The enzyme, aspartate transcarbamoylase (ATCase) from Moraxella (Branhamella) catarrhalis, has been purified. The holoenzyme has a molecular mass of approximately 510kDa, harbors predominantly positive charges and is hydrophobic in nature. The holoenzyme possesses two subunits, a smaller one of 40 kDa and a larger one of 45 kDa. A third polypeptide has been found to contribute to the overall enzymatic activity, having an approximate mass of 55 kDa. The ATCase purification included the generation of cell-free extract, streptomycin sulfate cut, 60 °C heat step, ammonium sulfate cut, dialysis and ion, gel-filtration and hydrophobic interaction chromatography. The enzyme's performance throughout purification steps was analyzed on activity and SDS-PAGE gradient gels. Its enzymatic, specific activities, yield and fold purification, were also determined.

Os fungos entomopatogênicos, como Metarhizium anisopliae, têm despertado grande interesse como agentes no controle de insetos-pragas. Estas espécies de fungos são especializadas na secreção de um complexo enzimático constituído de proteases, lipases e quitinases, entre outras, estando relacionadas com patogenicidade e virulência. Neste contexto a foi analisada a secreção de quitinases pelos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 de M. anisopliae var. anisopliae, como identificado molecularmente. Contudo, alguns aspectos morfológicos analisados mostram pequenas diferenças entre estes isolados. Para produção de quitinases, os isolados foram cultivados em fermentação submersa na presença e ausência de indutores e em fermentação em estado sólido, tendo crisálida como substrato. A maior síntese de quitinase intracelular foi obtida para IBCB 425 no meio contendo extrato de levedura mais glicose (EG). Visando a produção da enzima extracelular e disponibilidade de fonte de carbono, o meio extrato de levedura mais crisálida (EC), sob agitação foi padronizado para fermentação submersa (FSbm). Os maiores níveis enzimáticos intracelulares para os isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 foram obtidos entre 72 h e 216 h e para a forma extracelular entre 96h e 144h. A produção quitinásica em fermentação sólida (FSS) utilizando crisálida como fonte de carbono foi otimizada por delineamento composto central rotacional (DCCR, tendo como variáveis o tempo de crescimento e umidade. O melhor produtor de quitinase em FSS foi o isolado IBCB 360. A análise do secretoma mostrou um maior número de proteínas quando os isolados foram cultivados na presença do indutor, com destaque para o isolado IBCB 425. A maioria das proteínas secretadas pelos isolados IBCB 167 e IBCB 384, foram identificadas, estando entre elas a endo-N-acetyl--D-glucosaminidase, enzima do complexo quitinolítico. As quitinases produzidas pelos quatro isolados foram parcialmente purificadas em DEAE Celulose, obtendo-se dois picos de atividade quitinásica. O processo de purificação foi continuado para o IBCB 384 em coluna de exclusão molecular, obtendo se um único pico de atividade quitinásica, analisado por electrospray. A temperatura ótima de atividade para as quitinases produzida em FSS pelos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 variou de 50ºC a 60ºC e pH ótimo de atividade ficou na faixa de 5,0 - 5,5. As quitinases dos isolados mantiveram-se estáveis nas temperaturas de 30ºC e 40ºC e em uma ampla faixa de pH. Os sais BaCl2 e MnCl2 ativaram as quitinases dos isolados IBCB 167 e IBCB 425. Além disso, todas as quitinases foram tolerantes ao - mercaptoetanol. O comportamento cinético de todas as quitinases foi Michaeliano e a maior afinidade pelo substrato foi para a quitinase do isolado IBCB 360. Já os experimentos in vivo e in vitro mostraram que o isolado IBCB 425 foi melhor na fase pré-infecção e isolado IBCB 384 foi melhor na fase pós infecção, sendo o mais virulento. Portanto, os isolados M. anisopliae têm se mostrado como bons produtores de quitinases, com boa estabilidade a temperatura e pH além de outras características distintas que provavelmente estão relacionadas com o potencial de patogenicidade e virulência de cada isolado. / Entomopathogenic fungi such as Metarhizium anisopliae, have been attracting great interest as agents to control insect pests. These species of fungi are specialized in the secretion of an enzymatic complex consisting of proteases, lipases and chitinases, among others which are related to pathogenicity and virulence. In this context the secretion of chitinase by IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolated from M. anisopliae var. anisopliae molecularly identified, were analyzed. However, some structural features analyzed showed small differences among these isolates. For chitinase production, the isolates were grown in submerged culture in the presence and absence of inducers and under solid state fermentation with chrysalis as substrate. The enhanced synthesis of intracellular chitinase was obtained with IBCB 425 using yeast extract plus glucose (EG). Aiming to produce the extracellular enzyme and the carbon source available, the medium yeast extract and chrysalis (EC), was standardized to SbmF. The high intracellular enzymes levels produced by IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolates were obtained between 72 h and 216 h and for the extracellular form between 96h and 144h. The chitinase production in SSF using chrysalis as carbon source was optimized by CCRD, having the time of growth and moisture as variables. The best producer of chitinase in SSF was the isolated IBCB 360. The analysis of the secretome showed a great number of proteins when the isolates were grown in the presence of the inducer, especially for the isolated IBCB 425. Most of the proteins secreted by IBCB 167 and IBCB 384 isolates were identified. Among these proteins the endo-N-acetyl--D-glucosaminidase was identified, enzyme that participates in the chitinulitic complex. Chitinases produced by the isolates were partially purified on DEAE - cellulose, yielding two peaks of chitinase activity. The purification process was continued for IBCB 384 isolated using molecular exclusion chromatographic column, yielding only one peak of chitinase activity, analyzed by electrospray. The optimal temperature for the chitinase activity from IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolates obtained in SSF, ranged from 50 ºC to 60 ºC and the optimum pH of activity was 5.0 to 5.5. All chitinases were stable at 30 ºC and 40 ºC, and wide pH range. The BaCl2 and MnCl2 salts activated the chitinases of IBCB 167 and IBCB 425 isolates. In addition, all chitinases were mercaptoethanol tolerant. The kinetic behavior of all chitinases was Michaelian with the highest affinity to the substrate observed for the chitinase of isolated IBCB 360. The in vivo and in vitro experiments showed that isolated IBCB 425 was better in pre -infection phase and the isolated IBCB 384 was better in the post infection phase. Therefore, the M. anisopliae isolates were good producers of chitinases with interesting temperature and pH stability, and other different characteristics that are probably related to the potential pathogenicity and virulence of each isolate.

A proposta desse trabalho foi estudar o perfil de produção de enzimas hidrolíticas pelo fungo termófilo Thermoascus aurantiacus ATCC 204492 quando cultivado em resíduos agroindustriais e utilizá-las nas formas bruta ou purificada na hidrólise da polpa celulósica do bagaço de cana-de-açúcar. Para tanto, estudou-se a cinética de produção de xilanases e celulases em fermentação sólida, utilizando quatro diferentes tipos de resíduos agrícolas: bagaço e palha de cana-de-açúcar, palha de trigo e sabugo de milho. Os extratos obtidos foram investigados quanto ao teor de xilanase, endoglucanase, exoglucanase, β-glicosidase e β-xilosidase. A palha de cana-de-açúcar induziu as maiores atividades de xilanase em 9 dias (1679,8 UI/g) e de β-glicosidase em 6 dias (29,9 UI/g). Em sabugo de milho, o fungo produziu 46,0 UI/g de exoglucanase e 5,2 UI/g de β-xilosidase, em 17 dias. A maior produção de endoglucanase ocorreu em bagaço de cana-de-açúcar em 9 dias (108,9 UI/g). A carga inicial de inóculo foi avaliada para o meio preparado com bagaço e verificou-se que o aumento de 104 vezes no número de ascósporos influenciou somente a produção de exoglucanase, que teve sua atividade aumentada em 10 vezes. Após a determinação das atividades enzimáticas, o extrato de sabugo de milho foi aplicado em uma coluna trocadora de ânions, DEAE Sepharose CL6B, equilibrada em pH 3,5 e 6,0; a fim de se obter as enzimas em sua forma purificada. Pôde-se isolar uma xilanase, uma endoglucanase e uma β-glicosidase de massas molares 31,5 kDa, 32,4 kDa e 76,6 kDa, respectivamente. Os extratos enzimáticos do T. aurantiacus foram aplicados no bagaço de cana-de-açúcar in natura e na polpa celulósica do bagaço, obtendo 15 % de conversão enzimática da celulose (CEC), para ambos os substratos. Sendo assim, a polpa do bagaço de cana-de-açúcar foi pré-tratada com (1) proteases isoladas do abacaxi; (2) xilanase purificada de T. aurantiacus ou (3) ácido sulfúrico diluído. Em seguida foi feita a hidrólise do material pré-tratado com o extrato bruto de T. aurantiacus. O pré-tratamento com protease não teve efeito hidrolítico na polpa de bagaço, porém aumentou a CEC com as enzimas de T. aurantiacus de 9,4 % para 20,7 %. O pré-tratamento com a xilanase pura também não liberou açúcares redutores, contudo foi capaz de aumentar a CEC da polpa de bagaço para 30,0 %. O pré-tratamento com ácido diluído foi capaz de remover até 50 % da hemicelulose presente na polpa do bagaço, porém a remoção deste polissacarídeo não aumentou a CEC do bagaço com as enzimas de T. aurantiacus, mantendo o mesmo valor de CEC (15 %). / The purpose of this work was to study the production profile of hydrolytic enzymes of the thermophilic fungus Thermoascus aurantiacus ATCC 204492 when cultivated in agroindustrial residues and to use them in the forms crude or purified for the hydrolysis of the cellulosic pulp of the sugarcane bagasse. For so much, it was studied the kinetics of xylanases and cellulases production on solid fermentation, using four different types of agricultural residues: sugarcane bagasse, sugarcane straw, wheat straw and corn cob. The extracts obtained were investigated for xylanase, endoglucanase, exoglucanase, β-glucosidase and β-xylosidase activities. Sugarcane straw induced the highest level of xylanase at 9 days (1679.8 UI/g) and β-glicosidase (29.9 UI/g) at 6 days. With corn cob, the fungus produced 46.0 UI/g of exoglucanase and 5.2 UI/g of β-xylosidase at 17 days. The highest endoglucanase production occurred on sugarcane pulp (108.9 UI/g) at 9 days. The initial load of inocullum was evaluated for sugarcane bagasse medium and it was verified that the 10000 times increase of ascospores had influence only in the exoglucanase production, showing a 10 fold increase of its activity. The corn cob extracts were applied in an ion exchange column, DEAE Sepharose CL6B, in order to purify cellulases and hemicellulases presents in the extracts. It could be isolated a xylanase, an endoglucanase and a β-glucosidase of 31.5 kDa, 32.4 kDa and 76.3 kDa, respectively. The enzymatic extracts of T. aurantiacus were tested on sugarcane bagasse in natura and on sugarcane bagasse pulp and 15 % of enzymatic conversion of the cellulose (CEC) was obtained from both substrates. A pretreatment of sugarcane bagasse pulp with (1) proteases isolated from pineapple; (2) xylanase purified of T. aurantiacus and (3) diluted sulfuric acid was performed. The pretreatment with protease did not present any hydrolytic effect on the sugarcane bagasse pulp, however it increased the final CEC with the enzymes of T. aurantiacus from 9.4 % to 20.7 %. The pretreatment with pure xylanase did not release sugars from pulp bagasse, however it was capable to increase the yield of the enzymatic hydrolysis of the pulp to 30.0 %. The pretreatment with diluted acid was capable to remove up to 50 % of the hemicellulose from the pulp, but CEC was maintained on 15 %.

A proposta desse trabalho foi estudar o perfil de produção de enzimas hidrolíticas pelo fungo termófilo Thermoascus aurantiacus ATCC 204492 quando cultivado em resíduos agroindustriais e utilizá-las nas formas bruta ou purificada na hidrólise da polpa celulósica do bagaço de cana-de-açúcar. Para tanto, estudou-se a cinética de produção de xilanases e celulases em fermentação sólida, utilizando quatro diferentes tipos de resíduos agrícolas: bagaço e palha de cana-de-açúcar, palha de trigo e sabugo de milho. Os extratos obtidos foram investigados quanto ao teor de xilanase, endoglucanase, exoglucanase, β-glicosidase e β-xilosidase. A palha de cana-de-açúcar induziu as maiores atividades de xilanase em 9 dias (1679,8 UI/g) e de β-glicosidase em 6 dias (29,9 UI/g). Em sabugo de milho, o fungo produziu 46,0 UI/g de exoglucanase e 5,2 UI/g de β-xilosidase, em 17 dias. A maior produção de endoglucanase ocorreu em bagaço de cana-de-açúcar em 9 dias (108,9 UI/g). A carga inicial de inóculo foi avaliada para o meio preparado com bagaço e verificou-se que o aumento de 104 vezes no número de ascósporos influenciou somente a produção de exoglucanase, que teve sua atividade aumentada em 10 vezes. Após a determinação das atividades enzimáticas, o extrato de sabugo de milho foi aplicado em uma coluna trocadora de ânions, DEAE Sepharose CL6B, equilibrada em pH 3,5 e 6,0; a fim de se obter as enzimas em sua forma purificada. Pôde-se isolar uma xilanase, uma endoglucanase e uma β-glicosidase de massas molares 31,5 kDa, 32,4 kDa e 76,6 kDa, respectivamente. Os extratos enzimáticos do T. aurantiacus foram aplicados no bagaço de cana-de-açúcar in natura e na polpa celulósica do bagaço, obtendo 15 % de conversão enzimática da celulose (CEC), para ambos os substratos. Sendo assim, a polpa do bagaço de cana-de-açúcar foi pré-tratada com (1) proteases isoladas do abacaxi; (2) xilanase purificada de T. aurantiacus ou (3) ácido sulfúrico diluído. Em seguida foi feita a hidrólise do material pré-tratado com o extrato bruto de T. aurantiacus. O pré-tratamento com protease não teve efeito hidrolítico na polpa de bagaço, porém aumentou a CEC com as enzimas de T. aurantiacus de 9,4 % para 20,7 %. O pré-tratamento com a xilanase pura também não liberou açúcares redutores, contudo foi capaz de aumentar a CEC da polpa de bagaço para 30,0 %. O pré-tratamento com ácido diluído foi capaz de remover até 50 % da hemicelulose presente na polpa do bagaço, porém a remoção deste polissacarídeo não aumentou a CEC do bagaço com as enzimas de T. aurantiacus, mantendo o mesmo valor de CEC (15 %). / The purpose of this work was to study the production profile of hydrolytic enzymes of the thermophilic fungus Thermoascus aurantiacus ATCC 204492 when cultivated in agroindustrial residues and to use them in the forms crude or purified for the hydrolysis of the cellulosic pulp of the sugarcane bagasse. For so much, it was studied the kinetics of xylanases and cellulases production on solid fermentation, using four different types of agricultural residues: sugarcane bagasse, sugarcane straw, wheat straw and corn cob. The extracts obtained were investigated for xylanase, endoglucanase, exoglucanase, β-glucosidase and β-xylosidase activities. Sugarcane straw induced the highest level of xylanase at 9 days (1679.8 UI/g) and β-glicosidase (29.9 UI/g) at 6 days. With corn cob, the fungus produced 46.0 UI/g of exoglucanase and 5.2 UI/g of β-xylosidase at 17 days. The highest endoglucanase production occurred on sugarcane pulp (108.9 UI/g) at 9 days. The initial load of inocullum was evaluated for sugarcane bagasse medium and it was verified that the 10000 times increase of ascospores had influence only in the exoglucanase production, showing a 10 fold increase of its activity. The corn cob extracts were applied in an ion exchange column, DEAE Sepharose CL6B, in order to purify cellulases and hemicellulases presents in the extracts. It could be isolated a xylanase, an endoglucanase and a β-glucosidase of 31.5 kDa, 32.4 kDa and 76.3 kDa, respectively. The enzymatic extracts of T. aurantiacus were tested on sugarcane bagasse in natura and on sugarcane bagasse pulp and 15 % of enzymatic conversion of the cellulose (CEC) was obtained from both substrates. A pretreatment of sugarcane bagasse pulp with (1) proteases isolated from pineapple; (2) xylanase purified of T. aurantiacus and (3) diluted sulfuric acid was performed. The pretreatment with protease did not present any hydrolytic effect on the sugarcane bagasse pulp, however it increased the final CEC with the enzymes of T. aurantiacus from 9.4 % to 20.7 %. The pretreatment with pure xylanase did not release sugars from pulp bagasse, however it was capable to increase the yield of the enzymatic hydrolysis of the pulp to 30.0 %. The pretreatment with diluted acid was capable to remove up to 50 % of the hemicellulose from the pulp, but CEC was maintained on 15 %.

A enzima L-asparaginase (L-asparagina amino hidrolase, E.C. 3.5.1.1) é uma das drogas mais utilizadas no tratamento da leucemia linfoblástica aguda. A enzima catalisa a hidrólise do aminoácido asparagina em ácido aspártico e amônia. Algumas linhagens de células tumorais não são capazes de produzir asparagina, dependendo do aminoácido presente no plasma para a síntese proteica. A redução dos níveis plasmáticos de asparagina inibe a síntese de proteínas e depois a síntese de RNA e DNA das células leucêmicas levando-as a morte por apoptose. A cepa de Aspergillus terreus (PC-1.7.A) utilizada nesse trabalho foi isolada de solo e produziu altas concentrações de L-asparaginase. O objetivo do presente trabalho foi purificar, caracterizar, conjugar a enzima e avaliar sua atividade citotóxica em linhagens de células tumorais in vitro. Para a purificação da enzima foram utilizados métodos cromatográficos de interação por troca iônica (DEAE Sepharose) e por gel filtração em diferentes fluxos (Sephacryl S-200HR). A enzima pura foi conjugada com metóxi polietilenoglicol e manteve 93% da atividade inicial. A enzima presente no fluido da cultura dialisado e concentrado manteve sua atividade por até 90 dias a 5ºC. Composta por uma subunidade com massa molecular de 125 kDa a L-asparaginase purificada de A. terreus apresentou atividade catalítica ótima em pH 9,5 e 40ºC e foi estável nessa temperatura por pelo menos 120 minutos. A enzima pura e pura-conjugada apresentou valores de Km de 2,42 e 2,51 mmol/L e Vmax de 11,91 e 12,08 umol.min-1.mg-1, respectivamente. A enzima pura-conjugada perdeu metade de sua atividade em trinta minutos quando incubada com enzimas proteolíticas, enquanto que a enzima pura perdeu metade de sua atividade em cinco minutos sob as mesmas condições. A L-asparaginase pura na concentração de 200 ug/mL reduziu em 50% as células viáveis das linhagens tumorais HL-60 e RS4;11 nos tempos de incubação de 72 e 96 horas, respectivamente, sob as mesmas condições a enzima pura não apresentou atividade citotóxica contra a linhagem controle (PBMC). / The enzyme L-asparaginase (L-asparagin amino hydrolase, E.C. 3.5.1.1) is one of the most commonly used drugs in the treatment of acute lymphoblastic leukaemia. This enzyme catalyzes a hydrolysis of amino acid asparagine into aspartic acid and ammonia. Some tumour cell lines are unable to produce asparagine depending on the amino acid in plasma for protein synthesis. Reduced levels of plasma asparagine inhibit protein synthesis and later synthesis of RNA and DNA in leukemic cells causing them to die by apoptosis. The strain of Aspergillus terreus (PC-1.7.A) in this work was isolated from soil and produced high concentrations of L-asparaginase. The aim of this study was to purify, characterize, conjugate the enzyme and to evaluate its cytotoxic activity in tumour cell lines in vitro. Enzyme purification was achieved by applying chromatography methods of ion exchange (DEAE Sepharose) and gel filtration (Sephacryl S-200HR) at different flows. The pure enzyme was conjugated with methoxy polyethylene glycol and kept 93% of initial activity. The enzyme present in dialysed and concentrated culture fluid maintained its activity for up to 90 days at 5°C. Composed of a subunit with molecular mass of 125 kDa, L-asparaginase purified from A. terreus showed optimum catalytic activity at pH 9.5 and 40°C and was stable at this temperature for at least 120 minutes. The pure and pure-conjugated enzymes showed Km values of 2.42 and 2.51 mmol/L and Vmax of 11.91 and 12.08 umol.min-1.mg-1 respectively. The pure-conjugated enzyme lost half of its activity in thirty minutes when incubated with proteolytic enzymes, while pure enzyme lost half of its activity in five minutes under same conditions. Pure L-asparaginase at a concentration of 200 ug/mL reduced by 50% number a viable cells in tumour cell lines HL-60 and RS4;11 in incubation times of 72 and 96 hours, respectively. Under same conditions pure enzyme showed no cytotoxic activity against control cell line.

Lipases (EC 3.1.1.3) são um grupo de enzimas que catalisam a hidrólise e síntese de triacilgliceróis. Estas enzimas apresentam estabilidade em diversos solventes orgânicos, podendo ser aplicadas como biocatalisadores em vários processos anteriormente realizados apenas por catalisadores químicos. Este trabalho teve como objetivo produzir, purificar e imobilizar lipases de Staphylococcus warneri EX17, cepa capaz de utilizar glicerol como fonte de carbono. Inicialmente, as condições de cultivo para produção de lipases foram otimizadas através de duas ferramentas de planejamento experimental: delineamento Placket Burman (P-B) e delineamento composto central rotacional (DCCR). Determinou-se que as melhores condições para produção desta enzima são: temperatura de 36 °C; pH 8,1; 30 g/L de glicerol; 3,0 g/L de óleo de oliva e 2,5 g/L de óleo de soja. Também se verificou ser possível a utilização de glicerol residual, oriundo da síntese enzimática de biodiesel como fonte de carbono. O extrato enzimático mostrou-se estável em três solventes orgânicos testados (metanol, etanol e η-hexano). Ainda visando a otimização das condições de cultivo, foram realizados cultivos submersos em biorreatores a fim de estudar a influência da taxa volumétrica de transferência de oxigênio (kLa) e do controle do pH, na produção da enzima. A maior produção de lipases ocorreu quando aplicado um kLa de 38 h-1 e com o pH controlado em 7,0 ao longo do cultivo, o que permitiu aumentar a produção da enzima em 5 vezes, em relação ao obtido nas condições anteriormente empregadas. A purificação da lipase foi realizada baseando-se no mecanismo de ativação interfacial destas enzimas sobre superfícies hidrofóbicas. Duas resinas foram testadas, octil-Sepharose e butil- Toyopearl. A lipase produzida foi purificada em apenas um passo utilizando esta última resina. Foi estudada a hiperativação da lipase purificada na presença de detergentes, a atividade lipolítica foi aumentada em 2,5 vezes na presença de 0,1% de Triton X-100. A lipase purificada foi imobilizada através de três estratégias: adsorção em suporte hidrofóbico; união covalente unipontual e união covalente multipontual. A influência da imobilização na modulação das propriedades da enzima foi estudada. A lipase apresentou maior estabilidade quando imobilizada multipontualmente. A hidrólise de distintos ésteres quirais pelos diferentes biocatalisadores obtidos também foi estudada. Os ésteres utilizados foram: (±) mandelato de metila, (±)-2-O-butiril-2-fenilacético e (±)-2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo. A especificidade da enzima foi muito dependente do método de imobilização, sendo que a lipase imobilizada unipontualmente foi mais específica para o substrato (±)-2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo, enquanto que para os outros dois substratos foi a lipase adsorvida hidrofobicamente. Este estudo demonstrou que a lipase de S. warneri EX17 pode ser produzida utilizando glicerol residual como fonte de carbono, levando a diminuição do custo na produção da enzima, que apresenta propriedades bastante interessantes para sua aplicação em biocatálise. / Lipases (EC 3.1.1.3) constitute a group of enzymes that catalyze the hydrolysis and synthesis of triacylglycerols. These enzymes show stability in many organic solvents, being able to be used as biocatalysts in some processes that were once carried out only by chemical catalysys. The aim of this research was the production, purification, and immobilization of lipase by Staphylococcus warneri strain EX17 using glycerol as carbon source. Initially, the cultivation conditions for the production of lipases have been optimized through two statistical procedures, Plackett-Burman statistical design (PB) and central composite design (CCD). It was determined that the best conditions for this enzyme production are: temperature, 36 °C; pH, 8.1; glycerol, 30 g/L; olive oil, 3.0 g/L; and soybean oil, 2.5 g/L. It was also studied the use of raw glycerol from enzymatic synthesis of biodiesel as carbon source, and stability studies showed that this lipase from S. warneri EX17 was stable in methanol, ethanol and nhexane. Moreover, experiments were conducted in submerged bioreactors in order to study the influence of oxygen volumetric mass transfer rate (kLa) and the control of pH in the production of the enzyme. The higher lipase production occurred when the microorganism was submitted to a kLa of 38 h-1 and the pH controlled at 7.0 during the cultivation, which improved 5-fold the enzyme production, compared to the results obtained in shaker flasks. The lipase purification was carried out based on mechanisms of interfacial activation of these enzymes on hydrophobic surface. Two supports were tested, octyl-Sepharose and butyl-Toyopearl. The lipase produced was purified 20-fold in only one step of purification. The purified lipase was immobilized on cyanogens bromide activated agorese and its hyperactivation in the presence of detergents was studied. The lipolytic activity increased 2.5-fold in presence of 0.1% of Triton X-100. After this, lipase was immobilized by three strategies: adsorption on hydrophobic support, mild covalent attachment, and multipoint covalent attachment. The stability over thermal, organic solvent and detergent inactivation was verified, as well as the influence of the immobilization protocol in the modulation of the properties of the enzyme. The lipase showed higher stability when multipointly immobilized on glyoxyl agarose. The hydrolysis of different chiral esters by the three biocatalysts obtained was also studied. The esters used were: (±) methyl mandelate, ((±) methyl mandelate, (±)-2-O-butyryl-2-phenylacetic acid, (±)-2-hydroxy-4-phenyl-butyric acid ethyl ester. The specificity of the enzyme was highly dependent of the protocol of immobilization, and the lipase mildly immobilized on cyanogen bromide agarose was more specific to the hydrolysis of (±)-2-hydroxy-4-phenyl-butyric acid ethyl ester, while for the other two substrates was the lipase adsorbed on octyl agarose. This study demonstrated that the lipase from S. warneri EX17 can be produced using raw glycerol as carbon source, contributing to the reduction in production costs of the enzyme, and the enzyme, when immobilized on different supports, presented quite interesting properties that may be usefull as biocatalysts.

Lipases (EC 3.1.1.3) são um grupo de enzimas que catalisam a hidrólise e síntese de triacilgliceróis. Estas enzimas apresentam estabilidade em diversos solventes orgânicos, podendo ser aplicadas como biocatalisadores em vários processos anteriormente realizados apenas por catalisadores químicos. Este trabalho teve como objetivo produzir, purificar e imobilizar lipases de Staphylococcus warneri EX17, cepa capaz de utilizar glicerol como fonte de carbono. Inicialmente, as condições de cultivo para produção de lipases foram otimizadas através de duas ferramentas de planejamento experimental: delineamento Placket Burman (P-B) e delineamento composto central rotacional (DCCR). Determinou-se que as melhores condições para produção desta enzima são: temperatura de 36 °C; pH 8,1; 30 g/L de glicerol; 3,0 g/L de óleo de oliva e 2,5 g/L de óleo de soja. Também se verificou ser possível a utilização de glicerol residual, oriundo da síntese enzimática de biodiesel como fonte de carbono. O extrato enzimático mostrou-se estável em três solventes orgânicos testados (metanol, etanol e η-hexano). Ainda visando a otimização das condições de cultivo, foram realizados cultivos submersos em biorreatores a fim de estudar a influência da taxa volumétrica de transferência de oxigênio (kLa) e do controle do pH, na produção da enzima. A maior produção de lipases ocorreu quando aplicado um kLa de 38 h-1 e com o pH controlado em 7,0 ao longo do cultivo, o que permitiu aumentar a produção da enzima em 5 vezes, em relação ao obtido nas condições anteriormente empregadas. A purificação da lipase foi realizada baseando-se no mecanismo de ativação interfacial destas enzimas sobre superfícies hidrofóbicas. Duas resinas foram testadas, octil-Sepharose e butil- Toyopearl. A lipase produzida foi purificada em apenas um passo utilizando esta última resina. Foi estudada a hiperativação da lipase purificada na presença de detergentes, a atividade lipolítica foi aumentada em 2,5 vezes na presença de 0,1% de Triton X-100. A lipase purificada foi imobilizada através de três estratégias: adsorção em suporte hidrofóbico; união covalente unipontual e união covalente multipontual. A influência da imobilização na modulação das propriedades da enzima foi estudada. A lipase apresentou maior estabilidade quando imobilizada multipontualmente. A hidrólise de distintos ésteres quirais pelos diferentes biocatalisadores obtidos também foi estudada. Os ésteres utilizados foram: (±) mandelato de metila, (±)-2-O-butiril-2-fenilacético e (±)-2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo. A especificidade da enzima foi muito dependente do método de imobilização, sendo que a lipase imobilizada unipontualmente foi mais específica para o substrato (±)-2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo, enquanto que para os outros dois substratos foi a lipase adsorvida hidrofobicamente. Este estudo demonstrou que a lipase de S. warneri EX17 pode ser produzida utilizando glicerol residual como fonte de carbono, levando a diminuição do custo na produção da enzima, que apresenta propriedades bastante interessantes para sua aplicação em biocatálise. / Lipases (EC 3.1.1.3) constitute a group of enzymes that catalyze the hydrolysis and synthesis of triacylglycerols. These enzymes show stability in many organic solvents, being able to be used as biocatalysts in some processes that were once carried out only by chemical catalysys. The aim of this research was the production, purification, and immobilization of lipase by Staphylococcus warneri strain EX17 using glycerol as carbon source. Initially, the cultivation conditions for the production of lipases have been optimized through two statistical procedures, Plackett-Burman statistical design (PB) and central composite design (CCD). It was determined that the best conditions for this enzyme production are: temperature, 36 °C; pH, 8.1; glycerol, 30 g/L; olive oil, 3.0 g/L; and soybean oil, 2.5 g/L. It was also studied the use of raw glycerol from enzymatic synthesis of biodiesel as carbon source, and stability studies showed that this lipase from S. warneri EX17 was stable in methanol, ethanol and nhexane. Moreover, experiments were conducted in submerged bioreactors in order to study the influence of oxygen volumetric mass transfer rate (kLa) and the control of pH in the production of the enzyme. The higher lipase production occurred when the microorganism was submitted to a kLa of 38 h-1 and the pH controlled at 7.0 during the cultivation, which improved 5-fold the enzyme production, compared to the results obtained in shaker flasks. The lipase purification was carried out based on mechanisms of interfacial activation of these enzymes on hydrophobic surface. Two supports were tested, octyl-Sepharose and butyl-Toyopearl. The lipase produced was purified 20-fold in only one step of purification. The purified lipase was immobilized on cyanogens bromide activated agorese and its hyperactivation in the presence of detergents was studied. The lipolytic activity increased 2.5-fold in presence of 0.1% of Triton X-100. After this, lipase was immobilized by three strategies: adsorption on hydrophobic support, mild covalent attachment, and multipoint covalent attachment. The stability over thermal, organic solvent and detergent inactivation was verified, as well as the influence of the immobilization protocol in the modulation of the properties of the enzyme. The lipase showed higher stability when multipointly immobilized on glyoxyl agarose. The hydrolysis of different chiral esters by the three biocatalysts obtained was also studied. The esters used were: (±) methyl mandelate, ((±) methyl mandelate, (±)-2-O-butyryl-2-phenylacetic acid, (±)-2-hydroxy-4-phenyl-butyric acid ethyl ester. The specificity of the enzyme was highly dependent of the protocol of immobilization, and the lipase mildly immobilized on cyanogen bromide agarose was more specific to the hydrolysis of (±)-2-hydroxy-4-phenyl-butyric acid ethyl ester, while for the other two substrates was the lipase adsorbed on octyl agarose. This study demonstrated that the lipase from S. warneri EX17 can be produced using raw glycerol as carbon source, contributing to the reduction in production costs of the enzyme, and the enzyme, when immobilized on different supports, presented quite interesting properties that may be usefull as biocatalysts.

Lipases (EC 3.1.1.3) são um grupo de enzimas que catalisam a hidrólise e síntese de triacilgliceróis. Estas enzimas apresentam estabilidade em diversos solventes orgânicos, podendo ser aplicadas como biocatalisadores em vários processos anteriormente realizados apenas por catalisadores químicos. Este trabalho teve como objetivo produzir, purificar e imobilizar lipases de Staphylococcus warneri EX17, cepa capaz de utilizar glicerol como fonte de carbono. Inicialmente, as condições de cultivo para produção de lipases foram otimizadas através de duas ferramentas de planejamento experimental: delineamento Placket Burman (P-B) e delineamento composto central rotacional (DCCR). Determinou-se que as melhores condições para produção desta enzima são: temperatura de 36 °C; pH 8,1; 30 g/L de glicerol; 3,0 g/L de óleo de oliva e 2,5 g/L de óleo de soja. Também se verificou ser possível a utilização de glicerol residual, oriundo da síntese enzimática de biodiesel como fonte de carbono. O extrato enzimático mostrou-se estável em três solventes orgânicos testados (metanol, etanol e η-hexano). Ainda visando a otimização das condições de cultivo, foram realizados cultivos submersos em biorreatores a fim de estudar a influência da taxa volumétrica de transferência de oxigênio (kLa) e do controle do pH, na produção da enzima. A maior produção de lipases ocorreu quando aplicado um kLa de 38 h-1 e com o pH controlado em 7,0 ao longo do cultivo, o que permitiu aumentar a produção da enzima em 5 vezes, em relação ao obtido nas condições anteriormente empregadas. A purificação da lipase foi realizada baseando-se no mecanismo de ativação interfacial destas enzimas sobre superfícies hidrofóbicas. Duas resinas foram testadas, octil-Sepharose e butil- Toyopearl. A lipase produzida foi purificada em apenas um passo utilizando esta última resina. Foi estudada a hiperativação da lipase purificada na presença de detergentes, a atividade lipolítica foi aumentada em 2,5 vezes na presença de 0,1% de Triton X-100. A lipase purificada foi imobilizada através de três estratégias: adsorção em suporte hidrofóbico; união covalente unipontual e união covalente multipontual. A influência da imobilização na modulação das propriedades da enzima foi estudada. A lipase apresentou maior estabilidade quando imobilizada multipontualmente. A hidrólise de distintos ésteres quirais pelos diferentes biocatalisadores obtidos também foi estudada. Os ésteres utilizados foram: (±) mandelato de metila, (±)-2-O-butiril-2-fenilacético e (±)-2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo. A especificidade da enzima foi muito dependente do método de imobilização, sendo que a lipase imobilizada unipontualmente foi mais específica para o substrato (±)-2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo, enquanto que para os outros dois substratos foi a lipase adsorvida hidrofobicamente. Este estudo demonstrou que a lipase de S. warneri EX17 pode ser produzida utilizando glicerol residual como fonte de carbono, levando a diminuição do custo na produção da enzima, que apresenta propriedades bastante interessantes para sua aplicação em biocatálise. / Lipases (EC 3.1.1.3) constitute a group of enzymes that catalyze the hydrolysis and synthesis of triacylglycerols. These enzymes show stability in many organic solvents, being able to be used as biocatalysts in some processes that were once carried out only by chemical catalysys. The aim of this research was the production, purification, and immobilization of lipase by Staphylococcus warneri strain EX17 using glycerol as carbon source. Initially, the cultivation conditions for the production of lipases have been optimized through two statistical procedures, Plackett-Burman statistical design (PB) and central composite design (CCD). It was determined that the best conditions for this enzyme production are: temperature, 36 °C; pH, 8.1; glycerol, 30 g/L; olive oil, 3.0 g/L; and soybean oil, 2.5 g/L. It was also studied the use of raw glycerol from enzymatic synthesis of biodiesel as carbon source, and stability studies showed that this lipase from S. warneri EX17 was stable in methanol, ethanol and nhexane. Moreover, experiments were conducted in submerged bioreactors in order to study the influence of oxygen volumetric mass transfer rate (kLa) and the control of pH in the production of the enzyme. The higher lipase production occurred when the microorganism was submitted to a kLa of 38 h-1 and the pH controlled at 7.0 during the cultivation, which improved 5-fold the enzyme production, compared to the results obtained in shaker flasks. The lipase purification was carried out based on mechanisms of interfacial activation of these enzymes on hydrophobic surface. Two supports were tested, octyl-Sepharose and butyl-Toyopearl. The lipase produced was purified 20-fold in only one step of purification. The purified lipase was immobilized on cyanogens bromide activated agorese and its hyperactivation in the presence of detergents was studied. The lipolytic activity increased 2.5-fold in presence of 0.1% of Triton X-100. After this, lipase was immobilized by three strategies: adsorption on hydrophobic support, mild covalent attachment, and multipoint covalent attachment. The stability over thermal, organic solvent and detergent inactivation was verified, as well as the influence of the immobilization protocol in the modulation of the properties of the enzyme. The lipase showed higher stability when multipointly immobilized on glyoxyl agarose. The hydrolysis of different chiral esters by the three biocatalysts obtained was also studied. The esters used were: (±) methyl mandelate, ((±) methyl mandelate, (±)-2-O-butyryl-2-phenylacetic acid, (±)-2-hydroxy-4-phenyl-butyric acid ethyl ester. The specificity of the enzyme was highly dependent of the protocol of immobilization, and the lipase mildly immobilized on cyanogen bromide agarose was more specific to the hydrolysis of (±)-2-hydroxy-4-phenyl-butyric acid ethyl ester, while for the other two substrates was the lipase adsorbed on octyl agarose. This study demonstrated that the lipase from S. warneri EX17 can be produced using raw glycerol as carbon source, contributing to the reduction in production costs of the enzyme, and the enzyme, when immobilized on different supports, presented quite interesting properties that may be usefull as biocatalysts.

A enzima L-asparaginase (L-asparagina amino hidrolase, E.C. 3.5.1.1) é uma das drogas mais utilizadas no tratamento da leucemia linfoblástica aguda. A enzima catalisa a hidrólise do aminoácido asparagina em ácido aspártico e amônia. Algumas linhagens de células tumorais não são capazes de produzir asparagina, dependendo do aminoácido presente no plasma para a síntese proteica. A redução dos níveis plasmáticos de asparagina inibe a síntese de proteínas e depois a síntese de RNA e DNA das células leucêmicas levando-as a morte por apoptose. A cepa de Aspergillus terreus (PC-1.7.A) utilizada nesse trabalho foi isolada de solo e produziu altas concentrações de L-asparaginase. O objetivo do presente trabalho foi purificar, caracterizar, conjugar a enzima e avaliar sua atividade citotóxica em linhagens de células tumorais in vitro. Para a purificação da enzima foram utilizados métodos cromatográficos de interação por troca iônica (DEAE Sepharose) e por gel filtração em diferentes fluxos (Sephacryl S-200HR). A enzima pura foi conjugada com metóxi polietilenoglicol e manteve 93% da atividade inicial. A enzima presente no fluido da cultura dialisado e concentrado manteve sua atividade por até 90 dias a 5ºC. Composta por uma subunidade com massa molecular de 125 kDa a L-asparaginase purificada de A. terreus apresentou atividade catalítica ótima em pH 9,5 e 40ºC e foi estável nessa temperatura por pelo menos 120 minutos. A enzima pura e pura-conjugada apresentou valores de Km de 2,42 e 2,51 mmol/L e Vmax de 11,91 e 12,08 umol.min-1.mg-1, respectivamente. A enzima pura-conjugada perdeu metade de sua atividade em trinta minutos quando incubada com enzimas proteolíticas, enquanto que a enzima pura perdeu metade de sua atividade em cinco minutos sob as mesmas condições. A L-asparaginase pura na concentração de 200 ug/mL reduziu em 50% as células viáveis das linhagens tumorais HL-60 e RS4;11 nos tempos de incubação de 72 e 96 horas, respectivamente, sob as mesmas condições a enzima pura não apresentou atividade citotóxica contra a linhagem controle (PBMC). / The enzyme L-asparaginase (L-asparagin amino hydrolase, E.C. 3.5.1.1) is one of the most commonly used drugs in the treatment of acute lymphoblastic leukaemia. This enzyme catalyzes a hydrolysis of amino acid asparagine into aspartic acid and ammonia. Some tumour cell lines are unable to produce asparagine depending on the amino acid in plasma for protein synthesis. Reduced levels of plasma asparagine inhibit protein synthesis and later synthesis of RNA and DNA in leukemic cells causing them to die by apoptosis. The strain of Aspergillus terreus (PC-1.7.A) in this work was isolated from soil and produced high concentrations of L-asparaginase. The aim of this study was to purify, characterize, conjugate the enzyme and to evaluate its cytotoxic activity in tumour cell lines in vitro. Enzyme purification was achieved by applying chromatography methods of ion exchange (DEAE Sepharose) and gel filtration (Sephacryl S-200HR) at different flows. The pure enzyme was conjugated with methoxy polyethylene glycol and kept 93% of initial activity. The enzyme present in dialysed and concentrated culture fluid maintained its activity for up to 90 days at 5°C. Composed of a subunit with molecular mass of 125 kDa, L-asparaginase purified from A. terreus showed optimum catalytic activity at pH 9.5 and 40°C and was stable at this temperature for at least 120 minutes. The pure and pure-conjugated enzymes showed Km values of 2.42 and 2.51 mmol/L and Vmax of 11.91 and 12.08 umol.min-1.mg-1 respectively. The pure-conjugated enzyme lost half of its activity in thirty minutes when incubated with proteolytic enzymes, while pure enzyme lost half of its activity in five minutes under same conditions. Pure L-asparaginase at a concentration of 200 ug/mL reduced by 50% number a viable cells in tumour cell lines HL-60 and RS4;11 in incubation times of 72 and 96 hours, respectively. Under same conditions pure enzyme showed no cytotoxic activity against control cell line.

Os fungos entomopatogênicos, como Metarhizium anisopliae, têm despertado grande interesse como agentes no controle de insetos-pragas. Estas espécies de fungos são especializadas na secreção de um complexo enzimático constituído de proteases, lipases e quitinases, entre outras, estando relacionadas com patogenicidade e virulência. Neste contexto a foi analisada a secreção de quitinases pelos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 de M. anisopliae var. anisopliae, como identificado molecularmente. Contudo, alguns aspectos morfológicos analisados mostram pequenas diferenças entre estes isolados. Para produção de quitinases, os isolados foram cultivados em fermentação submersa na presença e ausência de indutores e em fermentação em estado sólido, tendo crisálida como substrato. A maior síntese de quitinase intracelular foi obtida para IBCB 425 no meio contendo extrato de levedura mais glicose (EG). Visando a produção da enzima extracelular e disponibilidade de fonte de carbono, o meio extrato de levedura mais crisálida (EC), sob agitação foi padronizado para fermentação submersa (FSbm). Os maiores níveis enzimáticos intracelulares para os isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 foram obtidos entre 72 h e 216 h e para a forma extracelular entre 96h e 144h. A produção quitinásica em fermentação sólida (FSS) utilizando crisálida como fonte de carbono foi otimizada por delineamento composto central rotacional (DCCR, tendo como variáveis o tempo de crescimento e umidade. O melhor produtor de quitinase em FSS foi o isolado IBCB 360. A análise do secretoma mostrou um maior número de proteínas quando os isolados foram cultivados na presença do indutor, com destaque para o isolado IBCB 425. A maioria das proteínas secretadas pelos isolados IBCB 167 e IBCB 384, foram identificadas, estando entre elas a endo-N-acetyl--D-glucosaminidase, enzima do complexo quitinolítico. As quitinases produzidas pelos quatro isolados foram parcialmente purificadas em DEAE Celulose, obtendo-se dois picos de atividade quitinásica. O processo de purificação foi continuado para o IBCB 384 em coluna de exclusão molecular, obtendo se um único pico de atividade quitinásica, analisado por electrospray. A temperatura ótima de atividade para as quitinases produzida em FSS pelos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 variou de 50ºC a 60ºC e pH ótimo de atividade ficou na faixa de 5,0 - 5,5. As quitinases dos isolados mantiveram-se estáveis nas temperaturas de 30ºC e 40ºC e em uma ampla faixa de pH. Os sais BaCl2 e MnCl2 ativaram as quitinases dos isolados IBCB 167 e IBCB 425. Além disso, todas as quitinases foram tolerantes ao - mercaptoetanol. O comportamento cinético de todas as quitinases foi Michaeliano e a maior afinidade pelo substrato foi para a quitinase do isolado IBCB 360. Já os experimentos in vivo e in vitro mostraram que o isolado IBCB 425 foi melhor na fase pré-infecção e isolado IBCB 384 foi melhor na fase pós infecção, sendo o mais virulento. Portanto, os isolados M. anisopliae têm se mostrado como bons produtores de quitinases, com boa estabilidade a temperatura e pH além de outras características distintas que provavelmente estão relacionadas com o potencial de patogenicidade e virulência de cada isolado. / Entomopathogenic fungi such as Metarhizium anisopliae, have been attracting great interest as agents to control insect pests. These species of fungi are specialized in the secretion of an enzymatic complex consisting of proteases, lipases and chitinases, among others which are related to pathogenicity and virulence. In this context the secretion of chitinase by IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolated from M. anisopliae var. anisopliae molecularly identified, were analyzed. However, some structural features analyzed showed small differences among these isolates. For chitinase production, the isolates were grown in submerged culture in the presence and absence of inducers and under solid state fermentation with chrysalis as substrate. The enhanced synthesis of intracellular chitinase was obtained with IBCB 425 using yeast extract plus glucose (EG). Aiming to produce the extracellular enzyme and the carbon source available, the medium yeast extract and chrysalis (EC), was standardized to SbmF. The high intracellular enzymes levels produced by IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolates were obtained between 72 h and 216 h and for the extracellular form between 96h and 144h. The chitinase production in SSF using chrysalis as carbon source was optimized by CCRD, having the time of growth and moisture as variables. The best producer of chitinase in SSF was the isolated IBCB 360. The analysis of the secretome showed a great number of proteins when the isolates were grown in the presence of the inducer, especially for the isolated IBCB 425. Most of the proteins secreted by IBCB 167 and IBCB 384 isolates were identified. Among these proteins the endo-N-acetyl--D-glucosaminidase was identified, enzyme that participates in the chitinulitic complex. Chitinases produced by the isolates were partially purified on DEAE - cellulose, yielding two peaks of chitinase activity. The purification process was continued for IBCB 384 isolated using molecular exclusion chromatographic column, yielding only one peak of chitinase activity, analyzed by electrospray. The optimal temperature for the chitinase activity from IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolates obtained in SSF, ranged from 50 ºC to 60 ºC and the optimum pH of activity was 5.0 to 5.5. All chitinases were stable at 30 ºC and 40 ºC, and wide pH range. The BaCl2 and MnCl2 salts activated the chitinases of IBCB 167 and IBCB 425 isolates. In addition, all chitinases were mercaptoethanol tolerant. The kinetic behavior of all chitinases was Michaelian with the highest affinity to the substrate observed for the chitinase of isolated IBCB 360. The in vivo and in vitro experiments showed that isolated IBCB 425 was better in pre -infection phase and the isolated IBCB 384 was better in the post infection phase. Therefore, the M. anisopliae isolates were good producers of chitinases with interesting temperature and pH stability, and other different characteristics that are probably related to the potential pathogenicity and virulence of each isolate.