A conversão biológica de biomassa celulósica em combustíveis e produtos químicos oferece elevados rendimentos de produtos para a o sucesso da economia e futuramente o potencial de custos muito baixos. A hidrólise enzimática, que converte a biomassa lignocelulósica a açúcares fermentáveis é uma etapa complexa do processo. Um requisito importante no custo-eficiente no processamento de biomassa lignocelulósica é empregar um reator que assegure, ou até mesmo promova uma elevada conversão de celulose para glicose com uma mínima dosagem de enzima. O objetivo da utilização do reator é também de processar um elevado teor de matéria seca e, consequentemente, elevados níveis de celulose que conduzem a um aumento na concentração do produto. No entanto, nos processos que empregam altas cargas de sólidos, além da viscosidade elevada do meio reacional, outros fatores afetam o processo, além da inibição do produto, sendo estes as limitações decorrentes da transferência de massa e a agitação e mistura do meio. Dentro deste contexto, o objetivo deste trabalho foi projetar um biorreator do tipo tambor rotativo para ser empregado no processo, em grande escala, de hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar. Para alcançar este objetivo foram realizados experimentos, em escala de bancada, em um protótipo já existente no laboratório. Neste equipamento foi adicionado uma carga de sólidos de 10% (p/v) (bagaço de cana de açúcar, in natura e pré-tratado) e enzima celulase (Accellerase 1500® (Danisco)). Os resultados dos experimentos no reator mostraram um aumento na concentração de glicose (L⁻&#185) convertida quando comparado com os realizados em frascos Erlenmeyer (controle). Isto ocorreu devido a melhor transferência de massa e de mistura no reator, sendo este mais eficiente, pois permite uma maior área de contacto da enzima com o substrato (bagaço). / The biological conversion of cellulosic biomass to fuels and chemicals offers high yields of products for the success of the economy and future the potential for very low costs. Enzymatic hydrolysis that converts fermentable sugars in lignocellulosic biomass is a complex step in this process. An important requirement in cost-efficient in the processing of lignocellulosic biomass is to employ a reactor that will ensure, or even promote, maximal conversion of cellulose to glucose with a minimum dosage of enzyme. The purpose of using the reactor is also for to process of high dry matter contents and therefore higher levels of cellulose that will also drive up the product concentration. However, the processes that emply high solid loadings, in addition to the high viscosity of the reaction mixture and other factors than product inhibition, notably mixing and mass transfer limitations. Within this context, the aim of this work was to design a bioreactor rotary drum to be used in the process, with largescale enzymatic hydrolysis from sugarcane bagasse. To achieve this objective were performed in a bench scale, with prototype already existing in the laboratory. In this equipment was added a solids loading of 10% (w/v) (sugar cane bagasse, raw and pretreated) and cellulose enzyme (Accellerase 1500® (Danisco)). The results of the reactor experiments showed an increase in glucose concentration (L⁻&#185) converted when compared with those realized in Erlenmeyer flasks (control). This occurred because the mass transfer and mixing in the reactor is more efficient because it allows greater contact area of the enzyme with the substrate (sugarcane bagasse).

Enzimas proteolíticas de origem vegetal têm sido amplamente empregadas em diversos estudos devido a sua capacidade de clivar anticorpos em fragmentos específicos, o que, para algumas aplicações, pode ser mais interessante do que a molécula de imunoglobulina como um todo. Além disso, elas podem ser utilizadas diretamente no paciente no papel de um \"fármaco\" (Há exemplos da aplicação de enzimas no estudo de várias patologias como: doenças auto-imunes, traumáticas ou neurológicas), no auxílio de técnicas clínicas para a detecção de anticorpos e como ferramentas para a produção de soros. Apesar de a utilização dessas enzimas ter grande importância e extensa aplicabilidade, o modo de ação das proteases ainda não é bem compreendido, entretanto, as mesmas são de fácil acesso e largamente encontradas na natureza. A ficina (encontrada nas figueiras) e bromelina (proveniente do abacaxi) são, por exemplo, enzimas que vem sendo exploradas em diversos trabalhos e demostram capacidade de digerir anticorpos. Neste projeto, propusemos verificar a atividade destas enzimas sobre anticorpos provenientes de equinos produção de fragmentos imunorreativos de imunoglobulina a partir de proteases de origem vegetal, diminuindo o risco potencial de transmissão de doenças de origem animal. Espera-se que os fragmentos gerados possam contribuir para diversos estudos de ordem clínica e para a produção de soros adequados contra as toxinas presentes nos venenos de animais. As amostras de soro foram obtidas a partir da imunização dos cavalos pertencentes ao Instituto Butantan, com \"pool\" de veneno de serpente do gênero Bothrops. Esses anticorpos foram purificados utilizando ácido caprílico, digeridos por bromelina ou ficina e diafiltrados. Os resultados obtidos indicam a formação do fragmento de imunoglobulina F(ab)\'2, como proposto no projeto, entretanto necessitando ainda de um delineamento experimental mais amplo a fim de otimizar o processo de digestão atingindo uma maior quantidade de fragmentos F(ab)\'2. / Proteolytic enzymes from vegetal origin have been largely employed in several studies due to its capacity to cleave antibodies into specific fragments, which for some applications, could be more relevant than the immunoglobulin molecule itself. Beyond that, they could be used directley into a patient playing the role of a \"drug\" (There are examples of enzyme application in studies of several pathologies such as autoimmune, traumatic and neurological diseases), in the aid of clinical techniques for antibodies detection and as tools for serum production. Despite the fact that those enzymes have been of great importance and large applicability, its ease of access and ubiquity in nature, the protease mode of action is still not fully understood. Ficin (found in Fig trees) and Bromelain (found in pineapples) are, for example, enzymes that are being explored in an array of articles and demonstrate the capacity to digest antibodies. In this project, we propose to verify the activity of such enzymes from vegetal origins over the antibodies obtained from equines in the production of immunoreactive fragments of immunoglobulin, lowering the potential risk of animal origin diseases transmission. It is hoped that the fragments generated can contribute to studies of clinical level and the production of proper serum against toxins present in animal poisons. Plasma samples were obtained from horse immunization with a venon \"pool\" from Bothrops snakes at Instituto Butantan. These antibodies were purified using caprilic acid, digested by bromelain or ficin and purified again using chromatographic techniques. The results indicate the formation of an immunoglobulin fragment - F(ab)\'2, however, more experiments are needed to optimize the digestive process in order to improve the reaction yield.

Os grãos de quinoa possuem excelente balanço nutricional além das propriedades funcionais, comparativamente superior à dos cereais. A quinoa é cultivada em diversos países e, devido às suas características, têm aumentado o interesse de pesquisadores e consumidores. A quinoa contém pericarpo branco, no entanto, existem grãos com pericarpo vermelho e preto, e todos os tipos são utilizados como alimento em diferentes preparações. Com o objetivo de avaliar as características de grãos de quinoa, amostras de cor branca, preta e vermelha foram analisadas quanto às propriedades físico-químicas e funcionais dos grãos e do amido extraído das diferentes amostras. O amido, extraído pelo método alcalino, foi submetido as análises de teor de amilose, difração de raios X, microscopia eletrônica de varredura (MEV), propriedades térmicas (por DSC-Differential Scanning Calorimeter) e propriedades de pasta (por RVA- Rapid Visco Analyser), além de suscetibilidade à hidrólise enzimática e cor. A composição físico-química dos grãos de quinoa apresentou como principais diferenças o teor de cinzas, fibras e amido. O teor de amilose variou de 13,6% a 21,3%, entre as amostras de amido; os padrões de cristalinidade dos amidos foram de tipo A, típico dos cereais; e, a cristalinidade relativa variou de 25,4 a 29,6 %; as micrografias obtidas por MEV apresentaram as formas poliédricas dos grânulos de amido. Os viscoamilogramas, obtidos para os diferentes amidos, mostraram um comportamento semelhante entre as amostras brancas e pretas. As propriedades térmicas de retrogradação das amostras de quinoa vermelha apresentaram uma menor taxa de retrogradação que variou de 7,5 a 8,5 %; as cultivares brancas apresentaram as maiores taxas de retrogradação de 19,0 a 25,4 %. A hidrólise enzimática dos grânulos de amido, analisada em equivalentes de maltose, variou de 7,2 a 8,7 mg/mL, com uma velocidade maior para a cultivar BSyB, em 60 minutos. O amido extraído das amostras brancas de quinoa apresentou valor de luminosidade de 99,0 e os amidos extraídos das amostras de cor vermelha e preta apresentaram em torno de 97,0. As análises realizadas neste estudo ampliam o conhecimento das características da quinoa de cor branca, vermelha e preta, além de mostrar que a cultivar brasileira (BSyB) apresenta características diferenciadas em vários parâmetros. Devido as suas propriedades todas as amostras analisadas possuem potencial para futuras aplicações tecnológicas. / The quinoa grain have excellent nutritional balance beyond functional properties, comparatively higher than that of cereals. Quinoa is cultivated in many countries and due to its characteristics; this has increased the interest of researchers and consumers. Quinoa contains white pericarp, however, there are red and black grain pericarp and all of kinds are used as food in different preparations. In order to evaluate the quinoa grain characteristics, samples of white, black and red color were analyzed for physical-chemical and functional properties of the grains and starch extracted from different samples, aiming a future technology use. Starch from quinoa grains was extracted by the alkaline method and analyzed for amylose content, X-ray diffraction, scanning electron microscopy (SEM), thermal properties (by Differential Scanning Calorimeter, DSC) and properties folder (by Rapid Visco Analyser, RVA), susceptibility to enzymatic hydrolysis and color. The physicochemical composition of quinoa grains presents major differences as the ash content, fiber and starch. The amylose content ranged from 13.6% to 21.3% among starch samples; patterns crystallinity of starches of type A were typical cereal; and the relative crystallinity ranged from 25.4 to 29.6%; SEM micrographs obtained showed the polyhedral forms of starch granules. The viscoamilogramas obtained for the different starches, show a similar behavior between the white and black samples. The thermal properties of retrogradation of red quinoa samples showed less retrogradation rate ranged from 7.5 to 8.5%; white cultivars showed the highest rates of downgrading from 19.0 to 25.4%. The enzymatic hydrolysis of the starch granules analyzed to maltose equivalents, ranged from 7.2 to 8.7 mg / ml, at a higher speed for cultivating BsyB in 60 minutes. The starch extracted from samples of white quinoa showed 99.0 brightness value and starches extracted from samples of red and black color had around 97.0. The analyzes performed in this study extend the knowledge of quinoa characteristics of white, red and black, in addition to showing that the Brazilian cultivar (BsyB) has different characteristics on various parameters. Because of their properties, all samples have the potential for future technological applications.

Devido à necessidade de se conhecer os impactos que as diversas atividades antropogênicas exercem sobre os ecossistemas torna-se relevante o estudo dos organismos aquáticos perante os resíduos tóxicos resultantes, com o objetivo de facilitar a identificação de áreas poluiídas ou contaminadas e estudos de meios atingidos por estes agentes poluentes. Estudo da microalga em contato com o fenol em concentrações conhecidas, compreende a determinação dos efeitos tóxicos e geração de metabólitos, caracterizando uma possível utilização deste microorganismo como bioindicador para contaminações do poluente. Determinou-se as concentrações de fenol capazes de em 24 horas inibirem o crescimento das células de L. polyedrum em 20 e 50% (IC 20 e IC 50) respectivamente 40 µmol.L-1 e 120 µmol.L-1. Identificou-se a necessidade de padronização das variáveis na execução dos ensaios dose-resposta com algas, permitindo construir protocolos que auxiliariam a obtenção de legislações que assegurem os limites de compostos tóxicos aos organismos costeiros. Calculou-se que a microalga L. polyedrum possui uma taxa de biodegradação do fenol por célula na média de aproximadamente (0,02 µmol.h-1.cel-1), capaz de biotransformar 120 µmol.L-1 de fenol em um período de 16 horas. Vias de biotransformação do fenol na microalga L.polyedrum se dão pela conjugação com a glutationa, catalisada por glutationa S-transferase e pela via metabólica de fenol hidroxilase e catecol 2,3-dihidroxigenase. Identificou-se a geração do ácido 2-hidroximucônico semialdeído, 1,2-dihidroxibenzeno (Catecol) e ácido 2-oxo 4-pentenóico como metabólitos resultantes da exposição de L. polyedrum ao fenol. O composto orgânico fenol é capaz de induzir um estado de aumento na atividade antioxidante da microalga L. polyedrum, sendo as enzimas superóxido dismutase e catalase os melhores biomarcadores, por terem sua expressão até três vezes maior no grupo exposto. Determinou-se que a razão GSH/GSSG no grupo tratado com fenol é menor, devido ao aumento de 20 ng.mL-1 de GSSG, expressando o efeito oxidativo no sistema glutationa, que em condições normais possui os níveis de GSSG muito abaixo dos de GSH. A avaliação fotossintética sugeriu que o fenol interferiu relativamente na fotossíntese da microalga em um curto intervalo de tempo, demonstrando a promissora sensibilidade a este poluente presente no ambiente marinho. / Due necessity of knowing and understand the impacts of diverse anthropogenic activities exerted above ecosystems became relevant the study of aquatic organisms exposed to toxic waste, this can facilitate the identification of polluted or contaminated areas. Study of microalgae in contact with phenol at known concentrations, comprehended a determination of the toxic effects and generation metabolites of characterizing the possible use of the organism as a bioindicator to contamination of the pollutant. In this work it was determined in 24 hours those inhibitor phenol concentrations of cell growth of L.polyedrum on 20% and 50% (IC 20 and IC 50) respectively 40 µmol.L-1 and 120 µmol.L-1. Acknowledged need for standardization of variables in the implementation of dose-response tests with algae, allowing you to build protocols that would help to obtain laws that ensure the limits of toxic compounds to coastal organisms. It was assumed that the L. polyedrum microalgae has a biodegradation rate of phenol per cell on average of about (0,02 µmol.h-1.cel-1), capable of biotransformation 120 µmol.L-1 of phenol in a period of 16 hours. Biotransformation pathways of phenol in the microalgae L. polyedrum occur by conjugation with glutathione, catalyzed by glutathione S-transferase and the metabolic pathway of phenol hydroxylase and catechol 2,3-dihydroxygenase. We identified 2- hydroxy muconic semialdehyde acid, 1,2-dihydroxybenzene (catechol) and 2-oxo-4-pentenoic acid as metabolites resulting from exposure to phenol. The phenol is able to induce a high active antioxidant enzymes on L. polyhedron, and the enzymes superoxide dismutase and catalase the best biomarkers since were induced three times more in the exposed group. It was determined that the GSH / GSSG ratio in the group treated with phenol, GSSG has an increase of 20 ng.mL-1. Evaluation suggested that the phenol interfered on photosynthesis of microalgae in a short time, showing promising sensitivity to this pollutant in the marine environment.

As comunidades microbianas regulam a ciclagem de nutrientes no solo. O impacto das mudanças climáticas sobre estas poderia alterar a estrutura, a função e provocar um desequilíbrio dos nutrientes no ambiente. O principal objetivo desse trabalho foi estudar o impacto da umidade sobre a diversidade e atividades enzimáticas das comunidades bacterianas em microcosmos compostos por solos dos biomas Caatinga e Mata Atlântica. Amostras de solo foram coletadas nos seguintes estados brasileiros: Bahia, Pernambuco e São Paulo totalizando quatro pontos de coleta, com um ponto em cada estado e dois pontos no estado de São Paulo. As amostras de solo dos dois biomas, foram incubadas em microcosmos, com três ciclos de umidade (60 %- 30 %, umidade relativa) e para cada ciclo de umidade, foram construídas uma biblioteca do gene 16S rRNA. Nas análises de alfa diversidade, foram calculados os índices PD (diversidade filogenética baseado nos ramos da árvore filogenética) e Shannon. Para avaliar a beta diversidade foi utilizado o índice Bray-Curts (índice de similaridade baseado nos grupos dominantes) e a distância UniFrac. Simultaneamente, cada uma das amostras de cada tratamento foi analisada para as seguintes atividades enzimáticas: fosfatase ácida e alcalina, arilsulfatase, desidrogenase, celulase, amilase, urease e fitase. Os resultados aqui obtidos mostraram que os filos Acidobacteria, Proteobacteria e Chloroflexi foram mais abundantes nos solos da Mata Atlântica e Actinobacteria, Proteobacteria, Chloroflexi e Acidobacteria nos solos da Caatinga, considerando a característica em estudo do efeito adverso do estresse hídrico. As classes mais prevalentes na Mata Atlântica foram Acidobacteria, Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria e Gammaproteobacteria. Enquanto que para a Caatinga, as classes prevalentes foram Ktedonobacteria, Actinobacteria-6 e Betaproteobacteria. No que diz respeito ao estresse hídrico sobre as atividades enzimáticas, os dados demonstraram efeito significativo para todos os solos amostrados, exceto para a enzima fitase. Por correlação entre as OTUs e as enzimas observou-se que grupos específicos foram correlacionados positivamente com a atividade das enzimas e com C e N total nos solos estudados. Estes resultados indicam que os ciclos de umidade afetam a distribuição taxonômica das comunidades bacterianas e as funções enzimáticas. / The microbial communities regulate the nutrient cycling in the soil. The impact of climate change on could alter the structure and function and cause an imbalance of nutrients in the environment. The main aim of this work was to study the impact of the soil humidity on diversity and enzymatic activities of bacterial communities in microcosms compounds soils of the Biosphere biomes of Caatinga and Atlantic Forest. Soil samples were collected in the following Brazilian states: Bahia, Pernambuco and Sao Paulo totaling four collection points, with a point in each state and two points in São Paulo. The soils samples of the two Biomes, were incubated in microcosms, with three humidity cycles (60% - 30% relative humidity) and for each humidity cycle, was constructed a 16S rRNA gene library. In the analyzes of alpha diversity, the PD indices were calculated (based on phylogenetic diversity branches of the phylogenetic tree) and Shannon and to test the beta diversity we used the Bray-Curts index (similarity index based on the dominant groups) and the distance UniFrac. Simultaneously, each soil sample of each treatment was analyzed for the following enzymatic activities: acid and alkaline phosphatase, arylsulfatase, dehydrogenase, cellulase, amylase, urease and phytase. The results herein obtained showed that the Phyla Acidobacteria, Proteobacteria and Chloroflexi were more abundant in the soils at Atlantic Forest, and Actinobacteria, Proteobacteria, Chloroflexi and Acidobacteria in the soils of Caatinga, considering the studied trait of the adverse effect of water stress. The most prevalent classes in the Atlantic Forest were Acidobacteria, Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria and Gammaproteobacteria. While for the Caatinga, the prevalent classes were Ktedonobacteria, Actinobacteria-6 and Betaproteobacteria. In regard to the hydric stress on the enzymatic activities, the data showed significant effects for all sampling soils, except for the enzyme phytase. By correlations between OTUs and enzymes it was observed that specific groups were positively correlated with the activity of the enzymes and carbon and total nitrogen in the studied soils. These results indicate that humidity cycle affects the taxonomic distribution of bacterial communities and the enzymatic functions.

Atualmente o consumo de xarope de maltose vem crescendo devido ao seu uso em cervejarias e está substituindo progressivamente os adjuntos amiláceos. O xarope de maltose é, tradicionalmente, produzido por meio da hidrólise ácida e/ou enzimática de amido ou flocos de milho. Este trabalho teve como objetivo analisar a possibilidade de obtenção de maltose a partir de outras matérias-primas amiláceas como a mandioca e a puba (produto derivado da fermentação da mandioca) pela ação da a-amilase bacteriana e da a-amilase fúngica sem que fosse necessária a extração do amido. Amostras de mandioca e puba com 10, 20 e 30% de sólidos foram incubadas com a-amilase bacteriana termoestável durante 10, 20 e 30 minutos a 80 0 C, adicionando-se em seguida, µ-amilase fúngica e incubando-se as amostras durante 48 horas a 55 0 C. O grau de sacarificação, expresso em dextrose equivalente (DE), foi determinado pelo método DNS em vários intervalos de tempo. Glicose e maltose foram determinadas por HPLC após 48 horas de sacarificação. Os resultados mostraram que o tempo de ação da a-amilase bacteriana não causou diferenças significativas no grau de hidrólise entre as amostras, mas a concentração de sólidos influiu significativamente no grau da liquefação das amostras. O comportamento das curvas do grau de sacarificação foi semelhante para todos os tratamentos tanto da mandioca quanto da puba. O conteúdo de maltose nas amostras variou entre 30-60% e a glicose entre 0-10% caracterizando um xarope com alto teor de maltose. A eficiência de hidrólise ficou abaixo do esperado. Entretanto, esse fato pode ser explicado pela utilização da mandioca sem extração prévia do amido e pelas dificuldades na extração dos sólidos por centrifugação. Pode-se afirmar que tanto a mandioca quanto à puba podem ser utilizadas como matéria prima em substituição ao milho na obtenção de xarope de maltose através da hidrólise enzimática. A puba, porém, é de mais fácil manuseio sendo que o tratamento com 20% de sólidos, exposto durante 10 minutos a a-amilase bacteriana proporcionou maior rendimento, atingindo 4,2 kg de maltose e 0,3 kg de glicose por 100 kg de mandioca fresca além de proporcionar menor quantidade de resíduo sólidos de 13,7 kg. / Nowadays the consumption of maltose syrups is increasing due to its utilization in breweries where it replaces starch adjuncts. Traditionally maltose syrup has been produced from cornstarch or pellets using acid and/or enzymatic hydrolysis. The objective of this work was to evaluate the possibility of obtaining maltose from starch sources other than maize, such as cassava roots or puba, a fermented cassava product, without extraction of the starch, using bacterial a-amylase and fungal a-amylase for starch hydrolysis. Cassava and puba samples with 10, 20 and 30% dry matter were incubated with termostable bacterial a-amylase for 10, 20 and 30 minutes at 80 0 C, followed by the addition of fungal a-amylase. The samples were incubated for 48 hours at 55 0 C. The degree of saccharification, expressed as dextrose equivalent (DE), was determined by the DNS method. The glucose and maltose contents of the hydrolysate were determined after 48 hours by HPLC. The results showed that the time of action of a-amylase did not influence the degree of saccharification of the samples but the solids concentration significantly affected the hydrolysis degree. The saccharification degree curves were similar for both cassava and puba. The maltose content of the samples varied between 30-60% and the glucose content between 0-10%, which characterized them as "High maltose syrups". The hydrolysis efficiency was lower than expected. However, this fact could be explained by the use of cassava without extraction of the starch and by the difficulty of extracting the solids by centrifugation. It was concluded that for replacement of corn starch, both cassava roots and puba could be used as raw materials for maltose syrup production by enzymatic hydrolysis. However the puba was easier to handle than cassava. The puba treatment consisting of 20% of solids and 10 minutes exposure to a-amylase gave the highest yield reaching 4.2 kg of maltose and 0.3 kg of glucose per 100 kg of raw cassava, in addition to a lower solids residue of 13.7 kg.

Celulose nanocristalina (CNC) é um material de grande ascensão e desenvolvimento no mercado, com um número cada vez maior de aplicações em diversos setores industriais. Contudo, suas aplicações dependem fortemente das propriedades químicas, físicas e ópticas inerentes da CNC, bem como a capacidade de subsequente modificação química. A produção de CNC por via enzimática é um processo controlado e ambientalmente correto que permite obter as CNCs com propriedades desejáveis, porém o processo ainda é pouco estudado. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi aumentar a seletividade da endoglucanase para as regiões amorfas e produzir CNC com alta cristalinidade e alto grau de pureza (baixo teor de hemicelulose). Para isso, foi investigado, pela primeira vez, os efeitos de um preparo enzimático rico em xilanase (Cellic HTec2 ®) para auxiliar na produção de CNC por hidrólise enzimática a partir de polpa kraft de eucalipto branqueada (BEKP). Surpreendentemente, combinações de enzimas com cargas mais elevadas de xilanase em relação a de endoglucanase, mostrou ter um maior potencial para produção de CNC, uma vez que esta foi a única condição que levou ao isolamento de nanopartículas. Essas nanopartículas apresentaram tamanho médio de 420-720nm, índice de cristalinidade entre 65-70%, suas suspensões aquosas permaneceram estáveis por um período maior do que 48h, e apresentaram termoestabilidade muito superior a CNCs obtidas pelo método tradicional de hidrólise com H2SO4. A combinação com carga de xilanase 3 e 7 vezes maior do que a de endoglucanase mostrou ser uma combinação ideal para produção de CNCs. Apesar da xilanase utilizada neste trabalho ter solubilizado mais 70% da xilana de BEKP, o teor de xilana encontrado nas CNCs mantiveram alto (13-15%) e não houve correlação com a composição química o resíduo de BEKP após a hidrólise enzimática. / Cellulose nanocrystal (CNC) is a high-value, emerging nanomaterial with an increasing number of applications in various industrial sectors. However, its applications depend heavily on the inherent chemical, physical and optical properties as well as its suitability for subsequent chemical modification. The enzymatic production of CNC is a controlled and ecofriendly process that allows to obtain CNC with improved properties, but the process is still poorly studied. In this context, the objective of this work was to increase the selectivity of an endoglucanase to the amorphous regions of cellulose and to produce CNC with high crystallinity and purity (low hemicellulose content). We investigated, for the first time, the ability of an endoxylanase enriched enzyme preparation (Cellic HTec2 ®) to aid in the production of CNC by enzymatic hydrolysis from a bleached eucalyptus kraft pulp (BEKP). Interestingly, it was found that combinations of enzymes with xylanase load higher than endoglucanase resulted in greater potential for CNC production, since this was the only condition that led to the isolation of nanoparticles. These nanoparticles showed an average particle size of 420- 720nm, crystallinity index between 65-70%, and their aqueous suspension could remain stable for a period longer than 48h. The enzymatically produced CNCs showed much higher thermostability than the CNC obtained by the traditional hydrolysis with H2SO4. The combination of xylanase loading 3 and 7 times greater than endoglucanase was shown to be an ideal combination for CNC production. Although the xylanase employed in this work solubilized more than 70% of the xylan in BEKP, the content of xylan found in CNC produced remained high (13-15%) and did not correlated with the chemical composition of the enzymatic hydrolysis cellulosic residue.

Um dos desafios relacionados à utilização de xilana para a fabricação de biofilmes, aditivos para fabricação de papéis, medicamentos e alimentos é a sua extração na forma polimérica e com alta pureza. Neste trabalho o material de partida para a obtenção de xilana foi o bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado quimio-termomecanicamente com álcali e sulfito, visando aproveitar esta fração, que corresponde a aproximadamente 25% (m/m). A composição química das xilanas no material original foi determinada, bem como o tipo e a proporção dos grupos pendentes. A extração de xilanas do bagaço de cana pré-tratado foi feita utilizando uma endoxilanase recombinante da família GH30, denominada xilanase VI, com mecanismo de ação dependente da presença de ácidos urônicos para a clivagem da cadeia principal de xilana. Partindo-se do DNA genômico de Trichoderma reesei QM6a, que contém o gene da xilanase VI, foi feita a clonagem em um vetor e este foi inserido em Escherichia coli Rosetta-gami, Pichia pastoris e Aspergillus nidulans A773. Os melhores resultados de expressão da xilanase VI foram obtidos em E. coli, porém os estudos com este sistema serão conduzidos em outro trabalho. A xilanase VI expressa em A. nidulans A773 foi parcialmente purificada e exibiu ótimos de atividade em pH 4-5 à 50 oC. Esta xilanase apresentou maior ação em glucuronoxilana de beechwood e em arabinoglucuronoxilana extraída de bagaço de cana, quando comparado à xilana de oat spelts e à medula de cana. Os dados de Km e Vmax em xilana beechwood exibiram valores de 0,783 mg/ml e 0,4675 UI/ml, respectivamente, em 10 min de reação. A extração enzimática do bagaço de cana pré-tratado com sulfito alcalino solubilizou 14% das xilanas e após uma extração alcalina o rendimento aumentou para 32%. A massa molar média das xilanas extraídas na etapa enzimática foi de 4000 Da, produzindo oligossacarídeos em vez de xilobiose ou xilose, mesmo após longos tempos de reação. Esta enzima se mostrou eficaz para a extração de xilanas de cadeias longas quando se comparada às xilanas extraídas por xilanases de outras famílias. / One of the challenges related to the use of xylan for the manufacture of biofilms, papermaking additives, drugs and food is its extraction in polymer form with high purity. In this project, the starting material for xylan isolation was the sugarcane bagasse pretreated with alkali-sulfite chemothermomechanical process, to recover this fraction, which corresponds to approximately 25% (w/w). The chemical composition of original xylans was determined, as well as the type and proportion of the pendant groups. Xylan extraction from pre-treated sugarcane bagasse was performed using a recombinant endoxylanase from the GH30 family, named xylanase VI, with an appendage-dependent mechanism of action for the xylan backbone cleavage. Starting from the genomic DNA of Trichoderma reesei QM6a, which contains the xylanase VI gene, cloning was done in a vector that was inserted into Escherichia coli Rosetta-gami, Pichia pastoris and Aspergillus nidulans A773. The highest xylanase VI expression results were obtained in E. coli, but studies with this system it will be conducted in future works. Xylanase VI expressed in A. nidulans A773 was purified and showed the higher activity at pH 4-5 at 50 oC. This xylanase present higher activities on beechwood glucuronoxylan and on arabinoglucuronoxylan extracted from sugarcane bagasse than on oat spelts xylan and sugarcane pith. Data for Km and Vmax in xylan beechwood showed values of 0.783 mg / ml and 0.4675 IU / ml, respectively, in 10 min of reaction. The enzymatic extraction of alkaline sulphite pretreated sugarcane bagasse solubilized 14% of the xylans followed by an alkaline extraction with yield of 32%. The average molar mass of xylans extracted in the enzymatic step was 4000 Da, producing oligosaccharides instead of xylobiose or xylose, even after long reaction periods. This enzyme proved effective for xylan extraction of long chains when compared to xylan hydrolysates by xylanases from other families.

As nonoceluloses são partículas com pelo menos uma dimensão menor que 100 nm. A produção delas a partir de materiais lignocelulósicos tem obtido grande destaque nos últimos anos. A celulose nanocristalina (CNC) é tradicionalmente produzida através da hidrólise ácida, utilizando alta concentração de ácido, grande volume de água e com baixo rendimento. A celulose nanofibrilada (CNF) é produzida pela desfibrilação mecânica de polpas celulósicas com alto consumo de energia. Por outro lado, embora a produção industrial de etanol 2G já tenha começado, com as primeiras plantas de produção em escala espalhadas pelo mundo, a hidrólise enzimática completa da celulose para este fim não é economicamente viável e gera um resíduo rico em celulose e altamente recalcitrante, que poderia ser utilizado para produzir nanoceluloses, que tem alto valor agregado. Neste contexto, este estudo investigou a viabilidade técnica da produção das nanoceluloses (CNC e CNF) integradas ao processo de produção de açúcares fermentescíveis para a produção de etanol 2G a partir do bagaço de cana-de-açúcar. Incialmente, em uma planta piloto de produção de etanol 2G, o bagaço foi pré-tratado por explosão a vapor, que gerou a celulignina que foi deslignificada com NaOH. A polpa celulósica gerada foi tratada com peróxido de hidrogênio em meio alcalino para realizar a remoção da lignina residual. Os materiais gerados pelo pré-tratamento e pelo processo de polpação em meio alcalino foram caracterizados quando sua composição química e hidrolisados com diferentes cargas de enzimas. Os resultados mostraram a eficiência dos pré-tratamentos aplicados ao bagaço de cana-de-açúcar causando o enriquecimento em celulose e a diminuição do teor lignina e de hemiceluloses, acarretando um maior acesso das enzimas a celulose. O estudo do efeito das cargas enzimáticas, do aumento da carga de sólidos e do sistema de agitação, resultou em conversões de celulose em torno de 80%, atingindo concentrações acima de 120 g/L. Utilizando o resíduo de hidrólise da polpa celulósica, foram obtidas as nanoceluloses. A CNC apresentou tamanho médio de partículas de 679 nm, índice de cristalinidade de 54%, diâmetros mais frequentes entre 55 e 65 nm e rendimento de aproximadamente 48%. A CNF apresentou tamanho médio de 722 nm e diâmetros com maior frequência em torno de 60 nm, e rendimento de aproximadamente 38%. As suspensões aquosas de CNC e CNF apresentaram baixa estabilidade, quando monitoradas através do potencial zeta. / Nanocelluloses are particles with at least one dimension smaller than 100 nm. Their production from lignocellulosic materials has gained prominence in recent years. Cellulose nanocrystals (CNC) is traditionally produced through acid hydrolysis using high acid concentration, high water volume and results in low yield. Cellulose nanofibrils (CNF) is produced by mechanical defibrillation of cellulosic pulps with high energy consumption. On the other hand, despite the fact the production of 2G ethanol has already reached commercial production, with the first commercial facilities around the worldwide, complete enzymatic hydrolysis of cellulose for this purpose is not economically viable and generates a highly recalcitrant residue rich in cellulose and, which could be used to produce nanocelluloses, high-added value products. In this context, this study investigated the technical viability of obtaining nanocelluloses integrated into the production process of fermentable sugars to obtain 2G ethanol from sugarcane bagasse. Initially, at a pilot plant for production of2G ethanol, sugarcane bagasse was pre-treated by steam explosion, generating cellulignin, which was delignified with NaOH. The resulting cellulosic pulp was treated with hydrogen peroxide in an alkaline medium to remove residual lignin. The materials generated after the pre-treatment and the pulping process in alkaline medium were characterized regarding their chemical composition and then hydrolyzed with different loads of enzymes. The results showed that the pre-treatments applied to the bagasse caused the enrichment in cellulose and the decrease of lignin and hemicelluloses contents, leading to a greater access of the enzymes to cellulose. The enzymatic charges used in the experiments, which were evaluated in combination with the increase of the solids loading together with the change of the agitation system, resulted in a cellulose conversion of around 80%, reaching concentrations above 120 g/L. Using the hydrolysis residue of the cellulosic pulp, nanocelluloses were obtained. The CNC showed a mean particle size of 679 nm, crystallinity index of 54%, diameters between 55 and 65 nm and a yield of about 48%. The CNF displayed an average particle size of 722 nm and diameters with higher frequency around 60 nm. The aqueous suspensions of CNC and CNF showed low stability when monitored through the zeta potential.

A cinética enzimática dos derivados de quinizarina com cadeias homólogas por lipases imobilizadas foi investigada por espectroscopia de fluorescência. Este estudo foi realizado em nível macroscópico e microscópico. Para o estudo macroscópico, foi utilizada a lipase suportada CALB (Novozyme® 435) e para o estudo microscópico a lipase Rhizopus niveus imobilizada em nanopartículas de sílica. Os derivados de quinizarina são espécies que não apresentam fluorescência, porém, quando são hidrolisados, tornam-se fluorescentes (quinizarina). Com um modelo cinético considerando um mecanismo de dois processos sequenciais do tipo Michaelis-Menten, foi possível fazer uma descrição adequada da evolução temporal da formação da quinizarina. O tempo médio de reação da hidrólise enzimática, em nível macroscópico, foi determinado para os derivados diacetato, dibutirato, dihexanoato e dioctanoato de quinizarina nos solventes hexano, ciclo-hexano e decalina saturados com água. No estudo microscópico, a lipase de Rhizopus niveus foi incorporada em nanopartículas de sílica de 200nm. A hidrólise enzimática foi monitorada por imagens e pela flutuação da intensidade de fluorescência com o tempo, por meio da microscopia de fluorescência confocal. Os resultados mostraram que, após a adição do substrato (derivados da quinizarina), começam a aparecer regiões fluorescentes devido ao trabalho enzimático (formação da quinizarina). As imagens de microscopia de fluorescência confocal não mostraram uma nítida diferença entre os substratos avaliados. Entretanto, o estudo da flutuação da intensidade de fluorescência mostrou que há uma diferença entre os substratos e que é possível estimar constantes de tempo de relaxação da atividade enzimática. Além disso, a atividade da lipase depende da forma em que a mesma está distribuída nas nanopartículas (ligada ou adsorvida) e também do tamanho da cadeia de alquílica que compões os derivados. O decaimento de fluorescência da quinizarina produzida pela hidrólise dos derivados pela lipase foi adquirido por microscopia de fluorescência confocal usando excitação de 2-fótons. / The kinetics of enzymatic hydrolysis of quinizarin diester by supported lipase dispersed beads in organic solvents was investigated by fluorescence spectroscopy. This study was performed on macroscopic and microscopic levels. For the macroscopic study was used CALB immobilized lipase (Novozyme ® 435) on acrylate beads, and for microscopic study Rhizopus niveus lipase immobilized on silica nanoparticles. The quinizarin derivatives (substrates) are non-fluorescent species, and only the end product quinizarin has fluorescence. A kinetic model considering two sequential Michaelis-Menten mechanisms provides a suitable description of the time evolution of the quinizarin formation monitored by emission spectroscopy and photon counting measurements. The average reaction time of the enzymatic hydrolysis was determined for quinizarin diacetate, dibutirate, dihexanoate and dioctanoate in hexane, cyclohexane and decaline water saturated solvents. In the microscopic study, the Rhizopus niveus lipase was dispersed into and bound silica mesoporous 200nm particles. In both systems, dispersed silica nanoparticles and a small fraction of aggregates are found in thin film. The enzyme activity was monitored by images and fluctuations of fluorescence intensity over time using confocal fluorescence microscopy. The results showed that after addition of substrate fluorescent spots due to enzyme activity start to appear. Confocal fluorescence images showed no clear difference among substrates. However, the study of fluorescence intensity fluctuations showed that enzyme activity depends on the type of substrate and enzyme support. In addition, the lipase activity depends on the form in which it is distributed in the nanoparticles (bound or entrapped) and the size of the alkyl diester derivatives. The fluorescence decay of quinizarin produced by lipase hydrolysis of diester was measured by confocal fluorescence microscopy using 2-photon pulse excitation.