During embryonic development a variety of tissues and organs such as the lung, eye, and kidney are being formed. The generation of functional organs is regulated by reciprocal cell-cell interactions. Via the secretion of soluble molecules one type of cells affect the fate of their neighboring cells. A central issue in organogenesis is how a cell interprets such extrinsic signals and adopts a specific fate, and how the cell in response to this signal establishes reciprocal signaling. Transcription factors play a critical role in this process and my thesis focuses on the role of the LIM-homeodomain transcription factor, Lhx2, in the development of three different organ systems, the liver, the hematopoietic system and the olfactory system. The liver is formed from endoderm of the ventral foregut and mesenchyme of the septum transversum (st) and its development depends upon signaling interactions between these two tissues. As the liver becomes a distinct organ it is colonized by hematopoietic cells and serves as hematopoietic organ until birth. The fetal liver provides a microenvironment that supports the expansion of the entire hematopoietic system (HS) including the hematopoietic stem cells (HSCs). Liver development in Lhx2-/- embryos is disrupted leading to a lethal anemia due to insufficient support of hematopoiesis. To further investigate the role of Lhx2 in liver development I analyzed gene expression from the Lhx2 locus during liver development in wild-type and Lhx2-/- mice. Lhx2 is expressed in the liver associated st mesenchymal cells that become integrated in the liver and contribute to a subpopulation of hepatic stellate cells in adult liver. Lhx2 is not required for the formation of these mesenchymal cells, suggesting that the phenotype in Lhx2-/- livers is due to the presence of defective mesenchymal cells. The putative role of Lhx2 in the expansion of the HS was examined by introducing Lhx2 cDNA into embryonic stem cells differentiated in vitro. This approach allowed for the generation of immortalized multipotent hematopoietic progenitor cell (HPC) lines that share many characteristics with normal HSCs. The Lhx2-dependent generation of HSC-like cell lines suggests that Lhx2 plays a role in the maintenance and/or expansion of the HS. To isolate genes putatively linked to Lhx2 function, genes differentially expressed in the HPC lines were isolated using a cDNA subtraction approach. This allowed for the identification of a few genes putatively linked to Lhx2 function, as well as several stem cell-specific genes. The antagonist of Wnt signalling, Dickkopf-1 (Dkk-1), was identified in the former group of genes as it showed a similar expression pattern in the fetal liver, as that of Lhx2 and expression of Dkk-1 in fetal liver and in HPC lines appeared to be regulated by Lhx2. This suggests that Dkk-1 plays a role in liver development and/or HSC physiology during embryonic development. During development of the olfactory epithelium (OE) neuronal progenitors differentiate into mature olfactory sensory neurons (OSNs) that are individually specified into over a thousand different subpopulations, each expressing a unique odorant receptor (OR) gene. The expression of Lhx2 in olfactory neurons suggested a potential role for Lhx2 in the development of OSNs. To address this OE from Lhx2-/- and wild-type mice was compared. In the absence of functional Lhx2 neuronal differentiation was arrested prior to onset of OR expression. Lhx2 is thus required for the development of OSN progenitors into functional, individually specified OSNs. Thus, Lhx2 trigger a variety of cellular responses in different organ systems that play important roles in organ development in vivo and stem cell expansion in vitro.

RAGE (receptor for advanved glycation endproducts) was identified on endothelial cells as binding partner for AGE-modified molecules. The term "Advanced glycation endproducts" involves a number of structurally diverse molecules, which derive from multiple complex rearrangements of reducing sugars with free amino-groups of proteins. They evolve during food production and also in vivo during ageing and to an accelerated degree in diabetes, where AGEs cause receptor-mediated cellular perturbations. Due to the pathological relevance the aim of this thesis was to generate a "biosensor" for AGEs. To this end, the membrane-expressed receptor (flRAGE) as well as soluble RAGE (sRAGE) were expressed in mammalian cells and investigated in numerous binding studies. These did not reveal a specific interaction of AGE-modified ligands with RAGE. In addition, the expression of RAGE on endothelial cells, as described in the literature, could not be followed neither with the help of newly generated monoclonal anti-RAGE antibodies, nor in quantitative "real time" RT-PCR analysis. These results cast doubts on the meaning of RAGE as a proinflammatory receptor in AGE-mediated pathologies and on the adequacy of RAGE for the "biosensor". At the same time the question concerning a physiological role of the receptor arose. RAGE-expression was analysed in different healthy human tissues by "real time" RT-PCR, which revealed an almost selective expression in lung tissue. An important indication for a possible physiological function of RAGE in lung provided the selective localization of RAGE on alveolar epithelial type I cells as demonstrated in frozen lung sections as well as in in vitro cultivated lung cells. RAGE could be identified as a novel, highly specific marker for the thin, expanded AT I cell, which form part of the air-blood-barrier. In the following, RAGE was found to be an interaction partner for collagen IV, a major component of the alveolar basal lamina. Membrane-expressed RAGE did not only strengthened adherence of cells but also induced cell spreading on collagen IV-coated surfaces. This preferential interaction of RAGE with collagen IV could substantially contribute to the functional morphology of AT I cells in vivo, thereby ensuring an effective bidirectional gas-exchange. The results of this thesis expose a novel, so far unnoticed aspect of the biology of RAGE, which presumably contributes to the phenotypic characteristic und function of normal human lung tissue. / RAGE (receptor for advanced glycation endproducts) wurde als Interaktionspartner auf Endothelzellen für AGE-modifizierte Moleküle identifiziert. Unter den "Advanced glycation endproducts" werden eine Vielzahl strukturell unterschiedlicher Moleküle zusammengefasst, die durch mehrstufige komplexe Umlagerungen zwischen reduzierenden Zuckern und freien Aminogruppen von Proteinen entstehen. Sie entstehen sowohl bei der Herstellung von Lebensmitteln, als auch in vivo während des Alterns und in erhöhtem Maß bei Diabetes, wobei sie Rezeptor-vermittelt Zellstörungen hervorrufen. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst aufgrund der pathologischen Relevanz eine Strategie zur Konzeption eines "Biosensors" für AGEs verfolgt. Hierfür wurde sowohl der membranständige Rezeptor (flRAGE) als auch löslicher RAGE (sRAGE) in Säugerzellen exprimiert und in zahlreichen Bindungs- und Funktionsanalysen getestet. Hierbei konnte keine spezifische Interaktion der AGE-modifizierten Moleküle mit RAGE nachgewiesen werden. Auch die in der Literatur beschriebene Expression von RAGE auf Endothelzellen konnte mit Hilfe neu generierter monoklonaler Antikörper, sowie in quantitativen "real time" RT-PCR-Analysen nicht nachvollzogen werden. Diese Ergebnisse warfen Zweifel an der grundlegenden Bedeutung von RAGE als proinflammatorischer Rezeptor in AGE-bedingten Krankheiten auf und stellten damit auch dessen Eignung für einen AGE-Biosensor in Frage. Gleichzeitig warf diese Skepsis die Frage nach einer möglichen physiologischen Funktion dieses Rezeptors auf. Eine vergleichende Analyse der RAGE-Expression in verschiedenen gesunden Geweben mittels "real time" RT-PCR ergab eine nahezu selektive Expression in Lungengewebe. Wichtige Anhaltspunkte für die Funktion von RAGE in der Lunge ergaben sich aus der selektiven Lokalisation des Rezeptors auf Alveolarepithelzellen Typ I (AT I) sowohl in Gefrierschnitten der Lunge als auch nach in vitro-Kultur von Lungenzellen. RAGE konnte als neuer, hoch spezifischer Marker für die lang gestreckten AT 1 Zellen, die einen Teil der Blut-Luft-Schranke bilden, definiert werden. In folgenden Funktionsanalysen konnte RAGE als spezifischer Interaktionspartner für Kollagen IV, einer Hauptkomponente der Alveolar-Basalmembran, identifiziert werden. Membranständiger RAGE verstärkte nicht nur die Adhärenz von Zellen an Kollagen IV-beschichtete Oberflächen, er induzierte auch Zell-"Spreading". Dies gab Anlass für die Vermutung, dass die beobachtete präferentielle Interaktion von RAGE mit Kollagen IV maßgeblich zu der funktionellen Morphologie der AT I Zellen in vivo beitragen könnte, die die Voraussetzung für einen effektiven bidirektionalen Gasaustausch darstellt. Durch die Ergebnisse dieser Arbeit wurde ein neuer, bisher unbeachteter Aspekt der Biologie des RAGE aufgedeckt, der vermutlich entscheidend zur phänotypischen Ausprägung und Funktion des normalen humanen Lungengewebes beiträgt.

Scar-free wound healing and regeneration are uncommon phenomena permitting the near complete restoration of damaged tissues, organs and structures. Although rare in mammals, many lizards are able to undergo scarless healing and regeneration following loss of the tail. This study investigated the spontaneous and intrinsic capacity of the leopard gecko (Eublepharis macularius) tail to undergo scar-free wound healing and regeneration following two different forms of tail loss: autotomy, a voluntary and evolved mechanism of tail shedding at fracture planes; and surgical amputation, involuntary loss of the tail outside the fracture planes. Furthermore, I investigated the ability of the regenerate tail to regenerate by amputating a regenerate tail (previously lost by autotomy). To investigate these phenomena I imaged wound healing and regenereating tails daily (following autotomy and amputation) to document gross morphological changes. I used histochemistry to document tissue structure and immunohistochemistry to determine the tissue/cellular location of my five proteins of interest (PCNA, MMP-9, WE6, α-sma, TGF-β3). Each of these proteins of interest has been previously documented during wound healing and/or regeneration in other wound healing/regeneration model organisms (e.g. mice, urodeles, lizards, zebrafish). Scar-free wound healing and regeneration occurred following autotomy, amputation of the original tail and amputation of the regenerate tail, indicating that the leopard gecko tail has an instrinsic scar-free wound healing and regenerative capacity that is independent of the mode of tail loss (autotomy or amputation). Furthermore immunohistochemistry revealed a conserved sequence and location of the expression of the five proteins of interest following both forms of tail loss. These results provide the basis for further studies investigating scar-free wound healing and regeneration in a novel amniote model, the leopard gecko. / NSERC

Nous avons étudié le transcriptome de neuf échantillons d'ARN extraits de cultures primaires de cellules non tumorales de l’épithélium de surface de l’ovaire (NOSE) provenant de quatre donneuses non porteuses de mutation, deux mutées sur BRCA1 et trois sur BRCA2, ainsi que de quatre échantillons d’ARN extraits de cultures primaires de cellules tumorales de l’ovaire (TOV) provenant de trois donneuses porteuses de mutation sur BRCA1 et une sur BRCA2. Nous avons identifié, pour la première fois, les signatures moléculaires associées à la présence d’une mutation de BRCA1 et BRCA2 dans les cellules NOSEs ainsi que la signature associée à la transformation tumorale des cellules NOSEs en TOVs chez les porteuses de mutation de BRCA1. Nous avons également localisé les domaines chromosomiques comportant des gènes corégulés en association avec la présence d’une mutation de BRCA1 dans les cellules NOSEs. Les allèles sauvage et muté de BRCA2 étaient exprimés dans les cellules TOVs provenant des porteuses de la mutation 8765delAG sur BRCA2. Nous avons observé que le niveau d’expression des transcrits de BRCA2 était plus élevé dans les cellules provenant des tumeurs ovariennes les plus agressives chez les femmes porteuses de la mutation 8765delAG sur BRCA2, les transcrits correspondants à l’allèle muté contribuant avec un pourcentage élevé du niveau d’expression total du gène. Le phénotype tumoral observé chez les Canadiennes Françaises porteuses de cette mutation pourrait résulter d’un effet de dosage de l’allèle muté. / We analyzed the transcriptome of nine primary cultures of non-tumor ovarian surface epithelium cells (NOSE) from four non-carriers, two BRCA1 and three BRCA2 carriers, and four primary cultures of tumor ovarian cells (TOV) from three BRCA1 and one BRCA2 carriers. We identified the first molecular signatures associated with the presence of BRCA1 and BRCA2 mutations in NOSEs and the first molecular signature associated with the transformation from NOSEs to TOVs in French Canadian women carriers of BRCA1 mutation. Moreover, we localized some co-regulated chromosomal domains associated with the presence of a BRCA1 mutation in NOSE cells. Wild-type and mutated BRCA2 allelic transcripts were expressed in tumor cells from 8765delAG BRCA2 mutation carriers, with the highest level of BRCA2 transcript expression and the highest contribution of the mutated allele in cells originating from the most aggressive ovarian tumors. The observed phenotype in BRCA2-mutated cells as well as the aggressiveness of the tumor could result from a dosage effect of the BRCA2 mutated allele.

Einleitung: Kurzkettige Fettsäuren (SCFA) stellen das hauptsächliche Energiesubstrat für Wiederkäuer dar. In Anbetracht des - bedingt durch höhere Milch-, Mast und Reproduktionsleistung - steigenden Energiebedarfs von Hauswiederkäuern wie Milchkuh und Mastbulle ist es von zentraler Bedeutung, die Mechanismen zur Resorption dieser Energielieferanten bzw. Ansatzpunkte für die Beeinflussung dieser Transportprozesse genau zu kennen. Dieses Wissen kann möglicherweise dabei helfen, zukünftig die Energieaufnahme der Tiere zu unterstützen bzw. sogar effizienter zu gestalten. Ziele der Untersuchungen: Deshalb war es Ziel der vorliegenden Arbeit, die Mechanismen zur Resorption von SCFA zu charakterisieren, wobei der Schwerpunkt auf den Transport aus den Pansenepithelzellen ins Blut gelegt wurde, da hierzu im Gegensatz zu ihrer Aufnahme aus dem Pansenlumen in die Epithelzellen noch sehr wenig bekannt war. In einem zweiten Schritt sollte untersucht werden, inwiefern die nachgewiesenen Mechanismen einer Regulation unterliegen und über welche Signalwege diese vermittelt werden könnte. Materialien und Methoden: Zur Charakterisierung der beteiligten Resorptionsmechanismen wurden Epithelstücke aus dem ventralen Pansensack von Schafen in Ussing-Kammern eingespannt und mit Hilfe radioaktiv markierten Azetats, Butyrats und L-Laktats der Transport dieser Substrate unter verschiedenen Bedingungen sowie verschiedenen Hemmstoffeinflüssen untersucht. Zur Charakterisierung regulativer Einflüsse wurden die Epithelstücke über sechs bzw. 24 Stunden mit Butyrat inkubiert und anschließend RNA bzw. Totalprotein extrahiert. Hiermit konnten Veränderungen in mRNA- und Proteinexpression mittels quantitativer Echtzeit-PCR bzw. Western Blot nachgewiesen werden. Ergebnisse: Die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit konnten zeigen, dass der Transport von SCFA über die basolaterale Membran des Pansenepithels hauptsächlich proteinvermittelt erfolgt. Eine signifikante Beteiligung lipophiler Diffusion, d.h. ein passiver Transport, kann weitgehend ausgeschlossen werden. Der aktive Transport wies eine bikarbonatabhängige und eine bikarbonatunabhängige Komponente auf. Der Einsatz von Hemmstoffen verschiedener Transportproteine ergab deutliche Hinweise darauf, dass der Monocarboxylattransporter (MCT) 1 eine Rolle beim bikarbonatgekoppelten Transport von Azetat bzw. allgemein unmetabolisierten SCFA spielt. Diese Hinweise wurden untersetzt durch die Beobachtung, dass MCT 1, aber auch der apikal bzw. intrazellulär lokalisierte MCT 4 durch langfristige Inkubation des Epithels mit Butyrat sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene signifikant erhöht exprimiert wurden, was als Anpassungsreaktion an eine Substratakkumulation interpretiert werden kann. Außerdem wurde auch die mRNA-Expression des Putativen Anionentransporters (PAT) 1 durch Inkubation mit Butyrat erhöht, was für eine Beteiligung auch dieses Transportproteins am SCFA-Transport über das Pansenepithel spricht. Allerdings ist im Gegensatz zu MCT 1 die Lokalisation des PAT 1 in der basolateralen Membran noch fraglich. Die Expressionssteigerung von Zielgenen des Nukleären Faktors ĸB und des Peroxisomenproliferator-aktivierten Rezeptors α sowie des Hypoxie-induzierbaren Faktors selbst deuten weiterhin darauf hin, dass die Steigerung der Transportkapazitäten von MCT 1 und 4 und auch PAT 1 über diese Signalwege vermittelt wird. Schlussfolgerungen: Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit erstmals der Transport von SCFA über die basolaterale Membran des Pansenepithels näher charakterisiert werden, sodass es nun möglich ist, zusammen mit den bereits vorliegenden Befunden für die apikale Membran ein komplettes Modell dafür zu erstellen. Auch wurden Erkenntnisse zu regulativen Einflüssen auf diesen Transport gewonnen, die es zukünftig ermöglichen könnten, die Resorption der SCFA aus dem Pansen nutritiv oder eventuell pharmakologisch zu beeinflussen. / Introduction: The main energy source for ruminants are short chain fatty acids (SCFA). Considering the ever increasing energy requirements of cattle due to increasing milk yield and meat production, it is crucial to identify the mechanisms for the resorption of these energy sources as well as possibilities to influence these transport mechanisms. This knowledge could help support the animals’ energy uptake or even making it more efficient. Aim: Thus, the aim of the present study was to characterise mechanisms for the resorption of SCFA focusing on their transport from the epithelial cells into the blood. In particular, since – compared to the research findings on the uptake of SCFA from ruminal lumen into the cells – so far only very little was known regarding this side of the epithelium. In a second step, the study aimed to elucidate whether the mechanisms observed are subject to regulatory processes and which signalling pathways are involved. Materials and methods: To characterise the transport mechanisms involved, epithelial pieces from the ventral sac of ovine rumen were mounted in Ussing chambers. Using radioactively labelled acetate, butyrate and L-lactate, the transport of these substrates was investigated under different conditions and by applying different inhibitors for potential SCFA transport proteins. To characterise regulatory influences, epithelial pieces were incubated with butyrate for six and 24 hours, respectively. Subsequently, total RNA and protein were extracted to detect changes in mRNA and protein expression using quantitative real time PCR and western blot, respectively. Results: The present study could show that transport of SCFA across the basolateral membrane of rumen epithelium is mainly realised by protein-mediated mechanisms. A significant participation of lipophilic diffusion, i.e. a passive transport, can almost entirely be excluded. The active transport could be divided into a bicarbonate-dependent and a bicarbonate-independent part. The experiments with inhibitors of different transport proteins showed clear evidence of an involvement of monocarboxylate transporter (MCT) 1 in the bicarbonate-dependent transport of acetate and non-metabolised SCFA in general. This evidence was supported by the finding that the expression of MCT 1 but also of the apically and intracellularly localised MCT 4 was increased significantly on both mRNA- and protein-level after long-term incubation of the epithelium with butyrate. This can be interpreted as an adaptation to a substrate accumulation. Additionally, butyrate incubation led to an increased mRNA expression of putative anion transporter (PAT) 1, which makes an involvement of this transport protein in SCFA transport across ruminal epithelium likely as well. However, in contrast to MCT 1 the localisation of PAT 1 in the basolateral membrane is still questionable. The increased expression of target genes of nuclear factor ĸB and peroxisome-proliferator activated receptor α as well as of hypoxia inducible factor strongly point to an involvement of these pathways in the increased expression of MCT 1 and 4 as well as PAT 1. Conclusions: In summary, this study could characterise the transport of SCFA across the basolateral membrane of ruminal epithelium in detail for the first time. This enables us to draw a complete model of ruminal SCFA transport. Also, evidence for regulatory influence on this transport processes was found, perhaps making it possible to influence resorption of SCFA from rumen by nutritive or pharmacological means in the future.

An essential prerequisite for the existence of multi-cellular life is the organization of cells into tissues. In this thesis, we theoretically study how large-scale tissue properties can emerge from the collective behavior of individual cells. To this end, we focus on the properties of epithelial tissue, which is one of the major tissue types in animals. We study how rheological properties of epithelia emerge from cellular processes, and we develop a physical description for the dynamics of an epithelial cell polarity. We apply our theoretical studies to observations in the developing wing of the fruit fly, Drosophila melanogaster. In order to study epithelial mechanics, we first develop a geometrical framework that rigorously describes the deformation of two-dimensional cellular networks. Our framework decomposes large-scale deformation into cellular contributions. For instance, we show how large-scale tissue shear decomposes into contributions by cell shape changes and into contributions by different kinds of topological transitions. We apply this framework in order to quantify the time-dependent deformation of the fruit fly wing, and to decompose it into cellular contributions. We also use this framework as a basis to study large-scale rheological properties of epithelia and their dependence on cellular fluctuations. To this end, we represent epithelial tissues by a vertex model, which describes cells as elastic polygons. We extend the vertex model by introducing fluctuations on the cellular scale, and we develop a method to perform perpetual simple shear simulations. Analyzing the steady state of such simple shear simulations, we find that the rheological behavior of vertex model tissue depends on the fluctuation amplitude. For small fluctuation amplitude, it behaves like a plastic material, and for high fluctuation amplitude, it behaves like a visco-elastic fluid. In addition to analyzing mechanical properties, we study the reorientation of an epithelial cell polarity. To this end, we develop a simple hydrodynamic description for polarity reorientation. In particular, we account for polarity reorientation by tissue shear, by another polarity field, and by local polarity alignment. Furthermore, we develop methods to quantify polarity patterns based on microscopical images of the fly wing. We find that our hydrodynamic description does not only account for polarity reorientation in wild type fly wings. Moreover, it is for the first time possible to also account for the observed polarity patterns in a number of genetically altered flies. / Eine wesentliche Voraussetzung für die Existenz mehrzelligen Lebens ist, dass sich einzelne Zellen sinnvoll zu Geweben ergänzen können. In dieser Dissertation untersuchen wir, wie großskalige Eigenschaften von Geweben aus dem kollektiven Verhalten einzelner Zellen hervorgehen. Dazu konzentrieren wir uns auf Epitheliengewebe, welches eine der Grundgewebearten in Tieren darstellt. Wir stellen theoretische Untersuchungen zu rheologischen Eigenschaften und zu zellulärer Polarität von Epithelien an. Diese theoretischen Untersuchungen vergleichen wir mit experimentellen Beobachtungen am sich entwickelnden Flügel der schwarzbäuchigen Taufliege (Drosophila melanogaster). Um die Mechanik von Epithelien zu untersuchen, entwickeln wir zunächst eine geometrische Beschreibung für die Verformung von zweidimensionalen zellulären Netzwerken. Unsere Beschreibung zerlegt die mittlere Verformung des gesamten Netzwerks in zelluläre Beitrage. Zum Beispiel wird eine Scherverformung des gesamten Netzwerks auf der zellulären Ebene exakt repräsentiert: einerseits durch die Verformung einzelner Zellen und andererseits durch topologische Veränderungen des zellulären Netzwerks. Mit Hilfe dieser Beschreibung quantifizieren wir die Verformung des Fliegenflügels während des Puppenstadiums. Des Weiteren führen wir die Verformung des Flügels auf ihre zellulären Beiträge zurück. Wir nutzen diese Beschreibung auch als Ausgangspunkt, um effektive rheologische Eigenschaften von Epithelien in Abhängigkeit von zellulären Fluktuationen zu untersuchen. Dazu simulieren wir Epithelgewebe mittels eines Vertex Modells, welches einzelne Zellen als elastische Polygone abstrahiert. Wir erweitern dieses Vertex Modell um zelluläre Fluktuationen und um die Möglichkeit, Schersimulationen beliebiger Dauer durchzuführen. Die Analyse des stationären Zustands dieser Simulationen ergibt plastisches Verhalten bei kleiner Fluktuationsamplitude und visko-elastisches Verhalten bei großer Fluktuationsamplitude. Neben mechanischen Eigenschaften untersuchen wir auch die Umorientierung einer Zellpolarität in Epithelien. Dazu entwickeln wir eine einfache hydrodynamische Beschreibung für die Umorientierung eines Polaritätsfeldes. Wir berücksichtigen dabei insbesondere Effekte durch Scherung, durch ein anderes Polaritätsfeld und durch einen lokalen Gleichrichtungseffekt. Um unsere theoretische Beschreibung mit experimentellen Daten zu vergleichen, entwickeln wir Methoden um Polaritätsmuster im Fliegenflügel zu quantifizieren. Schließlich stellen wir fest, dass unsere hydrodynamische Beschreibung in der Tat beobachtete Polaritätsmuster reproduziert. Das gilt nicht nur im Wildtypen, sondern auch in genetisch veränderten Tieren.

Diss. (sammanfattning) Umeå : Umeå universitet, 2010.

Diss. (sammanfattning) Umeå : Umeå universitet, 2010.

Chez les vertébrés, le battement coordonné des cils motiles présents par centaines à la surface apicale des cellules multiciliées (MCC) est requis pour propulser directionnellement les fluides biologiques à l’intérieur de certains organes (voies respiratoires, ventricules cérébraux, trompes utérines ou certaines structures embryonnaires). De nombreuses pathologies humaines sont associées à des défauts ciliaires ou à une perte des MCC (dyskinésies ciliaires, mucoviscidose, asthme,...). Dans ce contexte, mon travail de thèse a consisté à élucider les mécanismes complexes contrôlant la différenciation des MCC et donc la formation des cils motiles (multiciliogenèse). Par des approches de génomiques fonctionnelles à partir de deux modèles d’épithéliums multiciliés évolutivement éloignés (épithélium respiratoire humain et épiderme d’embryon de Xénope) nous avons identifié la famille des microARN (petits ARN non-codants régulateurs de l’expression génique) miR-449 comme majoritairement exprimée dans les MCC. Nous avons montré que miR-449 contrôle la multiciliogenèse i) en bloquant le cycle cellulaire, ii) en réprimant directement la voie de signalisation Notch et iii) en inhibant l’expression de la petite GTPase R-Ras. Enfin, nos travaux montrent que l’ensemble de ces mécanismes est conservé chez les vertébrés. En conclusion, miR-449 est un nouveau régulateur clé de la multiciliogenèse conservé au cours de l’évolution. Nos résultats pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques utilisant des petits ARN régulateurs dans le traitement de certaines pathologies associées à des défauts ciliaires. / In vertebrates, the coordinated beating of hundreds of motile cilia present at the apical surface of multiciliated cells (MCC) is required for propel directionally flow of biological fluids inside some organs (airways, cerebral ventricles, fallopian tubes or some embryonic structures). Many human diseases are associated with ciliary defects or loss of MCC (ciliary dyskinesia, cystic fibrosis, asthma ...). In this context, my thesis has sought to elucidate the complex mechanisms that control the differentiation of MCC and thus the formation of motile cilia (multiciliogenesis). By functional genomic approaches from two evolutionarily distant models of multiciliated epithelia (human respiratory epithelium and epidermis of Xenopus embryo) we identified the miR-449 family of microRNAs (small non-coding RNAs regulating gene expression) as mainly expressed in MCC. Then, we showed that miR-449 controlled multiciliogenesis by i) blocking the cell cycle ii) directly suppressing the Notch pathway and iii) by inhibiting the expression of the small GTPase R-Ras. Finally, we have demonstrated that all these mechanisms were conserved in vertebrates. In conclusion, miR-449 is a new key and conserved regulator of multiciliogenesis. Our findings could pave the way for new therapeutic strategies using small regulatory RNAs in the treatment of several diseases associated with ciliary defects.

In this study, we aimed to determine the levels of cytokines IL-1β, IL-4, IL-10, IFN-γ, MIF and VEGF in tears derived from healthy subjects. We tested cytokines as potential markers of inflammation for their potential use in clinical practice. Having reliable method for measuring cytokine levels in tears would enable an early diagnosis of eye diseases. In two phases, cytokines in tears of healthy individuals were analyzed using Bio-Plex Cytokine Assay (Bio-Rad). We assessed the suitability of methods for diagnostic purposes as well as the suitability of our selected cytokines. Statistically significant positive correlations of cytokines were confirmed: IL-10 with IFN-γ (r = 0,81), MIF with VEGF (r = 0,42 / r = 0,49), IL-1β with IL-10 (r = 0,52), IL-1β with IFN-γ (r = 0,55), IL-1β with VEGF (r = 0,38), IFN-γ with VEGF (r = 0,45) and IL-4 with VEGF (r = 0,48) in healthy subjects in tears. IL-4 (r = -0,37) and IFN-γ (r = -0,42) correlate negatively with age. In healthy individuals, there seem to be no differences with regard to gender, BMI, body fat, time of meal consumption prior to tear collection, eye strain when using a computer, dry eyes. Thus, studied cytokines are suitable for diagnostic purposes. Significant differences in concentrations of four (IL-1β, IL-10, IFN-γ a VEGF) of the five...