O epitélio nasal é a primeira porção do sistema respiratório a entrar em contato com o ambiente externo. Partículas da poluição do ar, principalmente os compostos orgânicos absorvidos, podem atuar como liberadores endócrinos. O receptor aril hidrocarboneto (AhR) é um importante competidor dos receptores de estrógeno-beta (ERbeta) que regulam a transcrição do gene para enzimas de metabolização xenobióticas (enzimas do citocromo P450). O objetivo deste estudo é identificar e quantificar ERbeta, AhR, CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1 e o perfil de muco no epitélio nasal de camundongos machos e fêmeas em diferentes fases do ciclo estral. Camundongos BALB/c machos (n=32) e fêmeas (n=84) foram expostos ao ar ambiente e ao MP2,5 concentrado a 600 ug.m-³ em um concentrador de partículas ambientais (CPAs). As fêmeas foram divididas de acordo com as fases do ciclo estral: proestro, estro e diestro. O epitélio nasal foi avaliado por RT-PCR e imuno-histoquímica para análise de expressão de ERbeta (proteína), Erbeta-1 e Erbeta-2 (gene), AhR (proteína e gene) e Cyp1a1, Cyp1a2 and Cyp1b1 (gene). A quantificação de muco neutro - Periodic Acid Schiff\'s (PAS+) e ácido - Alcian Blue (AB+) foi avaliada por morfometria. As exposições foram realizadas durante 5 dias/semana, por 45 ± 55 dias. A expressão de Erbeta-2 RNAm apresentou diferenças em resposta à exposição ao CPAs (p=0,016), bem como uma diminuição em fêmeas, quando comparadas aos camundongos machos (p=0,036). A expressão de Cyp1b1 RNAm foi significantemente menor no grupo exposto ao CPAs, em relação ao grupo exposto ao ar ambiente nas fêmeas em diestro (p=0,036). A expressão de Erbeta foi aumentada no epitélio nasal de fêmeas em estro expostas ao CPAs (p=0,005) e a expressão de AhR foi menor em fêmeas em proestro expostas ao CPAs (p=0,048). A exposição ao CPAs levou ao aumento do conteúdo de muco ácido em camundongos machos (p=0,048), o qual diminuiu em fêmeas (p=0,040), quando comparados ao grupo ar ambiente. Este estudo mostrou que houve diferentes respostas à exposição à poluição do ar no epitélio nasal entre machos e fêmeas, e que essas diferenças podem estar relacionadas com a predisposição de fêmeas apresentarem maior suscetibilidade a doenças respiratórias das vias aéreas / The nasal epithelium is the first portion of the respiratory system to reach contact with the external environment. Air pollution particles, mainly the organic compounds absorbed into them, may act as endocrine releasers. The aryl hydrocarbon (AhR) receptor is an important competitor of estrogenic receptors-beta (ERbeta) that regulate transcription of gene coding for xenobiotic-metabolizing enzymes (cytochrome P450 enzymes). The aim of this study is to identify and quantify in the nasal epithelium of male and female mice in different estrous cycle phases related with ERbeta, AhR, CYP1A1, 1A2, 1B1 and the mucus profile. Male (n=32) and female (n=84) BALB/c mice were exposed to ambient air and PM2.5 concentrated at 600 ug.m-³ in an ambient particle concentrator with a particulate matter diameter of 2.5 um (PM2.5). Females were subdivided in three estrous cycles: proestrus, estrus and diestrus. Nasal epithelium was evaluated through RT-PCR and immunohistochemistry for the expression of ERbeta (protein), Erbeta-1 and Erbeta-2 (gene expression), AhR (protein and gene expression) and Cyp1a1, Cyp1a2 and Cyp1b1 (gene expression). Morphometry was applied for evaluation of mucus profile: acid - Alcian Blue (AB+) and neutral - Periodic Acid Schiff\'s (PAS+). Exposure happened for 5 days/week, for 45 ± 55 days. There were differences in Erbeta-2 mRNA in response to exposition to CPAs (p=0.016), and a significant decrease in female compared male mice (p=0.036). Cyp1b1 mRNA was significantly smaller in the CPAs-exposed group compared with the ambient air group in diestrus female mice (p=0.036). The ERbeta expression increased in the nasal epithelium of CPAs-exposed females in the estrus cycle (p=0.005), and the AhR expression decreased in the proestrus cycle of CPAs-exposed females (p=0.048). The exposure to the CPAs led to an increase in the acidic content of mucus in male mice (p=0.048), and decreased in female mice (p=0.040), compared to the ambient air group. This study showed there were different responses in the nasal epithelia of male and female mice exposed to air pollution, which could be related to the predisposition of the females to present more susceptibility to airway respiratory diseases

Abstract Wnt4, a member of the Wnt family of secreted factors, is essential for kidney organogenesis since the kidney fails to develop in its absence. Besides the kidney, Wnt4 signaling is involved in the control of development of several other organs such as the gonads, adrenal glands and pituitary gland. In the context of the embryonic kidney, Wnt4 signaling induces mesenchymal to epithelial transition of the progenitor cells in the metanephric mesenchyme, an early step in nephrogenesis. Wnt4 signaling may also be relevant in the development of a childhood kidney tumor, the Wilms’ tumor, that involves the function of Wilms’ tumor suppressor protein 1 (WT1). Wilms’ tumor is thought to arise from the early metanephric mesenchymal cells of the embryonic kidney, but the detailed mechanisms are not known. The main aim of this project was to study the mechanisms that regulate expression of the Wnt4 gene by using immortalized embryonic kidney mesenchyme-derived mK4 cells as a model. The Wnt4 gene expression was also analyzed in vivo in the frog embryonic pronephros. Through the use of reporter assays and a two-hybrid screen, Sox11, a member of the SoxC family of transcription factors, was identified as a synergistic protein that interacts with WT1. Immunoprecipitation studies provided further evidence that Sox11 and WT1 may physically interact with each other in the developing embryonic kidney. Indeed, Sox11 and WT1 may regulate the Wnt4 gene expression in vivo since the morpholino-based knock-down of either WT1 or Sox11 led to notable downregulation of the Wnt4 gene expression in the frog embryonic pronephros. The other general aim of this thesis was to develop novel tissue targeting and therapy tools to the cell lineages regulated by the Wnt4 signals, including the podocytes. For this purpose, we utilized mice carrying a floxed expression cassette for the avidin-LDL receptor fusion protein, Lodavin, in the constitutively active Rosa-26 locus. Three Cre driver mice, including the Wnt4-Cre knock-in line, were used to activate Lodavin expression in the respective cells of the embryonic kidney. Moreover, we generated a podocyte injury model by expressing the human receptor for diphtheria toxin specifically in the podocytes. This was achieved by crossing mice containing a floxed expression cassette for this receptor in the Rosa-26 locus with those expressing the Cre recombinase under the nephrin promoter. Administration of diphtheria toxin led initially to podocyte damage only, followed by a progression to glomerular sclerosis. As a summary, Sox11 and WT1 serve as synergistic transcription factors that may regulate expression of the Wnt4 gene in vivo. The transgenic mouse models generated and used provide the basis to generate acute and chronic kidney disease models and the potential to purify the respective cells for developing cell-based therapy avenues for the kidney. Moreover, the Lodavin-based approaches may enable targeted delivery of biotinylated small compounds, proteins, viruses or even cells and novel means for in vivo imaging and functional studies. / Tiivistelmä Wnt-4 kuuluu signaloivien proteiinien Wnt-perheeseen ja sen toiminta on välttämätöntä munuaisen kehityksessä. Ilman Wnt-4 proteiinia munuainen ei kehity. Munuaisen lisäksi Wnt4-signalointi on mukana useiden muiden elinten, kuten sukurauhasten, lisämunuaisen ja aivolisäkkeen säätelyssä. Alkion munuaisessa Wnt4-signalointi saa aikaan mesenkymaalisen kantasolukon epitelisoitumisen, edustaen näin ollen nefronin kehityksen varhaisia vaiheita. Wnt4-signaloinnilla on myös merkittävä asema lapsuusiän munuaiskasvaimen, niin kutsutun Wilmsin kasvaimen kehittymisessä. Tämän tyyppisessä kasvaimessa keskeisenä on Wilmsin tuumoriproteiinin WT1:n toiminta, mutta myös Wnt4:n toiminnalla voi olla merkitystä. Wilmsin kasvaimen arvellaan saavan alkunsa varhaisista sikiöaikaisista jälkimunuaisen soluista, mutta yksityiskohtaisia mekanismeja ei vielä tunneta. Tämän projektin tarkoituksena oli tutkia Wnt4-geenin ilmentymistä sääteleviä mekanismeja käyttäen mallina mK4-soluja eli alkion munuaisesta saatuja, immortalisoituja soluja. Wnt4-geenin ilmentymistä analysoitiin myös in vivo sammakon alkion alkumunuaisessa. Tuplahybridi-analysoinnin avulla tunnistettiin transkriptiotekijäperhe SoxC:n jäsen Sox11 samantoimiseksi proteiiniksi transkriptiotekijä WT1:n kanssa Wnt4-geenin ilmentymisen säätelyssä. Immunopresipitaatiotutkimukset tukivat ajatusta, että Sox11 ja WT1 voisivat olla fyysisessä vuorovaikutuksessa säädellessään nefroninmuodostuksen alullepanossa ratkaisevan Wnt4-geenin ilmentymistä. Sox11 ja WT1 voivat mahdollisesti säädellä Wnt4-geenin ilmentymistä myös in vivo, sillä morfoliineihin perustuvissa kokeissa sekä WT1:n että Sox11:n hiljennys laski Wnt4-geenin ilmentymistasoa sammakon alkumunuaisessa. Tämän väitöstutkimuksen toinen yleinen tavoite oli kehittää uusia kudoskohdennus- ja terapiakeinoja Wnt4-signaloinnin säätelemille solulinjoille, kuten podosyyteille. Tätä tarkoitusta varten kloonattiin siirtogeeninen hiiri, jossa floksattu avidiini-LDL -reseptorifuusioproteiini, Lodavin, kohdennettiin jatkuvasti aktiiviseen Rosa-26 -lokukseen. Kolmea eri Cre-hiirilinjaa käytettiin aktivoimaan Lodavinin ilmentyminen kussakin tietyssä alkion munuaisen solupopulaatiossa. Yksi näistä Cre-linjoista oli Wnt4-Cre. Jotta kyettäisiin vahingoittamaan samoja soluja, jotka ilmentävät Lodavinia, hyödynnettiin difteriamyrkyn ihmisen reseptoria (iDTR). IDTR:n ilmentäminen tietyissä hiiren soluissa tekee ne alttiiksi tappavalle difteriamyrkylle. IDTR-perusteisen munuaisvauriomallin kehittämiseksi käytettiin floksattua iDTR-hiirimallia, ja geenin ilmentyminen aktivoitiin Wnt4-indusoiduissa munuaissolulinjoissa, erityisesti podosyyteissä Nephrin Cre -välitteisesti. NephrinCre;R26RiDTR hiiriä altistettiin difteriamyrkylle ja niiden munuaiskerästen muutoksia seurattiin. Tutkimukset antavat viitteitä siitä, että R26R-floksatut iDTR-hiiret toimivat hyvänä mallina kehitettäessä sekä akuutteja että kroonisia munuaistautimalleja. Yhteenvetona voidaan todeta, että Sox-11 ja WT-1 ovat samantoimisia transkriptiotekijöitä, jotka voivat säädellä Wnt4-geenin ilmentymistä in vivo. Tutkimuksessa kehitetyt ja käytetyt siirtogeeniset hiirimallit tarjoavat perustan kehittää sekä akuutteja että kroonisia munuaistautimalleja. Samalla ne mahdollistavat kulloistenkin solujen eristämisen uusien soluperusteisten hoitomenetelmien kehittelemiseksi. Lisäksi Lodavin-perusteiset lähestymistavat voivat mahdollistaa biotinyloitujen pienten yhdisteiden, proteiinien, virusten tai jopa solujen kuljetuksen kohdennetusti sekä avata uusia mahdollisuuksia in vivo -kuvantamiselle ja toiminnallisille tutkimuksille.

Introduction : La dysfonction primaire du greffon (DPG) post-transplantation pulmonaire est la principale cause de décès en phase péri-opératoire. Sa physiopathologie n’est pas encore totalement élucidée mais les lésions d’Ischémie/Reperfusion (I/R) pourraient constituer un facteur important de son développement. L’I/R et la DPG sont caractérisées par des dommages de l’endothélium vasculaire et de l’épithélium alvéolaire, un œdème pulmonaire et une réaction inflammatoire exacerbée. La résorption de l’œdème dépend du rétablissement de l’intégrité fonctionnelle alvéolaire, dont la capacité à réabsorber les ions Na+ (via les canaux ENaC), et secondairement le liquide par les cellules alvéolaires. Nous avons émis l’hypothèse que la dysfonction épithéliale alvéolaire, causée par l’I/R, présente dans les greffons donneurs (GD), jouerait un rôle clef dans le développement de la DPG chez les receveurs. Notre but était d’identifier de biomarqueurs, associés à la dysfonction épithéliale des GD et au développement de DPG chez les receveurs. Méthodes : L’impact d’un protocole mimant une I/R a d’abord été évalué sur des cultures primaires de cellules alvéolaires de rats. Puis, nous avons étudié l’impact de l’I/R in vivo grâce à des modèles de stress inflammatoire par infusion de LPS ou transplantation unilatérale chez le porc. Finalement, des biopsies de tissus de GD ont été recueillies durant les transplantations pulmonaires. Après détermination du grade de DPG chez les receveurs, nous avons étudié les facteurs et les altérations alvéolaires associés. Résultats : Une baisse d’expression des protéines de jonctions serrées (ZO-1), des canaux ioniques ENaC et CFTR ainsi qu’une réduction de la résistance transépithéliale et de la capacité de réparation suite aux lésions ont été observées suite au protocole mimant l’I/R dans le modèle de cultures primaires de cellules alvéolaires. Un traitement avec un activateur du canal K+ KvLQT1 (R L3) a permis d’améliorer la vitesse de réparation, l’intégrité de la barrière épithéliale et l’expression d’ENaC et CFTR. Dans nos modèles animaux, nous avons observé une réponse pro-inflammatoire et une altération des protéines ZO-1, ENaC et CFTR. Nos données préliminaires indiquent aussi une infiltration inflammatoire et une baisse d’ENaC, CFTR et ZO-1, déjà présentes dans les GD ayant subits une I prolongée, chez les receveurs ayant ensuite développés une DPG. Conclusion : Nos résultats soutiennent notre hypothèse du développement d’une dysfonction épithéliale alvéolaire, caractérisée par une altération de biomarqueurs de fonctionnalité et d’intégrité (ENaC, CFTR et ZO-1), en lien avec l’I/R et la DPG. / Background: Primary graft dysfunction (PGD) after lung transplantation is the first cause of death in the perioperative phase. The PGD pathophysiology is not fully elucidated, but Ischemia/Reperfusion (I/R) injury might be an important factor. I/R and PGD both feature endothelial/ epithelial damage, lung edema and inflammation. Edema resorption then depends on the restoration of the alveolar functional integrity, especially the ability of alveolar epithelial cells to reabsorb Na+ (through ENaC channels) and fluid. We hypothesized that alveolar epithelial dysfunction (related to I/R), observed within donor grafts, then plays a key role in the development of PGD in lung recipients. Our goal was to identify novel biomarkers, associated with epithelial dysfunction within donor’s grafts, and then PGD development in recipients. Methods: The impact of a protocol mimicking hypothermic ischemia and reperfusion was first tested on primary rat alveolar epithelial cell cultures. Then, the impact of I/R was studied in vivo using models of inflammatory stress induced by LPS infusion or after unilateral transplantation in pigs. Finally, lung biopsies from donor grafts were collected during lung transplantations. After defining PGD scores within the recipients, associated factors and alveolar alterations were finally analyzed. Results: In primary cell cultures, the protocol mimicking hypothermic I/R induced a decrease in tight junction proteins (ZO-1), transepithelial resistance, wound repair capacity as well as ENaC and CFTR channel expression. Treatment with a KvLQT1 K+ channel activator (R-L3) accelerated the repair rates and enhanced barrier integrity (ZO-1 staining) as well as ENaC and CFTR protein expressions. In the porcine models, an exacerbated inflammatory response was observed along with alveolar damage, lung edema and decreased ZO-1, ENaC and CFTR expressions. Our preliminary data using human samples collected during lung transplantations also indicate an inflammatory response and reduced ENaC, CFTR and ZO-1 expressions, already observed within lung grafts, submitted to longer cold ischemia duration, among lung recipients then developing a PGD. Conclusion: Altogether these data support our hypothesis of an alveolar epithelial dysfunction, featuring an alteration of functionality and barrier integrity biomarkers (ENaC, CFTR and ZO-1), associated with I/R and DPG.

Einleitung: Kurzkettige Fettsäuren (SCFA) stellen das hauptsächliche Energiesubstrat für Wiederkäuer dar. In Anbetracht des - bedingt durch höhere Milch-, Mast und Reproduktionsleistung - steigenden Energiebedarfs von Hauswiederkäuern wie Milchkuh und Mastbulle ist es von zentraler Bedeutung, die Mechanismen zur Resorption dieser Energielieferanten bzw. Ansatzpunkte für die Beeinflussung dieser Transportprozesse genau zu kennen. Dieses Wissen kann möglicherweise dabei helfen, zukünftig die Energieaufnahme der Tiere zu unterstützen bzw. sogar effizienter zu gestalten. Ziele der Untersuchungen: Deshalb war es Ziel der vorliegenden Arbeit, die Mechanismen zur Resorption von SCFA zu charakterisieren, wobei der Schwerpunkt auf den Transport aus den Pansenepithelzellen ins Blut gelegt wurde, da hierzu im Gegensatz zu ihrer Aufnahme aus dem Pansenlumen in die Epithelzellen noch sehr wenig bekannt war. In einem zweiten Schritt sollte untersucht werden, inwiefern die nachgewiesenen Mechanismen einer Regulation unterliegen und über welche Signalwege diese vermittelt werden könnte. Materialien und Methoden: Zur Charakterisierung der beteiligten Resorptionsmechanismen wurden Epithelstücke aus dem ventralen Pansensack von Schafen in Ussing-Kammern eingespannt und mit Hilfe radioaktiv markierten Azetats, Butyrats und L-Laktats der Transport dieser Substrate unter verschiedenen Bedingungen sowie verschiedenen Hemmstoffeinflüssen untersucht. Zur Charakterisierung regulativer Einflüsse wurden die Epithelstücke über sechs bzw. 24 Stunden mit Butyrat inkubiert und anschließend RNA bzw. Totalprotein extrahiert. Hiermit konnten Veränderungen in mRNA- und Proteinexpression mittels quantitativer Echtzeit-PCR bzw. Western Blot nachgewiesen werden. Ergebnisse: Die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit konnten zeigen, dass der Transport von SCFA über die basolaterale Membran des Pansenepithels hauptsächlich proteinvermittelt erfolgt. Eine signifikante Beteiligung lipophiler Diffusion, d.h. ein passiver Transport, kann weitgehend ausgeschlossen werden. Der aktive Transport wies eine bikarbonatabhängige und eine bikarbonatunabhängige Komponente auf. Der Einsatz von Hemmstoffen verschiedener Transportproteine ergab deutliche Hinweise darauf, dass der Monocarboxylattransporter (MCT) 1 eine Rolle beim bikarbonatgekoppelten Transport von Azetat bzw. allgemein unmetabolisierten SCFA spielt. Diese Hinweise wurden untersetzt durch die Beobachtung, dass MCT 1, aber auch der apikal bzw. intrazellulär lokalisierte MCT 4 durch langfristige Inkubation des Epithels mit Butyrat sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene signifikant erhöht exprimiert wurden, was als Anpassungsreaktion an eine Substratakkumulation interpretiert werden kann. Außerdem wurde auch die mRNA-Expression des Putativen Anionentransporters (PAT) 1 durch Inkubation mit Butyrat erhöht, was für eine Beteiligung auch dieses Transportproteins am SCFA-Transport über das Pansenepithel spricht. Allerdings ist im Gegensatz zu MCT 1 die Lokalisation des PAT 1 in der basolateralen Membran noch fraglich. Die Expressionssteigerung von Zielgenen des Nukleären Faktors ĸB und des Peroxisomenproliferator-aktivierten Rezeptors α sowie des Hypoxie-induzierbaren Faktors selbst deuten weiterhin darauf hin, dass die Steigerung der Transportkapazitäten von MCT 1 und 4 und auch PAT 1 über diese Signalwege vermittelt wird. Schlussfolgerungen: Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit erstmals der Transport von SCFA über die basolaterale Membran des Pansenepithels näher charakterisiert werden, sodass es nun möglich ist, zusammen mit den bereits vorliegenden Befunden für die apikale Membran ein komplettes Modell dafür zu erstellen. Auch wurden Erkenntnisse zu regulativen Einflüssen auf diesen Transport gewonnen, die es zukünftig ermöglichen könnten, die Resorption der SCFA aus dem Pansen nutritiv oder eventuell pharmakologisch zu beeinflussen.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Bedeutung kurzkettiger Fettsäuren für Wiederkäuer 3 2.2 Metabolismus von SCFA im Pansenepithel 4 2.2.1 Aufrechterhaltung des Konzentrationsgradienten vom Pansenlumen ins Epithel 4 2.2.2 Produktion von HCO3- aus CO2 durch die Carboanhydrase 5 2.2.3 Bereitstellung von Energie für die Epithelzellen 5 2.2.4 Bereitstellung von wasserlöslichen, glukosesparenden Energiesubstraten für die periphere Zirkulation 5 2.2.5 Verhinderung möglicher Schädigungen durch Butyrat 6 2.3 Transportmechanismen für kurzkettige Fettsäuren 7 2.3.1 Para- versus transzelluläre Resorption 7 2.3.2 Transzelluläre Resorption mittels lipophiler Diffusion 7 2.3.3 Proteinvermittelte SCFA-Permeation 9 2.3.4 Permeation von SCFA aus dem Epithel ins Blut 11 2.4 Beeinflussung der SCFA-Resorption auf Genexpressionsebene 17 2.4.1 Beeinflussung der Genexpression durch Butyrat 17 2.4.2 Beeinflussung der Genexpression durch Hypoxie 20 2.4.3 Mechanismen für die Regulation der Genexpression durch Butyrat (-Metaboliten) und Hypoxie 21 2.5 Fragestellungen dieser Arbeit 26 3 Ergebnisse 28 3.1 Publikation 1 28 3.2 Publikation 2 41 4 Diskussion 54 4.1 Transport von SCFA über die basolaterale Membran des Pansenepithels 54 4.1.1 Transport mittels lipophiler Diffusion 57 4.1.2 SCFA werden bevorzugt über die basolaterale Membran transportiert 58 4.1.3 SCFA(-Metaboliten) werden bikarbonatabhängig über die basolaterale Membran transportiert 59 4.1.4 SCFA(-Metaboliten) werden durch einen Anionenaustauschmechanismus ins Blut ausgeschleust 61 4.1.5 Azetat wird durch einen pHMB- und CHC-sensitiven Mechanismus transportiert 63 4.2 Der Transport von SCFA über das Pansenepithel unterliegt regulativen Einflüssen 68 4.2.1 Einfluss von Butyrat(-Metaboliten) auf die Expression von potentiellen SCFA Transportern 68 4.2.2 Mechanismen für die Regulation der Expression durch Butyrat(-Metaboliten) 72 4.3 Theoretisches Modell des SCFA-Transports und dessen Regulation auf Genexpressionsebene auf Grundlage der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit 74 5 Zusammenfassung 76 6 Summary 78 7 Literaturverzeichnis 80 Danksagung 98 / Introduction: The main energy source for ruminants are short chain fatty acids (SCFA). Considering the ever increasing energy requirements of cattle due to increasing milk yield and meat production, it is crucial to identify the mechanisms for the resorption of these energy sources as well as possibilities to influence these transport mechanisms. This knowledge could help support the animals’ energy uptake or even making it more efficient. Aim: Thus, the aim of the present study was to characterise mechanisms for the resorption of SCFA focusing on their transport from the epithelial cells into the blood. In particular, since – compared to the research findings on the uptake of SCFA from ruminal lumen into the cells – so far only very little was known regarding this side of the epithelium. In a second step, the study aimed to elucidate whether the mechanisms observed are subject to regulatory processes and which signalling pathways are involved. Materials and methods: To characterise the transport mechanisms involved, epithelial pieces from the ventral sac of ovine rumen were mounted in Ussing chambers. Using radioactively labelled acetate, butyrate and L-lactate, the transport of these substrates was investigated under different conditions and by applying different inhibitors for potential SCFA transport proteins. To characterise regulatory influences, epithelial pieces were incubated with butyrate for six and 24 hours, respectively. Subsequently, total RNA and protein were extracted to detect changes in mRNA and protein expression using quantitative real time PCR and western blot, respectively. Results: The present study could show that transport of SCFA across the basolateral membrane of rumen epithelium is mainly realised by protein-mediated mechanisms. A significant participation of lipophilic diffusion, i.e. a passive transport, can almost entirely be excluded. The active transport could be divided into a bicarbonate-dependent and a bicarbonate-independent part. The experiments with inhibitors of different transport proteins showed clear evidence of an involvement of monocarboxylate transporter (MCT) 1 in the bicarbonate-dependent transport of acetate and non-metabolised SCFA in general. This evidence was supported by the finding that the expression of MCT 1 but also of the apically and intracellularly localised MCT 4 was increased significantly on both mRNA- and protein-level after long-term incubation of the epithelium with butyrate. This can be interpreted as an adaptation to a substrate accumulation. Additionally, butyrate incubation led to an increased mRNA expression of putative anion transporter (PAT) 1, which makes an involvement of this transport protein in SCFA transport across ruminal epithelium likely as well. However, in contrast to MCT 1 the localisation of PAT 1 in the basolateral membrane is still questionable. The increased expression of target genes of nuclear factor ĸB and peroxisome-proliferator activated receptor α as well as of hypoxia inducible factor strongly point to an involvement of these pathways in the increased expression of MCT 1 and 4 as well as PAT 1. Conclusions: In summary, this study could characterise the transport of SCFA across the basolateral membrane of ruminal epithelium in detail for the first time. This enables us to draw a complete model of ruminal SCFA transport. Also, evidence for regulatory influence on this transport processes was found, perhaps making it possible to influence resorption of SCFA from rumen by nutritive or pharmacological means in the future.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Bedeutung kurzkettiger Fettsäuren für Wiederkäuer 3 2.2 Metabolismus von SCFA im Pansenepithel 4 2.2.1 Aufrechterhaltung des Konzentrationsgradienten vom Pansenlumen ins Epithel 4 2.2.2 Produktion von HCO3- aus CO2 durch die Carboanhydrase 5 2.2.3 Bereitstellung von Energie für die Epithelzellen 5 2.2.4 Bereitstellung von wasserlöslichen, glukosesparenden Energiesubstraten für die periphere Zirkulation 5 2.2.5 Verhinderung möglicher Schädigungen durch Butyrat 6 2.3 Transportmechanismen für kurzkettige Fettsäuren 7 2.3.1 Para- versus transzelluläre Resorption 7 2.3.2 Transzelluläre Resorption mittels lipophiler Diffusion 7 2.3.3 Proteinvermittelte SCFA-Permeation 9 2.3.4 Permeation von SCFA aus dem Epithel ins Blut 11 2.4 Beeinflussung der SCFA-Resorption auf Genexpressionsebene 17 2.4.1 Beeinflussung der Genexpression durch Butyrat 17 2.4.2 Beeinflussung der Genexpression durch Hypoxie 20 2.4.3 Mechanismen für die Regulation der Genexpression durch Butyrat (-Metaboliten) und Hypoxie 21 2.5 Fragestellungen dieser Arbeit 26 3 Ergebnisse 28 3.1 Publikation 1 28 3.2 Publikation 2 41 4 Diskussion 54 4.1 Transport von SCFA über die basolaterale Membran des Pansenepithels 54 4.1.1 Transport mittels lipophiler Diffusion 57 4.1.2 SCFA werden bevorzugt über die basolaterale Membran transportiert 58 4.1.3 SCFA(-Metaboliten) werden bikarbonatabhängig über die basolaterale Membran transportiert 59 4.1.4 SCFA(-Metaboliten) werden durch einen Anionenaustauschmechanismus ins Blut ausgeschleust 61 4.1.5 Azetat wird durch einen pHMB- und CHC-sensitiven Mechanismus transportiert 63 4.2 Der Transport von SCFA über das Pansenepithel unterliegt regulativen Einflüssen 68 4.2.1 Einfluss von Butyrat(-Metaboliten) auf die Expression von potentiellen SCFA Transportern 68 4.2.2 Mechanismen für die Regulation der Expression durch Butyrat(-Metaboliten) 72 4.3 Theoretisches Modell des SCFA-Transports und dessen Regulation auf Genexpressionsebene auf Grundlage der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit 74 5 Zusammenfassung 76 6 Summary 78 7 Literaturverzeichnis 80 Danksagung 98

Although the etiology and pathogenesis of inflammatory bowel disease (IBD) is not fully understood, it is generally accepted that the inflammation results from aberrant immune responses to antigens of gut microbiota in genetically susceptible individuals (Sartor et al., 2006). Alteration in intestinal microbiota has been found in IBD patients with increased abundance of certain bacteria and decreased abundance of others. Due to the complexity of the disease, multifaceted interactions between genetic factors, host immune response, gut microbiota and environment factors need to be taken into account. In this thesis, the pathogenesis of IBD was first reviewed in respect with the four factors mentioned above. Then we concentrated on the interaction between IBD-associated bacteria and mucosal immune system. We investigated the ability of mucosal-associated bacteria (MAB) from IBD patients to induce spontaneous colitis in germ-free (GF) mice and the impact of those bacteria on the development of dextran sulfate sodium (DSS)-colitis. Together with the analysis of the composition of gut microbiota of MAB colonized mice, we demonstrated the potential deleterious microbes were able to increase the susceptibility to DSS-colitis once they found a suitable niche. We revealed the mechanism of an E.coli strain...

Einleitung: Ruminal werden Futterpflanzen zu kurzkettigen Fettsäuren (SCFAs) abgebaut. Diese bilden die Hauptenergiequelle für den Wiederkäuerorganismus. Da diese Fettsäuren jedoch auch maßgeblich die pH-Homöostase der Vormagenschleimhaut beeinflussen, muss das Pansenepithel in der Lage sein, Änderungen im Substrat- und Protonenangebot festzustellen und anschließend regulative Prozesse anzupassen, um Stoffwechselentgleisungen und so auch einer Pansenazidose vorzubeugen. In anderen Spezies erwiesen sich sogenannte „Freie Fettsäurerezeptoren“ (FFARs) als potenzielle Sensoren veränderter SCFA-Mengen im Darmlumen, die u. a. durch Modulation der intrazellulären Spiegel an zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) ihre Wirkung vermitteln. Ziele der Untersuchungen: Es sollte in der vorliegenden Arbeit untersucht werden, ob FFARs im Pansenepithel des Schafes vorkommen und durch SCFAs aktiviert sowie intrazelluläre Signalwege über cAMP moduliert werden können. Im Anschluss sollte erarbeitet werden, inwiefern der nachgewiesene Einfluss von Butyrat auf die epithelialen cAMP-Spiegel Auswirkungen auf die epitheliale pH-Modulation infolge einer veränderten Aktivität von Monocarboxylattransportern (MCTs) und Na+/H+-Austauschern (NHEs) hat. Tiere, Material und Methoden: Sämtliche Untersuchungen wurden an Geweben des Vormagens von Schafen (Ovis gmelini aries) durchgeführt. Mittels Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) und immunhistochemischer Färbungen wurde das Vorliegen verschiedener FFARs in nativem Pansengewebe untersucht. Zur funktionellen Charakterisierung wurden Epithelstücke aus dem ventralen Pansensack in Ussing-Kammern inkubiert und anschließend die cAMP-Spiegel im Epithel mittels einer quantitativen, kompetitiven Analyse bestimmt. Dabei wurde der Einfluss von Forskolin (ein Stimulator der cAMP-synthetisierenden Adenylylzyklasen), von Butyrat sowie von Niacin (ein FFAR-Agonist) betrachtet. Mithilfe von radioaktiv markiertem Azetat wurde der Effekt variierender cAMP-Spiegel auf die Transportaktivität von MCTs unter Zuhilfenahme von zwei verschiedenen MCT-Hemmstoffen (Cyanohydroxyzimtsäure und p-Hydroxymercuribenzoesäure) in Ussing-Kammern evaluiert. Die Aktivität der NHEs wurde an kultivierten Pansenepithelzellen durch Messung des intrazellulären pH-Wertes mittels Spektrofluorometrie unter Einfluss des NHE-Inhibitors 5-N-Ethyl-N-Isopropyl Amilorid ermittelt. Auch hierbei wurden in den Zellen unterschiedliche cAMP-Spiegel durch Forskolin-Applikation induziert. Die Daten der verschiedenen Untersuchungen wurden an 5-8 Tieren je Versuchsansatz erhoben. Die Normalverteilung wurde mittels Kolmogorov–Smirnov-Test ermittelt. Ein Friedman-Test mit anschließendem Dunn-Test wurde für die Analyse der cAMP-Experimente genutzt. MCT und NHE Experimente wurden mithilfe einer einfachen, geblockten Varianzanalyse und anschließendem Tukey-Test ausgewertet. Ergebnisse: Die FFARs GPR109A und FFAR2 konnten an allen untersuchten Lokalisationen (Netzmagen, Pansenvorhof, dorsaler und ventraler Pansensack, Psalter) über RT-PCR bzw. im ventralen Pansensack auch über die immunhistochemischen Färbungen detektiert werden, wohingegen FFAR3 lediglich als mRNA im Vorhof nachweisbar war. Dies lässt die beiden Rezeptoren GPR109A und FFAR2 als mögliche Strukturen zur Detektion von SCFAs im Pansenepithel erscheinen. Die Analyse der intrazellulären cAMP-Spiegel in Epithelien aus dem ventralen Pansensack konnte einen hemmenden Einfluss von Butyrat auf diesen Botenstoff darlegen, was auf eine Beteiligung der genannten FFARs hindeutet. Die Applikation des GPR109A-Agonisten Niacin hatte jedoch keinen Effekt auf die cAMP-Spiegel, sodass eine Wirkungsvermittlung von Butyrat über diesen Rezeptor unwahrscheinlich scheint. Mit Blick auf die funktionellen Auswirkungen dieser cAMP-Modulation hatten variierende cAMP-Level im Kontrast zu Erkenntnissen aus Nicht-Wiederkäuerspezies keinen Einfluss auf die Transportaktivität des ruminalen MCT1 unter den gewählten in vitro-Versuchsbedingungen. Andererseits konnte die Regulation des intrazellulären pH-Wertes von kultivierten Pansenepithelzellen tendenziell durch erhöhte cAMP-Spiegel gehemmt werden, was auf einer Hemmung von NHEs durch den second messenger beruhen könnte. Schlussfolgerungen: Die Expression von GPR109A und FFAR2 lassen diese zwei FFARs als potenzielle Sensoren der intraruminalen bzw. intraepithelialen Nährstoffkonditionen erscheinen. Dabei deuten die vorliegenden Untersuchungen auf eine Aktivierung des FFAR2 durch Butyrat und dessen Metaboliten in den basalen Schichten des Pansenepithels hin. Infolge der Rezeptoraktivierung kommt es vermutlich zu einer Verminderung der intraepithelialen cAMP-Spiegel, welche wiederum einen (schwachen) Einfluss auf die Regulation des intrazellulären pH-Wertes mithilfe von NHEs zu haben scheinen. Entgegen unserer Ausgangshypothese scheinen aber die FFARs des ovinen Pansenepithels die pH-Homöostase des Epithels nur geringfügig zu beeinflussen. Ihre genaue physiologische Bedeutung – insbesondere des GPR109A – bleibt somit noch spekulativ.:1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Bedeutung kurzkettiger Fettsäuren für den Wiederkäuer 3 2.2 Transport kurzkettiger Fettsäuren über das Pansenepithel 3 2.2.1 Apikale Aufnahme in das Pansenepithel 4 2.2.2 Basolaterale Ausschleusung in den Blutstrom 6 2.3 Metabolisierung kurzkettiger Fettsäuren im Pansenepithel 8 2.4 pH-Homöostase 9 2.4.1 pH-Regulation des Pansenlumens 9 2.4.2 pH-Regulation des Pansenepithels 10 2.5 Anpassungsmechanismen des Pansenepithels 12 2.6 Rolle des Butyrats 15 2.7 Fettsäurerezeptoren 16 2.7.1 G-Protein-gekoppelte Rezeptoren 17 2.7.2 GPRs für SCFAs 17 2.7.2.1 FFAR2 17 2.7.2.2 FFAR3 18 2.7.2.3 GPR109A 19 2.7.3 FFARs im Wiederkäuerorganismus 20 2.8 Monocarboxylattransporter 22 2.8.1 Die Familie der MCTs 22 2.8.2 Regulation der MCTs 23 2.8.3 MCTs im Pansenepithel 24 2.9 Natrium-Protonen-Austauscher 26 2.9.1 Die Familie der NHEs 26 2.9.2 Regulation der NHEs 27 2.9.3 NHEs im Pansenepithel 28 2.10 Fragestellungen der vorliegenden Arbeit 30 3 Publikationen 32 3.1 Publikation 1 32 3.2 Publikation 2 41 3.2.1 Supporting Information 56 4 Diskussion 57 4.1 Nachweis von FFARs im Pansenepithel 57 4.1.1 Regulation intrazellulärer Signalwege durch FFARs 59 4.1.2 GPR109A als potenzieller Butyrat-Rezeptor im Pansenepithel 62 4.1.3 FFAR2 als potenzieller Rezeptor für Butyrat 63 4.2 Seitenabhängigkeit der Butyrat-Effekte 64 4.3 pH-Abhängigkeit der cAMP-Spiegel 66 4.4 Einfluss von cAMP auf die Aktivität der MCTs 68 4.5 Einfluss von cAMP auf die NHE-Aktivität 70 4.6 Schlussfolgerungen 73 5 Zusammenfassung 75 6 Summary 77 7 Literaturverzeichnis 79 8 Anhang 101 8.1 Im Rahmen dieser Dissertation gehaltene Präsentationen 101 Danksagung 103 / Introduction: Forage plants are ruminally degraded to short chain fatty acids (SCFAs). These serve as the main energy source for ruminants. As SCFAs also influence the pH-homeostasis of the ruminal mucosa, the epithelium must be able to detect changes of both substrate and proton accumulation and adapt transport processes accordingly, in order to prevent metabolic dysfunction and thus the risk of ruminal acidosis. Studies in non-ruminant species detected so-called ‘free fatty acid receptors’ (FFARs) as potential SCFA-sensors in the gut lumen. It has been shown that these receptors transduce their information by modulation of intracellular levels of cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Aim: This study intended to investigate if FFARs are located in the ovine ruminal epithelium. It should further be evaluated if FFARs can be stimulated by SCFAs leading to a modulation of intracellular pathways via cAMP. Finally, the study aimed to elucidate the influence of low epithelial cAMP-levels after butyrate application on the regulation of pH-homeostasis in the ruminal epithelium by modulating the activity of transport proteins such as monocarboxylate transporters (MCTs) and Na+/H+ exchangers (NHEs). Animals, material, and methods: All experiments were conducted with ovine (Ovis aries) ruminal tissues. The expression of different FFARs was investigated in native tissues using a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunohistochemical staining. For functional analysis, epithelial cAMP levels were determined by a quantitative and competitive assay after incubation of epithelia of the ruminal ventral sac in Ussing chambers. The influence of forskolin (a stimulator of the adenylyl cyclases), butyrate, as well as niacin (an FFAR agonist) was evaluated. Further, the effect of varying cAMP levels on transport activity of MCTs was characterised on Ussing chamber-mounted epithelia with radioactively labelled acetate and two MCT inhibitors (cyano-hydroxycinnamic acid and p-hydroxymercuribenzoic acid). Finally, the activity of NHEs was assessed in cultured ruminal epithelial cells. The intracellular pH was evaluated by spectrofluorometry while the cells were incubated with forskolin (to modify intracellular cAMP levels) or the NHE inhibitor 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-amiloride. The data for the different set-ups were acquired from 5-8 animals each. Kolmogorov–Smirnov test was used for testing normality. For cAMP level analyses, the Friedman test followed by Dunn's test was performed. MCT and NHE measurements were analysed using one-way randomized block analysis of variance followed by Tukey's test. Results: GPR109A and FFAR2 were detected in all ovine ruminal epithelia examined (reticulum, atrium ruminis, ruminal ventral and dorsal sac, omasum) by RT-PCR and in ruminal ventral sac also by immunohistochemical staining. FFAR3, however, was detected solely on mRNA level in tissues of the ovine atrium ruminis. Thus, the two immunohistochemically detected receptors may serve as potential sensors for SCFAs in the ruminal epithelium. The analysis of intraepithelial cAMP levels revealed an inhibiting influence of butyrate application on cAMP pointing to an activation of FFARs by this SCFA. Nonetheless, the incubation with the GPR109A agonist niacin did not show any effect on cAMP levels. This finding contradicts the theory of an activation of GPR109A by butyrate. Looking at functional consequences of varying cAMP levels, in contrast to studies on non-ruminant species ruminal MCT1 activity was not influenced by different cAMP levels, at least under the conditions chosen in this in vitro study. However, regulation of intracellular pH in cultured ruminal epithelial cells tended to decrease with augmented cAMP levels. This might be mediated by an inhibition of NHEs. Conclusions: The expression of GPR109A and FFAR2 points at a participation of these receptors in sensing intraruminal and intraepithelial energy status. The present data hint at an activation of FFAR2 by butyrate or its metabolites in the basal layers of the epithelium. Activation of the receptor leads to decreased cAMP levels. This in turn seems to slightly modify the regulation of intracellular pH via NHEs. Contradicting our initial hypothesis, ovine ruminal FFARs seem to play only a minor role in modulation of epithelial pH homeostasis. The main physiological role of ruminal FFARs – especially of GPR109A – remains to be clarified.:1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Bedeutung kurzkettiger Fettsäuren für den Wiederkäuer 3 2.2 Transport kurzkettiger Fettsäuren über das Pansenepithel 3 2.2.1 Apikale Aufnahme in das Pansenepithel 4 2.2.2 Basolaterale Ausschleusung in den Blutstrom 6 2.3 Metabolisierung kurzkettiger Fettsäuren im Pansenepithel 8 2.4 pH-Homöostase 9 2.4.1 pH-Regulation des Pansenlumens 9 2.4.2 pH-Regulation des Pansenepithels 10 2.5 Anpassungsmechanismen des Pansenepithels 12 2.6 Rolle des Butyrats 15 2.7 Fettsäurerezeptoren 16 2.7.1 G-Protein-gekoppelte Rezeptoren 17 2.7.2 GPRs für SCFAs 17 2.7.2.1 FFAR2 17 2.7.2.2 FFAR3 18 2.7.2.3 GPR109A 19 2.7.3 FFARs im Wiederkäuerorganismus 20 2.8 Monocarboxylattransporter 22 2.8.1 Die Familie der MCTs 22 2.8.2 Regulation der MCTs 23 2.8.3 MCTs im Pansenepithel 24 2.9 Natrium-Protonen-Austauscher 26 2.9.1 Die Familie der NHEs 26 2.9.2 Regulation der NHEs 27 2.9.3 NHEs im Pansenepithel 28 2.10 Fragestellungen der vorliegenden Arbeit 30 3 Publikationen 32 3.1 Publikation 1 32 3.2 Publikation 2 41 3.2.1 Supporting Information 56 4 Diskussion 57 4.1 Nachweis von FFARs im Pansenepithel 57 4.1.1 Regulation intrazellulärer Signalwege durch FFARs 59 4.1.2 GPR109A als potenzieller Butyrat-Rezeptor im Pansenepithel 62 4.1.3 FFAR2 als potenzieller Rezeptor für Butyrat 63 4.2 Seitenabhängigkeit der Butyrat-Effekte 64 4.3 pH-Abhängigkeit der cAMP-Spiegel 66 4.4 Einfluss von cAMP auf die Aktivität der MCTs 68 4.5 Einfluss von cAMP auf die NHE-Aktivität 70 4.6 Schlussfolgerungen 73 5 Zusammenfassung 75 6 Summary 77 7 Literaturverzeichnis 79 8 Anhang 101 8.1 Im Rahmen dieser Dissertation gehaltene Präsentationen 101 Danksagung 103

Die Durchfallerkrankung Giardiasis wird durch den Protisten Giardia duodenalis ausgelöst. Die Infektion erfolgt fäkal-oral, meist über kontaminiertes Trinkwasser. Der Parasit kolonisiert den oberen Bereich des Dünndarms und heftt sich an das Epithel, wodurch es die Krankheitsbeschwerden auslöst. Allerdings sind Details über die Mechanismen der Pathogenese unbekannt. Dazu kommt, dass der Ausgang einer Infektion fallspezifisch starken Schwankungen unterworfen ist, von selbst-limitierend bis chronisch und asymptomatischer Kolonisierung bis hin zur schweren Enteritis. Ein möglicher Pathomechanismus ist der Wegfall der Barrierefunktion des Dünndarmepithels, z.B. durch Beeinträchtigung von tight junctions oder Zelltod. In dieser Arbeit wurden Effekte von G. duodenalis auf in vitro Modellsysteme des humanen Dünndarmepithels untersucht. Dazu wurden hauptsächlich Daten über die Barrierefunktion sowohl von der weit verbreiteten Caco-2 Zelllinie, als auch über ein neu etabliertes humanes Dünndarmorganoidsystem, erhoben. Es konnte gezeigt werden, dass mehrere - mitunter in der Literatur als hochvirulent beschriebene - G. duodenalis Isolate zu keinerlei Beeinträchtigung der Barrierefunktion oder irgendeiner anderen untersuchten potenziellen Schädigung an zwei unterschiedlichen Caco-2 Zelllinien unter diversen Infektions- und Kulturbedingungen führte. Jedoch andererseits das neu entwickelte Dünndarmorganoidsystem mit pseudo-luminalem Medium TYI S 33 reproduzierbar die Zerstörung des Epithelmodells mit Zellverlust, Zelltod (apoptotisch und nicht-apoptotisch), Störung der tight junctions (Abbau und Dislokation von Claudinen und ZO-1) und den Verlust von Mikrovilli innerhalb ein bis zwei Tage nach Parasiteninfektion zeigen konnte. Zudem wurde das Auftauchen von ClCa-1-Signalen unter andauerndem Infektionsstress beobachtet, was die Differenzierung bzw. Metaplasie zu Becherzellen nahelegt, jedoch keine Wirtsreaktion auf die Gewebszerstörung zu sein scheint. / The protozoan parasite Giardia duodenalis is the etiological agent for the intestinal diarrheal disease giardiasis. Infections are acquired via the fecal-oral route, mostly via uptake of cysts from contaminated drinking water. The colonization of the hosts’ duodenum and upper jejunum and the attachment of Giardia trophozoites onto the epithelium is the cause of a variety of gastrointestinal complaints but the exact pathomechanisms are unknown. Furthermore, the outcome of Giardia infections varies greatly between individuals, ranging from self-limiting to chronic, and asymptomatic to severe enteritis. One proposed mechanism for the pathogenesis is the breakdown of intestinal barrier function, e.g. by tight junction impairment or induction of cell death. In this work, effects of G. duodenalis on in vitro models of the human small intestinal epithelium were investigated by studying mainly barrier-related properties and changes of widely used Caco-2 cells as well as newly established human small intestinal organoid-derived monolayers (ODMs). It could be shown that several isolates of G. duodenalis, some described as highly virulent, fail to induce barrier dysfunction or any other investigated pathological effect on two Caco-2 cell lines under various infection and culturing conditions. On the other side, by developing a new organoid-based model system and the use of luminal mock medium TYI-S-33, considerable epithelial disruption (including loss of cells), cell death (apoptosis and non-apoptotic), tight junction impairment (degradation and dislocation of claudins and ZO-1), and microvilli depletion reproducibly induced by G. duodenalis trophozoites between one and two days after infection could be observed. Moreover, emergence of ClCa-1 positive cells with ongoing parasite infections suggest epithelial differentiation or metaplasia towards goblet cells, which is furthermore not associated to tissue damage.

P-glycoprotein (P-gp) protects the mammalian intestinal epithelium by effluxing toxins from the epithelial cells as well as release of human endocannabinoids that inhibit neutrophil infiltration. Diminished or dysfunctional P-gp is associated with intestinal inflammation including ulcerative colitis (UC). Due to the microbiome dysbiosis associated with UC, we hypothesize that the healthy microbiota promote colonic P-gp expression. Utilizing mouse models of antibiotic treatment, microbiota reconstitution, and metabolite perturbation, we have shown butyrate and secondary bile acids, dependent on vancomycin-sensitive bacteria, induce P-gp expression in vivo. We have shown these metabolites together potentiate induction of P-gp in intestinal epithelial cell lines in vitro, which is sufficient to inhibit primary human neutrophil transmigration. Furthermore, in UC patients we find diminished P-gp expression is coupled to reduction of anti-inflammatory endocannabinoids and luminal content with reduced capability to induce P-gp expression. Additionally, we have found butyrate contributes to P-gp expression via histone deacetylase inhibition, and secondary bile acids regulate P-gp expression via nuclear receptors pregnane X receptor and vitamin D receptor. Employing RNA sequencing (RNAseq) in IECs uncovered signaling networks that are uniquely triggered with the combination of butyrate and secondary bile acids, suggesting additional pathways required for maximal P-gp expression in the colon. Together we identify a mechanistic link between cooperative functional outputs of the complex microbial community and suppression of intestinal inflammation. These data emphasize the importance of the intestinal microbiome in driving the P-gp axis to suppress aberrant neutrophil infiltration and identify potential therapeutic targets for promoting P-gp expression in an inflamed colon to reset homeostasis.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / The non-hematopoietic, stationary stromal cells located inside and surrounding skin-draining lymph nodes play a key role in regulating immune responses. We studied distinct populations of lymph node stromal cells from both human subjects and animal models in order to describe their phenotype and function. In the mouse model, we studied two distinct populations: an endothelial cell population expressing Ly51 and MHC-II, and an epithelial cell population expressing the epithelial adhesion molecule EpCAM. Analysis of intra-nodal and extra-nodal lymph node (CD45-) stromal cells through flow cytometry and qPCR provides a general phenotypic profile of the distinct populations. My research focused on the EpCAM+ epithelial cell population located in the fat pad surrounding the skin draining lymph nodes. The EpCAM+ population has been characterized by surface marker phenotype, anatomic location, and gene expression profile. This population demonstrates the ability to inhibit the activation and proliferation of both CD4 and CD8 T cells. This population may play a role in suppressing overactive inflammation and auto-reactive T cells that escaped thymic deletion. The other major arm of my project consisted of identifying a novel endothelial cell population in human lymph nodes. Freshly resected lymph nodes were processed into single cell suspensions and selected for non-hematopoietic CD45- stromal cells. The unique endothelial population expressing CD34 HLA-DR was then characterized and analyzed for anatomic position, surface marker expression, and gene profiles. Overall, these studies emphasize the importance of stationary lymph node stromal cells to our functioning immune systems, and may have clinical relevance to autoimmune diseases, inflammation, and bone marrow transplantation.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Carbon nanotubes (CNTs) are one of the most common nanoparticles (NP) found in workplace air. Therefore, there is a strong chance that these NP will enter the human body. They have similar physical properties to asbestos, a known toxic material, yet there is limited evidence showing that CNTs may be hazardous to human barrier epithelia. In previous studies done in our laboratory, the effects of CNTs on the barrier function in the human airway epithelial cell line (Calu-3) were measured. Measurements were done using electrophysiology, a technique which measures both transepithelial electrical resistance (TEER), a measure of monolayer integrity, and short circuit current (SCC) which is a measure of vectorial ion transport across the cell monolayer. The research findings showed that select physiologically relevant concentrations of long single-wall (SW) and multi-wall (MW) CNTs significantly decreased the stimulated SCC of the Calu-3 cells compared to untreated cultures. Calu-3 cells showed decreases in TEER when incubated for 48 hours (h) with concentrations of MWCNT ranging from 4µg/cm2 to 0.4ng/cm2 and SWCNT ranging from 4µg/cm2 to 0.04ng/cm2. The impaired cellular function, despite sustained cell viability, led us to investigate the mechanism by which the CNTs were affecting the cell membrane. We investigated the interaction of short MWCNTs with model lipid membranes using an ion channel amplifier, Planar Bilayer Workstation. Membranes were synthesized using neutral diphytanoylphosphatidylcholine (DPhPC) and negatively charged diphytanoylphosphatidylserine (DPhPS) lipids. Gramicidin A (GA), an ion channel reporter protein, was used to measure changes in ion channel conductance due to CNT exposures. Synthetic membranes exposed to CNTs allowed bursts of currents to cross the membrane when they were added to the membrane buffer system. When added to the membrane in the presence of GA, they distorted channel formation and reduced membrane stability.