Fatores dietéticos como o selênio (Se) são apontados como importantes moduladores do risco de desenvolvimento do câncer de mama. Essa neoplasia pode apresentar sua origem no início do desenvolvimento e, assim, a alimentação materna poderia ter importantes repercussões na programação fetal da doença. A fim de verificar se diferentes concentração de selênio na dieta materna poderiam programar o risco da progênie feminina ao câncer de mama, ratas foram alimentadas com ração contendo 0,15 (CO), 1,0 (SUP) ou 0,05 (DEF) ppm de Se durante a gestação e sua progênie feminina iniciada com DMBA. A progênie do grupo SUP apresentou menor suscetibilidade à carcinogênese, indicado pelo menor número médio e multiplicidade de adenocarcinomas mamários (p< 0,05), enquanto a do grupo DEF apresentou maior suscetibilidade à carcinogênese, indicado pela maior incidência dos mesmos (p< 0,05). Mães do grupo DEF apresentaram menor concentração de Se no sangue (p< 0,05) e sua prole apresentou menor atividade da enzima GPx1 (p< 0,05). Além disso, observou-se na glândula mamária da progênie de 50 dias menor expressão (western blot e qPCR) de ER&#945;, Her-2, EGFR e Ras no grupo SUP em comparação aos grupos CO e DEF (p< 0,05). Analisou-se, ainda, o padrão de metilação global do DNA (HPLC-DAD), expressão das enzimas DNMT1, 3a e 3b (qPCR), o padrão global de modificações pós traducionais em histonas (western blot) e o padrão de metilação da região promotora do gene Er&#945; (modificação com bissulfito e pirossequenciamento) na glândula mamária da progênie de 50 dias. Não houve diferença no padrão de metilação global do DNA e expressão das enzimas DNMTs (p>0,05). Houve aumento na expressão de H4K16 acetilada nos grupos SUP e DEF (p< 0,05). Finalmente, em comparação a progênie do grupo DEF, a do grupo SUP apresentou região promotora de Er&#945; com aumento marginal (p=0,07) na metilação de dois dinucleotídeos CpG. Conclui-se que o consumo de diferentes concentrações de Se na dieta materna tem impacto sobre a suscetibilidade da progênie ao câncer de mama na vida adulta através da modulação da expressão de receptores e oncogenes relacionados ao desenvolvimeto dessa neoplasia, além da influência em processos epigenéticos. Tais resultados apontam para a existência de uma \"janela de programação\" no início do desenvolvimento sensível a ação do Se, resultando em diminuição do risco de câncer de mama quando suplementado na dieta materna e o inverso quando de sua deficiencia. / Based on epidemiological studies and animal models, the essential micronutrient selenium has been highlighted as a promising dietary factor associated to breast cancer risk reduction. Breast cancer may have its origin in early development and thus the maternal diet could have important implications in the fetal programming of the disease. In order to ascertain whether differences in selenium concentration in maternal diet could modulate the susceptibility of female offspring to breast cancer, a biological assay was conducted in which female rats were fed a diet with 0.15 (CO), 1.0 (SUP) or 0.05 (DEF) ppm of selenium during gestational period and the female offspring subjected to a mammary carcinogenesis model induced by DMBA. SUP group offspring presented decreased susceptibility to mammary carcinogenesis, as indicated by lower (p< 0,05) average number and multiplicity od adenocarcinomas, while the DEF group offspring had a greater susceptibility, as indicated by the increase (p< 0,05) in adenocarcinomas incidency. Mothers of the DEF group pesented lower (p< 0,05) Se blood concetrations and their offspring presented lower (p<0,05).GPx1 activity. In addition, there was a decrease (p< 0,05) in ER&#945;, Her-2, EGFR and Ras expression (western blot and qPCR) in the mammary gland of 7 weeks old female SUP group offspring when compared to CO and DEF groups offspring. DNA global methylation pattern (HPLC-DAD), DNMT1, 3a e 3b expression (qPCR), global pattern of post-translational modification in histones (western blot) and methylation status of Er&#945; promoter region (bisulfite modification and pyrosequencing) were also evaluated in the mammary gland of 7 weeks old offspring. There was no diffrence (p>0,05) in DNA global methylation pattern and DNMTs expression. There was an increase in acetilated H4K16 expression in groups SUP and DEF (p< 0,05). Lastly, when compared to DEF offspring, the SUP offspring presented a marginal increase in the methylation of two CpG dinucleotides in the Er&#945; promoter region. In conclusion, the consumption of different selenium concentration in maternal diet plays a role in the progeny\'s breast cancer susceptibility through the modulation of receptors and oncogenes expression, in addition to modifications in epigenetic patterns. These results indicate the presence of a \"programming window\" in the beggining of development susceptible to selenium effects, resulting in decreased breast cancer risk when supplemented and the opposite when deficient.

Na inativação do cromossomo X (ICX) um dos dois cromossomos X presentes nas fêmeas de mamíferos placentários é silenciado transcricionalmente. Esse é um mecanismo de compensação de dose que assegura que a quantidade dos produtos gênicos oriundos do cromossomo X esteja em equilíbrio entre machos e fêmeas. A ICX pode ocorrer de modo aleatório, onde cada célula escolhe ao acaso qual será o cromossomo X inativado: cromossomo X paterno ou cromossomo X materno; ou de forma \"imprintada\" (termo adaptado do inglês imprinted), ou seja, dependente da origem parental do cromossomo X. Enquanto nas fêmeas marsupiais a inativação ocorre de forma \"imprintada\", sendo o X paterno inativado em todos os tecidos, nos mamíferos eutérios a ICX nos tecidos somáticos ocorre de modo aleatório. Porém alguns eutérios mantiveram o mecanismo \"imprintado\" de ICX exclusivamente nos tecidos extraembrionários, como ratos e camundongos. Em humanos, o estado controverso da ICX em tecidos extraembrionários foi reavaliado por nosso grupo utilizando uma análise mais ampla e identificou-se um padrão aleatório (Moreira de Mello et al., 2010), demonstrando a importância de se realizar uma análise global para se determinar o perfil de atividade do cromossomo X. Em bovinos o padrão de ICX em placenta não está claro. Ele foi verificado analisando-se a expressão de um único gene, e os autores concluíram que o padrão era \"imprintado\" (Xue et al., 2002). Porém a análise de um único gene pode não representar o estado epigenético de um cromossomo inteiro. Assim o padrão de ICX em tecidos extraembrionários bovinos se mostra uma questão importantíssima para ser esclarecida. No presente trabalho o cromossomo X bovino foi analisado em busca de SNPs (polimorfismos de base única) localizados em regiões codificadoras em genes expressos no tecido extraembrionário, permitindo assim através da análise da expressão alelo-específica determinar o padrão de expressão do cromossomo X. Os resultados apresentados neste trabalho mostram um padrão de expressão bialélica, indicando que em populações diferentes de células, diferentes cromossomos X estavam ativos. Portanto a ICX em tecidos extraembrionários bovinos ocorre de modo aleatório, padrão semelhantes àquele encontrado em humanos, e diferente daquele encontrado em ratos e camundongos. Este trabalho mostra a importância de uma análise global da expressão gênica no cromossomo X, permitindo assim traçar um perfil de atividade mais próximo possível da realidade. / In X chromosome inactivation (XCI), one of the two X chromosomes present in female mammals is transcriptionally silenced, resulting in a dosage compensation mechanism. The XCI can occur randomly, so that each cell chooses randomly which one will be the inactivated X chromosome: paternal (pX) or maternal (mX); or dependent on parental origin of X chromosome, ie, imprinted. While in female marsupials the inactivation occurs in an imprinted fashion, with the Xp inactivated in all tissues, both somatic and extra-embryonic, in the mammalian eutherians XCI in the somatic tissues occurs randomly. However some eutherians still retain the imprinted XCI mechanism exclusively in extra-embryonic tissues, such as rats and mice. In humans, the controversy of the XCI in placenta was re-evaluated by our group. Using a broader analysis, a random pattern was identified, in contrast to the previously published works. It demonstrated the importance of conducting a comprehensive analysis to determine the profile of X chromosome (Moreira de Mello et al., 2010). In cattle the pattern of XCI in bovine placenta is unclear. It was verified by analyzing the expression of a single gene, and the authors concluded that the pattern was imprinted (Xue et al., 2002). Because the analysis of a single gene may not represent the epigenetic state of an entire chromosome, the pattern of XCI in cattle extra-embryonic tissues is an important issue to be clarified. In the present study the cattle X chromosome was analyzed searching for SNPs (single nucleotide polymorphisms) located in coding regions of genes expressed in extra-embryonic tissue. So that, by analyzing the allele-specific expression it is possible to determine the X chromosome expression patter. The preset results show a bi-allelic expression pattern. This indicates that in different cells populations, different X chromosomes are active. Thus, the XCI in extra-embryonic tissues of bovines occurs randomly, similar to the human pattern but different to that verified in rats and mice. This work shows the importance of a global analysis of the gene expression in X chromosome, through which it can trace the closest activity profile as possible to reality.

Gliomas s~ao tumores heterog^eneos, o que contribui para seu alto grau de mortalidade, apesar de avan¸cos na classifica¸c~ao e tratamento. Desde 2016, a incorpora¸c~ao do estado dos genes IDH e da integridade dos cromossomos 1p e 19q na classifica¸c~ao de gliomas fornece aplica¸c~oes cl´?nicas importantes para o diagn´ostico e tratamento deste tumor; entretanto, a procura por assinaturas moleculares que possam refinar ainda mais os subtipos de glioma em subgrupos mais homog^eneos ´e um esfor¸co cont´?nuo. Este estudo utilizou o maior n´umero de amostras de gliomas adultos (n=932) at´e a atualidade, variando dos graus II ao IV, a fim de definir subgrupos de glioma utilizando assinaturas de metila¸c~ao do DNA, indepentemente de grau e histologia. No total, 7 subtipos foram identificados: Classiclike, Mesenchymal-like, LGm6-GBM, PA-like, Codels, G-CIMP-low and G-CIMP-high. A maior parte dos subgrupos com IDH tipo selvagem, isto ´e, Classic-like, Mesenchymal-like, LGm6-GBM, possuem padr~ao de baixa metila¸c~ao do DNA e um pior risco progn´ostico; caracter´?sticas cl´?nicas t´?picas de glioblastomas, o tipo mais agressivo de gliomas. Uma descoberta interessante foi a identifica¸c~ao do subgrupo PA-like dentre gliomas com IDH tipo selvagem, o qual compartilha aspectos gen^omicos similares a astrocitoma piloc´?tico, um glioma pedi´atrico benigno com bom quadro cl´?nico entre gliomas com IDH tipo selvagem. Codels, os quais abragem pacientes com muta¸c~ao em IDH e codele¸c~ao dos cromossomos 1p e 19, possuem o melhor progn´ostico dentre os gliomas difusos em adultos. Uma descoberta importante em rela¸c~ao a gliomas com muta¸c~ao em IDH, por´em sem codele¸c~ao dos cromossomos 1p e 19q, foi a estratifica¸c~ao de gliomas com fen´otipo metilador de ilhas CpG (G-CIMP) em G-CIMP-low, com n´?veis mais baixos de metila¸c~ao do DNA e pior quadro cl´?nico, e G-CIMP-high, com n´?veis mais altos de metila¸c~ao do DNA e melhor risco progn´ostico. Curiosamente, o grau de metila¸c~ao do DNA (-low e -high) estava associado com altera¸c~oes distintas em elementos regulat´orios e modifica¸c~oes de histona aberrantes na regi~ao promotora de genes do ciclo celular. Estes achados consolidaram a import^ancia cl´?nica da epigen´etica, particularmente da metila¸c~ao do DNA, em gliomas, como tamb´em levantou a possibilidade de que a sobrevida m´edia ruim de G-CIMP-low pode ser associada a elementos regulat´orios. Al´em disso, a hip´otese de que enhancers ativos podem agir na regula¸c~ao g^enica de G-CIMP-low fornece mais evid^encias de que elementos regulat´orios podem levar `a maior agressividade e prolifera¸c~ao de G-CIMP-low. Este estudo visa 1) identificar e caracterizar subtipos de gliomas difusos em adultos baseados na metila¸c~ao do DNA, e 2) avaliar a associa¸c~ao entre modifica¸c~oes de histona com um subtipo mais agressivo de G-CIMP / Gliomas are heterogeneous tumors which contribute to their high mortality despite advancements in classification and treatment. As of 2016, the incorporation of IDH status and the integrity of chromosomes 1p and 19q to glioma classification have provided important clinical application for diagnostics and treatment; however, the search for molecular signatures that further refine glioma subtypes into more homogeneous subgroups is an ongoing effort. This study used the largest sample cohort (n=932) of adult gliomas to date, ranging from grades II to IV, in order to define gliomas subgroups using DNA methylation signatures, independent of histopathological grading. In total, 7 subtypes were identified: Classic-like, Mesenchymal-like, LGm6-GBM, PA-like, Codels, G-CIMP-low and G-CIMP-high. Most IDH -wildtype subgroups, e.g. Classic-like, Mesenchymal-like and LGm6-GBM, had low DNA methylation pattern and a poor outcome, typical of glioblastomas, the most aggressive phenotype of gliomas. An interesting finding was the identification of the PA-like subgroup within IDH -wildtype samples, which shared similar genomic features with pilocytic astrocytoma, a rare pediatric benign glioma, with a good overall survival (OS) among IDH -wildtype gliomas. Codels, which comprise IDH mutant gliomas with codeletion of chromosomes 1p/19q have the best OS across all adult gliomas. An important finding regarding IDH mutant gliomas with no codeletion of chromosomes 1p/19q, was the further segregation of the Glioma-CpG Island Methylator Phenotype (G-CIMP) into G-CIMP-low, with lower levels of DNA methylation and worse OS, and G-CIMP-high, characterized by higher DNA methylation profile and better OS. Interestingly, the degree of G-CIMP methylation (-low and -high) was associated with distinct alterations in regulatory elements and aberrant histone modifications at promoter regions of cell cycle genes. These findings consolidated the clinical importance of epigenetics, particularly DNA methylation, in gliomas, as well as the possibility that aggressive OS in G-CIMP-low may be driven by regulatory elements. Moreover, our results suggest that active enhancers that might be acting in gene regulation in G-CIMP-low provide more evidence of the regulatory elements that might be driving aggressiveness and proliferation in G-CIMP-low. This study aims 1) to identify and characterize adult diffuse glioma DNA methylation subtypes, and 2) evaluate the association of histone modifications with a more aggressive G-CIMP subtype

A exposição ao estresse induz um aumento dos níveis de óxido nítrico (NO) e glutamato em estruturas do cérebro de ratos, as quais estão relacionadas com o transtorno de depressão maior (DM) em humanos. Ademais, o estresse está diretamente relacionado com o aumento da metilação do DNA, uma alteração epigenética repressiva, no hipocampo de animais. Estudos anteriores demonstraram o efeito tipo antidepressivo dos inibidores da enzima óxido nítrico sintase (NOS) em animais submetidos ao estresse. Porém não se sabe se há uma relação entre o aumento do NO e glutamato induzido pelo estresse e alteração na metilação do DNA em genes relacionado com a patofisiologia da DM. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar os efeitos dos inibidores da NOS nas alterações comportamentais e nos mecanismos intracelulares relacionado com a metilação do DNA no cérebro de ratos submetidos ao teste do desamparo aprendido (learned helplessness - LH) e em cultura celular do hipocampo desafiadas com NMDA e dexametasona. Métodos: Estudo 1: Cultura primária de células do hipocampo ou cultura imortalizada HiB5 foram desafiadas/estressadas com NMDA (30µM,1h), L-arginina (500µM,1h) e/ou dexametasona (1µM, 1h ou 24h) e pré-tratadas com inibidor seletivo da nNOS (NPA, 100nM, 30min antes do desafio) ou com inibidor da DNMT (5-Aza, 10 µM, 30 min antes do desafio). A expressão dos genes para as enzimas DNMTs, BDNF, NT4, TrkB e nNOS foram avaliadas por RT-qPCR, a expressão proteica das enzimas DNMT3b e nNOS foram avaliadas por western blotting. Estudo 2: Ratos foram submetidos à choques inescapáveis (0,4 mA; 40 choques) na sessão de pré-teste do LH, após sete dias os animais foram submetidos a sessão de teste (choques escapáveis de 0,4 mA). Os animais foram tratados com inibidores da NOS 7-nitroindazole (7-NI;60mg/kg,i.p), aminoguanidina (AMG; 30mg/kg,i.p) ou veículo por 7 dias e submetidos a sessão de teste 1h, após a última injeção. A metilação global foi analisada por imunoensaio (ELISA) e a expressão dos genes DNMT3b, BDNF, nNOS e iNOS foram avaliadas por RT-qPCR, nas estruturas: cortex, hipocampo ventral e hipocampo dorsal. Resultados: Estudo 1: O pré- tratamento com NPA, atenuou o aumento da expressão do mRNA para a enzima DNMT3b, em cultura primária do hipocampo desafiada com NMDA, dexametasona e Larginina, e também em cultura HiB5 desafiada com dexametasona. Porém, o NPA não inibiu a diminuição da expressão do BDNF (exon 1, exon 4 e exon 9), em cultura primária de células do hipocampo desafiadas com NMDA. O pré tratamento com 5-Aza, não inibiu as alterações induzidas pelo NMDA em cultura primária de hipocampo. Estudo 2: Ratos submetidos ao estresse dos choques inescapáveis na sessão de pré-teste apresentaram aumento no número de falhas em escapar dos choques na sessão de teste (desamparo aprendido), um efeito que foi atenuado pelo tratamento com AMG ou 7-NI. Interessantemente, o efeito comportamental do estresse foi acompanhado por aumento nos níveis da metilação global do DNA e DNMT3b no hipocampo ventral (vHPC), que foi atenuado pelos pré-tratamentos com AMG e 7-NI, porém não houve diferença estatisticamente significante no córtex e no hipocampo dorsal dos ratos. Conclusão: Os dados apresentados demonstraram que tanto o estresse (in vivo) quanto o desafio com glicocorticóides, NMDA e L-arginina (in vitro) são capazes de modular a expressão daenzima DNMT3b e a metilação de DNA no hipocampo. O tratamento com inibidores da NOS reduzem os efeitos do estresse in vivo (comportamental e molecular) e in vitro. Em conjunto, os dados sugerem que a liberação de glutamato e NO durante o estresse pode modular a expressão da enzima DNMT3b, levando ao aumento da metilação do DNA em genes relacionados com a resposta de adaptação ao estresse. Essa é a primeira evidência de que o NO pode modular metilação do DNA induzida por estresse. / Stress exposure increases glutamate and nitric oxide (NO) levels, as well as DNA methylation in the hippocampus. However, it is not yet known if there is a causal relationship between these events. Moreover, both nitric oxide synthase (NOS) inhibitors and DNA methylation inhibitors counteract the behavioral effects of stress. Therefore, our aim was to investigate the effects of NOS inhibitors on stress-induced changes on behaviour, DNA methylation and genes expression in the hippocampus of rats submitted to learned helplessness - LH. Moreover, the effects of direct administration of dexamethasone (glucocorticoid), NMDA and L-arginine was investigated in hippocampal cell cultures. Methods: Study 1: Primary hippocampal cell culture was challenged with NMDA (30µM,1h), L-arginine (500µM,1h) or dexamethasone (1µM,24h) and pretreated with nNOS inhibitor (NPA, 100nM, 30min before the challenge) or with DNMT inhibitor (5-Aza, 10 µM, 30 min before the challenge). DNMTs, BDNF, NT4, TrkB and nNOS gene expression was assessed by RT-qPCR. DNMT3b and nNOS levels were assessed by western blotting. Study 2: Rats were submitted to inescapable footshocks and treated with the NOS inhibitors 7-nitroindazole (7-NI; 60 mg/kg, i.p) or aminoguanidine (AMG; 30 mg/kg, i.p], or vehicle for 7 days and tested 1h after the last injection with escapable footshocks. The number of escape failures during the test, global DNA methylation (ELISA) and DNMT3b, BDNF, nNOS and iNOS mRNA expression (RT-qPCR) was evaluated. Results: NPA pretreatment attenuated DNMT3b mRNA expression in hippocampus primary cell culture challenged with NMDA, dexamethasone or L-arginine. Similarly effects were observed in HiB5 cell challenged with dexamethasone. However, NPA pretreatment did not inhibit the decrease of BDNF (exon 1, exon 4 and exon 9) induced by NMDA. Moreover, pretreatment with 5-Aza did not inhibit the decreased of BDNF induced by NMDA in primary cell culture. Study 2: Stress exposure increased the number of escape failures in the test, which was attenuated by treatment with AMG or 7-NI, an antidepressant-like effect. Interestingly, the increased DNA methylation DNMT3b mRNA expression in the ventral hippocampus (vHPC) of stressed rats were also attenuated by treatment with both AMG and 7-NI. Conclusions: NOS inhibitors attenuated stress-induced depressive-like behavior, DNA methylation and DNMT3b mRNA expression in the vHPC. In vitro, selective nNOS inhibition also blocks corticosterone-, NMDA- and L-arginine-induced DNMT3b mRNA expression in hippocampal cell culture. Altogether, our results suggest that glutamate release, leading to NO production during stress may mediate intracellular mechanisms that regulate DNMT3b expression and DNA methylation. This is the first evidence indicating that NO modulates DNA methylation induced by stress.

O chumbo (Pb) é um metal tóxico que se acumula no organismo e provoca diversos efeitos, afetando vários sistemas, tais como renal, gastrointestinal, reprodutor, endócrino, hepático e hematopoiético. No que se refere a estudos epigenéticos, quando comparados a outros metais, o Pb é, até o momento, o menos estudado e, portanto, muito pouco se sabe a respeito dos efeitos epigenéticos sobre a absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME) do Pb e, consequentemente, sobre a toxicidade induzida pela exposição ao Pb. Assim, o objetivo do presente estudo consiste em avaliar o padrão de metilação de regiões promotoras dos genes GCLC e MT2A, quantificar a porcentagem de metilação global além das dosagens de parâmetros hepáticos e renais e associá-los à exposição ao Pb. De acordo com os guidelines STROBE e STREGA, 100 trabalhadores do sexo masculino com idades entre 18 e 67 anos participaram do trabalho. Cerca de 6,0 mL de sangue e 5,0 mL de soro foram coletados após a assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE). As concentrações de Pb no sangue (Pb-s) e no plasma (Pb-p) foram determinadas por espectrometria de massas com plasma indutivamente acoplado (ICP-MS); o DNA genômico foi extraído do sangue total e quantificado por kits específicos. As amostras de DNA foram tratadas com bissulfito de sódio e a quantificação da porcentagem de metilação global do DNA dos indivíduos expostos ao metal foi determinada pelo método de Elisa indireto e o sequenciamento das amostras para avaliar o padrão de metilação de regiões promotoras dos genes GCLC (Subunidade Catalítica de Glutamato-Cisteína Ligase) e MT2A (Metalotioneína 2A), pela técnica de pirosequenciamento. Também foram determinadas as atividades das enzimas transaminase glutâmica oxalacética (TGO) e pirúvica (TGP), bem como da gama-glutamil transferase (GGT) no plasma por espectrofotometria UV/Visível. Cerca de 32% dos voluntários consomem bebidas alcoólicas regularmente e 12% são fumantes. A concentração de Pb-s em média foi de 19 ± 10 ?g/dL (variando de 1,8 a 48 ?g/dL) e Pb-p 0,56 ± 0,64 ?g/dL atingindo valores de até 4,0 ?g/dL. A maioria dos indivíduos, apresentou concentrações de ureia, creatinina, TGO, TGP e GGT dentro dos valores de referência. Em relação aos marcadores epigenéticos, foi observada uma associação inversa entre concentrações de Pb-s e Pb-p, ou seja, indivíduos que apresentavam altas concentrações do metal, tinham menor % de metilação global do DNA. Em relação ao estudo das regiões promotoras dos genes MT2A e GCLC, os resultados sugerem que o Pb não altera a metilação nas ilhas CpGs localizadas nas regiões promotoras dos genes MT2A e GCLC, entretanto, foi capaz de induzir alterações no padrão de metilação global do DNA, fornecendo resultados acerca das possíveis interações entre o genoma e o metal. / Lead (Pb) is a toxic metal that accumulates in the body and induces several effects, affecting several systems, such as renal, gastrointestinal, reproductive, endocrine, hepatic and hematopoietic. Regarding epigenetic studies, when compared to other metals, Pb is the least studied and, therefore, very little is known about the epigenetic effects on absorption, distribution, metabolism and excretion (ADME) of Pb and, consequently, on the toxicity induced by the metal. Therefore, the aim of the present study was to evaluate the methylation pattern of GCLC and MT2A gene promoter regions, to quantify the percentage of global methylation in addition to hepatic and renal measurement levels and to associate them with Pb exposure. According to the STROBE and STREGA guidelines, 100 male workers between 18 and 67 years old participated in the study. About 6.0 mL of blood and 5.0 mL of serum were collected after signing the free and informed consent term (TCLE). Pb concentrations in blood (b-Pb) and plasma (p-Pb) were determined by inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS); the genomic DNA was extracted from whole blood and quantified by specific kits. The DNA samples were treated with sodium bisulfite and the quantification of the DNA global methylation percentage of workers exposed to the metal was determined by the indirect Elisa method and the sequencing of the samples to evaluate the methylation pattern of GCLC (Catalytic Subunit of Glutamate-Cysteine Ligase) and MT2A (Metallothionein 2A) by the technique of pyrosequencing. The activities of glutamic oxalacetic transaminase (TGO) and pyruvic (TGP) enzymes as well as gamma-glutamyl transferase (GGT) in plasma were also determined by UV / Visible spectrophotometry. About 32% of volunteers regularly drink alcohol and 12% are smokers. The mean b-Pb concentration was 19 ± 10 ?g / dL (ranging from 1.8 to 48 ?g / dL) and p-Pb 0.56 ± 0.64 ?g / dL reaching values up to 4.0 ?g / dL. Most of the individuals had concentrations of urea, creatinine, TGO, TGP and GGT within the reference values. In relation to the epigenetic markers, an inverse association was observed between b-Pb and p-Pb concentrations, individuals with high concentrations of the metal, had lower % of global DNA methylation. Regarding the study of the promoter regions of the MT2A and GCLC genes, the results suggest that Pb does not alter the methylation in the CpG islands located in the promoter regions of the MT2A and GCLC genes, however, it was able to induce changes in the DNA global methylation pattern, providing results on possible interactions between the genome and the metal.

A leucemia linfóide aguda (LLA) é a neoplasia hematológica mais comum na infância e representa uma doença heterogênea em relação à biologia e ao prognóstico e seu tratamento consiste principalmente em quimioterapia. Apesar dos avanços no tratamento, cerca de 20% dos pacientes apresentam recaída da doença e/ou óbito indicando a necessidade de terapias diferenciadas para esse grupo. Recentemente, drogas epigenéticas como inibidores de DNA metiltransferases (iDNMTs) tem mostrado efeitos anti-neoplásicos promissores para o tratamento de diversos tipos de neoplasias incluindo a LLA. Nos tumores, a hipermetilação gênica é encontrada em vários genes, incluindo genes de reparo do DNA, reguladores do ciclo celular e apoptose. Sendo assim, drogas desmetilantes estão sendo apontadas como promissores agentes para o tratamento do câncer. A Zebularina (ZB) é um iDNMT análogo de citidina que inibe a metilação do DNA. Esta droga tem mostrado resultados animadores para o tratamento de diversas neoplasias, incluindo glioblastoma, leucemia mielóide aguda, câncer de mama, próstata e outros. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos do tratamento com a ZB, associada ou não à quimioterápicos, em linhagens celulares pediátricas de LLA, por meio de ensaios funcionais como proliferação celular, capacidade clonogênica, apoptose e ciclo celular. Além disso, foi analisada a capacidade desmetilante da droga e a expressão dos genes DNMT1, DNMT3a e DNMT3b após o tratamento com a ZB. A ZB inibiu a proliferação celular de maneira dose e tempo-dependente e agiu sinergicamente quando combinada com o MTX em ambas as linhagens. Ela também diminuiu a capacidade clonogênica e aumentou a taxa de apoptose nas duas linhagens estudadas. Além disso, o tratamento com ZB causou uma parada na fase S do ciclo celular na linhagem ReH. A ZB foi capaz de desmetilar parcialmente o gene AhR e reduzir a expressão dos genes DNMT1, DNMT3a e DNMT3b. Todos os dados encontrados no presente trabalho sugerem que as drogas desmetilantes podem ser interessantes agentes para o tratamento da LLA pediátrica. / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common hematologic malignancy in childhood and represents a heterogeneous disease regarding its biology and prognosis. Its treatment consists mainly of chemotherapy. Despite advances in treatment, about 20% of patients experience disease recurrence and/or death indicating the need for differentiated therapies for this group. Recently, epigenetic drugs such as DNA methyltransferases inhibitors (iDNMTs) has shown antineoplastic and promising results for several types of tumors including ALL. Gene hypermethylation is found in several genes in tumors cells, including genes responsible for DNA repair, cell cycle and apoptosis regulators. Therefore, demethylating agents may be promising agents for cancer treatment. Zebularine (ZB) an iDNMT is a cytidine analogue that inhibits DNA methylation. This drug has shown promising results for the treatment of many cancers, including glioblastoma, acute myeloid leukemia, breast and prostate cancer and others. The aim of this study was to evaluate the effects of ZB treatment, associated or not with chemotherapeutic agents, in childhood ALL cell lines through functional tests such as cell proliferation, clonogenic capacity, apoptosis and cell cycle. In addition, we examined the demethylating ability of ZB and the expression of DNMT1, DNMT3a and DNMT3b genes after treatment with this agent. ZB inhibited cell proliferation in a dose- and time-dependent manner and showed synergistic effects when combined with MTX in both cell lines. ZB treatment also reduced clonogenic capacity and increased the number of apoptotic cells in both cell lines studied. Furthermore, treatment with ZB caused an S phase cell cycle arrest in ReH cell line. ZB was able to partially demethylate AhR gene and reduce the expression of genes DNMT1, DNMT3a and DNMT3b. These results suggest that demethylating drugs may be interesting agents for the treatment of childhood ALL.

A Dnmt3b é a principal DNA metiltransferase no processo de remetilação de regiões de DNA repetitivo do genoma durante a onda de reprogramação epigenética que ocorre no desenvolvimento embrionário. Sua expressão é regulada por uma série de mecanismos, entre os quais encontram-se os microRNAs (miRNAs). O objetivo deste trabalho foi investigar o papel dos mRNAs hsa-miR-203, hsa-miR-26a e hsa-miR-26b na regulação da expressão de DNMT3B durante a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas e suas consequências para a metilação do DNA destas células. Para isto, geramos curvas de expressão dos miRNAs investigados, bem como da DNMT3B, a fim de verificar a existência de correlação entre elas. Também analisamos o efeito da superexpressão de miRNAs miméticos sobre a expressão de DMMT3B e o efeito da inibição da interação entre os miRNAs e a região 3\'UTR de DNMT3B sobre a expressão da DNA metiltransferase e sobre os níveis de metilação do DNA das células. Constatamos que a expressão de DNMT3B está inversamente correlacionada com a expressão dos miRNAs hsa-miR-203, hsa-miR-26a e hsa-miR-26b, mas não do hsa-miR-29b, regulador já validado para o controle da expressão de DNMT3B em células tumorais. Verificamos também que o impedimento da ligação do hsa-miR-203 ao segundo sítio predito para a ligação deste miRNA ao mRNA de DNMT3B ocasionou um aumento significativo na expressão da DNA metiltransferase, embora tal aumento não tenha refletido alteração nos níveis de metilação do DNA das células. Desta forma, concluímos que os miRNAs investigados fazem parte da maquinaria de regulação da DNA metiltransferase 3B na diferenciação de células-tronco embrionárias, embora o exato papel funcional de cada um deles no controle da expressão de DNMT3B e na metilação do DNA destas células ainda necessite ser melhor esclarecido / Dnmt3b is the major DNA methyltransferase in the proccess of repetitive DNA remethylation during the epigenetic reprogramming wave that occurs in the embryonic development. Its expression is regulated through several mechanisms, including microRNA (miRNAs). The aim of this study was to investigate the role of the miRNAs hsa-miR-203, hsa-miR-26a, and hsa-miR-26b in the regulation of DNMT3B expression during the differentiation of human embryonic stem-cells, and its consequences to the DNA methylation of these cells. To accomplish this, we generated expression curves for the investigated miRNAs, as well as for DNMT3B, to verify the existence of correlation between them. We also analysed the effect of superexpressing mimetic miRNAs on DNMT3B expression, and the effect of inhibiting the interaction of these miRNAs with DNMT3B 3\'UTR region on the DNA methyltransferase expression and the levels of DNA methyation. We found that DNMT3B expression is inversely correlated to hsa-miR-203, hsa-miR-26a, and hsa-miR-26b expression, but not to hsa-miR-29b, a previously validated DNMT3B regulator in tumor cells. We also verified that blocking the interaction of hsa-miR-203 to its predicted second interaction site at the DNMT3B mRNA significantly increased DNMT3B expression, but did not interfere with the levels of DNA methylation in these cells. Thus, we conclude that the investigated miRNAs are part of the DNMT3B regulatory machinery during the differentiation of embryonic stem-cells, although the exact functional role of each of them in the control of DNMT3B expression and in the DNA methylation of these cells still remains to be further explored

Les maladies chroniques, comme les maladies cardiovasculaires (MCV), la maladie d'Alzheimer (AD), la dépression et l'ostéoporose, sont les principales causes de mortalité dans le monde. L'identification de facteurs de risque communs à ces maladies pourrait contribuer à un vieillissement «sain» mieux surveillé en utilisant des stratégies personnalisées de prédiction des risques, de prévention précoce et de traitement adéquat, en tenant compte des comorbidités très souvent existantes. Dans cette thèse, 8 publications ont été développées. Dans un premier temps, j'ai résumé, dans un article de revue, les défis actuels et les opportunités de la pharmacogénomique des médicaments contre les maladies cardiovasculaires. J'ai participé à la formation d'un consortium international, le Consortium VEGF et j'ai participé à une étude qui a identifié des interactions épistasiques entre les polymorphismes qui régulent les niveaux de VEGF et la pression artérielle et les indices d'adiposité. J'ai également démontré qu’un marqueur génétique de VEGF, le rs4416670, était significativement associé à un risque accru de dépression. En outre, j'ai signalé deux interactions significatives entre les variantes liées au VEGF affectant la densité minérale osseuse du col fémoral chez les femmes ménopausées. J'ai également étudié deux marqueurs liés au métabolisme des lipides : l'apolipoprotéine E (APOE) et le «lipolysis-stimulated receptor» (LSR). J'ai trouvé que le variant LSR rs916147 peut interagir avec APOE d'une manière qui inverse l'effet protecteur de l'allèle ε2 de l'APOE sur les lipides sanguins, fournissant ainsi de nouvelles connaissances sur les mécanismes de l'hyperlipoprotéinémie de type III. Les interactions épistasiques entre ces deux gènes augmentent également le risque d’AD même en l'absence de l'allèle à risque, APOE ε4. Finalement, j'ai réalisé des études épigénetiques (EWAS) sur l'obésité centrale et les traits lipidiques chez des individus sains. Les résultats suggèrent qu'un CpG pourrait affecter le tour de taille à travers une voie de signalisation de l'insuline. En outre, deux CpGs ont été associées aux niveaux des triglycérides par des gènes liés aux maladies cardiaques génétiques (PRKAG2) et à l'inhibition de la signalisation Wnt / bêta-caténine impliquée dans le développement des MCV et d’AD (KREMEN2). En conclusion, dans cette thèse j’ai utilisé l'étude de l'épistasie et de l'épigénétique pour identifier des interrelations complexes entre VEGF, LSR, APOE et différentes maladies chroniques (MCV, AD, ostéoporose, dépression) proposant ainsi de nouveaux mécanismes et des dénominateurs communs de ces maladies qui devraient être utilisés comme biomarqueurs de médecine personnalisée / Chronic diseases, like cardiovascular diseases (CVD), Alzheimer’s disease (AD), depression and osteoporosis, are major causes of mortality in the world. Identification of common to those diseases risk factors could help for a better-monitored ‘healthy’ aging, by promotion of personalised strategies for risk prediction, early prevention and adequate treatment, all taking into account the very often existing comorbidities. In this thesis, 8 publications have been developed. Initially, in a review paper, I have summarised the current challenges and opportunities of pharmacogenomics of CVD medications. I have participated in the formation of an international consortium, the VEGF Consortium, and I have participated in a study that identified significant epistatic interactions between polymorphisms that regulate the levels of VEGF and their effects on blood pressure and adiposity indexes. I have also demonstrated that one genetic marker of VEGF, rs4416670, was significantly associated with an increased risk for depression. Furthermore, I have reported two significant interactions between VEGF-related variants affecting the femoral neck bone mineral density in post-menopausal women. I have focused also on two markers linked with lipids metabolism: the apolipoprotein E (APOE) and the lipolysis-stimulated receptor (LSR). I have found that the LSR variant rs916147 can interact with APOE in a way that reverses the protective effect of the ε2 allele of APOE on blood lipids, thus providing new insights in the mechanisms underlying type III hyperlipoproteinemia. Epistatic interactions between these two genes have also been shown to increase the risk of AD, even in the absence of the known risk allele APOE ε4. Finally, I have performed epigenome-wide association studies (EWAS) on central obesity and blood lipid traits in healthy individuals. The results suggest that one methylation probe could affect waist circumference through an insulin-signaling pathway. Furthermore, two methylations probes were associated with triglycerides levels through genes linked with genetic heart diseases (PRKAG2) and with inhibition of the Wnt/beta-catenin signaling that is involved in CVD and AD development (KREMEN2). In conclusion, this thesis used the study of epistasis and epigenetics and identified complex inter-relationships between VEGF, LSR, APOE and different chronic diseases (CVD, AD, osteoporosis, depression) and novel mechanisms that link disease development with DNA methylation, thus demonstrating their role as common denominators of diseases that can be used as valuable markers in personalised medicine

Le gène H19, soumis à l’empreinte parentale, est fortement exprimé durant le développement embryonnaire, cependant, son expression est réprimée après la naissance dans l’ensemble des tissus à l’exception du muscle squelettique, et plus particulièrement des cellules souches musculaires : les cellules satellites. L’objectif de ma thèse a été de déterminer le rôle du gène H19 dans la mise en place et dans la fonction de ces cellules souches durant la myogénèse adulte. En utilisant un modèle murin présentant une délétion du gène H19, les souris H19∆3, notre laboratoire avait montré que le gène H19 est capable de moduler, dans le muscle embryonnaire, l’expression de neuf gènes appartenant à un réseau de gènes soumis à l’empreinte parentale (IGN) impliqué dans la croissance. Au cours de ma thèse, j’ai étudié le phénotype des muscles de ces souris mutantes qui présentent une hyperplasie et une hypertrophie des fibres musculaires. Ce phénotype est accompagné d’une diminution du nombre de cellules satellites qui apparait lors de l’entrée en quiescence de ces cellules. De façon étonnante, nous avons observé une meilleure capacité de régénération, malgré le nombre réduit de cellules satellites, dans les muscles H19∆3 comparée à celle des muscles wt. Cela indique que la capacité d’auto-renouvellement des cellules satellites n’est pas influencée par l’absence du gène H19. De même, nous avons observé une surexpression de plusieurs gènes appartenant à l’IGN lors de la régénération musculaire des muscles mutants comparés aux muscles wt. Ces résultats indiquent que le gène H19 module l’expression des gènes de l’IGN durant l’embryogénèse et par la suite, durant les étapes de régénération de la myogénèse adulte. / The imprinted H19 gene is highly expressed during embryonic development. H19 is fully repressed after birth in all tissues, with the exception of skeletal muscle, and especially of the muscle stem cells: the satellite cells. The aim of my thesis was to define the function of the H19 gene in the satellite cells establishment and function during adult myogenesis. Using loss-of-function H19∆3 mice, the laboratory had shown that the H19 gene was able to modulate the expression of several genes belonging to an imprinted gene network (IGN) in the embryonic muscle. During my thesis, I studied the muscle phenotype of these adult mice, which present both fiber hyperplasia and hypertrophy. This phenotype is accompanied by an important reduction of the satellite cell number, probably due to a delay in their entry into quiescence. Unexpectedly, despite the reduction in the number of satellite cells in mutant mice, the self-renewal capacity of the satellite cells is fully retained. In addition, we observe a better regeneration potential of the mutant muscles compared with wt muscles. This is accompanied by the enhanced expression of several genes from the IGN. These results indicate that H19 gene can modulate IGN gene expression both during embryogenesis and after birth, in adult myogenesis.

A esquistossomose é um grave problema de saúde pública, com alta mortalidade e morbidade em países endêmicos, causada pelo verme trematódeo do gênero Schistosoma. O praziquantel é a única droga disponível para tratamento da doença, é usada em larga escala para tratamento de populações de áreas endêmicas, porém não previne a reinfecção e tem efeito somente em vermes adultos. Drogas estudadas em câncer como inibidores de histona deacetilases (iHDACs) modificam o padrão epigenético da célula desencadeando a morte celular, e em Schistosoma mansoni já foi mostrado que a inibição de HDACs além de aumentar a acetilação de histonas alterou o fenótipo de miracídios e provocou morte em esquistossômulos e vermes adultos. O presente estudo investigou o efeito do iHDAC Trichostatin A (TSA) na regulação da transcrição gênica em esquistossômulos, detectando por meio de ensaios de microarray centenas de genes diferencialmente expressos, relacionados a replicação de DNA, metabolismo e complexos modificadores de histonas. A inibição de HDAC em vermes adultos levou a um aumento da acetilação nas marcas de histonas H3K9ac, H3K14ac e H4K5ac relacionadas à indução de transcrição. Com imunoprecipitação de cromatina seguida de PCR (ChIP-qPCR) detectou-se o aumento de deposição de H3K9ac e H3K14ac na região promotora de genes com expressão aumentada ou diminuída, porém a marca de repressão H3K27me3 não sofreu alteração na região promotora de nenhum gene analisado. Análises adicionais indicaram um conjunto de genes diferencialmente expressos que codificam proteínas histone readers, que fazem parte de complexos modificadores de histonas, como EED capaz de identificar a marca de repressão H3K27me3 e regular a atividade de EZH2, apontando um novo alvo terapêutico. O efeito sinérgico entre iHDAC e um iEZH2 foi testado e detectou-se o aumento da mortalidade de esquistossômulos. A estrutura de SmEZH2 foi modelada por homologia e usada para análises computacionais que sugeriram uma alta afinidade de ligação de SmEZH2 com o iEZH2, abrindo uma perspectiva de desenvolvimento de novas drogas específicas para tratamento da esquistossomose. / Schistosomiasis is a serious public health problem, with high mortality and morbidity in endemic countries, caused by trematode worms of the genus Schistosoma. Praziquantel is the only available drug for treatment of the disease; it is used extensively to treat populations in endemic areas, but does not prevent reinfection and is effective only in adult worms. Drugs studied in cancer as histone deacetylase inhibitors (iHDACs) modify the epigenetic status of the cell, triggering cell death, and it has been shown in Schistosoma mansoni that inhibition of HDACs increase histone acetylation, alter the phenotype of miracidia and cause death in schistosomules and adult worms. The present study investigated the effect of iHDAC Trichostatin A (TSA) on the regulation of gene transcription in schistosomules, detecting by means of microarray assays hundreds of differentially expressed genes related to DNA replication, metabolism and histone remodeling complexes. Inhibition of HDAC in adult worms led to an increase in histone acetylation marks H3K9ac, and H3K14ac H4K5ac related to transcriptional induction. With chromatin immunoprecipitation followed PCR (ChIP-qPCR) we detected an increased deposition of H3K9ac and H3K14ac at the promoter region of genes with increased or decreased expression, but the repressive mark H3K27me3 was not changed at all analyzed gene promoter regions. Additional analysis indicated a set of differentially expressed genes that encode histone reader proteins that are part of histone modifier complexes such as EED, which is able to identify the repression mark H3K27me3 and to regulate EZH2 activity, pointing to a new therapeutic target. The synergistic effect between iHDAC and one iEZH2 has been tested and found to cause an increase in schistosomules mortality. The SmEZH2 structure was modeled by homology and used for computational analyses, which suggested a high affinity binding of SmEZH2 with iEZH2, opening the opportunity for development of new specific drugs for treatment of schistosomiasis.