A mineralização do esqueleto começa dentro de vesículas matriz derivadas de células (MVs); então, os minerais se propagam para a matriz de colágeno extracelular. A fosfatase alcalina não específica de tecido (TNAP) degrada o pirofosfato inorgânico (PPi), um potente inibidor da mineralização, quee contribui com Pi (Fosfato) de ATP para iniciar a mineralização. Em comparação com a membrana plasmática, as MVs são ricas em Colesterol (Chol) (32%) e TNAP, mas como o Chol influencia a atividade da TNAP ainda não está claro. Nós reconstituímos TNAP em lipossomos de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dimiristoilfosfocolina (DMPC) dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) combinada com Chol ou seus derivados Colestenona (Achol) e Ergosterol (Ergo). Comparamos as propriedades cinéticas: Velocidade máxima de hidrólise (Vmax), constante de afinidade (k0,5), cooperatividade (n) e eficiência catalítica (kcat / k0,5) da TNAP para os substratos fisiológicos ATP e PPi, quando o TNAP é incorporada nestes diferentes microambientes lípidicos. O DPPC mais 36% de esteróis em lipossomos aumentaram a atividade catalítica do TNAP em relação ao ATP. A presença de Chol também aumentou a propagação de minerais em 3,4 vezes. A eficiência catalítica da TNAP em relação ao ATP foi quatro vezes menor nos proteolipossomos de DOPC, em comparação aos proteolipossomos do DPPC. Os proteolipossomos DOPC também aumentaram a biomineralização 2,8 vezes em comparação com os proteolipossomos de DPPC. O TNAP catalisou a hidrólise do ATP mais eficientemente no caso do proteolipossomo consistindo em DOPC com 36% de Chol. O mesmo comportamento surgiu com Achol e Ergo. A organização do lipídio e a estrutura do esterol influenciaram a tensão superficial (), a atividade fosfohidrolítica do TNAP na monocamada e a eficiência catalítica do TNAP nas bicamadas. Membranas na fase L (Achol) proporcionaram melhores parâmetros cinéticos em relação às membranas na fase Lo (Chol e Ergo). a presença de SM ou Chol: SM 90:10 (mol%), proteolipossomos DPPC não alterou os valores de eficiência catalítica, para a hidrólise do ATP. No entanto, estes proteolipossomos aumentaram a propagação mineral em cerca de 4,5 e 8 vezes, respectivamente, em comparação com DPPC puro. O aumento na eficiência catalítica para proteolipossomos contendo DMPC: SM 90:10 e DMPC: Chol: SM 80:10:10 (% molar) foi observado. Em conclusão, as propriedades físicas e a organização lateral de lipídios em proteolipossomas são cruciais para o controle. propagação mineral mediada pela atividade da TNAP durante a mineralização / Mineralization of the skeleton starts within cell-derived matrix vesicles (MVs); then, minerals propagate to the extracellular collagenous matrix. Tissuenonspecific alkaline phosphatase (TNAP) degrades inorganic pyrophosphate (PPi), a potent inhibitor of mineralization, and contributes Pi (Phosphate) from ATP to initiate mineralization. Compared to the plasma membrane, MVs are rich in Cholesterol (Chol) (32%) and TNAP, but how Chol influences TNAP activity remains unclear. We have reconstituted TNAP in liposomes of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), dimyristoylphosphocholine (DMPC) dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) combined with Chol or its derivatives Cholestenone (Achol) and Ergosterol (Ergo). We compare the kinetic properties: maximum rate of hydrolysis (Vmax), affinity constant (k0,5), cooperativity (n) and catalytic efficiency (kcat / k0,5) of TNAP for the physiological substrates ATP and PPi, when TNAP is incorporated in these different microenvironments lipids. DPPC plus 36% sterols in liposome increased the catalytic activity of TNAP toward ATP. The presence of Chol also increased the propagation of minerals by 3.4-fold. The catalytic efficiency of TNAP toward ATP was fourfold lower in DOPC proteoliposomes as compared to DPPC proteoliposomes. DOPC proteoliposomes also increased biomineralization by 2.8-fold as compared to DPPC proteoliposomes. TNAP catalyzed the hydrolysis of ATP more efficiently in the case of the proteoliposome consisting of DOPC with 36% Chol. The same behavior emerged with Achol and Ergo. The organization of the lipid and the structure of the sterol influenced the surface tension (), the TNAP phosphohydrolytic activity in the monolayer, and the TNAP catalytic efficiency in the bilayers. Membranes in the L phase (Achol) provided better kinetic parameters as compared to membranes in the Lo phase (Chol and Ergo). The presence of SM or Chol:SM 90:10 (mol%), DPPC-proteoliposomes did not alter the catalytic efficiency values, for the ATP hydrolysis. However, these proteoliposomes increased the mineral propagation by about 4.5 and 8-fold, respectively, compared to neat DPPC. The increase in catalytic efficiency for proteoliposomes containing DMPC:SM 90:10 and DMPC:Chol:SM 80:10:10 (mol%) was observed. In conclusion, the physical properties and the lateral organization of lipids in proteoliposomes are crucial to control mineral propagation mediated by TNAP activity during mineralization

Iron/Manganese superoxide dismutases (Fe/Mn-SODs) are metalloenzymes with highly conserved protein folds, active sites, and dimer interfaces. They protect cells against oxidative stress by catalyzing the conversion of the cytotoxic free radical superoxide to molecular oxygen and hydrogen peroxide. The majority are highly specific for the type of metal (iron or manganese) present within the active site. However, there are many key aspects of metal specificity and catalytic activity that lack a structural explanation. Computational analyses suggested that several residues are important for fine-tuning the redox potential of the metal in the active site and thereby the catalytic activity. The main objective of this thesis is to evaluate the influence of several point mutations (M27V, G73A, H75I, L80F, D150G and Q172D) and one double mutation (Q149G+G74Q)) in terms of metal specificity, catalytic activity and three-dimensional structure using the superoxide dismutase from Trichoderma reesei (TrSOD) as a model system. The corresponding genes were cloned, expressed and the resulting proteins characterized by X-ray crystallography, electron paramagnetic resonance (EPR), atomic absorption spectroscopy (AAS), dynamic light scattering (DLS) and their enzymatic activity determined. The native protein was shown to be able to use either Mn or Fe (5000 units/mg and 500 units/mg, respectively) for catalysis suggesting it to be properly classified as cambialistic. Structures for native TrSOD and the Mn-G73A, Fe-H75I, Mn-L80F, Fe-D150G and Fe-M27V, Mn-M27V mutants were solved at 2.3 Å, 2.0 Å, 2.03 Å, 2.0 Å, 1.85 Å, 1.4 Å and 1.6 Å resolution, respectively. The H75I, L80F and M27V mutations are easily accommodated by small local structural changes to the three-dimensional structure. On the other hand, the G73A mutation destabilize one of the dimer-dimer interfaces of the tetramer making it possible for two distorted tetramers to interact forming an octamer. This enzyme also lost all catalytic activity probably due to resulting exposure of the active site consistent with the observation of a sixth ligand (solvent molecule) bound to the metal in one subunit. The D150G mutant remained tetrameric but with reduced symmetry related to the rearrangement of the last helix (H9). Our results show that a large impact on activity and oligomerization of TrSOD can be generated by a single amino acids substitution in some cases and provide some insights into our understanding of the structural details associated with the metal ion specificity and oligomerization in superoxide dismutases. / Superóxido dismutases de ferro e manganês (Fe/Mn-SODs) são metaloenzimas com enovelamentos, sítios ativos e interfaces diméricas altamente conservados. Estas enzimas protegem as células contra o estresse oxidativo pela conversão do ânion superóxido em oxigênio molecular e peróxido de hidrogênio. A maioria são altamente específicas pelo tipo de metal (ferro ou manganês) presente no sítio ativo. Entretanto, existem vários aspectos críticos sobre a especificidade pelo metal e da atividade catalítica que ainda não foram explicados em termos estruturais. Análises computacionais sugerem que vários resíduos são importantes para o ajuste do potencial redox do metal no sitio ativo e, portanto, a atividade catalítica. O objetivo principal deste trabalho é avaliar a influência de mutações simples (TrSOD) (M27V, G73A, H75I, L80F, D150G e Q172D) e dupla (Q149G + G74Q) em superóxido dismutases de Trichoderma reesei em termos de especificidade pelo metal, atividade catalítica e estrutura. Os genes correspondentes foram clonados, expressos e as proteínas resultantes caracterizadas por cristalografia de raios-X, ressonância paramagnética electrónica (EPR), espectroscopia de absorção atómica (AAS), dispersão de luz dinâmica (DLS), e a atividade enzimática foi determinada. Foi mostrado que a proteína nativa é capaz de usar tanto Mn quanto Fe (5000units/mg e 500units/mg, respectivamente) para catálise sugerindo que deveria ser a classificada como enzima cambialistica. Estruturas da enzima nativa e mutantes (Mn-G73A, Fe-H75I, Mn-L80F, Fe-D150G, Fe-M27V e Mn-M27V) foram resolvidas a resoluções de 2.3 Å, 2.0 Å, 2.03 Å, 2.0 Å, 1.85 Å, 1.4 Å e 1.6 Å respetivamente. As mutações H75I, L80F e M27V são acomodadas facilmente por reajustes locais na estrutura tridimensional. Por outro lado, a mutação G73A desestabiliza uma das interfaces dímero-dímero do tetrâmero levando à formação de um octâmero feito por dois tetrâmeros distorcidos. Esta enzima também perde atividade provavelmente devido a um aumento na acessibilidade do sítio ativo, coerente com a observação de um sexto ligante (molécula de solvente) coordenando o metal em uma das subunidades. O mutante D150G continuou tetramérica mas com simetria reduzida relacionado com o rearranjo da última hélice (H9). Estes resultados mostram que, em alguns casos, uma mutação simples pode ter um impacto significativo no estado oligomérico e atividade catalítica da proteína TrSOD e fornece conhecimentos para a nossa compreensão dos detalhes estruturais associados com a especificidade de íons metálicos e oligomerização em superóxido dismutases.

Ce travail de thèse présente une nouvelle classe de microélectrodes de fibres de nanotubes de carbone (NT). Celles-ci sont réalisées par un filage en voie humide autorisant l’inclusion d’additifs au sein des fibres afin d’adapter leur formulation. Ainsi, le développement d’électrodes incluant la bilirubine oxydase (BOD) pour biopile enzymatique a permis d’obtenir un haut courant de réduction à l’aide d’un transfert d’électrons direct entre BOD et NT. Egalement, des actionneurs électromécaniques incluant une faible quantité de PVA réticulé sont proposés. De telles fibres génèrent une grande contrainte et présentent un temps de réponse court lorsqu’une faible tension leur est appliquée. La mobilité des NT les uns par rapport aux autres au sein de celles-ci a été réduite. Cette dernière est présente dans tout actionneur en NT et génère du fluage et une relaxation de contrainte de ces matériaux limitant ainsi leurs performances. Ces travaux ouvrent de nombreuses voies pour de nouvelles microtechnologies de conversion d’énergie, notamment appliquées au médical ou dans la micro-robotique. / This PhD work presents a new class of carbon nanotubes (NT) fibers microelectrodes. These fibers are produced by a wet spinning process which enables the inclusion of additives within the fibers in order to adapt their formulation. Thus, new microelectrodes for enzymatic biofuel cells that comprise bilirubin oxidase (BOD) have been realized in a one step process and enable a direct electron transfer process between the enzyme and NT at a high potential with a high reduction current. Furthermore, we also developed new NT microfibers including a small quantity of chemically crosslinked PVA for electrochemical actuators. They generate a large stress and a short response time when stimulated by a low voltage in an aqueous electrolyte. Moreover, the CNT mobility within these fibers is greatly reduced. The latter is present in any CNT actuator and induces creep and stress relaxation of these material prohibiting the possibility to obtain high actuating performances. The present results open routes towards the development of novel technologies for energy conversion potentially useful in micro-devices, biomedical applications and micro-robotics.

Dans le contexte énergétique actuel où le développement de carburant alternatif devient un enjeu majeur pour la recherche, ce travail se propose de développer un modèle cinétique prédictif de l'hydrolyse enzymatique de la cellulose qui représente une des étapes limitantes du procédés de production d'éthanol à partir de biomasse par voie biochimique. Pour mieux comprendre les mécanismes réactionnels mis en jeu, une approche expérimentale a été choisi, avec d'une part la caractérisation cinétique des enzymes impliquées dans la réaction d'hydrolyse et d'autres part le suivi de l'évolution des propriétés structurales et de la réactivité du substrat. L'étude de la réactivité des enzymes pures et en mélange a permis de montrer que le cocktail réel sécrété par Trichoderma reesei peut être représenté par un mélange de quatre enzymes majoritaires. Puis, la caractérisation multi-échelle de substrats partiellement hydrolysés a permis de mettre en évidence le mécanisme d'érosion des particules par les enzymes. Le modèle cinétique développé, prenant en compte la réactivité des enzymes pures, les phénomènes de synergies et une description du substrat a permis d'expliquer les résultats obtenus en cinétique initiale. Cependant, l'introduction des phénomènes de perte de réactivité du substrat et de désactivation des enzymes ont dus être introduit pour améliorer la prédiction du modèle en cinétique globale. / In the worldwide energetic context, developing new carburant is an important topic for researchers. The enzymatic hydrolysis of cellulose is still considered as a main limiting step of the biological production of biofuels from lignocellulosic biomass. In order to better understand mechanisms involved in this reaction, an experimental study have been performed. On the one hand; kinetic parameters of enzymes used during the enzymatic hydrolysis have been determined and on the other hand, we have studied the evolution of substrates morphology and reactivity during the reaction. Pure enzymes and mix of enzymes have been studied and we demonstrate that the entire cocktail secreted by Trichoderma reesei can be described by a mix of four main enzymes. Then, structural characterization of partially hydrolysed substrate have shown that cellulosic particles are eroded by enzymes. The developed kinetic model considering the intrinsic reactivity of each enzymes, the synergy between enzymes and a substrate description allows a good description of the initial stage of the reaction. However, the substrate reactivity loss and the enzyme deactivation had been introduced to have a good description of the entire reaction.

O bagaço de cana de açúcar é uma fonte de energia renovável e matéria prima promissora na produção de biocombustível, pois representa cerca de 30% de glicose contida na planta com potencial de ser hidrolisado e convertido em etanol. Os principais constituintes do bagaço de cana são a celulose, formada por cadeia linear de glicose, a hemicelulose, um polímero amorfo constituído de xilose, arabinose, galactose e manose e a lignina, um polímero complexo formado por unidades de fenilpropanos que atuam como revestimento impermeabilizante nas fibras, difícil de ser removido por sua característica recalcitrante. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a eficiência da irradiação com feixe de elétrons como pré-tratamento do bagaço de cana para hidrólise enzimática da celulose. O pré-tratamento do bagaço de cana é uma das etapas mais importante para torná-lo economicamente viável e competitivo na produção de energia. Como pré-tratamento o processamento por feixe de elétrons pode fragilizar a estrutura da hemicelulose e lignina, pela ação de radicais altamente reativos que quebram as ligações químicas, reduzindo o grau de polimerização das fibras. Foram avaliados os efeitos da radiação na estrutura e composição do bagaço, assim como a combinação do processamento por feixe de elétrons com o pré-tratamento de esplosão à vapor. Para hidrólise enzimática utilizou-se enzimas comerciais fornecidas pela Novozymes. O processamento por feixe de elétrons levou a alterações na estrutura e composição do bagaço de cana aumentando a solubilidade pela degradação de celulose alfa e hemicelulose e aumentando também o rendimento da hidrólise enzimática. No caso do bagaço explodido, não houve alteração no rendimento da hidrólise enzimática, mas o processamento por feixe de elétrons promoveu uma redução de 67% no furfural, que é formado no processo de explosão a vapor. / The sugar cane bagasse is a renewable energy source and a raw material promise in the biofuel production, once represents about 30% of glucose contained in the plant with the potential to be hydrolyzed and then converted to ethanol. The bagasse is composed of cellulose, straight chain of glucose, of hemicellulose, an amorphous polymer consisting of xylose, arabinose, galactose, and mannose, and of lignin, a complex polymer consisting of fenilpropans units that acts as waterproof coating on the fibers, which is hard to remove due its recalcitrant nature. The aim of this work was to study the electron beam processing as a pretreatment of sugarcane bagasse to enzymatic hydrolysis of cellulose. The pretreatment of sugarcane bagasse is one of the most importante steps to make this material economically viable and competitive on the energy production. As a pretreatment the electron beam processing can weak the hemicellulose and lignin structures by the action highly reactive radicals that breaks the links, reducing the degree of polymerization fibers. It was evaluated the chemical and structural modifications on fibers caused by the irradiation, the enzymatic hydrolysis of electron beam as the only pretreatment and combined to steam explosion. For enzymatic hydrolysis it was used the commercial enzymes from Novozymes. The radiation processing promotes changes in structure and composition of sugarcane bagasse, increasing the solubility, that is related to hemicellulose and cellulose cleavage, and also increasing the enzymatic conversion yield. In the case of exploded bagasse there is no changes in the enzymatic hydrolysis yield, however the electron beam processing promoted a 67% reduction of furfural, that is formed in the steam explosion process.

Green macroalgae represent an attractive source of renewable carbon. Conversion of algal biomass to useful products requires depolymerization of the cell wall polysaccharides cellulose and ulvan. Cellulose saccharification has been widely studied and involves synergistic action of endoglucanases, exoglucanases, and β-glucosidases. The enzymatic depolymerization of ulvan has not received the same attention and additional studies are required in order to fully understand the mechanisms involved in its biodegradation. Synthetic biology offers the possibility of importing modules such as biomass-degrading systems and biofuel producing pathways from different organisms into a genetically tractable host such as Escherichia coli. In this study it was shown that E. coli expressing the glycosidase CHU2268 of Cytophaga hutchinsonii grows well on cello-oligosaccharides such as cellohexaose, and co-expression with the endoglucanase CenA of Cellulomonas fimi allows growth on untreated crystalline cellulose. Moreover, a model for ulvan utilization was built for the first time based on a polysaccharide utilization locus from the alga-associated flavobacterium Formosa agariphila. It was also shown that F. agariphila, is able to grow using biomass from the green macroalga Ulva lactuca as its sole carbon source, and enzymes with ulvanase activity are induced by the presence of this alga in the culture medium. Enzymes for ulvan depolymerization from F. agariphila, including an ulvan lyase, xylanases and rhamnosidases, were cloned using the PaperClip DNA assembly method and expressed in active form in E. coli. Furthermore, a secretion system based on the use of the Antigen 43 was successfully used to secrete an active ulvan lyase using E. coli and ribosome binding sites of different strengths were studied and used to optimize the system. These results represent a first step for the design of a microorganism capable of utilizing green macroalgal biomass for the production of biofuels and other valuable bio-products.

A procura por tecnologias que minimizem o consumo de água e o potencial poluidor da indústria do couro tem aumentado. O uso de enzimas em diversas etapas produtivas deste processo é uma alternativa cada vez mais comum, pois além de ser considerada tecnologia limpa, acelera o processo produtivo. O objetivo deste trabalho foi analisar o desempenho de oito enzimas comerciais (A1, B1, B2, B3, C1, C2, C3 e C4) fornecidas por três empresas do setor (A, B e C) em processos chamados coenzimáticos, com teores reduzidos de produtos químicos, nas etapas de remolho, depilação/caleiro e purga, por meio da comparação com processos tradicionais puramente químicos. Na etapa de remolho foi verificada a influência do tempo de processamento, tipo e concentração de enzima, sendo a pele analisada quanto ao teor de gorduras e matéria volátil e o banho analisado com relação à concentração de cloretos, sólidos totais, fixos e voláteis. Na etapa de depilação/caleiro foi estudada a influência do tempo, tipo e concentração de enzima, em comparação com dois processos químicos (tradicional e reduzido), sendo analisada a pele em diferentes tempos de processo (via análise de MEV). Na etapa de purga, o processo foi avaliado com relação ao tipo de enzima aplicada e ao tempo de processamento. Ao todo foram realizados 24 testes (12 de remolho, 6 de depilação/caleiro e 6 de purga) e em todos eles, além das análises citadas anteriormente, foram feitas análises de Carbono Orgânico Total (COT) e Proteína Solúvel (método de Lowry) nos banhos. Adicionalmente, foi determinada a atividade das enzimas A1, B3 e C3 frente ao colágeno e das enzimas A1, B3, C3 e B1 frente a lipídeos. Em geral, os resultados apontam que os processos coenzimáticos alcançam um maior potencial de remoção de matéria orgânica, quando comparado aos processos puramente químicos, destacando-se as enzimas C1 no remolho e B1 e B2 na depilação/caleiro. Na purga as enzimas apresentaram desempenho semelhante, destacando-se as enzimas B3 e C3. Os testes de determinação da atividade enzimática demonstraram que a enzima B3 não apresenta atividade frente ao colágeno, enquanto que as enzimas A1 e C3 possuem atividade frente a este substrato. Já para a atividade lipolítica, o maior desempenho foi verificado para a enzima A1. A utilização de enzimas em curtumes tem sua eficácia comprovada na etapa de purga, recentemente na depilação/caleiro e remolho também apresentou resultados positivos. / The search for technologies that minimize water consumption and pollution potential of the leather industry has increased. The use of enzymes in various productive stages of this process is a common alternative, since it is a clean technology and accelerates the process. The aim of this study was to analyze the performance of eight commercial enzyme (A1, B1, B2, B3, C1, C2, C3 and C4) provided by three companies in the sector (A, B and C) in processes appointed co-enzymatic, with reduced levels chemicals on the steps of soaking, dehairing/liming and bating, by comparison with the traditional purely chemical. In the stage of soaking was seen from the influence of processing time, type and enzyme’s concentration, being the skin analyzed for fat content and volatile matter and bath analyzed with respect to the concentration of chloride, total solids, fixed and volatile. In step dehairing/liming was studied the influence of time, type and enzyme’s concentration, compared with two chemical processes (traditional and reduced) and the skin was treated at different process times (by SEM analysis). In the bating step, the process was evaluated for the type of enzyme used and the processing time. Altogether 24 tests were performed (12 of soaking, 6 of dehairing/liming and 6 of bating) and all of them, besides the previously mentioned tests were analyzed for Total Organic Carbon (TOC) and Soluble Protein (Lowry method) in baths. Additionally, it was determined the activity of enzymes A1, B3 and C3 against the collagen and enzymes A1, B3, C3 and B1 front of lipids. In general, the results indicate that the co-enzymatic processes reach a greater potential for removal of organic matter when compared to purely chemical processes, especially the enzymes in the soaking C1, B1 and B2 in dehairing/liming. In bating, the enzymes showed similar performance, especially enzymes B3 and C3. Tests for determination of enzyme activity showed that the enzyme has no activity against B3 to collagen, while the A1 and C3 enzymes have activity against this substrate. As for the lipase activity, the greatest effects were observed for the enzyme A1. The use of enzymes in leather processing has proven effective in purging step recently in soaking and dehairing/liming also had positive results.

A exploração indiscriminada dos combustíveis fósseis vem alertando para o colapso próximo do suprimento de energia. Fontes alternativas vêm sendo exploradas com o propósito de apresentarem-se como combustíveis com o mesmo potencial, além de estarem inseridas em um contexto de desenvolvimento sustentável. O Brasil, por consolidar sua posição com forte mercado agroindustrial e dispor de uma grande variedade de unidades agrícolas possui como subprodutos uma alta quantidade de resíduos, como o sabugo de milho. Assim, buscam-se viabilizar metodologias que tornem a exploração desta fonte economicamente vantajosa para a obtenção de etanol de segunda geração (2G). Novas metodologias vêm propondo o emprego de tensoativos como aditivos tanto no prétratamento quanto na hidrólise enzimática de materiais lignocelulósicos. Neste contexto, o presente trabalho objetivou estudar a hidrólise enzimática do sabugo de milho pré-tratado por ácido diluído na presença de diferentes concentrações do tensoativo Tween 80 em associação com a dosagem do complexo enzimático Cellic CTec2 para a obtenção de um hidrolisado rico em glicose para obtenção de etanol pela levedura Scheffersomyces stipitis CBS 6054 através do processo SHF (Separate Hydrolysis and Fermentation). Os ensaios foram conduzidos de acordo com planejamento experimental 23 com face centrada e 3 repetições no ponto central. As variáveis estudadas foram: concentração de surfactante no pré-tratamento e na hidrólise enzimática e dosagem do complexo enzimático. Os resultados mostraram que o uso do surfactante no pré-tratamento com ácido sulfúrico diluído surtiu maior efeito na remoção de lignina e hemicelulose quando empregado na concentração de 10% (m/m). Nesta condição foi possível observar um aumento (21,1%) na perda de celulose em relação ao pré-tratamento sem a presença de surfactante. A maior diminuição na cristalinidade (81,23%) foi com o uso de 10% do tensoativo. A análise da superfície de resposta permitiu determinar as condições ótimas do processo SHF para obtenção de máximo rendimento em glicose (entre 80 e 90 %) que foi quando a concentração de surfactante no pré-tratamento aumentou de 0 a 10 % (m/m) mantendo-se constante em seu nível superior a concentração de surfactante na hidrolise enzimática (10 % m/m) com redução na dosagem de enzima (25,50 FPU/gmaterial lignocelulósico seco). Nestas condições experimentais obteve-se favorecimento no rendimento em glicose (80,54%) e concentração em glicose (61,98 g/L) no meio reacional concomitantemente com o favorecimento no rendimento em xilose (70,66%). Esta levedura fermentou concomitantemente os açúcares (glicose, xilose e celobiose) a etanol com elevados fator de conversão (0,37 g/g) e produtividade volumétrica (1,02 getanol/L.h). A velocidade especifica máxima de consumo destes açúcares foi favorecida na seguinte ordem: glicose, celobiose e xilose. Após esta fermentação foi obtido um material com uma superfície mais porosa e fragmentada. Este fato evidenciou que o complexo enzimático agiu eficientemente quebrando a celulose cristalina obtendo um material amorfo. Espera-se que este trabalho tenha contribuído para o desenvolvimento de uma tecnologia alternativa para a produção de etanol por via biotecnológica a partir da fração lignocelulósica do sabugo de milho, a fim de mitigar os impactos ambientais intrínsecos ao processo. / The indiscriminate exploitation of fossil fuels has been warning of the near collapse of the energy supply. Alternative sources have been explored with the purpose of presenting themselves as fuels with the same potential, besides being inserted in a context of sustainable development. Brazil, by consolidating its position with a strong agroindustrial market and having a wide variety of agricultural units, has as a by-product a high amount of waste, such as corn cob. Thus, we seek to make feasible methodologies that make the exploitation of this source economically advantageous to obtain second generation etanol (2G). New methodologies have proposed the use of surfactants as additives in both pretreatment and enzymatic hydrolysis of lignocellulosic materials. In this context, the present work aimed to study the enzymatic hydrolysis of diluted-acid pretreated corn cob in the presence of different concentrations of the Tween 80 surfactant in combination with the dosage of the Cellic CTec2 enzymatic complex to obtain a glucose rich hydrolysate to produce ethanol by the yeast Scheffersomyces stipitis CBS 6054 in SHF (Separate Hydrolysis and Fermentation) process. The experiments were conducted according to experimental design 23 with centered face and 3 repetitions at the central point. The variables studied were: concentration of surfactant in the pretreatment and in the enzymatic hydrolysis and dosage of the enzymatic complex. The results showed that the use of surfactant in the pretreatment with diluted sulfuric acid had a greater effect on the removal of lignin and hemicellulose when used at the concentration of 10% (w/w). In this condition, the cellulose content was decreased by 21.1% as compared with the amount presents in the diluted-acid corn cob pretreatment without surfactant. The greatest decrease in crystallinity (81.23%) was with the use of 10% of the surfactant. The response surface analysis allowed to determine the optimum conditions of the SHF process to obtain maximum glucose yield (between 80 and 90%), when the pre-treatment surfactante concentration increased from 0 to 10% (w/w) with a reduction in the enzyme dosage (25,50 FPU/g dry lignocellulosic material) at a higher level than the surfactant concentration in the enzymatic hydrolysis. In these experimental conditions, glucose yield (80.54%) and glucose concentration (61.98 g/L) in the reaction medium were favored concomitantly with xylose yield (70.66%). This yeast concomitantly fermented the sugars (glucose, xylose and cellobiose) to ethanol with high conversion factor (0.37 g/g) and volumetric productivity (1.02 getanol/L.h). The maximum specific velocity of consumption of these sugars was favored in the following order: glucose, cellobiose and xylose. After this fermentation was obtained a material with a more porous and fragmented surface. This fact evidenced that the enzymatic complex acted efficiently breaking down the crystalline cellulose obtaining an amorphous material. It is hoped that this work had contributed to the development of an alternative technology to produce ethanol by Biotechnological route from the corn cob lignocellulosic fraction in order to mitigate the environmental impacts intrinsic to the process.

As dietas de vacas em lactação são compostas principalmente por carboidratos que não estão totalmente disponíveis para fermentação microbiana no rúmen, o que pode ser um fator crítico para a obtenção de energia em ruminantes. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da adição de enzima fibrolítica (Fibrozyme®, Alltech Inc., Springfield, KY) e amilolítica (Amaize, Alltech Inc., Springfield, KY) nas dietas sobre o consumo de nutrientes, índice de seleção de partículas, digestibilidade aparente total, fermentação ruminal, metabolismo de nutrientes, produção e composição do leite de vacas em lactação. Para o experimento, 32 vacas multíparas da raça Holandesa com 181.3 ± 35.3 (média ± SD) dias em lactação (DEL), 571 ± 72.7 kg de peso vivo (PV) e 29.6 ± 5.24 kg/d de produção de leite (PL), foram distribuídas em 8 quadrados Latinos 4×4. Os tratamentos foram obtidos por esquema fatorial 2×2 pela combinação de enzima fibrolítica e amilolítica, como segue: 1) Controle (CONT): dieta basal sem adição de enzimas exógenas; 2) Enzima fibrolítica (FIB): dieta basal com adição de 1 g/kg de Fibrozyme± no concentrado da dieta (51 UI de atividade xilanase/kg de matéria seca (MS) da dieta; Alltech, Nicholasville, KY, USA; batch#: 417990-2); 3) Enzima amilolítica (AMI): dieta basal com adição de 0,66 g/kg de Amaize no concentrado da dieta (203 FAU/kg MS da dieta; Alltech Nicholasville, KY, USA; batch: 432715-1); e 4) FIB+AMI: adição de 1 e 0,66 g/kg de Fibrozyme® e Amaize, respectivamente. As enzimas foram aplicadas para atender um consumo de 12 g/dia de Fibrozyme® e 8 g/dia de Amaize, de acordo com as recomendações do fabricante. A enzima foi adicionada ao concentrado durante a preparação na fábrica de ração (toda semana). Não foram observados efeitos das enzimas sobre o consumo e digestibilidade dos nutrientes. Contudo, houve efeito de interação entre FIB e AMI para o consumo de partículas entre 19 e 8 mm. A enzima amilolítica aumentou o consumo de partículas entre 19 e 8 mm nos animais que não recebiam FIB. Além disso, AMI reduziu o consumo de partículas maiores que 19 mm. Outro efeito observado foi a interação entre FIB e AMI sobre a concentração de butirato ruminal. A enzima amilolítica aumentou a concentração de butirato apenas nos animais tratados com FIB. Houve tendência de interação entre enzimas sobre a excreção de nitrogênio (N) no leite, em que FIB reduziu a excreção de N no leite apenas nos animais não tratados com AMI. Ainda, AMI reduziu a excreção de N na urina. Ainda, houve interação entre os efeitos de enzima fibrolítica e amilolítica sobre a concentração de colesterol e a atividade enzimática da aspartato aminotransferase (AST) e gama glutamiltransferase (GGT). A enzima fibrolítica reduziu a concentração de colesterol e aumentou a atividade da enzima GGT nos animais não tratados com enzima amilolítica. No entanto, a enzima amilolítica aumentou a concentração de colesterol e a atividade da AST nos animais alimentados com enzima fibrolítica. Houve interação entre enzimas exógenas sobre a produção de proteína e lactose no leite. A enzima fibrolítica reduziu a produção de proteína e lactose nos animais não alimentados com AMI. Não houve mudanças na produção de leite com a suplementação de enzimas exógenas. Em nosso estudo foram encontrados efeitos no consumo de partículas, fermentação ruminal, excreção de N e mudanças na composição do leite, contudo não foram observadas alterações no desempenho produtivo dos animais. / Lactating cows diets are comprised mostly of carbohydrates which are not fully available for microbial fermentation in the rumen, critical factor for to obtain energy in ruminants. The aimed of this study was to evaluate the effect of fibrolytic enzyme (Fibrozyme®, Alltech Inc., Springfield, KY) on nutrient intake, sorting index, total tract digestion, ruminal fermentation, nitrogen utilization, metabolic profile, milk yield and composition in diets with or without amylolytic enzyme (Amaize, Alltech Inc., Springfield, KY) of mid-lactating dairy cows. Thirty-two multiparous Hostein cows with 181.3 ± 35.3 (mean ± SD) days in milk (DIM), 571 ± 72.7 kg of body weight (BW) and 29.6 ± 5.24 kg/d of milk yield, were blocked and randomly allocated to a sequence of treatments in a 4 × 4 Latin square experimental design. Treatments were obtained in a 2 × 2 factorial arrangement, as follows: 1) Control (CONT), basal diet without exogenous enzymes; 2) Fibrolytic enzyme (FIB), provision of Fibrozyme® (batch#: 417990-2; Alltech, Nichollasvile, KY) at 1 g/kg of concentrate (51 IU of xylanase activity/kg diet DM); 3) Amylolytic enzyme (AMY), provision of AmaizeTM (batch#: 432715-1; Alltech) at 0.66 g/kg of concentrate (203 FAU/kg diet DM); and 4) Fibrolytic enzyme plus amylolytic enzyme (FIB+AMY), enzymes added at the same rate in FIB and AMY treatments. The enzymes were applied to meet the intake of 12 and 8 g/cow/day of Fibrozyme® and AmaizeTM, respectively. Enzymes products were added to concentrate during its preparation (once a week). Enzymes no effects on intake and digestibility of nutrients. However, there was FIB and AMY interaction effect on selection index of particle size between 19 and 8 mm. Amylolytic enzyme increase selection index of particles with 19 and 8 mm, only treatments without FIB. Furthermore, AMY decreased the sorting for feed with particle size greater than 19 mm. There was FIB and AMY interaction effect on butyric acid concentration. Amylolytic enzyme increased on butyrate concentrations in cows treated with fibrolytic enzyme. Fibrolytic and amylolytic enzyme interaction effect tended on N excreted in milk, in which FIB decrease N excreted in milk only on animals non-treated with AMY. Whereas AMY reduced urinary N excretion. There was interaction effects of fibrolytic and amylolytic enzymes on cholesterol concentration and the enzymatic activity of AST and GGT. The fibrolytic enzyme reduced cholesterol concentration and increased GGT enzyme activity in animals not treated with amylolytic enzyme. There was FIB and AMY interaction effect on lactose and protein production. Fibrolytic enzyme decreased lactose and protein production, only on animals non-treated with AMY. Exogenous enzymes had no impact on milk production of dairy cows. Enzymes exogenous affected on particle size greater, ruminal fermentation and milk composition. This study did not show evidences that fibrolytic and amylolytic enzymes can alter total tract nutrient digestibility and performance of mid-lactating cows.

Orientador: Eleonora Cano Carmona / Banca: Aline Aparecida Pizzirani Kleiner / Banca: Helia Hamuri Sato / Banca: Rosa dos Prazeres M.F. Inocentes / Banca: Marcia Regina Brochetto Braga / Resumo: Enzimas degradadoras de xilana, principal componente da hemicelulose, têm sido utilizadas em várias aplicações biotecnológicas, sendo que em alguns processos é necessário o uso de enzimas purificadas. Aplicações comerciais para as enzimas xilanolíticas envolvem a hidrólise enzimática da xilana, que está presente nos resíduos agrícolas e agroindustriais, sendo convertido a xilose e outros açúcares, que podem ser utilizados como substratos em processos fermentativos para a obtenção de proteínas celulares, combustíveis líquidos e outras substâncias químicas. A utilização destas enzimas também diminui a liberação de agentes poluentes em determinados efluentes, como da indústria de polpa de celulose. Xilanases e β- xilosidases são produzidas principalmente por bactérias e fungos, sendo que em geral, os fungos as produzem em níveis mais elevados. O gênero Penicillium apresenta espécies já caracterizadas como boas produtoras destas enzimas. Uma linhagem deste gênero, isolada de solo brasileiro, na região da Mata Atlântica e identificada como Penicillium sclerotiorum destacou-se por produzir xilanase em níveis elevados. O objetivo deste trabalho consistiu na avaliação da influência das condições de cultivo sobre a produção do complexo xilanolítico produzido por P. sclerotiorum, na caracterização físico-química desse sistema, bem como purificação e caracterização bioquímica de seus principais componentes. Por meio da determinação das condições ótimas de produção e da caracterização deste complexo enzimático foi possível estabelecer metodologias eficientes de purificação de xilanases e uma β-xilosidase. Através da caracterização físico-química das enzimas purificadas, foi possível avaliar seu potencial biotecnológico, visando futuras aplicações em processos industriais. / Abstract: Xylan degrading enzymes, the main component of hemicellulose, have been used in various biotechnological applications, and in some cases the use of purified enzymes is necessary. Commercial applications of xylanolytic enzymes involve the enzymatic hydrolysis of xylan, which is present in agricultural and agro-industrial wastes, and can be converted to xylose and other sugars, which can be further used as substrates in fermentation processes to obtaining cellular protein, liquid fuels and other chemicals. The utilization of these enzymes also decreases the release of certain pollutants in wastewater, as in the pulp and paper industry. Xylanases and β-xilosidases are mainly produced by bacteria and fungi, and in general, the fungi produce them at higher levels. The genus Penicillium presents species already characterized as good producers of these enzymes. One strain of this genus isolated from Brazilian soil in the Mata Atlântica region and identified as Penicillium sclerotiorum attracted attention by producing xylanase in high levels. The objective of this study was to evaluate the influence of culture conditions on the production of the xylanolytic complex produced by P. sclerotiorum to characterize physical and chemical properties of this system as well to purify and biochemical characterize its main components. By determining optimal conditions for production and by characterizing this enzymatic complex it was possible to establish efficient methodologies for purification of xylanases and one β-xylosidase. Through their physical and chemical characterization, it was possible to evaluate their biotechnological potential for future applications in industrial processes. / Doutor