-1. Quanto a atividade específica P. sajor-caju produziu lacase e MnP com maior eficiência comparado com as outras linhagens, enquanto que P. albidus CCB 068, produziu peroxidases com maior eficiência. O cultivo em vinhaça in natura foi mais eficiente que em meio sólido com bagaço. As estabilidades das atividades enzimáticas variaram conforme a linhagem do fungo, tempo de cultivo e com o tempo de estocagem, de 1, 2 e 24 h na temperatura ambiente. A descoloração do índigo foi relacionada com a atividade enzimática de lacase e MnP para a linhagem do fungo P. sajor-caju CCB 020. Entretanto, como foi mostrado no estudo, os basidiomicetos P. sajor-caju CCB 020, P. ostreatus, P. albidus CCB 068 apresentaram uma descoloração da vinhaça foi possível observar que o fungo P. sajor-caju CCB 020 apresentou maior potencial de descoloração da vinhaça de aproximadamente 70%, em relação ao P. ostreatus e P. albidus CCB 068 tiveram resultado inferior. A descoloração da vinhaça com relação à absorbância é lida a 680 nm. Ambos fungos inoculados em meio contendo vinhaça + bagaço teve melhor resultado nos 3º, 6º, 9º, 12º, 21º e 30º dias, exceto aos 15º e 18º dias, onde o meio só com vinhaça teve melhor resultado, em ambos os comprimentos de onda (\'lâmbda\'). O P. sajor-caju CCB 020 inoculado em meio de vinhaça + bagaço foi melhor aos 9º e 12º dias, na eficiência da descoloração do corante com 83,56% a 77,56% dos resultados, para P. ostreatus foi melhor aos 6º e 12º dias, na descoloração do corante com 46,09% a 46,18% respectivamente, já para P. albidus CCB 068 resultado foi nos dias 6º e 9º dias (56,23% e 57,42%) / Due to the convenience of using enzymes in the processing of products, technology development of enzymatic processes and its use are growing in the industry because of numerous applications in various sectors of economic and health importance. The fungi of the genus Pleurotus synthesize a variety of lignocellulolytic enzymes that has the potential to degrade / transform various polymeric compounds, including vinasse originating from the sugar industry. The proposal is to evaluate lignocellulolytic enzymes such as laccase, peroxidase and MnP, synthesized by the fungi P. sajor-caju CCB 020, P. ostreatus and P.albidus CCB 068 cultivated in vinasse and /or sugarcane bagasse moistened with vinasse. The activity of these extracellular enzymes was evaluated every three days for 30 days with regard to stability in relation to time and related to the degradation ability of the indigo dye. The cultivation of the fungi was performed at 28°C in incubators, with stirring of vinasse in nature, and the solid medium was stationary. After culturing, the supernatant or the enzyme solution extracted from the solid medium with citrate buffer was used. Decolorization of the indigo dye was tested in solution at 0.02% at pH 4.5 and 35 °C temperature. The activities varied according to the culture medium and the strains. Laccase had peaks of activity between the 12th and 15th days with values ranging from 384 to 1463 UI L-1, in the liquid and solid medium with peaks at the 6th day of culture, with values ranging from 4 a 40 UI L-1. Peroxidase activity peaked at the 12th, 15th and 21st days of cultivation, according to the strain of the fungus and activities from 356 to 975 UI L-1. The MnP activity peaked at the 12th and 18th days and had peak activities from 2.24 to 174 IU L-1. The specific activity P. sajor-caju CCB 020 produced laccase and MnPmore efficiently when compared with the other strains, whereas P. albidus, produced peroxidases more efficiently. Cultivation in vinasse in nature was more efficient than cultivation in solid medium with sugar cane bagasse. The stabilities of the enzymaticactivities varied with the strain of the fungus, cultivation time and the storage time of 1, 2 and 24 h at room temperature. The indigo decolorization was related to the enzymatic activity of laccase and MnP for the strain of the fungus P. sajor-caju CCB 020. However, Pleurotus showed decolorization of vinasse, and it was noticed that P. sajor-caju CCB 020 showed greater potential for vinasse decolorization, about 70%, compared to the others that had lower results. The vinasse decolorization with respect to the absorbance is read at 680 nm. Both fungi inoculated in medium containing vinasse + bagasse had better results on the 3rd ,6th, 9th, 12th, 21st and 30th days, except on the 15th and 18th days when the medium with vinasse alone had better results in both wavelengths (\'lâmbda\'). The P. sajorcaju CCB 020 inoculated in the vinasse + bagasse medium was better on the 9thand 12th days, in the efficiency of decolorization of the dye with 83.56% to 77.56% of the results, for P. ostreatus it was better on the 6th and 12th days in decolorization of the dye with 46.09% and 46.18% respectively, while for P. albidus CCB 068 the result was on the 6th and 9th days (56.23% and 57.42%)

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-13T17:40:40Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 102581 bytes, checksum: 6314ebfd93d2770787b8eabe59f04a49 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-13T17:40:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 102581 bytes, checksum: 6314ebfd93d2770787b8eabe59f04a49 (MD5) Previous issue date: 2003-12-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Lentinula edodes (Berk.) Pegler é um fungo incluído entre os causadores da podridão branca, que pode ser cultivado em toras de madeira maciça de eucalipto ou toras artificiais, formadas por casca de eucalipto, um resíduo ligninocelulósico abundante em indústrias de papel e celulose no Brasil. Este trabalho teve como objetivo determinar o perfil das enzimas ligninocelulolíticas de três isolados de L. edodes, UFV52, UFV52 e UFV77, crescidos em substrato a base de casca de eucalipto e, também, investigar os efeito da adição ao meio de crescimento desse fungo de compostos que aumentam a atividade ou síntese de lacase, visando a melhoria da eficiência no processo de degradação da lignina e celulose presentes no substrato. O monitoramento semanal das atividades durante 75 dias de crescimento em substrato constituído por 80% de casca de eucalipto e 20% de farelo de arroz, adicionado de CaCO 3 e CaSO 4 , demonstrou a existência da síntese de lacase, manganês peroxidase, celulase e lanase, mas não de lignina peroxidase. O isolado UFV52 foi o que apresentou maior atividade de lacase, e para ele determinou- vse que as concentrações de 2,6 mM de N, como NH 4 NO 3 e de 250 μM de Cu, como CuSO 4 , em meio de cultura líquido foram as que propiciaram a maior atividade desta enzima. A atividade de lacase foi três vezes maior do que a do tratamento controle em micélio crescido em meio de cultura adicionado de tartarato de amônia (55 μM), sem contudo aumentar a concentração de proteína solúvel. A vanilina (1 mM) e o ácido 3 hidróxi benzóico (1 mM) aumentaram a degradação da lignina e celulose, sem, contudo, modificar a atividade de lacase. O padrão eletroforético da lacase demostrou que o efeito do tartarato não foi o de indução de novas isoformas, mas sim o de aumentar a atividade da enzima presente. O aumento na atividade da lacase e na eficiência de utilização do substrato pelo L. edodes UFV52 não redundou em indução de corpos de frutificação do fungo. Assim, para a produção do fungo comestível há necessidade de se selecionar isolados de L. edodes adaptados ao cultivo em toras artificiais a base de casca de eucalipto. / Lentinula edodes (Berk.) Pegler belongs to the white rot fungi group, and can be cultivated in wood logs of eucalypt or artificial logs, made with eucalypt bark, a lignocellulosic residue abundant in the paper and pulp industry in Brazil. This study aimed to determine the lignocellulolytic enzymatic profile of three L. edodes isolates UFV52, UFV52 and UFV77 cultivated in eucalypt bark - based substrate and also to investigate the effects of the addition of compounds to the culture medium in increasing the activity or synthesis of laccase, in order to increase the efficiency in the lignin and cellulose degradation process. The enzymatic assays were performed weekly for 75 days in substrate made from 80% eucalypt bark and 20% rice bran, with the addition of CaCO 3 and CaSO 4 , and laccase, manganese peroxidase, xylanase and cellulase, but not lignin peroxidase, were determined. The isolate UFV52 presented the highest laccase activity, and, in liquid medium, the N (NH 4 NO 3 ) and Cu (CuSO 4 ) concentrations that provided the highest laccase activity were 2.6 mM and 250 μM, respectively. Laccase activity were three time higher in medium receiving xammonium tartrate (55 μM), but no increase in soluble protein level were observed. Vanillin (1 mM) and 3 hidroxy benzoic acid (1 mM) increased lignin and cellulose degradation without modifying laccase activity. The electrophoretic pattern of laccase demonstrated that ammonium tartrate did not induce new isoforms, but enhanced the activity of the constitutive form. The increase in laccase activity and in the efficiency of utilization of the substrate by L. edodes UFV52 did not induce mushrooms formation. In this way, for the mushroom production in eucalypt bark-based artificial logs there must be selected adapted L. edodes isolates.

Atualmente há grande interesse no desenvolvimento de processos enzimáticos eficientes para a hidrólise da biomassa lignocelulósica. O objetivo deste trabalho foi a otimização da produção por fermentação em estado sólido e a caracterização bioquímica, no extrato bruto, das -glucosidases, -xilosidases e xilanases produzidas por Colletotrichum graminicola e das lacases produzidas por Pycnoporus sanguineus. Também foi avaliado o potencial de aplicação dos extratos obtidos em coquetéis enzimáticos para a sacarificação de resíduos agroindustriais. A otimização das condições de cultivo, empregando a Metodologia de Superfície de Resposta, levou à produção de 159,3 ± 12,7 U g-1, 125,88 ± 6,4 U g-1, 378,1 ± 23,3 U g-1 e 138,6 ± 6,4 U g-1 de -glucosidases, -xilosidases, xilanases e lacases, respectivamente. Os meios de cultivo empregados foram constituídos por farelo de trigo suplementado com resíduos agroindustriais. Todas as enzimas produzidas apresentaram pH e temperatura ótimos de reação de 4,5-5,0 e 65ºC, respectivamente, bem como boa estabilidade térmica e ao pH. O coquetel composto pelos extratos brutos obtidos em condições otimizadas para a produção de xilanases (ECg) e lacases (EPs), em mistura com um extrato bruto de Trichoderma reesei rico em celulases (ETr) foi muito eficiente na sacarificação de palha de cana e papelão, sem pré-tratamento, atingindo rendimentos de 41,4 e 71,1% em glicose, respectivamente. Além disso, este coquetel foi mais eficiente na sacarificação de bagaço de cana explodido e in natura bem como de palha de cana in natura, quando comparado a um coquetel contendo celulases comerciais (Celluclast®) em mistura com ECg e EPs. Visando estudos futuros da ação individual de cada enzima sobre a biomassa, foi purificada uma -glucosidase majoritária de C. graminicola. A enzima mostrou temperatura e pH ótimos de reação de 5,0 e 65ºC, respectivamente, boa estabilidade térmica e ao pH, além da estimulação por xilose, propriedade muito interessante para emprego em coquetéis mistos de celulases e xilanases. Os resultados encontrados sugerem que as enzimas produzidas por C. graminicola e P. sanguineus, assim como os coquetéis enzimáticos avaliados, apresentam características muito interessantes para aplicações biotecnológicas, particularmente em processos de sacarificação da biomassa para obtenção de etanol celulósico. / There is currently a great interest in developing efficient processes for the enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass. The objective of this study was the optimization of the culture conditions for the production of -glucosidases, xylanases and -xylosidases by Colletotrichum graminicola and laccases by Pycnoporus sanguineus under solid state fermentation, followed by the biochemical characterization of the enzymes in the crude extracts. The potential of application of the extracts to compose enzyme cocktails for the saccharification of agroindustrial residues was also investigated. Optimization of the culture conditions using the Response Surface Methodology led to the production of 159.3 ± 12.7 U g - 1, 125.88 ± 6.4 U g- 1, 378.1 ± 23.3 U g - 1 and 138.6 ± 6.4 U g - 1 of -glucosidases, -xylosidases, xylanases and laccases, respectively. The culture media employed consisted mainly of wheat bran, supplemented with agroindustrial residues. All enzymes produced showed optimum pH and temperature of 4.5-5.0 and 65° C, respectively, as well as good thermal and pH stability. A cocktail composed of the crude extracts obtained under optimized conditions for the production of xylanases (ECg) and laccases (EPs), mixed with a Trichoderma reesei crude extract (ETr), rich in cellulases, was highly efficient for the saccharification of sugarcane trash and cardboard, without pretreatment, reaching yields of 41.4% and 71.1% in glucose, respectively. Moreover, this cocktail was more efficient than a cocktail composed of commercial cellulases (Celluclast ®) in combination with ECg and EPs for the saccharification of raw and steam exploded sugarcane bagasse, as well as raw sugarcane trash. Aiming future studies on the individual action of each enzyme on biomass, a majoritary -glucosidase from C. graminicola was purified. The enzyme showed optima of temperature and pH of 5.0 and 65° C, respectively, good thermal and pH stability, as well as stimulation by xylose, a very interesting property for its application in mixed cellulase-xylanase cocktails. The results suggested that the enzymes produced by C. graminicola and P. sanguineus, as well as the cocktails employed in this study, have good potential for biotechnological applications, particularly in biomass saccharification processes for cellulosic ethanol production.

Atualmente há grande interesse no desenvolvimento de processos enzimáticos eficientes para a hidrólise da biomassa lignocelulósica. O objetivo deste trabalho foi a otimização da produção por fermentação em estado sólido e a caracterização bioquímica, no extrato bruto, das -glucosidases, -xilosidases e xilanases produzidas por Colletotrichum graminicola e das lacases produzidas por Pycnoporus sanguineus. Também foi avaliado o potencial de aplicação dos extratos obtidos em coquetéis enzimáticos para a sacarificação de resíduos agroindustriais. A otimização das condições de cultivo, empregando a Metodologia de Superfície de Resposta, levou à produção de 159,3 ± 12,7 U g-1, 125,88 ± 6,4 U g-1, 378,1 ± 23,3 U g-1 e 138,6 ± 6,4 U g-1 de -glucosidases, -xilosidases, xilanases e lacases, respectivamente. Os meios de cultivo empregados foram constituídos por farelo de trigo suplementado com resíduos agroindustriais. Todas as enzimas produzidas apresentaram pH e temperatura ótimos de reação de 4,5-5,0 e 65ºC, respectivamente, bem como boa estabilidade térmica e ao pH. O coquetel composto pelos extratos brutos obtidos em condições otimizadas para a produção de xilanases (ECg) e lacases (EPs), em mistura com um extrato bruto de Trichoderma reesei rico em celulases (ETr) foi muito eficiente na sacarificação de palha de cana e papelão, sem pré-tratamento, atingindo rendimentos de 41,4 e 71,1% em glicose, respectivamente. Além disso, este coquetel foi mais eficiente na sacarificação de bagaço de cana explodido e in natura bem como de palha de cana in natura, quando comparado a um coquetel contendo celulases comerciais (Celluclast®) em mistura com ECg e EPs. Visando estudos futuros da ação individual de cada enzima sobre a biomassa, foi purificada uma -glucosidase majoritária de C. graminicola. A enzima mostrou temperatura e pH ótimos de reação de 5,0 e 65ºC, respectivamente, boa estabilidade térmica e ao pH, além da estimulação por xilose, propriedade muito interessante para emprego em coquetéis mistos de celulases e xilanases. Os resultados encontrados sugerem que as enzimas produzidas por C. graminicola e P. sanguineus, assim como os coquetéis enzimáticos avaliados, apresentam características muito interessantes para aplicações biotecnológicas, particularmente em processos de sacarificação da biomassa para obtenção de etanol celulósico. / There is currently a great interest in developing efficient processes for the enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass. The objective of this study was the optimization of the culture conditions for the production of -glucosidases, xylanases and -xylosidases by Colletotrichum graminicola and laccases by Pycnoporus sanguineus under solid state fermentation, followed by the biochemical characterization of the enzymes in the crude extracts. The potential of application of the extracts to compose enzyme cocktails for the saccharification of agroindustrial residues was also investigated. Optimization of the culture conditions using the Response Surface Methodology led to the production of 159.3 ± 12.7 U g - 1, 125.88 ± 6.4 U g- 1, 378.1 ± 23.3 U g - 1 and 138.6 ± 6.4 U g - 1 of -glucosidases, -xylosidases, xylanases and laccases, respectively. The culture media employed consisted mainly of wheat bran, supplemented with agroindustrial residues. All enzymes produced showed optimum pH and temperature of 4.5-5.0 and 65° C, respectively, as well as good thermal and pH stability. A cocktail composed of the crude extracts obtained under optimized conditions for the production of xylanases (ECg) and laccases (EPs), mixed with a Trichoderma reesei crude extract (ETr), rich in cellulases, was highly efficient for the saccharification of sugarcane trash and cardboard, without pretreatment, reaching yields of 41.4% and 71.1% in glucose, respectively. Moreover, this cocktail was more efficient than a cocktail composed of commercial cellulases (Celluclast ®) in combination with ECg and EPs for the saccharification of raw and steam exploded sugarcane bagasse, as well as raw sugarcane trash. Aiming future studies on the individual action of each enzyme on biomass, a majoritary -glucosidase from C. graminicola was purified. The enzyme showed optima of temperature and pH of 5.0 and 65° C, respectively, good thermal and pH stability, as well as stimulation by xylose, a very interesting property for its application in mixed cellulase-xylanase cocktails. The results suggested that the enzymes produced by C. graminicola and P. sanguineus, as well as the cocktails employed in this study, have good potential for biotechnological applications, particularly in biomass saccharification processes for cellulosic ethanol production.

A inoculação de forrageiras com fungos lignocelulolíticos é uma alternativa para melhorar a qualidade destas sem adição de substâncias químicas. Este projeto visa melhorar a degradabilidade de seis forrageiras: Brachiaria decumbens cv. Basilisk, Pennisetum purpureum Schum. cv. Napier, Panicum maximum cv. Aruana, Cenchrus ciliares cv. Buffel, bagaço de cana-de-açúcar e cana-de-açúcar picada por meio do cultivo de quatro fungos do gênero Pleurotus. Outrossim, extrato enzimático, nas concentrações de 2, 4 e 6 mL, produzido pelo fungo P. sajor-caju CCB 020 crescido em vinhaça, durante 6º, 12º e 18º dias, foram aplicados às mesmas forrageiras. As avaliações das dietas foram pela técnica de produção de gases, degradabilidade in vitro e análise bromatológica do substrato. As atividades das enzimas Lacase, Peroxidase, Manganês Peroxidase, Endoglucanase, Exoglucanase e Xilanase foram determinadas, por um período de 24 dias. Os resultados foram estatisticamente avaliados, utilizando SAS® (Statistical Analysis System Inst., Cary, North Carolina). Os fungos crescidos nas forrageiras, produziram enzimas hidrolíticas e oxidativas durante o processo de fermentação, que atuaram na transformação das forrageiras. A quantidade de proteínas aumentou significativamente na cana-de-açúcar picada e capim Buffel, inoculados com os fungos P. ostreatus e P. albidus CCB 068. A forrageira Aruana foi a que melhor respondeu ao tratamento com fungo, sendo que com P. sajor-caju, ao 18º dia de incubação, teve a concentração de acetato 1,24 vezes maior, em relação a amostra controle, e as demais concentrações de AGCC, como propionato e butirato, diminuir e a razão C2:C3 aumentou. A cana-de-açúcar incubada com P. albidus CCB 068, ao 18º dia, diminuiu as concentrações de acetato, propionato e butirato e aumentou a razão C2:C3 em 0,86 - 0,58 - 0,71 - 1,48 vezes, respectivamente. O bagaço inoculado ao 24º dia com P. albidus provocou aumento nas concentrações de acetato, propionato e butirato e diminuição na razão C2:C3, em 1,14 - 1,75 - 1,32 - 0,64 vezes, respectivamente, e com P. ostreatus mostrou o mesmo comportamento. Com os demais tratamentos nenhum efeito significativo foi observado, pelo teste de Tukey a 5%, entretanto ocorre tendência de aumentar a razão C2:C3 com o tratamento com os fungos. Na produção de gases e degradabilidade in vitro das forrageiras, utilizando os extratos enzimáticos, ocorreu aumento com a concentração aplicada. Efeitos significativos foram observados para as forrageiras Brachiaria, Napier e Aruana, já as forrageiras Buffel, bagaço de cana-de-açúcar e cana-de-açúcar picada não mostraram diferenças significativas, pelo teste de Tukey a 5%. Diferenças nas análises de AGCC não foram significativas, pelo teste de Tukey a 5%, dentro das concentrações ou período de incubação do fungo, nas seis forrageiras, entretanto há uma interação com as atividades das enzimas e pela razão C2:C3 a maior concentração testada de 6 mL, do extrato com o fungo, incubado durante 12º dias, possam ser recomendadas para obtenção de ganho nutricional das dietas. Conclui-se que tanto os fungos inoculados nas forrageiras, como seus extratos enzimáticos foram capazes de modificar a composição bromatológica original das forrageiras. A degradabilidade, ganho nutricional e sustentabilidade ambiental, podem variar substancialmente para os diferentes tipos de forrageiras, espécie de fungo e tempo de incubação. Os resultados obtidos sugerem que os Pleurotus, é um fungo apropriado para melhorar o valor nutritivo das forragerias como alimento para ruminates, melhorando a composição bromatoligica, mas também aumentando a degradabilidade / The inoculation of forages with lignocellulolytic fungi is an option for improving quality without adding chemical products. This project aims to improve the degradability of six forages: Brachiaria decumbens cv. Basilisk, Pennisetum purpureum Schum. Cv. Napier, Panicum maximum cv. Aruana, Cenchrus ciliares cv. Buffel, sugarcane bagasse and chopped sugarcane by cultivating four fungi of the genus Pleurotus. In addition, enzymatic extract, at concentrations of 2, 4 and 6 mL, produced by P. sajor-caju CCB 020, developed in vinasse, during 6, 12 and 18 days were applied to the same forages. The evaluations of the diets were by in vitro technique of gas production and bromatological analysis of the substrate. The activities of the enzymes Lacase, Peroxidase, Manganese Peroxidase, Endoglucanase, Exoglucanase and Xylanase were determined, for a period of 24 days. The results were statistically evaluated by SAS® analysis (Statistical Analysis System Inst., Cary, North Carolina). The fungi grown in the forages, produced hydrolytic and oxidative enzymes during the fermentation process that worked in forage transformation. The amount of proteins increased significantly in the chopped sugarcane and Buffel, inoculated with P. ostreatus and P. albidus CCB 068 fungi. The Aruana grass was the one that responded better to fungi treatments. With P. sajor-caju at the 18th day of incubation, the concentration of acetate was 1.24 times higher than the control sample, and the concentrations of other short chain fatty acids (SCFA), such as propionate and butyrate, tended to decrease and the C2:C3 ratio increased. Sugarcane incubated with P. albidus CCB068 at day 18 decreased acetate, propionate and butyrate concentrations and increased the C2:C3 ratio in 0.86, 0.58, and 0.71 - 1.48 fold, respectively. The bagasse inoculated at the 24th day with P. albidus caused an increase in acetate, propionate and butyrate concentrations and a decrease in the C2:C3 ratio in 1.14, 1.75, and 1.32 - 0.64 fold, respectively, and with P. ostreatus showed the same behavior. With the other treatments, no significant effect was observed by the Tukey test. However, there is a tendency to increase the C2:C3 ratio with the fungus treatment. In the production of gases and in vitro degradability of forages, using the enzymatic extracts, an increase with the applied concentrations occurred. Significant effects were observed for the Brachiaria forage at 5%, while forage Buffel, sugarcane bagasse and chopped sugarcane did not show significant differences by Tukey\'s test at 5%. Differences in the SCFA analyzes were not significant, by the Tukey\'s test at 5%, within the concentrations or incubation period of the fungus, in the six forages studied. However there is an interaction with the activities of the enzymes and the C2:C3, the highest concentration tested (6 mL) of the fungi extracts, incubated for 12 days, can be recommended to obtain increase in nutritional value of the diets. It is concluded that both the fungi inoculated on the forage and their enzymatic extracts were able to modify the original bromatological composition of the forage. The degradability, increase of nutritional value and environmental sustainability, can vary substantially for different types of forages, species of fungus and incubation time. The results suggest that Pleurotus is an appropriate fungus for improving the nutritive value of forage crops as feed for ruminates, improving the bromatoligic composition, but also enhancing the degradability

A inoculação de forrageiras com fungos lignocelulolíticos é uma alternativa para melhorar a qualidade destas sem adição de substâncias químicas. Este projeto visa melhorar a degradabilidade de seis forrageiras: Brachiaria decumbens cv. Basilisk, Pennisetum purpureum Schum. cv. Napier, Panicum maximum cv. Aruana, Cenchrus ciliares cv. Buffel, bagaço de cana-de-açúcar e cana-de-açúcar picada por meio do cultivo de quatro fungos do gênero Pleurotus. Outrossim, extrato enzimático, nas concentrações de 2, 4 e 6 mL, produzido pelo fungo P. sajor-caju CCB 020 crescido em vinhaça, durante 6º, 12º e 18º dias, foram aplicados às mesmas forrageiras. As avaliações das dietas foram pela técnica de produção de gases, degradabilidade in vitro e análise bromatológica do substrato. As atividades das enzimas Lacase, Peroxidase, Manganês Peroxidase, Endoglucanase, Exoglucanase e Xilanase foram determinadas, por um período de 24 dias. Os resultados foram estatisticamente avaliados, utilizando SAS® (Statistical Analysis System Inst., Cary, North Carolina). Os fungos crescidos nas forrageiras, produziram enzimas hidrolíticas e oxidativas durante o processo de fermentação, que atuaram na transformação das forrageiras. A quantidade de proteínas aumentou significativamente na cana-de-açúcar picada e capim Buffel, inoculados com os fungos P. ostreatus e P. albidus CCB 068. A forrageira Aruana foi a que melhor respondeu ao tratamento com fungo, sendo que com P. sajor-caju, ao 18º dia de incubação, teve a concentração de acetato 1,24 vezes maior, em relação a amostra controle, e as demais concentrações de AGCC, como propionato e butirato, diminuir e a razão C2:C3 aumentou. A cana-de-açúcar incubada com P. albidus CCB 068, ao 18º dia, diminuiu as concentrações de acetato, propionato e butirato e aumentou a razão C2:C3 em 0,86 - 0,58 - 0,71 - 1,48 vezes, respectivamente. O bagaço inoculado ao 24º dia com P. albidus provocou aumento nas concentrações de acetato, propionato e butirato e diminuição na razão C2:C3, em 1,14 - 1,75 - 1,32 - 0,64 vezes, respectivamente, e com P. ostreatus mostrou o mesmo comportamento. Com os demais tratamentos nenhum efeito significativo foi observado, pelo teste de Tukey a 5%, entretanto ocorre tendência de aumentar a razão C2:C3 com o tratamento com os fungos. Na produção de gases e degradabilidade in vitro das forrageiras, utilizando os extratos enzimáticos, ocorreu aumento com a concentração aplicada. Efeitos significativos foram observados para as forrageiras Brachiaria, Napier e Aruana, já as forrageiras Buffel, bagaço de cana-de-açúcar e cana-de-açúcar picada não mostraram diferenças significativas, pelo teste de Tukey a 5%. Diferenças nas análises de AGCC não foram significativas, pelo teste de Tukey a 5%, dentro das concentrações ou período de incubação do fungo, nas seis forrageiras, entretanto há uma interação com as atividades das enzimas e pela razão C2:C3 a maior concentração testada de 6 mL, do extrato com o fungo, incubado durante 12º dias, possam ser recomendadas para obtenção de ganho nutricional das dietas. Conclui-se que tanto os fungos inoculados nas forrageiras, como seus extratos enzimáticos foram capazes de modificar a composição bromatológica original das forrageiras. A degradabilidade, ganho nutricional e sustentabilidade ambiental, podem variar substancialmente para os diferentes tipos de forrageiras, espécie de fungo e tempo de incubação. Os resultados obtidos sugerem que os Pleurotus, é um fungo apropriado para melhorar o valor nutritivo das forragerias como alimento para ruminates, melhorando a composição bromatoligica, mas também aumentando a degradabilidade / The inoculation of forages with lignocellulolytic fungi is an option for improving quality without adding chemical products. This project aims to improve the degradability of six forages: Brachiaria decumbens cv. Basilisk, Pennisetum purpureum Schum. Cv. Napier, Panicum maximum cv. Aruana, Cenchrus ciliares cv. Buffel, sugarcane bagasse and chopped sugarcane by cultivating four fungi of the genus Pleurotus. In addition, enzymatic extract, at concentrations of 2, 4 and 6 mL, produced by P. sajor-caju CCB 020, developed in vinasse, during 6, 12 and 18 days were applied to the same forages. The evaluations of the diets were by in vitro technique of gas production and bromatological analysis of the substrate. The activities of the enzymes Lacase, Peroxidase, Manganese Peroxidase, Endoglucanase, Exoglucanase and Xylanase were determined, for a period of 24 days. The results were statistically evaluated by SAS® analysis (Statistical Analysis System Inst., Cary, North Carolina). The fungi grown in the forages, produced hydrolytic and oxidative enzymes during the fermentation process that worked in forage transformation. The amount of proteins increased significantly in the chopped sugarcane and Buffel, inoculated with P. ostreatus and P. albidus CCB 068 fungi. The Aruana grass was the one that responded better to fungi treatments. With P. sajor-caju at the 18th day of incubation, the concentration of acetate was 1.24 times higher than the control sample, and the concentrations of other short chain fatty acids (SCFA), such as propionate and butyrate, tended to decrease and the C2:C3 ratio increased. Sugarcane incubated with P. albidus CCB068 at day 18 decreased acetate, propionate and butyrate concentrations and increased the C2:C3 ratio in 0.86, 0.58, and 0.71 - 1.48 fold, respectively. The bagasse inoculated at the 24th day with P. albidus caused an increase in acetate, propionate and butyrate concentrations and a decrease in the C2:C3 ratio in 1.14, 1.75, and 1.32 - 0.64 fold, respectively, and with P. ostreatus showed the same behavior. With the other treatments, no significant effect was observed by the Tukey test. However, there is a tendency to increase the C2:C3 ratio with the fungus treatment. In the production of gases and in vitro degradability of forages, using the enzymatic extracts, an increase with the applied concentrations occurred. Significant effects were observed for the Brachiaria forage at 5%, while forage Buffel, sugarcane bagasse and chopped sugarcane did not show significant differences by Tukey\'s test at 5%. Differences in the SCFA analyzes were not significant, by the Tukey\'s test at 5%, within the concentrations or incubation period of the fungus, in the six forages studied. However there is an interaction with the activities of the enzymes and the C2:C3, the highest concentration tested (6 mL) of the fungi extracts, incubated for 12 days, can be recommended to obtain increase in nutritional value of the diets. It is concluded that both the fungi inoculated on the forage and their enzymatic extracts were able to modify the original bromatological composition of the forage. The degradability, increase of nutritional value and environmental sustainability, can vary substantially for different types of forages, species of fungus and incubation time. The results suggest that Pleurotus is an appropriate fungus for improving the nutritive value of forage crops as feed for ruminates, improving the bromatoligic composition, but also enhancing the degradability

Submitted by Johnny Rodrigues (johnnyrodrigues@ufcg.edu.br) on 2018-04-30T15:58:21Z No. of bitstreams: 1 PATRÍCIA MARINHO SAMPAIO ABREU - DISSERTAÇÃO PPGEQ 2014..pdf: 1386986 bytes, checksum: 53c5cb13c63d39fea994a27eb67bd701 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-30T15:58:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PATRÍCIA MARINHO SAMPAIO ABREU - DISSERTAÇÃO PPGEQ 2014..pdf: 1386986 bytes, checksum: 53c5cb13c63d39fea994a27eb67bd701 (MD5) Previous issue date: 2014-08-08 / Capes / Este trabalho teve por objetivo produzir as enzimas lacase e endoglicanase (CMCase) por meio da fermentação em estado sólido (FES) utilizando resíduos agroindustriais sob ação do fungo Psilocybe castanella CCIBt 2781. O fungo foi previamente crescido em MEA 2% e inoculado em substratos a base de palha de milho verde suplementado com cana-de-açúcar e bagaço de coco verde suplementado com farinha de soja nas proporções adequadas para se obter C/N 90, mediadores óleo vegetal (1 mL), Tween 80 (0,1 mL), RBBR 2% (1 mL) e 70% de umidade a 28ºC, por 60 dias. A extração enzimática foi feita em tampão acetato de sódio, pH 4,8. A atividade de lacase foi determinada pela oxidação do ABTS, e a atividade de endoglicanase determinada por meio da dosagem dos açúcares redutores produzidos na degradação enzimática da carboximetilcelulose (CMC). Obteve-se a produção de lacase pelo fungo Psilocybe castanella CCIBt 2781 sob as diferentes condições de cultivo. Uma maior produtividade foi alcançada quando o meio foi suplementado com soja. O pico de atividade de lacase ocorreu em torno do 30º dia de fermentação (113,12 U/L), contendo coco como fonte de carbono, suplementado com soja como fonte de nitrogênio, sob ação de todos os mediadores. Para o substrato a base de milho e cana, os maiores valores de atividade, foi de 98,25 U/L em 60 dias, para o mesmo tratamento. A maximização da produção de endoglicanase (0,29 U/g) ocorreu apenas para o substrato a base de milho e cana, em 45 dias, sob a influência do corante têxtil RBBR. Esses resultados mostram que a bioconversão desses resíduos sob fermentação em estado sólido (FES) é uma forma viável de obtenção das enzimas lignocelulolíticas e possuem aplicabilidade na área biotecnológica. Os dados obtidos neste estudo permitiram também evidenciar a capacidade de P. castanella CCIBt 2781de degradar o corante Azul Brilhante Remazol R em meio de cultura utilizado, durante o intervalo de tempo de 45 dias, havendo total descoloração do corante após esse período. / This study aimed to produce the enzymes laccase and endoglucanase (CMCase) by solid state fermentation (SSF) using agro-industrial residues by the action of the fungus Psilocybe castanella CCIBt 2781. Fungus was previously grown on 2% MEA substrates and inoculated into the background of green maize straw supplemented with sugar cane bagasse and coconut supplemented with soybean meal in the proper proportions to obtain C/N 90, mediators vegetable oil (1 ml), Tween 80 (0,1 mL), RBBR 2% (1 mL) and 70% humidity at 28°C for 60 days. The enzyme extraction was performed in sodium acetate buffer, pH 4,8. The laccase activity was determined by oxidation of ABTS, and the activity of endoglucanase determined by dosage of the reducing sugars produced in the enzymatic degradation of carboxymethylcellulose (CMC). Obtained the production of laccase by the fungus Psilocybe castanella CCIBt 2781 under different culture conditions. A higher yield was achieved when the medium was supplemented with soy. The peak activity of laccase occurred around the 30th day of fermentation (113,12 U/L), containing coconut oil as carbon source, supplemented with soy as nitrogen source, under the action of all mediators. For the substrate from corn and sugarcane, the highest values of activity was 98,25 U/L in 60 days for the same treatment. Maximising production of endoglucanase (0,29 U/g) was observed only for the substrate from corn and sugar cane, in 45 days, under the influence of textile dye RBBR. These results show that the bioconversion of these wastes in solid state fermentation (SSF) is a feasible way of obtaining lignocellulolytic enzymes form and have applicability in biotechnology field. The results of this study also allowed to show the ability of P. castanella CCIBt 2781de degrade Remazol Brilliant Blue R dye in used culture medium during the time interval of 45 days, resulting in complete decolorization after this period.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 807100 bytes, checksum: 0492f1cb907f9d50a51882efd7f76fcd (MD5) Previous issue date: 2012-02-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Three thermophilic lignocellulolytic microbial communities were selected by enriched method with continual subcultivation at 55 °C. One community was selected from cow manure compost, another from decaying sugar cane bagasse, and the last one was obtained by mixing aliquots of the culture suspension from the first two. Those communities were able to degrade a cellulosic strip in three cultivation days. Evaluating the maximal day of CMCase and xylanase activity, it was observed that the mixed consortium showed the best results, with CMCase activity of 0.09 U mg-1 at the second day of cultivation, and xylanase activity of 2.86 U mg-1 at the fourth day. These enzymes were partially characterized with relation to temperature and pH of optimal activity. It was observed that CMCase showed the highest activity at 60 °C and pH 5.4, and kept 80% of its activity in a pH range of 4.5-6.5. On the other hand, the best activity for xylanase was verified at 65 °C, and in that same pH range, the enzyme kept 97% of its residual activity. Cell-free extract was concentrated by ultrafiltration. The enzymatic cocktail obtained showed CMCase activity 25-fold higher and xylanase activity 55-fold higher than the crude enzymatic extract. The cocktail was conserved by adding 50% glycerol. After storage for 60 days at 4 °C, xylanase kept 80% of the initial activity and CMCase didn t show loss of activity when kept at 25 °C for the same period. The mixed community cellular mass constitutes an inoculant able to maintain the cellulolytic phenotype after rapid freezing and storage at - 80 °C for 60 days. Fed-batch essay suggested that this community has potential to be manipulated in order to continuously hold the cellulolytic enzymes expression over time. The results evidenced the acquisition of an enzymatic cocktail from an inoculant which cellulolytic activity supported pH changes and optimal activity around 60 °C. / Três comunidades microbianas lignocelulolíticas e termofílicas foram selecionadas por subcultivo em meio de enriquecimento a 55 °C. Uma comunidade foi selecionada a partir de esterco de gado em compostagem, outra de bagaço de cana em decomposição e a terceira foi obtida a partir da mistura de alíquotas do meio de cultivo das duas anteriores. Tais comunidades apresentavam a característica de decompor uma fita de celulose em três dias de cultivo. Ao se avaliar o dia de máxima atividade CMCase e xilanase em cada comunidade, verificou-se que os melhores resultados foram encontrados no consórcio misto, com atividade de 0,09 U mg-1 para CMCase no segundo dia de cultivo e 2,86 U mg-1 para xilanase no quarto dia. Essas enzimas foram parcialmente caracterizadas em relação à temperatura e pH ótimos de atuação. Verificou-se que CMCase apresentou maior atividade a 60 °C e pH 5,4, e manteve 80% de sua atividade numa faixa de pH de 4,5 a 6,5. Já para a xilanase, a temperatura ótima foi de 65 °C e nessa mesma faixa de pH manteve uma atividade residual de 97%. O extrato livre de células foi concentrado por ultrafiltração e obteve-se um coquetel enzimático com atividade de CMCase e xilanase maior que no extrato bruto cerca de 25 e 55 vezes, respectivamente. O coquetel foi conservado pela adição de 50% de glicerol. Após 60 dias de armazenamento a 4 °C, a xilanase manteve 80% de sua atividade inicial e a CMCase não apresentou perda de atividade quando mantida a 25 °C pelo mesmo período. A massa celular da comunidade mista constitui um inoculante capaz de manter o fenótipo celulolítico após congelamento rápido e armazenamento a - 80 °C por 60 dias. Ensaio em batelada alimentada mostrou que essa comunidade apresenta potencial para ser manipulada a fim de se manter continuamente a expressão de enzimas celulolíticas ao longo do tempo. Os resultados mostraram que foi possível obter um coquetel de enzimas a partir do inoculante, cuja atividade celulolítica tolerou variações de pH e temperatura ótima em torno de 60 °C.