Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-29T13:14:34Z No. of bitstreams: 1 ana-paula-araujo.pdf: 1867740 bytes, checksum: ab9d7b2866753474ebe7ecb95d8e32d9 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-29T13:14:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ana-paula-araujo.pdf: 1867740 bytes, checksum: ab9d7b2866753474ebe7ecb95d8e32d9 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A eritropoetina (EPO) é um hormônio produzido, principalmente, pelos rins, que regula a produção de células vermelhas do sangue. Trata-se de uma glicoproteína com 166 aminoácidos, três sítios de N-glicosilação e um de O-glicosilação. Apresenta massa molecular na faixa de 30-34 kDa, sendo aproximadamente 40% correspondente aos glicídeos. A EPO está disponível como agente terapêutico produzido através da tecnologia do DNA recombinante em cultura de células de mamíferos. A EPO humana recombinante (rHuEPO) é usada para o tratamento de anemia associada à insuficiência renal crônica. Devido a relevância médica da rHuEPO, sua produção está sendo nacionalizada através do processo de transferência de tecnologia do Centro de Inmunología Molecular (CIM), de Cuba, para o Instituto de Tecnologia de Imunobiológicos (Bio-Manguinhos)/FIOCRUZ. O controle de qualidade sobre o processo produtivo da rHuEPO e seu produto final é bastante rigoroso. Neste contexto, o mapeamento peptídico é um dos mais importantes ensaios usados no controle em processo da produção de proteínas recombinantes. Este ensaio assegura a integridade da estrutura primária das proteínas ao final das etapas de suas purificações. Sendo assim, o objetivo desta dissertação de mestrado foi definir uma metodologia de mapeamento peptídico da rHuEPO, visando o controle de processo da produção deste biofármaco em Bio-Manguinhos. Previamente, a preparação da rHuEPO fornecida pelo CIM foi avaliada quanto a sua homogeneidade e caracterizadapor eletroforeses em gel de poliacrilamida, cromatografia de fase reversa, cromatofocalização eespectrometria de massa. Para obter os peptídeos da rHuEPO, a hidrólise enzimática desta glicoproteína com a enzima tripsina foi avaliada em diferentes tempos de incubação e com relações enzima/substrato distintas. O fracionamento dos peptídeos foi feito por cromatografia líquida de fase reversa em coluna C18, empregando-se diferentes colunas cromatográficas e gradientes de eluição. As principais frações peptídicas isoladas da cromatografia de fase reversa foram analisadas por espectrometria de massa a fim de comprovar a identidade dos peptídeostrípticos da rHuEPO. A especificidade da metodologia desenvolvida foi avaliada através da comparação dos perfis peptídicos do hidrolisado tríptico da rHuEPO e do quimotripsinogênio A. A hidrólise tríptica usando-se relação enzima/substrato de 1/50 (p/p), concentração de rHuEPO de 1 mg/mL e incubação de 1 hora a 37o C hidrolisou mais de 99% da glicoproteína. As colunas cromatográficas de fase reversa Hi-Pore RP 318, Vydac 218TP C18 e Delta Pak C18 se mostraram aptas para o fracionamento dos peptídeos trípticos da rHuEPO. Em comparação à metodologia usada no CIM, o tempo de incubação de hidrólise foi reduzido em, pelo menos,2 horas e a duração da corrida cromatográfica para obtenção do mapa peptídico diminuiu em, pelo menos, 1 hora e 42 minutos. Na análise por espectrometria de massa das frações isoladas da cromatografia de fase reversa, seis peptídeos trípticos da rHuEPO foram observados. Tais frações peptídicas foram identificadas como pertencentes à EPO humana pelo programa Mascot Search Results. Dessa forma, ficou estabelecida uma metodologia de mapeamento peptídico especifica, simples e rápida para ser utilizada no controle em processo da produção da rHuEPO em Bio-Manguinhos. / Erythropoietin (EPO) is a hormone produced mainly by the kidney that regulates the production of red blood cells. It is a glycoprotein with 166 amino acids, three N-glycosylation and one O-glycosylation sites. It has a molecular weight in the range of 30-34 kDa, being approximately 40% of its content corresponding to carbohydrates. EPO is available as a therapeutic agent produced by recombinant DNA technology in mammaliancell culture. The recombinant human EPO (rHuEPO) is used to treat anemia associated with chronic renal disease. Due to rHuEPO medical relevance, its production technology is a subject of transference from the Centro de Inmunología Molecular(CIM), Cuba, to the Instituto de Tecnologia em Imunonobiologicos(Bio-Manguinhos)/FIOCRUZ. The quality control over production process of rHuEPO and its final product is quite rigorous. In this context, peptidemapping is one of the most important tests used in process control of recombinant proteins production. This test ensures the primary structure integrity of a protein after its purification processes. Thus, the objective of this dissertation was to define a methodology for peptide mapping of rHuEPO aiming to be used in the process control of this biopharmaceutical production in Bio-Manguinhos. Previously, the preparation of rHuEPO provided by CIM was characterized by polyacrylamidegel electrophoresis, reversed phase chromatography, chromatofocusing and mass spectrometry. In order to obtain rHuEPO peptides, the enzymatic hydrolysis of this glycoprotein with the enzyme trypsin was assessed at differents incubation times and enzyme/substrate ratio. Peptides fractionation was performed by reverse phase liquid chromatography, using distincts C18 columns and elution gradients. The main peptide fractions from reversed phase chromatography were analyzed by mass spectrometry to confirm the identity of rHuEPO tryptic peptides. The specificity of the developed methodology was evaluated by comparing peptides profiles from rHuEPO and Chymotrypsinogen A tryptic hydrolysates. The tryptic digestion using enzyme/substrate ratio of 1/50 (w/w), substrate concentration of 1 mg/mL and incubation for 1 hour at 37°C hidrolysated more than 99% of the glicoprotein. The reversed phase columns Hi-Pore RP318, Vydac 218TP C18 e Delta Pak C18 were able to fractionate the rHuEPO tryptic peptides. Compared to the methodology used in CIM, the hydrolysis incubation time was reduced by at least 2 hours and the chromatographic running time to obtain the peptide map was decreased by at least 1 hour and 42 minutes. The mass spectrometry analysis of the fractions isolated from reversed-phase chromatography showed six tryptic peptides of rHuEPO. These peptide fractions were identified as belonging to human EPO by the program Mascot Search Results. Thus it was established an specific, simple and fast peptide mapping methodology to use in process control of rHuEPO in Bio-Manguinhos.

Introdução: Embora a anemia esteja associada a um pior prognóstico em pacientes com insuficiência cardíaca (IC), sua fisiopatologia ainda não está completamente esclarecida especialmente em pacientes estáveis em acompanhamento ambulatorial. A interação complexa entre as alterações do metabolismo do ferro, ação das citocinas inflamatórias, doença renal crônica e atividade da medula óssea em pacientes com IC permanece com controvérsias, sendo necessários mais estudos para seu esclarecimento. Objetivos: Explorar o metabolismo do ferro, hepcidina, fator de necrose tumoral (TNF)-a e eritropoetina (EPO) em pacientes com IC e acompanhamento ambulatorial com e sem anemia. Investigar se a capacidade funcional desses pacientes apresenta alguma associação com a presença de anemia ou alterações no metabolismo do ferro. Métodos: Foram avaliados pacientes com IC sistólica, estáveis, em acompanhamento ambulatorial, com e sem anemia (de acordo com critérios da Organização Mundial da Saúde), que realizaram avaliação clínica e laboratorial com a realização de exames para caracterização do metabolismo do ferro, incluindo receptor solúvel da transferrina (sTfR), também eritropoetina (EPO), taxa EPO observada/predita (O/P), TNF-a e hepcidina. Um subgrupo de pacientes realizou ergoespirometria para avaliação da capacidade funcional. Resultados: Foram incluídos 60 pacientes (38 com anemia, idade média 65 anos, fração de ejeção média 30% e 75% do sexo masculino). A maioria dos pacientes (69%) apresentou critérios compatíveis com deficiência de ferro, independente da presença de anemia. Os pacientes com IC e anemia apresentaram níveis de hepcidina e TNF-a maiores e taxa EPO O/P menores quando em comparação com o grupo de pacientes sem anemia. A saturação de transferrina (TSAT), o sTfR e a taxa EPO O/P apresentaram associação independente com a presença de anemia. No subgrupo de pacientes que foi submetido à avaliação ergoespirométrica houve uma tendência a um pico de VO2 menor nos pacientes com deficiência de ferro. Também foi observada uma correlação entre o pico de VO2 e a TSAT (r = 0,53; p = 0,01). Conclusões: Em pacientes com IC e anemia, estáveis e em acompanhamento ambulatorial a presença de deficiência de ferro e a produção atenuada de EPO são comuns. Uma melhor caracterização da anemia na IC pode apresentar impacto no desenvolvimento de novos alvos terapêuticos para proporcionar uma melhora funcional nesses pacientes.

Introdução: Embora a anemia esteja associada a um pior prognóstico em pacientes com insuficiência cardíaca (IC), sua fisiopatologia ainda não está completamente esclarecida especialmente em pacientes estáveis em acompanhamento ambulatorial. A interação complexa entre as alterações do metabolismo do ferro, ação das citocinas inflamatórias, doença renal crônica e atividade da medula óssea em pacientes com IC permanece com controvérsias, sendo necessários mais estudos para seu esclarecimento. Objetivos: Explorar o metabolismo do ferro, hepcidina, fator de necrose tumoral (TNF)-a e eritropoetina (EPO) em pacientes com IC e acompanhamento ambulatorial com e sem anemia. Investigar se a capacidade funcional desses pacientes apresenta alguma associação com a presença de anemia ou alterações no metabolismo do ferro. Métodos: Foram avaliados pacientes com IC sistólica, estáveis, em acompanhamento ambulatorial, com e sem anemia (de acordo com critérios da Organização Mundial da Saúde), que realizaram avaliação clínica e laboratorial com a realização de exames para caracterização do metabolismo do ferro, incluindo receptor solúvel da transferrina (sTfR), também eritropoetina (EPO), taxa EPO observada/predita (O/P), TNF-a e hepcidina. Um subgrupo de pacientes realizou ergoespirometria para avaliação da capacidade funcional. Resultados: Foram incluídos 60 pacientes (38 com anemia, idade média 65 anos, fração de ejeção média 30% e 75% do sexo masculino). A maioria dos pacientes (69%) apresentou critérios compatíveis com deficiência de ferro, independente da presença de anemia. Os pacientes com IC e anemia apresentaram níveis de hepcidina e TNF-a maiores e taxa EPO O/P menores quando em comparação com o grupo de pacientes sem anemia. A saturação de transferrina (TSAT), o sTfR e a taxa EPO O/P apresentaram associação independente com a presença de anemia. No subgrupo de pacientes que foi submetido à avaliação ergoespirométrica houve uma tendência a um pico de VO2 menor nos pacientes com deficiência de ferro. Também foi observada uma correlação entre o pico de VO2 e a TSAT (r = 0,53; p = 0,01). Conclusões: Em pacientes com IC e anemia, estáveis e em acompanhamento ambulatorial a presença de deficiência de ferro e a produção atenuada de EPO são comuns. Uma melhor caracterização da anemia na IC pode apresentar impacto no desenvolvimento de novos alvos terapêuticos para proporcionar uma melhora funcional nesses pacientes.

A eritropoietina (EPO) é um hormônio que pertence a um grupo de fatores de crescimento hematopoiético, controlando a proliferação e a diferenciação de células da medula óssea. Ela age induzindo a elevação da produção de células vermelhas, aumentando a quantidade de hemoglobina e o oxigênio circulante. Este hormônio é principalmente secretado pelo rim, e é amplamente usado na medicina no tratamento de anemias, desordens renais e cardíacas, tumores e diversas outras doenças. A EPO recombinante tem sido produzida em células de mamíferos (COS-1 e CHO) em culturas in vitro e tem sido expressa experimentalmente em células de insetos, leveduras e bactérias. Até o momento, há somente uma descrição da expressão transgênica desta proteína em plantas sem, no entanto, sucesso na regeneração de plantas saudáveis e férteis. No presente trabalho, plantas transgênicas de arroz (Oryza sativa) e tabaco (Nicotiana tabaccum) contendo o gene da EPO foram geradas, nas quais foi avaliada a expressão gênica e detectada a presença da proteína recombinante. O gene recombinante da EPO utilizado foi sintetizado baseado na técnica de “overlapping” de nucleotídeos. Um fragmento de 582 pb correspondente ao cDNA da EPO foi clonado e submetido a seqüenciamento automático. Uma mutação no nucleotídeo 252 (G A) foi identificada, o que não modificou o aminoácido codificado pelo códon, uma glicina. O fragmento foi transferido para o vetor de expressão pWUbi.tm1, o qual contém o promotor do gene da ubiquitina e o terminador tm1'. Este cassete de expressão foi transferido para o vetor binário pWBVec4a, que foi transformado nas cepas AGL1 e LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens. Estas cepas foram utilizadas na transformação de arroz e de tabaco, respectivamente. A integração do transgene no genoma da planta foi comprovada por PCR. A expressão da EPO nas plantas de tabaco foi detectada por RT-PCR convencional e quantitiativa, e a presença da proteína foi avaliada por SDS-PAGE e Western blot, provando o sucesso da obtenção de plantas transgênicas de tabaco expressando EPO. Foi obtida por auto-fecundação a geração T1, a qual apresentou segregação mendeliana. Nenhuma das plantas avaliadas apresentou qualquer tipo de deformidade ou mal-formação. Não foi possível a obtenção de plantas de arroz transgênicas devido à deficiência das mesmas no processo de regeneração, possivelmente em conseqüência da super-expressão do transgene em função do promotor escolhido. / Erythropoietin (EPO) is a hormone that belongs to a group of growth hematopoeitic factors, which control the proliferation and differentiation of marrow bone´s cells. It acts inducing the production of blood red cells, increasing the amount of circulating hemoglobin and oxygen. This hormone, mostly secreted by kidneys, is widely used in medicine as a treatment for anaemia, kidney and heart disorders, tumors and numerous diseases. Recombinant EPO has been produced in mammalian cells (COS-1 and CHO) cultured in vitro and has been also experimentally inserted into insect, yeast and bacterial cells. Up to now, to the best of our knowledge, there is only one description of transgenic expression of this protein in plants but without success in the generation of healthy, fertile plants. In the present work we evaluated the expression of human EPO in plants such as rice (Oryza sativa) and tobacco (Nicotiana tabaccum). The recombinant EPO gene was synthesized based on the nucleotide “overlapping” technique. A fragment of 582 bp corresponding to the EPO cDNA was cloned and then submitted to automatic sequencing. At that time, a mutation on nucleotide 252 (G A) was identified. It did not modify the encoded amino acid of the codon, a glycine. This fragment was transferred to the expression vector pWUbi.tm1, armed with the promoter of the ubiquitin gene and the terminator tm1’. This expression cassette was transferred to the binary vector pWBVec4a, which was then transformed into strains ALG1 and LB4404 of Agrobacterium tumefaciens. These strains were employed in the transformation of rice and tobacco, respectively. Transgenic integration into plant genomes was evaluated by PCR. The expression of EPO in tobacco plants was detected by conventional and quantitative RTPCR and the presence of the protein was evaluated by SDS-PAGE and western blot, successfully proving the generation of transgenic tobacco plants expressing EPO. By selfcrossing it was obtained a collection of T1 plants, which presented mendelian segregation of the transgene, and none of the plants presented any kind of miss-formation or deformity. It was not possible to obtain rice transgenic plants due to their deficiency in the regeneration process, possibly due to the transgene over-expression driven by the ubiquitin promoter.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / A anemia na Insuficiência Renal Crônica deve-se à redução da produção de eritropoetina, devido à diminuição da massa renal funcionante. A eritropoetina tem sido preconizada para o tratamento da anemia, no entanto, cerca de 5% dos pacientes são resistentes à mesma. A resistência à eritropoetina é definida como a necessidade do uso de uma dose maior que 12.000U/Kg por semana, sem atingir o hematócrito alvo de 33 a 36%. As citocinas pró-inflamatórias têm uma associação importante com a anemia resistente ao tratamento com eritropoetina(EPO). A pentoxifilina tem sido usada para inibir a produção dessas citocinas pró-inflamatórias. Este estudo foi realizado com os pacientes sob hemodiálise no Instituto de Nefrologia Ribamar Vaz, do Hospital da Santa Casa de Misericórdia de Maceió-AL. Os pacientes com diagnóstico de resistência à eritropoetina receberam pentoxifilina na dose de 400mg VO, após hemodiálise por seis meses. Avaliamos o hematócrito e a proteína C reativa (PCR) em 2 momentos: ao final de três meses com 12 pacientes e, ao final de seis meses, com 7 pacientes. A média de PCR dos 12 pacientes, no primeiro mês, foi de 5,65mg/l. No terceiro mês, de 2,58mg/l. Porém, no sexto mês, considerando apenas os 7 que terminaram o projeto, foi de 4,55mg/l. Não foi observada diferença significativa. A média final dos hematócritos(Htc) observada nos pacientes foi de 28,74 %. A média dos Htc na avaliação de seis meses que precederam o início do projeto, foi de 26,22%. Não foi observada diferença estatisticamente significante, quer nos 12 pacientes acompanhados por três meses ou nos 7 que conseguiram concluir o estudo. Não observamos correlação entre os níveis de PCR e os de hematócrito. No entanto, em nossa amostragem, a média de PCR basal não estava elevada e este pode ter sido um fator importante nos resultados díspares em relação aos dados da literatura. Sendo assim, concluímos que, em nossa amostra, não obtivemos benefícios com o uso da pentoxifilina. Porém, certamente se fazem necessários estudos mais amplos e controlados para que se possa chegar a conclusões que norteiem a indicação clínica desta droga como coadjuvante da EPO. / Anemia in End Stage Renal Disease occurs due to the reduction in the production of erythropoietin, caused by the decrease of the remaining renal mass. Erythropoietin has been indicated for the treatment of anemia; however, about 5% of the patients are resistant to it. Erythropoietin resistance makes it necessary to increase the dosage to more than 12000U/Kg/ per week, but without reaching the hematocrit target which should remain between 33 to 36%. The pro-inflammatory cytokines have an important association with the anemia resistant to erythropoietin treatment. Pentoxifylline has been used to inhibit the production of these pro-inflammatory cytokines. This study was carried out with patients on hemodialysis at the Ribamar Vaz Institute of Nephrology – at the Santa Casa de Misericórdia Hospital of Maceió. The patients with diagnosis of resistance to erythropoietin received pentoxifylline in the dosage of 400mg VO, after hemodialysis for six months. The hematocrit and protein C reactive (PCR) were analyzed twice: first at the end of three months with 12 patients and later at the end of six months, with 7 patients. The PCR average of the 12 patients in the first month was 5.65. In the third month it was 2.58. However, in the sixth month, just considering the 7 that finished the project, it was 4.55. No significant differences were observed. The final average of hematocrits observed in the patients was 28.74%. The HTC average, in the six-months evaluation that preceded the project, was 26.22%. No statistically-relevant differences were observed neither in the 12 patients followed for 3 months, nor in the 7 that had concluded the study. No correlations between the levels of PCR and HTC were observed. However, in our sampling, the average of basal PCR was not high and this might have been an important factor to explain the difference between our results and current literature. Therefore, we have concluded there were no benefits with the use of pentoxifylline. However, further studies, more comprehensive and accurate, are necessary in order to investigate the use of this drug as a support to EPO. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Introdução: Embora a anemia esteja associada a um pior prognóstico em pacientes com insuficiência cardíaca (IC), sua fisiopatologia ainda não está completamente esclarecida especialmente em pacientes estáveis em acompanhamento ambulatorial. A interação complexa entre as alterações do metabolismo do ferro, ação das citocinas inflamatórias, doença renal crônica e atividade da medula óssea em pacientes com IC permanece com controvérsias, sendo necessários mais estudos para seu esclarecimento. Objetivos: Explorar o metabolismo do ferro, hepcidina, fator de necrose tumoral (TNF)-a e eritropoetina (EPO) em pacientes com IC e acompanhamento ambulatorial com e sem anemia. Investigar se a capacidade funcional desses pacientes apresenta alguma associação com a presença de anemia ou alterações no metabolismo do ferro. Métodos: Foram avaliados pacientes com IC sistólica, estáveis, em acompanhamento ambulatorial, com e sem anemia (de acordo com critérios da Organização Mundial da Saúde), que realizaram avaliação clínica e laboratorial com a realização de exames para caracterização do metabolismo do ferro, incluindo receptor solúvel da transferrina (sTfR), também eritropoetina (EPO), taxa EPO observada/predita (O/P), TNF-a e hepcidina. Um subgrupo de pacientes realizou ergoespirometria para avaliação da capacidade funcional. Resultados: Foram incluídos 60 pacientes (38 com anemia, idade média 65 anos, fração de ejeção média 30% e 75% do sexo masculino). A maioria dos pacientes (69%) apresentou critérios compatíveis com deficiência de ferro, independente da presença de anemia. Os pacientes com IC e anemia apresentaram níveis de hepcidina e TNF-a maiores e taxa EPO O/P menores quando em comparação com o grupo de pacientes sem anemia. A saturação de transferrina (TSAT), o sTfR e a taxa EPO O/P apresentaram associação independente com a presença de anemia. No subgrupo de pacientes que foi submetido à avaliação ergoespirométrica houve uma tendência a um pico de VO2 menor nos pacientes com deficiência de ferro. Também foi observada uma correlação entre o pico de VO2 e a TSAT (r = 0,53; p = 0,01). Conclusões: Em pacientes com IC e anemia, estáveis e em acompanhamento ambulatorial a presença de deficiência de ferro e a produção atenuada de EPO são comuns. Uma melhor caracterização da anemia na IC pode apresentar impacto no desenvolvimento de novos alvos terapêuticos para proporcionar uma melhora funcional nesses pacientes.

A eritropoietina (EPO) é um hormônio que pertence a um grupo de fatores de crescimento hematopoiético, controlando a proliferação e a diferenciação de células da medula óssea. Ela age induzindo a elevação da produção de células vermelhas, aumentando a quantidade de hemoglobina e o oxigênio circulante. Este hormônio é principalmente secretado pelo rim, e é amplamente usado na medicina no tratamento de anemias, desordens renais e cardíacas, tumores e diversas outras doenças. A EPO recombinante tem sido produzida em células de mamíferos (COS-1 e CHO) em culturas in vitro e tem sido expressa experimentalmente em células de insetos, leveduras e bactérias. Até o momento, há somente uma descrição da expressão transgênica desta proteína em plantas sem, no entanto, sucesso na regeneração de plantas saudáveis e férteis. No presente trabalho, plantas transgênicas de arroz (Oryza sativa) e tabaco (Nicotiana tabaccum) contendo o gene da EPO foram geradas, nas quais foi avaliada a expressão gênica e detectada a presença da proteína recombinante. O gene recombinante da EPO utilizado foi sintetizado baseado na técnica de “overlapping” de nucleotídeos. Um fragmento de 582 pb correspondente ao cDNA da EPO foi clonado e submetido a seqüenciamento automático. Uma mutação no nucleotídeo 252 (G A) foi identificada, o que não modificou o aminoácido codificado pelo códon, uma glicina. O fragmento foi transferido para o vetor de expressão pWUbi.tm1, o qual contém o promotor do gene da ubiquitina e o terminador tm1'. Este cassete de expressão foi transferido para o vetor binário pWBVec4a, que foi transformado nas cepas AGL1 e LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens. Estas cepas foram utilizadas na transformação de arroz e de tabaco, respectivamente. A integração do transgene no genoma da planta foi comprovada por PCR. A expressão da EPO nas plantas de tabaco foi detectada por RT-PCR convencional e quantitiativa, e a presença da proteína foi avaliada por SDS-PAGE e Western blot, provando o sucesso da obtenção de plantas transgênicas de tabaco expressando EPO. Foi obtida por auto-fecundação a geração T1, a qual apresentou segregação mendeliana. Nenhuma das plantas avaliadas apresentou qualquer tipo de deformidade ou mal-formação. Não foi possível a obtenção de plantas de arroz transgênicas devido à deficiência das mesmas no processo de regeneração, possivelmente em conseqüência da super-expressão do transgene em função do promotor escolhido. / Erythropoietin (EPO) is a hormone that belongs to a group of growth hematopoeitic factors, which control the proliferation and differentiation of marrow bone´s cells. It acts inducing the production of blood red cells, increasing the amount of circulating hemoglobin and oxygen. This hormone, mostly secreted by kidneys, is widely used in medicine as a treatment for anaemia, kidney and heart disorders, tumors and numerous diseases. Recombinant EPO has been produced in mammalian cells (COS-1 and CHO) cultured in vitro and has been also experimentally inserted into insect, yeast and bacterial cells. Up to now, to the best of our knowledge, there is only one description of transgenic expression of this protein in plants but without success in the generation of healthy, fertile plants. In the present work we evaluated the expression of human EPO in plants such as rice (Oryza sativa) and tobacco (Nicotiana tabaccum). The recombinant EPO gene was synthesized based on the nucleotide “overlapping” technique. A fragment of 582 bp corresponding to the EPO cDNA was cloned and then submitted to automatic sequencing. At that time, a mutation on nucleotide 252 (G A) was identified. It did not modify the encoded amino acid of the codon, a glycine. This fragment was transferred to the expression vector pWUbi.tm1, armed with the promoter of the ubiquitin gene and the terminator tm1’. This expression cassette was transferred to the binary vector pWBVec4a, which was then transformed into strains ALG1 and LB4404 of Agrobacterium tumefaciens. These strains were employed in the transformation of rice and tobacco, respectively. Transgenic integration into plant genomes was evaluated by PCR. The expression of EPO in tobacco plants was detected by conventional and quantitative RTPCR and the presence of the protein was evaluated by SDS-PAGE and western blot, successfully proving the generation of transgenic tobacco plants expressing EPO. By selfcrossing it was obtained a collection of T1 plants, which presented mendelian segregation of the transgene, and none of the plants presented any kind of miss-formation or deformity. It was not possible to obtain rice transgenic plants due to their deficiency in the regeneration process, possibly due to the transgene over-expression driven by the ubiquitin promoter.

A eritropoietina (EPO) é um hormônio que pertence a um grupo de fatores de crescimento hematopoiético, controlando a proliferação e a diferenciação de células da medula óssea. Ela age induzindo a elevação da produção de células vermelhas, aumentando a quantidade de hemoglobina e o oxigênio circulante. Este hormônio é principalmente secretado pelo rim, e é amplamente usado na medicina no tratamento de anemias, desordens renais e cardíacas, tumores e diversas outras doenças. A EPO recombinante tem sido produzida em células de mamíferos (COS-1 e CHO) em culturas in vitro e tem sido expressa experimentalmente em células de insetos, leveduras e bactérias. Até o momento, há somente uma descrição da expressão transgênica desta proteína em plantas sem, no entanto, sucesso na regeneração de plantas saudáveis e férteis. No presente trabalho, plantas transgênicas de arroz (Oryza sativa) e tabaco (Nicotiana tabaccum) contendo o gene da EPO foram geradas, nas quais foi avaliada a expressão gênica e detectada a presença da proteína recombinante. O gene recombinante da EPO utilizado foi sintetizado baseado na técnica de “overlapping” de nucleotídeos. Um fragmento de 582 pb correspondente ao cDNA da EPO foi clonado e submetido a seqüenciamento automático. Uma mutação no nucleotídeo 252 (G A) foi identificada, o que não modificou o aminoácido codificado pelo códon, uma glicina. O fragmento foi transferido para o vetor de expressão pWUbi.tm1, o qual contém o promotor do gene da ubiquitina e o terminador tm1'. Este cassete de expressão foi transferido para o vetor binário pWBVec4a, que foi transformado nas cepas AGL1 e LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens. Estas cepas foram utilizadas na transformação de arroz e de tabaco, respectivamente. A integração do transgene no genoma da planta foi comprovada por PCR. A expressão da EPO nas plantas de tabaco foi detectada por RT-PCR convencional e quantitiativa, e a presença da proteína foi avaliada por SDS-PAGE e Western blot, provando o sucesso da obtenção de plantas transgênicas de tabaco expressando EPO. Foi obtida por auto-fecundação a geração T1, a qual apresentou segregação mendeliana. Nenhuma das plantas avaliadas apresentou qualquer tipo de deformidade ou mal-formação. Não foi possível a obtenção de plantas de arroz transgênicas devido à deficiência das mesmas no processo de regeneração, possivelmente em conseqüência da super-expressão do transgene em função do promotor escolhido. / Erythropoietin (EPO) is a hormone that belongs to a group of growth hematopoeitic factors, which control the proliferation and differentiation of marrow bone´s cells. It acts inducing the production of blood red cells, increasing the amount of circulating hemoglobin and oxygen. This hormone, mostly secreted by kidneys, is widely used in medicine as a treatment for anaemia, kidney and heart disorders, tumors and numerous diseases. Recombinant EPO has been produced in mammalian cells (COS-1 and CHO) cultured in vitro and has been also experimentally inserted into insect, yeast and bacterial cells. Up to now, to the best of our knowledge, there is only one description of transgenic expression of this protein in plants but without success in the generation of healthy, fertile plants. In the present work we evaluated the expression of human EPO in plants such as rice (Oryza sativa) and tobacco (Nicotiana tabaccum). The recombinant EPO gene was synthesized based on the nucleotide “overlapping” technique. A fragment of 582 bp corresponding to the EPO cDNA was cloned and then submitted to automatic sequencing. At that time, a mutation on nucleotide 252 (G A) was identified. It did not modify the encoded amino acid of the codon, a glycine. This fragment was transferred to the expression vector pWUbi.tm1, armed with the promoter of the ubiquitin gene and the terminator tm1’. This expression cassette was transferred to the binary vector pWBVec4a, which was then transformed into strains ALG1 and LB4404 of Agrobacterium tumefaciens. These strains were employed in the transformation of rice and tobacco, respectively. Transgenic integration into plant genomes was evaluated by PCR. The expression of EPO in tobacco plants was detected by conventional and quantitative RTPCR and the presence of the protein was evaluated by SDS-PAGE and western blot, successfully proving the generation of transgenic tobacco plants expressing EPO. By selfcrossing it was obtained a collection of T1 plants, which presented mendelian segregation of the transgene, and none of the plants presented any kind of miss-formation or deformity. It was not possible to obtain rice transgenic plants due to their deficiency in the regeneration process, possibly due to the transgene over-expression driven by the ubiquitin promoter.

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-14T17:12:41Z No. of bitstreams: 1 luciana-carreiras-norte.pdf: 1395438 bytes, checksum: 31a432f41d7dee6ad0313c1c37736102 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-14T17:12:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 luciana-carreiras-norte.pdf: 1395438 bytes, checksum: 31a432f41d7dee6ad0313c1c37736102 (MD5) Previous issue date: 2007 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Nesta avaliação, realizaram-se ensaios cromatográficos de purificação de eritropoetina humana recombinante, a partir do sobrenadante de cultura de células de mamíferos da linhagem CHO (células de ovário de hamster chinês), produtoras deste biofármaco. Compararam-se as membranas comerciais de troca iônica Sartobind (MA) Q e D, com o objetivo de avaliar a sua aplicabilidade a processos de purificação de EPO. Ambas as membranas apresentaram-se capazes de adsorver EPO nas condições avaliadas. EPO foi detectada nas amostrasde eluído de ambas as membranas, tendo-se verificado que o imunoensaio dotipo dot-blotfoi aquele que forneceu as informações mais conclusivas. Já nas análises de eletroforese, verificou-se um perfil difuso das bandas do eluído das membranas, o que foi creditado à heterogeneidade glicídica da EPO, como anteriormente demonstrado na literatura. / In the present work, the purification of recombinant human erythropoietin (rhEPO) from CHO (Chinese hamster ovary) cell culture supernatant was investigated using anion-exchange chromatography. Commercial membrane adsorbers (Sartobind D and Q) were compared, with the aim of evaluating their aplicability to EPO purification processes. Both membranes were able to adsorb EPO under the conditions evaluated in this work. EPO was detected in the eluate of both membranes. The immunoassay dot-blot was the most interesting analytical tool, giving the most conclusive results. Electrophoretic analyses showeda diffuse band, probably due to glycan heterogeneity in the EPO molecules, as previously reported in the literature.

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-29T17:53:07Z No. of bitstreams: 1 ana-rodrigues-de-andrade.pdf: 2209967 bytes, checksum: daf5f7b7ad34996e5a40131114f4b681 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-29T17:53:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ana-rodrigues-de-andrade.pdf: 2209967 bytes, checksum: daf5f7b7ad34996e5a40131114f4b681 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A eritropoetina é o hormônio responsável pela regulação da produção de células vermelhas. A eritropoetina humana recombinante (rhEPO) produzida em laboratório e usada como medicamento pode apresentar as isoformas alfa e beta, chamadas de alfaepoetina e betaepoetina humana recombinante. O tratamento com rhEPO melhora bastante a vida de pacientes anêmicos e/ou em diálise, reduzindo a necessidade de transfusão de sangue. A grande demanda por este biofármaco justifica o esforço de pesquisa não só para conhecimento de seus mecanismos de ação e desenvolvimento de processos de produção, como também para controle da qualidade do produto. É de grande importância o desenvolvimento de métodos de análise que diminuam a margem de erro e aumentem a precisão e a confiabilidade dos resultados, além de reduzir o tempo de liberação para o mercado. O ensaio de determinação da potência da alfaepoetina humana recombinante produzida por Bio-Manguinhos é realizado pelo método de camundongos normocitêmicos, com contagem de reticulócitos por microscopia. Estemétodo de contagem é demorado, pouco preciso e desgastante para o analista. O objetivo deste trabalho é estudar o uso do método de citometria de fluxo na contagem de reticulócitos para o ensaio de potência da alfaepoetina humana recombinante. Visando a implantação do método no Departamento de Controle de Qualidade (DEQUA) de Bio-Manguinhos, o desenvolvimento deste trabalho teve também como objetivo comparar a sua eficácia em relação aoprocesso atualmente utilizado, e a realizar os testes necessários à sua validação. Os camundongos foram inoculados com três doses diferentes de amostra ou material de referência e os reticulócitos presentes no sangue coletado foram marcados com o corante fluorescente laranja de tiazol (Retic-COUNT). Os reticulócitos foram contados em citômetro de fluxo FACSCalibur e seu percentual foi utilizadopara a determinação da potência de acordo com os cálculos da Farmacopéia Européia 6ª edição. Para a comparação entre os métodos, vinte lotes de alfaepoetina humana recombinante produzidos por Bio-Manguinhos tiveram sua potência determinada pela contagem de reticulócitos por citometria e microscopia. Para a determinação da repetitividade e da precisão intermediária, foi utilizado um único lote de alfaepoetina humana recombinante. Para avaliar a concordância entre os métodos de citometria de fluxo e microscopia, foi utilizado o teste estatístico de Bland-Altman, com comparação dos vinte resultados obtidoscom os mesmo lotes, analisados a partir das mesmas amostras de sangue. Os resultados apresentaram boa repetitividade e precisão intermediária e mostraram que os métodos são equivalentes no que diz respeitoà determinação da potencia da rhEPO produzida por Bio-Manguinhos. No entanto, em funçãoda alta probabilidade de erros associados ao método de microscopia, a introdução da citometria de fluxo mostra-se uma alternativa bastante promissora para suprir a demanda de testes com precisão, reprodutibilidade e maior velocidade de liberação de lotes. / Erythropoietin is the hormone responsible for the regulation of the red cells’ production. The recombinant human erythropoietin (rhEPO) produced in laboratory and used as a drug exists in the alpha and beta isoforms, called alpha epoietin and beta epoietin. The treatment with rhEPO improves the life of anemic patients and/or on dialysis, reducing the need for blood transfusion. The high demand for this biopharmaceutical product justifies the research effort not only for the knowledge of its mechanisms of action and development of production processes, but also for the product quality control. The development of quality control methods able to reduce errors and increase the accuracy and the reliability of the results, along with a reduction in the release timeto the market, is of great importance. The assay to determine the biological activity of the recombinant human alpha epoietin produced in Bio-Manguinhos is performed bythe normocythaemic mice method and reticulocyte counting by microscopy. This counting method is time consuming, imprecise and stressful to the analyst. The present study aimed to study the use of the flow cytometric method for reticulocyte counting in the biological activity assay for the human alpha epoietin. Intending to implement this new method in the Quality Control Department of Bio-Manguinhos, this work also compared its effectiveness with the currently used method, and the tests required to its validation were performed. The mice were inoculated with three different dosesof sample and reference material, and the reticulocytes on the collected blood were stained with the fluorescent dye thiazole orange (Retic-COUNT). The reticulocytes were counted in a FACSCalibur flow cytometer and their percentage was used for the biological activity determination in accordance with the European Pharmacopoeia 6 th edition. To compare the methods, the biological activity of twenty batches of recombinant human alpha epoetin produced by Bio-Manguinhos was determined trough both cytometry and microscopy. Tothe determination of repeatability and intermediate precision, only a single batch of recombinant human alpha epoetin was used. For the evaluation of agreement between both methods, the Bland-Altman test was used to the compare the twenty results obtained from the same batches, analyzed from the same blood samples. The results showed good repeatability and intermediate precision and indicated that the two methods are equivalent when it concerns thedetermination of the rhEPO biological activity. However, due to the high probability of errors associated with the microscopy method, the introduction of the flow cytometry method seems to be a promising alternative to meet the demand for analyses with precise and reproducible results, along with a good speed in releasing batches for the market.