A Pasteurella multocida é o agente causador da pasteurelose pulmonar dos suínos, sendo comum a ocorrência dessa infecção associada com o Mycoplasma hyopneumoniae no curso da pneumonia enzoótica. O agente é encontrado em pulmões de várias espécies animais e no homem. A infecção de suínos com o circovírus suíno tipo 2 (PCV2) causa uma forma de infecção sistêmica com profundos efeitos no sistema linfóide, causando prejuízos aos processos normais de defesa e facilitando a instalação de infecções secundárias, incluindo a pneumonia enzoótica complicada pela Pasteurella multocida. O objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar amostras de P. multocida obtidas de suínos com sinais clínicos compatíveis com os da circovirose e de animais de frigorífico quanto ao seu perfil bioquímico, capsular e sensibilidade a antimicrobianos. Foram utilizados 453 materiais (pulmões e suabes das lesões pulmonares), resultando em 115 isolados bacterianos de 79 pulmões. Paralelamente, procurou-se avaliar a eficiência do isolamento da bactéria a partir de dois sítios de amostragem no pulmão: do exsudato bronquial e da superfície de corte pulmonar. Numa amostragem dos casos, procurou-se estabelecer a relação entre a infecção com PCV2 e as lesões pulmonares induzidas pela P. multocida. Numa análise do grau de pneumonia foram classificadas 38 lesões como leves, 19 como médias e 15 graves. Na análise bacteriológica, todas as amostras foram positivas para o teste da catalase e oxidase e negativas para o citrato e H2S, e 11,3% foram negativas ao teste do indol. Utilizando-se os substratos sorbitol, manitol, trealose, maltose e arabinose foram observados seis perfis distintos. O tipo capsular A esteve presente em 93,91% das amostras e o tipo D em 6,09%. Nenhuma das amostras possuía o gene codificador da toxina dermonecrótica (toxA) e a resistência antimicrobiana foi baixa e a oxitetraciclina o princípio ativo com maior resistência 15,65%. / Pasteurella multocida is the etiologic agent of swine respiratory pasteurellosis and the infection occurs specially associated with Mycoplasma hyopneumoniae in the course of enzootic pneumonia. The agent can be isolated from the lung of several animal species and man. Infection of pigs with porcine circovirus (PCV2) causes a systemic infection with deep effects on the lymphoid system (porcine multisystemic wasting syndrome, PMWS), resulting in impairment of the normal defense processes and facilitating secondary infections, including enzootic pneumonia complicated with Pasteurella multocida. The objective of the present work was to isolate and characterize strains of P. multocida obtained from pigs with clinical signs compatible with PMWS and from slaughter pigs, considering biochemical profile, capsular typing and antibiotic sensitivity testing. A total of 453 materials (lungs and swabs from lung lesions) were used, resulting in 115 bacterial isolates from 79 lungs. At the same time, the efficiency of the isolation of the bacteria from two different sites in the lung was assessed: bronchial exudate and the cut surface of the lung. In a sample of the cases it was tried to establish the relationship between PCV2 infection and lung lesions induced by P. multocida. Analyzing degrees of pneumonia, 38 lesions were classified as mild, 19 as intermediate and 15 as severe. In the bacteriological analysis, all strains were positive for catalase and oxidase, and negative for citrate and H2S, and 11.3 were negative in the indole test. Using sugar fermentation (sorbitol, manitol, trealose, maltose and arabinose) six different profiles were established. Capsular type A was diagnosed in 93.91% of the samples and type D in 6.09%. All strains were negative for the gene codifying dermonecrotic toxin (toxA). Antimicrobial resistance was low, and tetracycline was the product showing higher resistance (15.65%).

Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica, enfermidade distribuída mundialmente em rebanhos suínos nas fases de crescimento e terminação. A pneumonia enzoótica tem sido considerada uma das mais importantes causas de perdas econômicas na suinocultura mundial. Tendo em vista a disponibilidade dos genomas completos de três linhagens diferentes de M. pneumoniae, sendo duas patogênicas (linhagens 7448 e 232) e outra não patogênica (linhagem J) e a ausência de sistemas genéticos adequados para o estudo destes genomas, é necessidade emergente o desenvolvimento de ferramentas genéticas funcionais neste organismo. Atualmente, cinco espécies de micoplasmas possuem vetores replicativos disponíveis para transformação. No entanto nenhum deles possui a oriC de M. hyopneumoniae, e estudos sugerem que estes vetores são espécie-específicos e não seriam replicados em M. hyopneumoniae. Este trabalho teve como objetivos a construção de um vetor replicativo e o desenvolvimento de um sistema para transformação de M. hyopneumoniae. Os resultados alcançados constituem uma etapa prévia e imprescindível para o estudo de supostas regiões promotoras nesta espécie. O plasmídio replicativo pOSTM construído neste trabalho foi obtido a partir do vetor pUC18, adicionando-se a origem de replicação de M. hyopneumoniae e o cassete de expressão do gene de resistência à tetraciclina (tetM), controlado pelo promotor do gene da espiralina de Spiroplasma citri. A transformação foi realizada através de eletroporação e as células transformantes foram selecionadas pelo fenótipo de resistência à tetraciclina. Os transformantes resistentes à tetraciclina foram confirmados através da amplificação por PCR de porção do vetor inserido nas células. Tal comprovação permite concluir que o M. hyopneumoniae é um organismo susceptível à transformação e que o determinante tetM heterólogo é funcional neste patógeno. / Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of enzootic pneumonia of pigs.The disease has a worldwide distribution in growing and finishing pigs. The enzootic pneumonia has been considered one of the most important causes of economic losses in the worldwide swine breeding. The now available complete sequences of the genomes of two pathogenic (7448 and 232) and one non-pathogenic strain (J) of M. hyopneumoniae and the lack of suitable genetic systems to study these genomes points to the emergent need for the development of functional genetic tools for this organism. Currently, there are replicating vectors available for five species of mycoplasmas. However none of them posses oriC of M. hyopneumoniae, and studies suggest that these vectors are species-specific and they would not be functional in M. hyopneumoniae. The aim of the present study was to construct a replicating vector and the development of a system for transformation of M. hyopneumoniae. These constitute a previous and essential stage for the study of putative promoter regions in this species. To construct the replicating plasmid pOSTM the oriC of M. hyopneumoniae and the expression cassette containing the gene for tetracycline resistance (tetM), controlled by spiralin gene promoter of Spiroplasma citri, were introduced into the vector pUC18. The transformation was achieved by electroporation and transformants were selected for tetracycline resistance. Tetracycline resistance transformants were confirmed through PCR amplification of portion of the inserted vector. Such evidence allows the conclusion that M. hyopneumoniae is amenable to transformation and heterologous tetM determinant is functional in this pathogen.

A Pasteurella multocida é o agente causador da pasteurelose pulmonar dos suínos, sendo comum a ocorrência dessa infecção associada com o Mycoplasma hyopneumoniae no curso da pneumonia enzoótica. O agente é encontrado em pulmões de várias espécies animais e no homem. A infecção de suínos com o circovírus suíno tipo 2 (PCV2) causa uma forma de infecção sistêmica com profundos efeitos no sistema linfóide, causando prejuízos aos processos normais de defesa e facilitando a instalação de infecções secundárias, incluindo a pneumonia enzoótica complicada pela Pasteurella multocida. O objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar amostras de P. multocida obtidas de suínos com sinais clínicos compatíveis com os da circovirose e de animais de frigorífico quanto ao seu perfil bioquímico, capsular e sensibilidade a antimicrobianos. Foram utilizados 453 materiais (pulmões e suabes das lesões pulmonares), resultando em 115 isolados bacterianos de 79 pulmões. Paralelamente, procurou-se avaliar a eficiência do isolamento da bactéria a partir de dois sítios de amostragem no pulmão: do exsudato bronquial e da superfície de corte pulmonar. Numa amostragem dos casos, procurou-se estabelecer a relação entre a infecção com PCV2 e as lesões pulmonares induzidas pela P. multocida. Numa análise do grau de pneumonia foram classificadas 38 lesões como leves, 19 como médias e 15 graves. Na análise bacteriológica, todas as amostras foram positivas para o teste da catalase e oxidase e negativas para o citrato e H2S, e 11,3% foram negativas ao teste do indol. Utilizando-se os substratos sorbitol, manitol, trealose, maltose e arabinose foram observados seis perfis distintos. O tipo capsular A esteve presente em 93,91% das amostras e o tipo D em 6,09%. Nenhuma das amostras possuía o gene codificador da toxina dermonecrótica (toxA) e a resistência antimicrobiana foi baixa e a oxitetraciclina o princípio ativo com maior resistência 15,65%. / Pasteurella multocida is the etiologic agent of swine respiratory pasteurellosis and the infection occurs specially associated with Mycoplasma hyopneumoniae in the course of enzootic pneumonia. The agent can be isolated from the lung of several animal species and man. Infection of pigs with porcine circovirus (PCV2) causes a systemic infection with deep effects on the lymphoid system (porcine multisystemic wasting syndrome, PMWS), resulting in impairment of the normal defense processes and facilitating secondary infections, including enzootic pneumonia complicated with Pasteurella multocida. The objective of the present work was to isolate and characterize strains of P. multocida obtained from pigs with clinical signs compatible with PMWS and from slaughter pigs, considering biochemical profile, capsular typing and antibiotic sensitivity testing. A total of 453 materials (lungs and swabs from lung lesions) were used, resulting in 115 bacterial isolates from 79 lungs. At the same time, the efficiency of the isolation of the bacteria from two different sites in the lung was assessed: bronchial exudate and the cut surface of the lung. In a sample of the cases it was tried to establish the relationship between PCV2 infection and lung lesions induced by P. multocida. Analyzing degrees of pneumonia, 38 lesions were classified as mild, 19 as intermediate and 15 as severe. In the bacteriological analysis, all strains were positive for catalase and oxidase, and negative for citrate and H2S, and 11.3 were negative in the indole test. Using sugar fermentation (sorbitol, manitol, trealose, maltose and arabinose) six different profiles were established. Capsular type A was diagnosed in 93.91% of the samples and type D in 6.09%. All strains were negative for the gene codifying dermonecrotic toxin (toxA). Antimicrobial resistance was low, and tetracycline was the product showing higher resistance (15.65%).

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-08-18T15:38:40Z No. of bitstreams: 1 Claudio Henrique Clemente Fernandes.pdf: 1914599 bytes, checksum: da7b1a519963cc8ffa30d5c1998aa94f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-18T15:38:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Claudio Henrique Clemente Fernandes.pdf: 1914599 bytes, checksum: da7b1a519963cc8ffa30d5c1998aa94f (MD5) Previous issue date: 2007-02-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The bovine enzootic leucosis (BEL) is a contagious infect disease cosmopolitan, with immune depressor potential, characterized by chronic evolution and great injuries that cause to the national cattle- breeding. The general objective of the achievement of this study was to contribute to the Bovine Leukosis Virus (BLV), realizing immune serologic essay to find dimension of the infection (serum-prevalent) and establish a parameter for evaluation of the immune condition (levels of serum lysozyme) of milky cattle breeding raised in the north region of Tocantins state. It was colleted serum samples of 38 bovine herds, totalizing 881 samples submitted to the double radial immune diffusion test of Ouchterlony in agar gel. From this universe of samples, 400 samples were divided in 2 groups. According to the immune serologic result obtained. G1 200 BLV negative samples, G2 BLV positive samples. The samples were still submitted to a simple radial immunodiffusion of Mancini to define the serum concentration of lysozyme which obtained results were statistically analyzed by t- student test. The results demonstrated that the BEL is amply disseminated in bovine herds examined (94,7% - 36/38), with a prevalence of serum antibodies anti BLV of the studied population corresponding to 37% (328/821) this is the first register of the infection in Tocantins State. The serum levels of lysozyme found G1 8,94 /ml e G2 7,05 /ml, knowing that the average difference between the two groups was 1,92 /ml, so, more elevated in the BLV negative animals than in the BLV positive ones, this revealed how significant is that difference. It can signalize an immune depression state of the immunity system. The obtained results demonstrated the large dissemination of BEL, being the influence, of risk factors in connection with a reduction of levels of lysozyme in animals BLV positives, and suggest that immune serologic tests realized, make possible the validation of an important parameter of evaluation of immune state of BLV positive bovine contributing, this way, to elucidation of immune depressor paper of bovine leucosis virus. / A Leucose Enzoótica dos Bovinos (LEB) é uma doença infecto-contagiosa, cosmopolita, de potencial imunodepressor, caracterizada pela evolução crônica e pelos grandes prejuízos que determina a pecuária bovina nacional. O objetivo geral com a realização deste estudo foi contribuir para a elucidação do papel imunodepressor do Vírus da Leucose Bovina (VLB), realizando ensaios imunossorológicos para dimensionar a infecção (soroprevalência) e estabelecer um parâmetro de avaliação do estado imunitário (teores de lisozima sérica) de bovinos leiteiros criados na Região Norte do Estado do Tocantins. Foram colhidas amostras séricas de 38 rebanhos bovinos, totalizando 882 amostras submetidas ao teste de Imunodifusão Radial Dupla de Ouchterlony em gel de ágar. Desse universo amostral, 400 amostras foram divididas em dois grupos, em função do resultado imunossorológico obtido: G1 200 amostras VLB negativos e G2 200 amostras VLB positivos. As amostras foram submetidas, ainda, à Imunodifusão Radial Simples de Mancini para determinar a concentração sérica da lisozima, cujos resultados obtidos foram analisados estatisticamente pelo teste t-Student. Os resultados demonstraram que a LEB encontra-se amplamente disseminada nos rebanhos examinados (94,7% - 36/38), com uma prevalência de anticorpos séricos anti-VLB da população estudada igual a 37,0% (326/881), sendo este o primeiro registro da infecção no Estado do Tocantins. Os níveis séricos de lisozima encontrados foram G1 8,94 g/ml e G2 7,05 g/ml, sendo que a diferença média entre os dois grupos foi de 1,92 g/ml, portanto, mais elevado nos animais VLB negativos do que nos VLB positivos, diferença esta que se revelou significante, sinalizando um estado imunitário de imunodepressão. Os resultados obtidos demonstraram a ampla disseminação da LEB, sob a influência de fatores de risco, em conexão com a redução dos teores de lisozima nos animais VLB positivos, e sugerem que os ensaios imunossorológicos realizados possibilitaram a validação de um importante parâmetro de avaliação do estado imunitário de bovinos VLB positivos, contribuindo, desta forma, para a elucidação do papel imunodepressor do Vírus da Leucose Bovina.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-10-18T13:39:28Z No. of bitstreams: 1 Luiz Carlos Fontes Baptista Filho.pdf: 748065 bytes, checksum: c624b21e9ec70bfdd8c60bd08dac6e9f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-18T13:39:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luiz Carlos Fontes Baptista Filho.pdf: 748065 bytes, checksum: c624b21e9ec70bfdd8c60bd08dac6e9f (MD5) Previous issue date: 2012-03-17 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Enzootic Leukosis (EBL) and Bovine Tuberculosis (BT) compromise the immune status of the herds, especially the immunosuppressive potential of bovine leukosis virus (BLV). Several factors interfere with leukocyte values of cattle, but little is known about the effects of BT on them. The aim with the study was to evaluate the leukogram of tuberculinized cattle, with a view to the use of leukocytes as an epidemiologic tool in combating EBL in dairy herds of Pernambuco. 1.000 serum samples from 33 herds of cattle coming from various municipalities in the state were submitted to the serodiagnosis of EBL (AGID), being 920 cattle previously tuberculinized by the simultaneously comparative technique (SCT). Blood smears were prepared of all tuberculinized cattle, and the total and differential leukocyte count was performed using conventional techniques. The evaluation of the influence of BT in leukocyte counts was performed by comparing the results of four experimental groups, according to the results of the AGID and SCT (gTB group - 41 to the positive SCT; group gLEB - the 151 AGID positive, group gNEG - 379 to the negative TSC and AGID, group gINT - 43 positive to both tests). The prevalence rates of TB and LEB were, respectively, 11% (99/920) and 28% (282/1000), with 88% (29/33) of herds contributing at least one animal positive for one or both tests. From the 920 cattle examined, 43 (4,7%) were positive to both tests simultaneously. The mean values of leukocytes and lymphocytes (x 103/mm3 of blood) of the experimental groups were, respectively: gTB 9,6 ± 2,5 and 5,9 ± 1,9; gLEB 13,3 ± 6,3 and 9,1 ± 6,0; gNEG 11,5 ± 3,8 and 7,6 ± 5,1; and gINT 11,8 ± 4,3 and 8,0 ± 3,5. There were significant differences (p<0,05) between leukocytes and lymphocytes, when confronted gTB group (lower values) and gLEB (higher values) with the gNEG group, while gINT group did not differ (p>0,05) in none of the parameters analyzed in relation to the group gNEG. It is concluded that the leukogram is influenced by bovine BT, and health programs to combat LEB in dairy herds in the state of Pernambuco, and include the white blood cell count as an epidemiologic tool wish to consider the strategic prior tuberculin test the herds involved, being discarded cattle that are experiencing imunoalergic test positivity. / Leucose Enzoótica (LEB) e Tuberculose bovina (TB) comprometem o estado imunitário dos rebanhos, especialmente pelo potencial imunodepressor do Vírus da Leucose Bovina (VLB). Inúmeros fatores interferem nos valores leucométricos dos bovinos, porém, pouco se sabe dos efeitos da TB sobre os mesmos. O objetivo com o estudo foi avaliar o leucograma de bovinos tuberculizados, com vista ao uso da leucometria como ferramenta epidemiológica no combate à LEB em rebanhos leiteiros de Pernambuco. Amostras séricas de 1.000 bovinos procedentes de 33 rebanhos de diversos municípios do estado foram submetidas ao sorodiagnóstico da LEB (IDGA), sendo 920 bovinos previamente tuberculinizados pela técnica simultânea comparada (TSC). Esfregaços sanguíneos foram confeccionados de todos os bovinos tuberculinizados, sendo a contagem total e diferencial dos leucócitos realizada usando técnicas convencionais. A avaliação da influência da TB no leucograma foi realizada pelo confronto dos resultados de quatro grupos experimentais, em função dos resultados da IDGA e TSC (grupo gTB - 41 positivos ao TSC; grupo gLEB - 151 positivos à IDGA; grupo gNEG - 379 negativos ao TSC e IDGA; grupo gINT - 43 positivos a ambos os testes). As taxas de prevalência da TB e da LEB foram, respectivamente, 11% (99/920) e 28% (282/1000), com 88% (29/33) dos rebanhos contribuindo com ao menos um animal positivo para um ou ambos os testes. Dos 920 bovinos examinados, 43 (4,7%) apresentaram positividade simultânea a ambos os testes. Os valores médios dos leucócitos e linfócitos (x 103/mm3 de sangue) dos grupos experimentais foram, respectivamente: gTB 9,6 ± 2,5 e 5,9 ± 1,9; gLEB 13,3 ± 6,3 e 9,1 ± 6,0; gNEG 11,5 ± 3,8 e 7,6 ± 5,1; e gINT 11,8 ± 4,3 e 8,0 ± 3,5. Houve diferença significativa (p<0,05) entre os leucócitos e linfócitos, quando confrontados os grupos gTB (valores menores) e gLEB (valores maiores) com o grupo gNEG, enquanto o grupo gINT não diferiu (p>0,05) em nenhum dos parâmetros analisados em relação ao grupo gNEG. Conclui-se que o leucograma dos bovinos sofre influência da TB, devendo programas sanitários de combate à LEB em rebanhos leiteiros do estado de Pernambuco e que incluam a leucometria como ferramenta epidemiológica estratégica preconizar a prévia tuberculinização dos rebanhos envolvidos, sendo descartados os bovinos que apresentarem positividade ao teste imunoalérgico.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2018-03-09T13:59:06Z No. of bitstreams: 1 Luiz Carlos Fontes Baptista Filho.pdf: 1860534 bytes, checksum: f341ae75df7ad5c7e6deb23b92d3052c (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-09T13:59:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luiz Carlos Fontes Baptista Filho.pdf: 1860534 bytes, checksum: f341ae75df7ad5c7e6deb23b92d3052c (MD5) Previous issue date: 2016-02-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Enzootic Bovine Leukosis (EBL) and Bovine Tuberculosis (BT) are infectious diseases that cause great losses to the dairy industry due to the discard of animals, carcasses condemnation and veterinary services. The aim with this work was to evaluate the performance of a commercial imported (IDEXX®) enzyme linked immunoassay kits (ELISA) on the diagnosis and control of EBL and BT in dairy cattle naturally infected raised in the state of Pernambuco. The ELISA has being tested for assisting the diagnosis of both diseases, with the purpose of increasing the results sensitivity. While the efforts aim progressively to replacement of the agar gel immunodiffusion (AGID) for a more sensitive technique on the EBL diagnosis, about the BT the technique could be used in conjunction with the tuberculin test for the detection of animals at different stages of the immune response to the etiological agent. Blood serum samples from 327 dairy herds in the state of Pernambuco were subjected to AGID and commercial imported ELISA CHEKIT-leucosis-serum, produced by IDEXX® laboratory, for the diagnosis of EBL. 25 samples that resulted inconclusive to one or both tests were discarded. 302 samples were examined, resulting positive 24.1% (73/302) in the AGID and 45% (136/302) in the ELISA. The lack of agreement between the diagnostic methods was probably due to the high sensitivity of ELISA, which detects antibodies even in situations with low serum levels. The ELISA in relation to the AGID, considered the standard technique, had a sensitivity of 98.6%, specificity of 72% and Kappa 0.55. About the TB diagnosis, 379 cattle were tested for cervical compared test (CCT) and had blood serum samples examined for identification of anti-Mycobacterium bovis antibodies throught the ELISA kit IDEXX® M. bovis Ab Test. From the 379 cattle examined, 16 (4.2%) were positive to CCT and 10 (2.6%) to ELISA. The results associated to tuberculosis, with the simultaneous use of both tests, would allow the discard of 26 infected cattle and not 16, if the CCT had been used alone, resulting in remaining 10 potentially infected cattle and disseminators of the disease. It is concluded that the ELISA is relevant in the control and eradication of EBL and BT, its application on EBL diagnosis may replace the AGID, as well as in the TB, together with the tuberculin skin test. / Leucose Enzoótica dos Bovinos (LEB) e Tuberculose dos Bovinos (TB) são doenças infecciosas que causam grandes prejuízos à pecuária leiteira devido ao descarte de animais, condenação de carcaças e serviços veterinários. O objetivo com a realização deste trabalho foi avaliar o desempenho de kits de ensaio imunoenzimático (ELISA) comerciais importados (IDEXX®) no diagnóstico e controle da LEB e TB em bovinos leiteiros infectados naturalmente criados no estado de Pernambuco. O ELISA vem sendo progressivamente testado para auxiliar o diagnóstico de ambas as enfermidades, com a finalidade de aumentar a sensibilidade dos resultados. Enquanto que na LEB visa-se a substituição progressiva da imunodifusão em gel de ágar (IDGA) por uma técnica mais sensível, na TB a técnica poderia ser utilizada em conjunto com o teste da tuberculina, para a detecção de animais em distintas fases da resposta imunológica ao agente etiológico. Amostras de soro sanguíneo de 327 bovinos leiteiros do estado de Pernambuco foram submetidas à IDGA e ao ELISA comercial importado CHEKIT-Leucose-serum, produzido pelo laboratório IDEXX® para o diagnóstico da LEB. Descartadas 25 amostras inconclusivas a um ou a ambos os testes, 302 amostras foram examinadas, sendo 24,1% positivas (73/302) na IDGA e 45% (136/302) no ELISA. A falta de concordância entre os métodos diagnósticos ocorreu devido, provavelmente, à elevada sensibilidade do ELISA, que possibilita detectar anticorpos mesmo em situações com baixos teores séricos. O ELISA, em relação à IDGA, técnica considerada padrão, sensibilidade de 98,6%, especificidade de 72% e índice Kappa de 0.55. Em relação ao diagnóstico da TB, foram considerados 379 bovinos, sendo submetidos ao teste da tuberculina cervical comparado (TCC) e amostras de soro sanguíneo dos mesmos examinadas para identificação de anticorpos anti-Mycobaterium bovis, com o uso do kit ELISA IDEXX® M. bovis Ab Test. Dos 379 bovinos examinados, 16 (4,2%) apresentaram positividade ao TCC e 10 (2,6%) ao ELISA. Os resultados obtidos associados à tuberculose, com o uso simultâneo dos dois testes, possibilitariam o descarte de 26 bovinos infectados e não de 16, caso fosse usado o TCC isoladamente, resultando na permanência de 10 bovinos potencialmente infectados e disseminadores da doença. Conclui-se que o ELISA é relevante no controle e erradicação da LEB e da TB, podendo seu uso na LEB ocorrer em substituição à IDGA e na TB em conjunto com o teste da tuberculina.

Dentre os vários fatores que podem influenciar a polarização das respostas imunológicas nos animais destacam-se o tipo do agente agressor envolvido, as células apresentadoras de antígenos atuantes no processo e o microambiente formado pelas citocinas. Diferentes perfis de citocinas podem determinar o curso da doença, uma vez que distúrbios no equilíbrio da produção e liberação destes polipeptídeos têm papel significativo no desencadeamento e agravamento de diversas enfermidades. Vírus podem interferir com as funções das citocinas em vários níveis, influenciando na natureza da resposta imune do hospedeiro. Este desequilíbrio entre a produção de citocinas do tipo Th1 e Th2 é geralmente considerado como uma das causas da cronificação das infecções por retrovírus. O VLB, assim como outros retrovírus, também possui esta capacidade de manipular a resposta imune do hospedeiro a fim de direcionar os estágios alinfocitóticos (AL) e de linfocitose persistente (LP). No entanto, seu efeito diretamente sobre as citocinas no sangue e leite dos animais infectados ainda não foi completamente elucidado. Desta forma, o presente estudo objetivou a avaliação da resposta imune contra o VLB em vacas naturalmente infectadas por meio da quantificação de um perfil abrangente de citocinas presentes tanto no soro sanguíneo como no lácteo minimizados outros aspectos de estimulação que não fossem a presença do próprio vírus in vivo. Para tanto foram coletadas amostras de sangue e leite de 11 animais divididos em seus respectivos grupos experimentais (4, 3 e 4 animais para os grupos negativo, AL e LP, respectivamente) e determinadas as concentrações séricas e lácteas de IL-1&beta;, IL-4, IL-10, TNF-&alpha; e IFN-&gamma;. Para as comparações entre os grupos utilizou-se o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis e quando estes apresentaramse significativos aplicou-se \"pós-teste\" para verificar onde tal diferença ocorreu. O nível de significância aplicado nos testes foi de 5 % (P&le;0,05), sempre considerando hipóteses alternativas bicaudais. Verificou-se que não houve diferença nas concentrações das citocinas IL-1&beta;, IL-4, IFN-&gamma; e TNF-&alpha; no sangue dos animais pertencentes aos diferentes grupos experimentais. Quanto às concentrações das citocinas no soro lácteo dos bovinos testados nos diferentes grupos, os resultados demonstraram comportamentos semelhantes aos habitualmente descritos na literatura científica para o sangue periférico, sugerindo que a atuação do VLB sobre a glândula mamária promova interações análogas às observadas sistemicamente. Os resultados obtidos apontam para um envolvimento do VLB sobre o perfil de citocinas da glândula mamária nos animais sororreagentes. / Among the many factors that can influence the polarization of immune responses in animals include the type of the offending agent involved, the antigen-presenting cells active in the process and the microenvironment formed by the cytokine. Different profiles of cytokines may determine the course of the disease, since disturbances in the balance of production and release of these polypeptides play a significant role in triggering and worsening of many diseases. Viruses can interfere with the functions of cytokines at various levels, influencing the nature of the host immune response. This imbalance in cytokine production from Th1 and Th2 is generally regarded as a cause of chronic infections by retroviruses. The BLV, like other retroviruses, also possess this ability to manipulate the host immune response in order to drive the stages non-lymphocytotic and persistent lymphocytosis. However, its effect directly on cytokines in blood and milk of infected animals has not been fully elucidated. Thus, this study aimed at evaluating the immune response against the BLV in cows naturally infected by quantifying a comprehensive profile of cytokines present in both the serum and in whey minimized others aspects of stimulation that was not the presence of the virus itself in vivo. For this purpose, samples of blood and milk of 11 animals divided into their respective experimental groups (4, 3 and 4 animals for groups negative, PL- and PL+, respectively) and certain whey and serum concentrations of IL-1&beta;, IL- 4, IL-10, TNF-&alpha; and IFN-&gamma;. For comparisons between groups used the nonparametric Kruskal-Wallis test and when they showed up was applied to significant \"post test\" to see where this difference occurred. The level of significance in the tests was 5 % (P&le; 0.05), when considering two-tailed alternative hypotheses. There was no difference in the concentrations of IL-1&beta;, IL-4, IFN-&gamma; and TNF-&alpha; in the blood of animals belonging to the different experimental groups. The concentrations of cytokines in the whey of cattle in different groups, the results showed behaviors similar to those usually described in scientific literature to the peripheral blood, suggesting that the action of BLV on the mammary gland promotes interactions similar to those seen systemically. The results indicate an involvement of BLV on the cytokine profile of the mammary gland in animals seropositive.

Diferentes populações de leucócitos desempenham papeis fundamentais na eliminação de agentes invasores através da sua fagocitose e destruição, utilizando-se de mecanismos dependentes (metabolismo oxidativo) e independentes de oxigênio. Baseando-se na hipótese de que o vírus da Leucose Enzoótica Bovina, uma enfermidade crônica, que afeta, particularmente, os órgãos ricos em tecido linfóide destes animais, altera quantitativa e qualitativamente as subpopulações de leucócitos circulantes dos bovinos, influenciando na qualidade da resposta imunológica inata destes animais, o presente estudo avaliou a produção intracelular de peróxido de hidrogênio (H2O2) por leucócitos circulantes, frente estímulo in vitro com forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), lipopolissacarídeos de Escherichia coil (LPS) e após fagocitose de Staphylococcus aureus conjugados com iodeto de propídio (Sa-PI). Para tal, células foram obtidas de cinco vacas negativas no diagnóstico para LEB, de cinco vacas naturalmente infectadas pelo vírus da leucose bovina (VLB), alinfocitóticas, e de cinco vacas infectadas, manifestando linfocitose persistente (LP), e analisadas por citometria de fluxo. Foi averiguada a normalidade da distribuição dos resultados, utilizando-se do teste de Anderson-Darling, e sua homoscedasticidade, utilizando-se do teste F ou do teste de Lavene. Para a análise das freqüências observadas, foi utilizado o teste Qui-quadrado. Para a avaliação das diferenças entre as médias dos resultados obtidos, foram feitos os testes de análise de variância (One-way ANOVA), de Tukey-Kramer, teste t de Student, de Mann-Whitney ou de Kruskal-Wallis. A porcentagem média total de células produzindo H2O2, caracterizada pela intensidade de fluorescência da 2,7-diclorofluoresceína, no ensaio sem estímulo in vitro, de 30,60%, foi menor (p=0,005) que aquela observada no ensaio com adição in vitro de LPS, de 52,00%, e que aquela obtida no ensaio com adição in vitro de PMA, de 63,13%. A porcentagem média total de células produzindo H2O2 no ensaio com estímulo por fagocitose in vitro de SaPI, de 47,47%, não diferiu da observada no ensaio sem estímulo. As porcentagens médias totais de células produzindo H2O2 não diferiram entre os ensaios em que houve prévio estímulo in vitro. Não houve diferença na porcentagem de leucócitos que estavam produzindo H2O2, entre os grupos experimentais, todavia, a produção intracelular média de H2O2, sem estímulo in vitro (p=0,007), após adição in vitro de PMA (p<0,001), de LPS (p=0,001) ou após fagocitose (p=0,002), de leucócitos obtidos de animais apresentando LP, foi menor que aquela verificada em células provenientes de animais soronegativos e de animais soropositivos alinfocitóticos. A porcentagem de leucócitos realizando fagocitose, caracterizada pela intensidade de fluorescência do iodeto de propídio, entre as células obtidas de animais com LP, de 7,20%, foi menor que aquela verificada nas amostras coletadas de animais soronegativos, de 12,90%, e soropositivos alinfocitóticos, de 14,70% (p=0,047). Além disso, as células provenientes de animais com LP apresentaram uma menor intensidade de fagocitose que aquela observada em leucócitos de animais soronegativos e soropositivos alinfocitóticos (p<0,001). Assim, os resultados obtidos demonstram uma vulnerabilidade funcional em leucócitos sangüíneos obtidos de animais infectados pelo VLB, manifestando LP. / Different leukocyte populations play key roles on the elimination of foreign antigens through phagocytosis and killing by oxygen-independent and -dependent (respiratory burst) mechanisms. Assuming that Enzootic Bovine Leukosis virus (BLV), that causes a chronic disease, and affects, mainly, lymphoid tissues, alters bovine circulating leukocyte subpopulations quantitatively and qualitatively, and influences the innate immune response, this study evaluated the intracellular production of hydrogen peroxide (H2O2) of circulating leukocytes after in vitro stimuli with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), Escherichia coli lipopolysaccharides (LPS), or phagocytosis of propidium iodide-labeled Staphylococcus aureus (PI-Sa). Cells were obtained from five BLV-negative cows, five naturally BLV-infected, non-lymphocytotic cows, and five BLV-positive cows with persistent lymphocytosis (PL), and analyzed by flow cytometry. Normality was tested using the Anderson-Darling test, followed by an F test or a Lavene\'s test to analyze the equality of variances. Differences among frequencies were tested using the Qui-square test. Differences among means were verified by a one way analysis of variance (ANOVA), followed by a Turkey-Kramer test, or a Student t-test, a Mann-Whitney U-test, or a Kruskal-Wallis test. Mean total percentage of H2O2-producing cells, characterized by the intensity of 2,7-dichlorofluorescein fluorescence, in the assay without in vitro stimulus (30.60%) was smaller (p=0.005) than that verified in the assay after in vitro addition of LPS (52.00%), and after addition of PMA (63.13%). Mean total percentage of H2O2-producing cells in the assay with stimulus by in vitro phagocytosis of PI-Sa (47.47%) was not different from that verified in the assay without in vitro stimulus. Mean total percentages of H2O2-producing leukocytes did not differ among assays with previous in vitro stimuli. There was no difference in the percentages of H2O2-producing leukocytes, among cells obtained from cows that belonged to different groups. However, mean intracellular H2O2-production of leukocytes obtained from BLV-infected cows, presenting PL, without in vitro stimulus (p=0.007), after in vitro addition of PMA (p<0.001), or LPS (p=0.001), or after phagocytosis (p=0.002) was smaller than that verified in leukocytes obtained from non-infected and from BLV-infected, non-lymphocytotic, cows. The percentage of leukocytes that were carrying out phagocytosis, characterized by the intensity of propidium iodide fluorescence, among cells obtained from BLV-infected cows, presenting PL (7.20%), was smaller (p=0.047) than that verified among cells obtained from non-infected and from BLV-infected (12.90%), non-lymphocytotic (14.70%), cows. Furthermore, leukocytes obtained from BLV-infected cows, presenting PL, showed smaller phagocytosis intensity (p<0.001) than leukocytes obtained from non-infected and from BLV-infected, non-lymphocytotic, cows. Therefore, results show a functional vulnerability of circulating leukocytes obtained from BLV-infected, lymphocytotic cows.

Foi demonstrado o envolvimento das espécies reativas de oxigênio (ERO) na patogênese de algumas retroviroses, levando muitas vezes à progressão e/ou persistência das mesmas. No entanto, o papel das espécies reativas de oxigênio resultante da modulação do sistema antioxidante, e seu envolvimento na infecção de bovinos naturalmente infectados pelo VLEB, até o presente trabalho, não tinha sido ainda investigado. Desta forma, o presente estudo objetivou-se avaliar o envolvimento do estresse oxidativo na infecção pelo VLEB em bovinos naturalmente infectados, associado ou não ao estabelecimento da linfocitose persistente (LP). Assim, a avaliação do estresse oxidativo se deu pelo teor de malondialdeído, concentração de glutationa reduzida, atividade da glutationa peroxidase e da superóxido dismutase, e pela atividade antioxidante total; e a resposta imune pela quantificação das subpopulações de linfócitos, função fagocítica e produção intracelular de peróxido de hidrogênio de leuccitos polimorfonucleares, morte celular e proliferação linfocitária, além da avaliação hematológica e sorodiagnóstico da leucose enzoótica bovina (LEB). Os resultados do presente estudo apontaram para o envolvimento do estresse oxidativo na infecção pelo vírus da leucose enzoótica bovina, dado pela menor concentração de glutationa peroxidase e a tendência a menor atividade da superxido dismutase eritrocitárias nos animais infectados pelo VLEB, não podendo, contudo, ser associado à fase da infecção. Ademais, os marcadores de estresse oxidativo não apresentaram alterados nem sequer a atividade antioxidante total destes animais. Além disso, o presente trabalho apontou para menor proliferação de linfócitos e redução da apoptose de células CD5+ nos animais infectados pelo VLEB manifestando LP, corroborados pelo significante aumento da população de linfcitos B (CD21+), e dos principais co-marcadores das células infectadas, no caso células CD5+ e CD11b+, nestes animais. No entanto, não observou diferenças significativas na população de linfócitos T destes animais, nem sequer alteração da capacidade fagocítica e produção intracelular de peróxido de hidrogênio pela população de leucócitos polimorfonucleares nos animais infectados. / Abundant observations of multiple pathogenic interactions between reactive oxygen species (ROS) and the pathogenesis of some retroviruses have drawn attention to role of ROS on disease progression and/or persistence of infection. Therefore, the role of the oxidative stress resulted from the modulation of the antioxidant system in dairy cows naturally infected with BLV has not been studied yet. So, the present study tries to investigate the involvement of oxidative stress in dairy cows naturally infected with BLV associated or not with the persistent lymphocytosis (PL). Thus, the oxidative stress was evaluated by the malondialdehyde, reduced glutathione content, and by the activity of glutathione peroxidase and superoxide dismutase, and also total antioxidant activity. The immune response was also evaluated by the quantification of lymphocyte subsets, lymphocyte proliferation, polymorfonuclear leukocytes phagocytosis and intracellular hydrogen peroxide production, and cell death. The results of the present work point out to an involvement of oxidative stress in dairy cows naturally infected with BLV, given by a lower glutathione peroxidase activity and also a tendency towards lower superoxide dismutase activity, but it can be not associated with PL. Futhermore, the oxidative stress markers and also the total antioxidant status was not altered in infected animals. The present study also showed a lower lymphocyte proliferarion and apoptosis rates of CD5+ cells, strengthen by a higher B cells (CD21+) counts and also by a significant augment of CD5+ and CD11b+ positive cells that are often co-expressed by the infected cells. Although, no significant difference was observed in T cells counts. Moreover, the phagocytosis rates and the intracellular hydrogen peroxide production by the polymorphonuclear leukocytes are not altered in BLV infected dairy cows.

O vírus da leucose enzoótica bovina (VLEB) pode interferir na proporção e na funcionalidade dos linfócitos B e das demais células sanguíneas. Acreditando-se que essas alterações pudessem interferir nos mecanismos de defesa da glândula mamária, o presente estudo avaliou funcionalmente os fagócitos sanguíneos e lácteos de vacas naturalmente infectadas pelo VLEB, por meio da expressão de diferentes receptores de superfície celular de fagócitos e linfócitos; da morte celular dos fagócitos e do linfócito B; pelo potencial de fagocitose e produção intracelular de peróxido de hidrogênio pelas células CD14+ e CH138+. Foram selecionadas nove vacas negativas para a LEB (grupo negativo), dez positivas sem linfocitose (grupo AL) e seis positivas com linfocitose persistente (grupo LP). Independente do perfil hematológico das vacas positivas para a LEB, nas amostras de sangue foram observadas menor expressão de células mononucleares CD14+, de linfócitos T (CD3+) e de linfócitos B CD21+ CD11b+ e maior expressão de linfócitos B (CD21+). As vacas do grupo LP apresentaram menores quantidades de linfócitos T auxiliares (CD3+ CD4+) e de linfócitos B CD21+ CD5- CD11b- e maiores quantidades de linfócitos B CD21+ CD5+ CD11b+. Menores quantidades de linfócitos B CD21+ CD5+ foram observados nas vacas do grupo AL do que nas vacas do grupo negativo. As vacas do grupo LP apresentaram menores índices de fagocitose por Escherichia coli pelas células mononucleares CD14+, menor produção de peróxido de hidrogênio e menores índices de fagocitose por Staphylococcus aureus pelas células polimorfonucleares CH138+. As vacas do grupo LP apresentaram menores índices de necrose, de apoptose e/ou necrose e maior viabilidade das células mononucleares CD14+, das células polimorfonucleares CH138+ e dos linfócitos B (CD21+). Apenas os linfócitos B (CD21+) das vacas do grupo LP apresentaram menores índices de morte por apoptose, e as células mononucleares CD14+ das vacas do grupo AL manifestaram maiores índices de apoptose e/ou necrose do que as vacas negativas. Independente do perfil hematológico das vacas, nas amostras de leite foram observadas maiores quantidades de macrófagos e maiores expressões de linfócitos T (CD3+) e de linfócitos B (CD21+). As vacas do grupo AL apresentaram maior quantidade de linfócitos B (CD21+) do que as vacas negativas. As vacas do grupo LP apresentaram menores quantidades de linfócitos T citotóxicos (CD3+ CD8+), de linfócitos B CD21+ CD11b+ e de linfócitos B CD21+ CD5+ CD11b+ e maior quantidade de linfócitos B CD21+ CD5- CD11b-. As vacas do grupo AL apresentaram menores índices de fagocitose por Escherichia coli pelos macrófagos CD14+ e pelos leucócitos CH138+ e as vacas do grupo LP apresentaram maior produção de peróxido de hidrogênio intracelular. As vacas positivas para LEB apresentaram maiores índices de morte por necrose dos macrófagos CD14+ e dos linfócitos B (CD21+) e menores índices de morte por apoptose dos macrófagos CD14+, dos leucócitos CH138+ e dos linfócitos B (CD21+). Estas vacas também apresentaram maior viabilidade dos macrófagos CD14+ e dos leucócitos CH138+. As vacas do grupo LP apresentaram maiores índices de apoptose e/ou necrose dos macrófagos CD14+, de necrose de leucócitos CH138+ e de viabilidade de linfócitos B (CD21+). Resultados permitem concluir que a o VLEB altera a resposta imune da glândula mamária. / The enzootic bovine leukemia virus (BLV) can influence the amount of lymphocytes B and other blood cells and their functions. Believing that these changes could interfere in the defense mechanisms of the mammary gland, this study evaluated blood and milk phagocytes functions from cows naturally infected VLEB through the expression of different cell surface receptors of phagocytes and lymphocytes; from death cell of phagocytes and B lymphocytes; the phagocytosis and intracellular production of hydrogen peroxide by CD14+ and CH138+ cells. We chose nine cows negative for the LEB (negative group), ten positive without lymphocytosis (LA group) and six positive with persistent lymphocytosis (LP group). In blood samples of positive cows for BLV, it was observed smaller expression of CD14+ mononuclear, T lymphocytes (CD3+) and CD21+ CD11b+ B lymphocytes, along with increased expression of B lymphocytes (CD21+). Cows of the LP group had lower amounts of T helper lymphocytes (CD3+ CD4+) and CD21+ CD5- CD11b- B lymphocytes and higher amounts of CD21+ CD5+ CD11b+ B lymphocytes. In cows of AL group it was observed lower amounts of CD21+ CD5+ B lymphocytes than in cows of negative group. Cows of LP group had lower rates of Escherichia coli phagocytosis by CD14+ mononuclear cells, lower intracellular production of hydrogen peroxide and lower rates of phagocytosis of Staphylococcus aureus by CH138+ polymorphonuclear cells. Cows of LP group showed less necrosis, apoptosis and/or necrosis and increased viability of CD14+ mononuclear cells, CH138+ polymorphonuclear cells and B lymphocytes (CD21+). Only the B-lymphocytes (CD21+) of the cows in the LP group showed less apoptosis, and CD14 + mononuclear cells from cows in the AL group showed higher rates of apoptosis and/or necrosis than the ones from negative cows. In the milk sample, the positive cows showed higher amounts of macrophages and increased expression of T lymphocytes (CD3+) and B lymphocytes (CD21+). Cows of AL group showed a higher amount of B lymphocytes (CD21+) than negative cows. Cows of LP group had lower amounts of T cytotoxic lymphocytes (CD3+, CD8+), CD21+ CD11b+ B lymphocytes and CD21+, CD5+, CD11b+, B lymphocytes and increased amount of CD21 + CD5- CD11b- B lymphocytes. Cows of the AL group had lower rates of Escherichia coli phagocytosis by CD14+ macrophages and CH138+ leukocytes and cows of group LP had higher production of intracellular hydrogen peroxide. The positive cows for LEB had higher rates of death by necrosis of CD14+ macrophages and B lymphocytes (CD21+) and lower rates of apoptosis of CD14+ macrophages, CH138+ leukocytes and B lymphocytes (CD21+). These cows also had higher viability of CD14+ macrophages and CH138+ leukocytes. Cows on the LP group had higher rates of apoptosis and/or necrosis of CD14+ macrophages, necrosis of CH138+ leukocytes and viability of B lymphocytes (CD21+). Results suggested that the VLEB influence the immune response of the mammary gland.