Os grãos de quinoa possuem excelente balanço nutricional além das propriedades funcionais, comparativamente superior à dos cereais. A quinoa é cultivada em diversos países e, devido às suas características, têm aumentado o interesse de pesquisadores e consumidores. A quinoa contém pericarpo branco, no entanto, existem grãos com pericarpo vermelho e preto, e todos os tipos são utilizados como alimento em diferentes preparações. Com o objetivo de avaliar as características de grãos de quinoa, amostras de cor branca, preta e vermelha foram analisadas quanto às propriedades físico-químicas e funcionais dos grãos e do amido extraído das diferentes amostras. O amido, extraído pelo método alcalino, foi submetido as análises de teor de amilose, difração de raios X, microscopia eletrônica de varredura (MEV), propriedades térmicas (por DSC-Differential Scanning Calorimeter) e propriedades de pasta (por RVA- Rapid Visco Analyser), além de suscetibilidade à hidrólise enzimática e cor. A composição físico-química dos grãos de quinoa apresentou como principais diferenças o teor de cinzas, fibras e amido. O teor de amilose variou de 13,6% a 21,3%, entre as amostras de amido; os padrões de cristalinidade dos amidos foram de tipo A, típico dos cereais; e, a cristalinidade relativa variou de 25,4 a 29,6 %; as micrografias obtidas por MEV apresentaram as formas poliédricas dos grânulos de amido. Os viscoamilogramas, obtidos para os diferentes amidos, mostraram um comportamento semelhante entre as amostras brancas e pretas. As propriedades térmicas de retrogradação das amostras de quinoa vermelha apresentaram uma menor taxa de retrogradação que variou de 7,5 a 8,5 %; as cultivares brancas apresentaram as maiores taxas de retrogradação de 19,0 a 25,4 %. A hidrólise enzimática dos grânulos de amido, analisada em equivalentes de maltose, variou de 7,2 a 8,7 mg/mL, com uma velocidade maior para a cultivar BSyB, em 60 minutos. O amido extraído das amostras brancas de quinoa apresentou valor de luminosidade de 99,0 e os amidos extraídos das amostras de cor vermelha e preta apresentaram em torno de 97,0. As análises realizadas neste estudo ampliam o conhecimento das características da quinoa de cor branca, vermelha e preta, além de mostrar que a cultivar brasileira (BSyB) apresenta características diferenciadas em vários parâmetros. Devido as suas propriedades todas as amostras analisadas possuem potencial para futuras aplicações tecnológicas. / The quinoa grain have excellent nutritional balance beyond functional properties, comparatively higher than that of cereals. Quinoa is cultivated in many countries and due to its characteristics; this has increased the interest of researchers and consumers. Quinoa contains white pericarp, however, there are red and black grain pericarp and all of kinds are used as food in different preparations. In order to evaluate the quinoa grain characteristics, samples of white, black and red color were analyzed for physical-chemical and functional properties of the grains and starch extracted from different samples, aiming a future technology use. Starch from quinoa grains was extracted by the alkaline method and analyzed for amylose content, X-ray diffraction, scanning electron microscopy (SEM), thermal properties (by Differential Scanning Calorimeter, DSC) and properties folder (by Rapid Visco Analyser, RVA), susceptibility to enzymatic hydrolysis and color. The physicochemical composition of quinoa grains presents major differences as the ash content, fiber and starch. The amylose content ranged from 13.6% to 21.3% among starch samples; patterns crystallinity of starches of type A were typical cereal; and the relative crystallinity ranged from 25.4 to 29.6%; SEM micrographs obtained showed the polyhedral forms of starch granules. The viscoamilogramas obtained for the different starches, show a similar behavior between the white and black samples. The thermal properties of retrogradation of red quinoa samples showed less retrogradation rate ranged from 7.5 to 8.5%; white cultivars showed the highest rates of downgrading from 19.0 to 25.4%. The enzymatic hydrolysis of the starch granules analyzed to maltose equivalents, ranged from 7.2 to 8.7 mg / ml, at a higher speed for cultivating BsyB in 60 minutes. The starch extracted from samples of white quinoa showed 99.0 brightness value and starches extracted from samples of red and black color had around 97.0. The analyzes performed in this study extend the knowledge of quinoa characteristics of white, red and black, in addition to showing that the Brazilian cultivar (BsyB) has different characteristics on various parameters. Because of their properties, all samples have the potential for future technological applications.

Atualmente o consumo de xarope de maltose vem crescendo devido ao seu uso em cervejarias e está substituindo progressivamente os adjuntos amiláceos. O xarope de maltose é, tradicionalmente, produzido por meio da hidrólise ácida e/ou enzimática de amido ou flocos de milho. Este trabalho teve como objetivo analisar a possibilidade de obtenção de maltose a partir de outras matérias-primas amiláceas como a mandioca e a puba (produto derivado da fermentação da mandioca) pela ação da a-amilase bacteriana e da a-amilase fúngica sem que fosse necessária a extração do amido. Amostras de mandioca e puba com 10, 20 e 30% de sólidos foram incubadas com a-amilase bacteriana termoestável durante 10, 20 e 30 minutos a 80 0 C, adicionando-se em seguida, µ-amilase fúngica e incubando-se as amostras durante 48 horas a 55 0 C. O grau de sacarificação, expresso em dextrose equivalente (DE), foi determinado pelo método DNS em vários intervalos de tempo. Glicose e maltose foram determinadas por HPLC após 48 horas de sacarificação. Os resultados mostraram que o tempo de ação da a-amilase bacteriana não causou diferenças significativas no grau de hidrólise entre as amostras, mas a concentração de sólidos influiu significativamente no grau da liquefação das amostras. O comportamento das curvas do grau de sacarificação foi semelhante para todos os tratamentos tanto da mandioca quanto da puba. O conteúdo de maltose nas amostras variou entre 30-60% e a glicose entre 0-10% caracterizando um xarope com alto teor de maltose. A eficiência de hidrólise ficou abaixo do esperado. Entretanto, esse fato pode ser explicado pela utilização da mandioca sem extração prévia do amido e pelas dificuldades na extração dos sólidos por centrifugação. Pode-se afirmar que tanto a mandioca quanto à puba podem ser utilizadas como matéria prima em substituição ao milho na obtenção de xarope de maltose através da hidrólise enzimática. A puba, porém, é de mais fácil manuseio sendo que o tratamento com 20% de sólidos, exposto durante 10 minutos a a-amilase bacteriana proporcionou maior rendimento, atingindo 4,2 kg de maltose e 0,3 kg de glicose por 100 kg de mandioca fresca além de proporcionar menor quantidade de resíduo sólidos de 13,7 kg. / Nowadays the consumption of maltose syrups is increasing due to its utilization in breweries where it replaces starch adjuncts. Traditionally maltose syrup has been produced from cornstarch or pellets using acid and/or enzymatic hydrolysis. The objective of this work was to evaluate the possibility of obtaining maltose from starch sources other than maize, such as cassava roots or puba, a fermented cassava product, without extraction of the starch, using bacterial a-amylase and fungal a-amylase for starch hydrolysis. Cassava and puba samples with 10, 20 and 30% dry matter were incubated with termostable bacterial a-amylase for 10, 20 and 30 minutes at 80 0 C, followed by the addition of fungal a-amylase. The samples were incubated for 48 hours at 55 0 C. The degree of saccharification, expressed as dextrose equivalent (DE), was determined by the DNS method. The glucose and maltose contents of the hydrolysate were determined after 48 hours by HPLC. The results showed that the time of action of a-amylase did not influence the degree of saccharification of the samples but the solids concentration significantly affected the hydrolysis degree. The saccharification degree curves were similar for both cassava and puba. The maltose content of the samples varied between 30-60% and the glucose content between 0-10%, which characterized them as "High maltose syrups". The hydrolysis efficiency was lower than expected. However, this fact could be explained by the use of cassava without extraction of the starch and by the difficulty of extracting the solids by centrifugation. It was concluded that for replacement of corn starch, both cassava roots and puba could be used as raw materials for maltose syrup production by enzymatic hydrolysis. However the puba was easier to handle than cassava. The puba treatment consisting of 20% of solids and 10 minutes exposure to a-amylase gave the highest yield reaching 4.2 kg of maltose and 0.3 kg of glucose per 100 kg of raw cassava, in addition to a lower solids residue of 13.7 kg.

Celulose nanocristalina (CNC) é um material de grande ascensão e desenvolvimento no mercado, com um número cada vez maior de aplicações em diversos setores industriais. Contudo, suas aplicações dependem fortemente das propriedades químicas, físicas e ópticas inerentes da CNC, bem como a capacidade de subsequente modificação química. A produção de CNC por via enzimática é um processo controlado e ambientalmente correto que permite obter as CNCs com propriedades desejáveis, porém o processo ainda é pouco estudado. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi aumentar a seletividade da endoglucanase para as regiões amorfas e produzir CNC com alta cristalinidade e alto grau de pureza (baixo teor de hemicelulose). Para isso, foi investigado, pela primeira vez, os efeitos de um preparo enzimático rico em xilanase (Cellic HTec2 ®) para auxiliar na produção de CNC por hidrólise enzimática a partir de polpa kraft de eucalipto branqueada (BEKP). Surpreendentemente, combinações de enzimas com cargas mais elevadas de xilanase em relação a de endoglucanase, mostrou ter um maior potencial para produção de CNC, uma vez que esta foi a única condição que levou ao isolamento de nanopartículas. Essas nanopartículas apresentaram tamanho médio de 420-720nm, índice de cristalinidade entre 65-70%, suas suspensões aquosas permaneceram estáveis por um período maior do que 48h, e apresentaram termoestabilidade muito superior a CNCs obtidas pelo método tradicional de hidrólise com H2SO4. A combinação com carga de xilanase 3 e 7 vezes maior do que a de endoglucanase mostrou ser uma combinação ideal para produção de CNCs. Apesar da xilanase utilizada neste trabalho ter solubilizado mais 70% da xilana de BEKP, o teor de xilana encontrado nas CNCs mantiveram alto (13-15%) e não houve correlação com a composição química o resíduo de BEKP após a hidrólise enzimática. / Cellulose nanocrystal (CNC) is a high-value, emerging nanomaterial with an increasing number of applications in various industrial sectors. However, its applications depend heavily on the inherent chemical, physical and optical properties as well as its suitability for subsequent chemical modification. The enzymatic production of CNC is a controlled and ecofriendly process that allows to obtain CNC with improved properties, but the process is still poorly studied. In this context, the objective of this work was to increase the selectivity of an endoglucanase to the amorphous regions of cellulose and to produce CNC with high crystallinity and purity (low hemicellulose content). We investigated, for the first time, the ability of an endoxylanase enriched enzyme preparation (Cellic HTec2 ®) to aid in the production of CNC by enzymatic hydrolysis from a bleached eucalyptus kraft pulp (BEKP). Interestingly, it was found that combinations of enzymes with xylanase load higher than endoglucanase resulted in greater potential for CNC production, since this was the only condition that led to the isolation of nanoparticles. These nanoparticles showed an average particle size of 420- 720nm, crystallinity index between 65-70%, and their aqueous suspension could remain stable for a period longer than 48h. The enzymatically produced CNCs showed much higher thermostability than the CNC obtained by the traditional hydrolysis with H2SO4. The combination of xylanase loading 3 and 7 times greater than endoglucanase was shown to be an ideal combination for CNC production. Although the xylanase employed in this work solubilized more than 70% of the xylan in BEKP, the content of xylan found in CNC produced remained high (13-15%) and did not correlated with the chemical composition of the enzymatic hydrolysis cellulosic residue.

Um dos desafios relacionados à utilização de xilana para a fabricação de biofilmes, aditivos para fabricação de papéis, medicamentos e alimentos é a sua extração na forma polimérica e com alta pureza. Neste trabalho o material de partida para a obtenção de xilana foi o bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado quimio-termomecanicamente com álcali e sulfito, visando aproveitar esta fração, que corresponde a aproximadamente 25% (m/m). A composição química das xilanas no material original foi determinada, bem como o tipo e a proporção dos grupos pendentes. A extração de xilanas do bagaço de cana pré-tratado foi feita utilizando uma endoxilanase recombinante da família GH30, denominada xilanase VI, com mecanismo de ação dependente da presença de ácidos urônicos para a clivagem da cadeia principal de xilana. Partindo-se do DNA genômico de Trichoderma reesei QM6a, que contém o gene da xilanase VI, foi feita a clonagem em um vetor e este foi inserido em Escherichia coli Rosetta-gami, Pichia pastoris e Aspergillus nidulans A773. Os melhores resultados de expressão da xilanase VI foram obtidos em E. coli, porém os estudos com este sistema serão conduzidos em outro trabalho. A xilanase VI expressa em A. nidulans A773 foi parcialmente purificada e exibiu ótimos de atividade em pH 4-5 à 50 oC. Esta xilanase apresentou maior ação em glucuronoxilana de beechwood e em arabinoglucuronoxilana extraída de bagaço de cana, quando comparado à xilana de oat spelts e à medula de cana. Os dados de Km e Vmax em xilana beechwood exibiram valores de 0,783 mg/ml e 0,4675 UI/ml, respectivamente, em 10 min de reação. A extração enzimática do bagaço de cana pré-tratado com sulfito alcalino solubilizou 14% das xilanas e após uma extração alcalina o rendimento aumentou para 32%. A massa molar média das xilanas extraídas na etapa enzimática foi de 4000 Da, produzindo oligossacarídeos em vez de xilobiose ou xilose, mesmo após longos tempos de reação. Esta enzima se mostrou eficaz para a extração de xilanas de cadeias longas quando se comparada às xilanas extraídas por xilanases de outras famílias. / One of the challenges related to the use of xylan for the manufacture of biofilms, papermaking additives, drugs and food is its extraction in polymer form with high purity. In this project, the starting material for xylan isolation was the sugarcane bagasse pretreated with alkali-sulfite chemothermomechanical process, to recover this fraction, which corresponds to approximately 25% (w/w). The chemical composition of original xylans was determined, as well as the type and proportion of the pendant groups. Xylan extraction from pre-treated sugarcane bagasse was performed using a recombinant endoxylanase from the GH30 family, named xylanase VI, with an appendage-dependent mechanism of action for the xylan backbone cleavage. Starting from the genomic DNA of Trichoderma reesei QM6a, which contains the xylanase VI gene, cloning was done in a vector that was inserted into Escherichia coli Rosetta-gami, Pichia pastoris and Aspergillus nidulans A773. The highest xylanase VI expression results were obtained in E. coli, but studies with this system it will be conducted in future works. Xylanase VI expressed in A. nidulans A773 was purified and showed the higher activity at pH 4-5 at 50 oC. This xylanase present higher activities on beechwood glucuronoxylan and on arabinoglucuronoxylan extracted from sugarcane bagasse than on oat spelts xylan and sugarcane pith. Data for Km and Vmax in xylan beechwood showed values of 0.783 mg / ml and 0.4675 IU / ml, respectively, in 10 min of reaction. The enzymatic extraction of alkaline sulphite pretreated sugarcane bagasse solubilized 14% of the xylans followed by an alkaline extraction with yield of 32%. The average molar mass of xylans extracted in the enzymatic step was 4000 Da, producing oligosaccharides instead of xylobiose or xylose, even after long reaction periods. This enzyme proved effective for xylan extraction of long chains when compared to xylan hydrolysates by xylanases from other families.

As celuloses nanocristalinas (CNC) são partículas de, pelo menos, uma dimensão nanométrica, possuem baixa densidade, alta resistência e área de superfície para realizar modificações químicas, podendo melhorar as propriedades de materiais compósitos. O método mais tradicional para isolar CNC é por hidrólise ácida com ácido sulfúrico, porém este procedimento apresenta desvantagens. Além disso, a ação não seletiva do ácido também ataca as regiões cristalinas levando a um baixo rendimento de produção, e a obtenção de uma suspensão muito diluída de açúcares solubilizados e outros compostos indesejáveis, o que inviabiliza a recuperação dos açúcares. Outra possibilidade para o isolamento de CNC envolve a utilização de preparos enzimáticos de celulases, uma alternativa promissora. Porém, a utilização de baixa carga de polpa celulósica e alta quantidade de enzima tipicamente utilizadas na rota enzimática para obter nanocristais são fatores limitantes. A fim de tentar superar estes problemas, este trabalho teve como objetivo avaliar um sistema de tratamento enzimático em duas etapas para possibilitar a condução do tratamento enzimático em alta concentração de polpa celulósica e baixa dose de enzimas e permitir a produção de CNC e recuperar os açúcares solubilizados em alta concentração. Os resultados mostraram que ao realizar uma hidrólise com baixa carga de sólidos e com suplementação de ?- glicosidade foi possível obter uma conversão de celulose 30% maior, mas uma significativa redução da eficiência enzimática foi observada quando a carga de sólidos foi aumentada, mesmo utilizando a suplementação.Por meio do sistema de duas etapas, foi possível obter uma conversão de celulose e uma concentração de açúcares relativamente alta, além de obter CNC com propriedades comparáveis as obtidas em situações tradicionais de hidrólises. No entanto, o diferencial da hidrólise aplicando o sistema de duas etapas se caracterizou pela utilização de, aproximadamente, metade da quantidade de enzimas utilizadas nas hidrólise tradicionais. Alem disso, o sistema em duas etapas possibilitou a reciclagem das enzimas não adsorvidas para reações de hidrólises subsequentes, se mostrando mais um fator de destaque para a área de conversão enzimática. Conclui-se, portanto, que este sistema se mostrou muito eficiente e promissor o que é interessante do ponto e vista econômico para processos subsequentes à hidrólise. / Nanocrystalline celluloses (CNC) are particles of at least one nanometric dimension, have low density, high strength and surface area to perform chemical modifications, and can improve the properties of composite materials. The most traditional method for isolating CNC is by hydrolysis with sulfuric acid, however this procedure has drawbacks. In addition, the non-selective action of the acid also attacks the crystalline regions leading to a low yield of production, and obtaining a very diluted suspension of solubilized sugars and other undesirable compounds, which impairs prevents the recovery of sugars. Another possibility for the isolation of CNC involves the use of enzymatic preparations of cellulases, a promising alternative. However, the use of low cellulosic pulp load and high amount of enzyme typically used in the enzymatic route to obtain nanocrystals are limiting factors. In order to overcome these problems, this work had as objective to evaluate a system of enzymatic treatment in two stages to enable the conduction of the enzymatic treatment in high concentration of cellulose pulp and low dose of enzymes and to allow the production of CNC and to recover the solubilized sugars in high concentration. The results showed that when hydrolysis was carried out with low solids loading and with ?-glycoside supplementation, 30% higher cellulose conversion was achieved, but a significant reduction of the enzymatic efficiency was observed when solids loading was increased, even using by means of the two-stage system, it was possible to obtain relatively high cellulose conversion and sugar concentration, in addition to obtaining CNCs with properties comparable to those obtained in traditional hydrolysis situations. However, the differential of the hydrolysis applying the two-stage system was characterized by the use of approximately half the amount of enzymes used in traditional hydrolysis. In addition, the two-step system allowed the recycling of the non-adsorbed enzymes to subsequent hydrolysis reactions, showing another important fator for the enzymatic conversion area. It is concluded, therefore, that this system proved very efficient and promising what is interesting from the economic point of view of processes subsequent to the hydrolysis.

As nonoceluloses são partículas com pelo menos uma dimensão menor que 100 nm. A produção delas a partir de materiais lignocelulósicos tem obtido grande destaque nos últimos anos. A celulose nanocristalina (CNC) é tradicionalmente produzida através da hidrólise ácida, utilizando alta concentração de ácido, grande volume de água e com baixo rendimento. A celulose nanofibrilada (CNF) é produzida pela desfibrilação mecânica de polpas celulósicas com alto consumo de energia. Por outro lado, embora a produção industrial de etanol 2G já tenha começado, com as primeiras plantas de produção em escala espalhadas pelo mundo, a hidrólise enzimática completa da celulose para este fim não é economicamente viável e gera um resíduo rico em celulose e altamente recalcitrante, que poderia ser utilizado para produzir nanoceluloses, que tem alto valor agregado. Neste contexto, este estudo investigou a viabilidade técnica da produção das nanoceluloses (CNC e CNF) integradas ao processo de produção de açúcares fermentescíveis para a produção de etanol 2G a partir do bagaço de cana-de-açúcar. Incialmente, em uma planta piloto de produção de etanol 2G, o bagaço foi pré-tratado por explosão a vapor, que gerou a celulignina que foi deslignificada com NaOH. A polpa celulósica gerada foi tratada com peróxido de hidrogênio em meio alcalino para realizar a remoção da lignina residual. Os materiais gerados pelo pré-tratamento e pelo processo de polpação em meio alcalino foram caracterizados quando sua composição química e hidrolisados com diferentes cargas de enzimas. Os resultados mostraram a eficiência dos pré-tratamentos aplicados ao bagaço de cana-de-açúcar causando o enriquecimento em celulose e a diminuição do teor lignina e de hemiceluloses, acarretando um maior acesso das enzimas a celulose. O estudo do efeito das cargas enzimáticas, do aumento da carga de sólidos e do sistema de agitação, resultou em conversões de celulose em torno de 80%, atingindo concentrações acima de 120 g/L. Utilizando o resíduo de hidrólise da polpa celulósica, foram obtidas as nanoceluloses. A CNC apresentou tamanho médio de partículas de 679 nm, índice de cristalinidade de 54%, diâmetros mais frequentes entre 55 e 65 nm e rendimento de aproximadamente 48%. A CNF apresentou tamanho médio de 722 nm e diâmetros com maior frequência em torno de 60 nm, e rendimento de aproximadamente 38%. As suspensões aquosas de CNC e CNF apresentaram baixa estabilidade, quando monitoradas através do potencial zeta. / Nanocelluloses are particles with at least one dimension smaller than 100 nm. Their production from lignocellulosic materials has gained prominence in recent years. Cellulose nanocrystals (CNC) is traditionally produced through acid hydrolysis using high acid concentration, high water volume and results in low yield. Cellulose nanofibrils (CNF) is produced by mechanical defibrillation of cellulosic pulps with high energy consumption. On the other hand, despite the fact the production of 2G ethanol has already reached commercial production, with the first commercial facilities around the worldwide, complete enzymatic hydrolysis of cellulose for this purpose is not economically viable and generates a highly recalcitrant residue rich in cellulose and, which could be used to produce nanocelluloses, high-added value products. In this context, this study investigated the technical viability of obtaining nanocelluloses integrated into the production process of fermentable sugars to obtain 2G ethanol from sugarcane bagasse. Initially, at a pilot plant for production of2G ethanol, sugarcane bagasse was pre-treated by steam explosion, generating cellulignin, which was delignified with NaOH. The resulting cellulosic pulp was treated with hydrogen peroxide in an alkaline medium to remove residual lignin. The materials generated after the pre-treatment and the pulping process in alkaline medium were characterized regarding their chemical composition and then hydrolyzed with different loads of enzymes. The results showed that the pre-treatments applied to the bagasse caused the enrichment in cellulose and the decrease of lignin and hemicelluloses contents, leading to a greater access of the enzymes to cellulose. The enzymatic charges used in the experiments, which were evaluated in combination with the increase of the solids loading together with the change of the agitation system, resulted in a cellulose conversion of around 80%, reaching concentrations above 120 g/L. Using the hydrolysis residue of the cellulosic pulp, nanocelluloses were obtained. The CNC showed a mean particle size of 679 nm, crystallinity index of 54%, diameters between 55 and 65 nm and a yield of about 48%. The CNF displayed an average particle size of 722 nm and diameters with higher frequency around 60 nm. The aqueous suspensions of CNC and CNF showed low stability when monitored through the zeta potential.

A cinética enzimática dos derivados de quinizarina com cadeias homólogas por lipases imobilizadas foi investigada por espectroscopia de fluorescência. Este estudo foi realizado em nível macroscópico e microscópico. Para o estudo macroscópico, foi utilizada a lipase suportada CALB (Novozyme® 435) e para o estudo microscópico a lipase Rhizopus niveus imobilizada em nanopartículas de sílica. Os derivados de quinizarina são espécies que não apresentam fluorescência, porém, quando são hidrolisados, tornam-se fluorescentes (quinizarina). Com um modelo cinético considerando um mecanismo de dois processos sequenciais do tipo Michaelis-Menten, foi possível fazer uma descrição adequada da evolução temporal da formação da quinizarina. O tempo médio de reação da hidrólise enzimática, em nível macroscópico, foi determinado para os derivados diacetato, dibutirato, dihexanoato e dioctanoato de quinizarina nos solventes hexano, ciclo-hexano e decalina saturados com água. No estudo microscópico, a lipase de Rhizopus niveus foi incorporada em nanopartículas de sílica de 200nm. A hidrólise enzimática foi monitorada por imagens e pela flutuação da intensidade de fluorescência com o tempo, por meio da microscopia de fluorescência confocal. Os resultados mostraram que, após a adição do substrato (derivados da quinizarina), começam a aparecer regiões fluorescentes devido ao trabalho enzimático (formação da quinizarina). As imagens de microscopia de fluorescência confocal não mostraram uma nítida diferença entre os substratos avaliados. Entretanto, o estudo da flutuação da intensidade de fluorescência mostrou que há uma diferença entre os substratos e que é possível estimar constantes de tempo de relaxação da atividade enzimática. Além disso, a atividade da lipase depende da forma em que a mesma está distribuída nas nanopartículas (ligada ou adsorvida) e também do tamanho da cadeia de alquílica que compões os derivados. O decaimento de fluorescência da quinizarina produzida pela hidrólise dos derivados pela lipase foi adquirido por microscopia de fluorescência confocal usando excitação de 2-fótons. / The kinetics of enzymatic hydrolysis of quinizarin diester by supported lipase dispersed beads in organic solvents was investigated by fluorescence spectroscopy. This study was performed on macroscopic and microscopic levels. For the macroscopic study was used CALB immobilized lipase (Novozyme ® 435) on acrylate beads, and for microscopic study Rhizopus niveus lipase immobilized on silica nanoparticles. The quinizarin derivatives (substrates) are non-fluorescent species, and only the end product quinizarin has fluorescence. A kinetic model considering two sequential Michaelis-Menten mechanisms provides a suitable description of the time evolution of the quinizarin formation monitored by emission spectroscopy and photon counting measurements. The average reaction time of the enzymatic hydrolysis was determined for quinizarin diacetate, dibutirate, dihexanoate and dioctanoate in hexane, cyclohexane and decaline water saturated solvents. In the microscopic study, the Rhizopus niveus lipase was dispersed into and bound silica mesoporous 200nm particles. In both systems, dispersed silica nanoparticles and a small fraction of aggregates are found in thin film. The enzyme activity was monitored by images and fluctuations of fluorescence intensity over time using confocal fluorescence microscopy. The results showed that after addition of substrate fluorescent spots due to enzyme activity start to appear. Confocal fluorescence images showed no clear difference among substrates. However, the study of fluorescence intensity fluctuations showed that enzyme activity depends on the type of substrate and enzyme support. In addition, the lipase activity depends on the form in which it is distributed in the nanoparticles (bound or entrapped) and the size of the alkyl diester derivatives. The fluorescence decay of quinizarin produced by lipase hydrolysis of diester was measured by confocal fluorescence microscopy using 2-photon pulse excitation.

O bagaço de cana de açúcar é um resíduo lignocelulósico que, após a sua hidrólise, pode ser utilizado como substrato para a produção de hidrogênio (H2) por fermentação. O objetivo deste trabalho foi realizar pré-tratamentos do bagaço de cana com os ácidos clorídrico (HCl) e fosfórico (H3PO4) para a solubilização de carboidratos, produzindo o mínimo de inibidores, bem como para tornar a sua estrutura mais suscetível à hidrólise enzimática. Além disso, foi verificada a possibilidade de utilização dos hidrolisados na produção biológica de H2 por uma cultura mista de micro-organismos. A otimização das condições de pré-tratamento com os ácidos foi feita por meio de um planejamento experimental, variando-se a concentração entre 0,64 e 7,36 % (m/v), a temperatura de 63,20 a96,80°C e o tempo de 38,40 a 441,60 min. Nos hidrolisados obtidos foram determinadas as concentrações de açúcares redutores totais (ART) e de monossacarídeos, tais como a glicose, a xilose e a arabinose, além de potenciais inibidores de fermentação, o furfural, o hidroximetilfurfural (HMF) e o ácido acético. As condições de pré-tratamento do bagaço, nas quais foram obtidas as maiores concentrações de ART (13,88 g/L) foi utilizando 6,0 % (m/v) de HCl, em 360,00 min., a 90°C. Entretanto, sob estas condições, também foram detectadas as concentrações mais elevadas dos inibidores. A condição ótima para a hidrólise com o HCl, obtida através da análise estatística, na qual a concentração de inibidores foi minimizada e a de ART maximizada foi de 96,80ºC, 441,6 min e 7,36 % (m/v) de ácido. Para o pré-tratamento com o H3PO4, as condições ótimas foram as mesmas encontradas para o HCl, obtendo-se 4,98 g/L de ART. Os bagaços pré-tratados foram submetidos à hidrólise enzimática com a enzima Celluclast® e um extrato enzimático bruto com atividade de xilanases. A maior concentração de ART (20,98 g/L) obtida pelas duas hidrólises (ácido/enzimática) foi no bagaço pré-tratado com HCl no tempo de 360,00 min., 6,0 % (m/v) de ácido a 90°C, o qual também apresentou a maior concentração de inibidores (total de 1,23 g/L). O hidrolisado obtido com HCl que apresentou maior concentração de ART foi utilizado em ensaios de fermentação para a produção de H2 por cultura mista. / Sugarcane bagasse is a lignocellulosic residue that can be used as substrate to produce hydrogen (H2) by fermentation after hydrolysis. This study aimed to optimize the pretreatment of sugarcane bagasse with hydrochloric acid (HCl) and phosphoric acid (H3PO4), to solubilize carbohydrates and produce the minimal amount of inhibitors as well as make its structure more susceptible to enzymatic hydrolysis. In addition, we verified the possibility of using hydrolysates in the biological production of H2 by a mixed culture of microorganisms. We optimized the conditions for bagasse pretreatment with acids using an experimental designwe varied the concentration between 0.64 and 7.36% (w/v), the temperature from 63.20 to 96.80 °C, and the time from 38.40 to 441.60 min. In the hydrolysates, we determined the concentrations of total reducing sugars (TRS); monosaccharides such as glucose, xylose, and arabinose; and potential inhibitors of fermentation like furfural, hydroxymethylfurfural (HMF), and acetic acid. The conditions of bagasse pretreatment 6.0% (w/v) HCl, 360 min. and 90 °C led to the highest TRS concentrations (13.88 g L-1), but also to the highest concentrations of inhibitors. Statistical analysis revealed that the optimum conditions for the hydrolysis of sugar cane bagasse with HCl that minimized the concentration of inhibitors while maximizing the TRS concentration were: 96.80 °C, 441.6 min, and 7.36% (w/v) of acid. The optimum conditions for pre-treatment with H3PO4 were the same as those found for HCl; which yielded 4.98 g L-1 TRS. We subjected the pretreated bagasse to enzymatic hydrolysis with Celluclast® enzyme and to a crude enzyme extract with xylanase activity. For both hydrolyses (acid and enzymatic), the highest TRS concentration (20.98 g L-1) was achieved with the bagasse pretreated with HCl 6.0% (w/v) at 90 °C for 360.00 min., which also furnished the highest concentration of inhibitors (total 1.23 g L-1). The hydrolysate obtained with HCl contained higher TRS concentration was used as substrate in fermentation assays for the production of H2 by mixed culture.

For the citrus processing industry the disposal of fresh peels has become a major concern for manyfactories. Orange peels are the major solid by-product. Dried orange peels have a high content ofpectin, cellulose and hemicellulose, which make it suitable as fermentation substrate when hydrolyzed.The present work aims at utilizing orange peels for the production of ethanol by using the fungusMucor indicus. Hence, producing a valuable product from the orange peel waste. The biomass growthwas also examined, since the biomass of the fungus can be processed into chitosan, which also is avaluable material.The work was first focused on examining the fungus ability to assimilate galacturonic acid and severalother sugars present in orange peel hydrolyzate (fructose, glucose, galactose, arabionose, and xylose).Fructose and glucose are the sugars which are consumed the fastest whereas arabinose, xylose andgalacturonic acid are assimilated much slower.One problem when using orange peels as raw material is its content of peel oils (mainly D-limonene),which has an immense antimicrobial effect on many microorganism even at low concentrations. Inorder to study M. indicus sensitivity to peel oil the fungus was grown in medium containing differentconcentrations of D-limonene.At very low limonene concentrations the fungal growth was delayed only modestly, hence a couple ofhours when starting from spores and almost nothing when starting with biomass. Increasing theconcentration to 0.25% (v/v) and above halted the growth to a large extent. However, the fungus wasable to grow even at a limonene concentration of 1.0%, although, at very reduced rate. Cultivationsstarted from spore-solution were more sensitive than those started with biomass.Orange peels were hydrolyzed by two different methods to fermentable sugars, namely by dilute acidhydrolysis (0.5% (v/v) H2SO4) at 150 °C and by enzymatic hydrolysis by cellulase, pectinase and β-glucosidase. The fungus was able to produce ethanol with a maximum yield of about 0.36 g/g after 24h when grown on acid hydrolyzed orange peels both by aerobic and anaerobic cultivation. Apreliminary aerobic cultivation on enzymatic hydrolyzed orange peels gave a maximum ethanol yieldof 0.33 g/g after 26 h.The major metabolite produced during the cultivations was ethanol. Apart from ethanol, glycerol wasthe only component produced in significant amounts. In cultivations performed aerobically on acidandenzymatic hydrolyzed orange peels the glycerol yields were 0.048 g/g after 24 h.Two different techniques were also examined in order to evaluate if the methods could be use asbiomass determining methods when solid particles are present in the culture medium. The problemwith solid particles is that they will be buried inside the fungal biomass matrix. Hence makingseparation impossible prior to dry weight determination in the ordinary way. However, none of themethods involving chitin extraction or chitosan extraction did show any good results.The results from the present work are rather clear, M. indicus was able to grow and produce bothethanol and biomass even when limonene was present in the culture medium. The maximum ethanolyield was achieved after about 24 h in cultivations performed on both acid hydrolyzed and enzymatichydrolyzed orange peels. However, in order to say if the method can be applicable at industrial scaleand made economically feasible the subject has to be investigated further.

Os materiais lignocelulósicos, devido ao seu importante potencial de conversão em açúcares e biocombustíveis, estão sendo extensivamente estudados, nas últimas três décadas. O uso de sabugo de milho como matéria-prima lignocelulósica oferece possibilidades promissoras para a produção de energia renovável. A lignocelulose normalmente consiste em celulose, hemicelulose e lignina. A celulose e a hemicelulose podem ser convertidas em açúcares através de processos químicos ou biológicos, e estes açúcares (principalmente glicose, xilose e arabinose) podem ser fermentados a produtos químicos valiosos como o bioetanol. Na conversão de biomassa em biocombustíveis, o pré-tratamento é o primeiro passo para desestruturar a lignocelulose, deixando-a mais acessível para enzimas que convertem os carboidratos em açúcares fermentescíveis. A tecnologia de extrusão por dupla rosca é comumente usada nas indústrias de polímeros e alimentos, podendo ser um método de pré-tratamento viável, uma vez que possui capacidade de expor a biomassa a uma variedade de condições de cisalhamento sob diferentes temperaturas em um processo de fluxo contínuo, com grande quantidade de sólidos (40-60% em massa). Neste trabalho, foi avaliada a hidrólise enzimática do sabugo de milho pré-tratado em extrusora de dupla rosca para obtenção de açúcares. O pré-tratamento por extrusão, a 115-130°C e 14 rpm (velocidade da dupla rosca), empregou uma relação sólido:líquido de 1:1, onde a fração líquida foi estudada variando-se a relação dos aditivos água e glicerol. O sabugo de milho extrudado, na melhor relação água e glicerol, foi hidrolisado pelo complexo enzimático Cellic CTec2, associado ou não ao Cellic HTec2, empregando-se carga de sólidos de 10%. Na sequência, a dosagem de enzimas e a carga de sólidos foram otimizadas pela metodologia de superfície de resposta (RSM), a fim de se obter elevados valores de conversão de celulose em glicose (y1) e produtividade em glicose (y2). A extrusão do sabugo de milho foi favorecida com o uso de água e glicerol na relação 25:25 (% m/m). O glicerol presente no meio não causou inibição na hidrólise enzimática dispensando a etapa de lavagem dos sólidos. O complexo enzimático comercial Cellic Ctec2 favoreceu a conversão de celulose em glicose. Através da metodologia de análise de superfície de resposta (RSM), foram estabelecidas a dosagem do complexo enzimático comercial Cellic Ctec2 (32 FPU/gmaterial lignocelulósico seco) e a carga de sólidos (17,8% m/m) para maximizar as conversões de celulose em glicose (90,4% m/m) e de hemicelulose em xilose e arabinose (44,0% m/m) e produtividade em glicose (0,69 g/L.h). O rendimento em açúcares totais (323 Kg de glicose e 148 Kg de xilose e arabinose) foi de 471 Kg para cada tonelada de sabugo de milho seco. Nesta condição, as constantes cinéticas para a conversão de celulose em glicose foram: Vmax de 6,00 % (m/m)/h e Km de 22,59 gcelulose/Lsolução. Estes resultados são promissores para obtenção de um hidrolisado de sabugo de milho com elevado teor de monossacarídeos para uso em bioprocessos, de forma sustentável e com mínimo impacto ambiental. / Lignocellulosic materials due to their significant conversion potential in sugars and biofuels have been extensively studied in the last three decades. The use of corn cob as a lignocellulosic feedstock offers promising possibilities for the production of renewable energy. Lignocellulose usually consists of cellulose, hemicellulose and lignin. Cellulose and hemicellulose can be converted into sugars by chemical or biological processes, and these sugars (especially glucose, xylose and arabinose) can be fermented to valuable chemicals such as bioethanol. In the conversion of biomass to biofuels, pretreatment is the first step in de-structuring lignocellulose, making it more accessible to enzymes that convert carbohydrates to fermentable sugars. Twin screw extrusion technology is commonly used in the polymer and food industries, and it may be a viable pretreatment method due to its ability to simultaneously expose biomass to a variety of shear conditions at different temperature in a flow continuous process using large amount of material (40-60% of biomass). In this work, the enzymatic hydrolysis of corn cob was evaluated after its pretreatment in a twin-screw extruder to obtain sugars. Extrusion pretreatment, at 115-130°C and 14 rpm (double screw velocity), employed a solid: liquid ratio of 1: 1, where the liquid fraction was studied by varying the ratio of water and glycerol additives. Extruded corn cob, in the best water and glycerol ratio, was hydrolyzed by the Cellic CTec2 enzymatic complex, associated or not to Cellic HTec2, using 10% solids loading. In the sequence, the dosage of enzymes and the solids loading were optimized by response surface methodology (RSM) to obtain high values of cellulose conversion to glucose (y1), and glucose productivity (y2). The extrusion of corn cob was favored by using water and glycerol in the ratio of 25:25 (% m/m). The glycerol present in the medium did not cause inhibition in the enzymatic hydrolysis dispensing the washing step of the solids. The commercial enzymatic complex Cellic Ctec2 favored the conversion of cellulose to glucose. By the response surface methodology (RSM) were established the dosage of the commercial enzymatic complex Cellic Ctec2 (32 FPU/g dry lignocellulosic material) and solids loading (17.8% m/m) to maximize the conversions of cellulose to glucose (90.4% w/w) and of hemicellulose to xylose and arabinose (44.0% w/w) and glucose productivity (0.69 g/Lh). The yield of total sugars (323 kg of glucose and 148 kg of xylose and arabinose) was 471 kg for each ton of dried corn cob. In this condition, the kinetic constants for the conversion of cellulose to glucose were: Vmax of 6.00% (m/m)/h and Km of 22.59 gcellulose/Lsolution. These results are promising for obtaining a corn cob hydrolysate with high content of monosaccharides to be used in bioprocesses, in a sustainable manner and with minimal environmental impact.