A fragmentação do DNA espermático é uma das principais causas de infertilidade nos machos. Alterações na integridade do DNA podem ser decorrentes da ação de espécies reativas de oxigênio (EROS), de defeitos na protaminação e da apoptose. A sensibilidade do espermatozoide ovino frente as biotecnologias reprodutivas pode ser resultado de uma alta suscetibilidade a ação de EROS ou alterações na protaminação espermática desencadeadas por estresse oxidativo induzido por estresse térmico, tornando o espermatozoide mais suscetível a fragmentação de DNA. Com o objetivo de entender mais este processo, foi realizado um primeiro experimento para avaliar o status oxidativo, os atributos espermáticos e a expressão gênica de proteínas envolvidas nos processos de protaminação em diferentes níveis de suscetibilidade a peroxidação lipídica (baixo, médio, alto e altíssimo) em sêmen ovino. Foi observado um aumento da atividade enzimática da glutationa peroxidase e uma diminuição da atividade enzimática da glutationa redutase no plasma seminal no grupo com suscetibilidade a peroxidação lipídica alta e altíssima. Com relação a catalase, não foi verificado esse aumento, no entanto houve maior imunodetecção desta enzima. Em relação a condição espermática, observou-se um aumento na porcentagem de defeitos totais e lesões nas membranas acrossomal e plasmática, além de porcentagens menores de espermatozoides com baixo potencial de membrana mitocondrial no grupo com maior suscetibilidade a peroxidação lipídica. Este mesmo grupo também apresentou alta suscetibilidade ao dano da cromatina e aumento do número de cópias do gene da protamina 1 (PRM1) em espermatozoides. O segundo experimento avaliou os atributos de espermatozoides provenientes do ejaculado e do epidídimo frente ao estresse térmico induzido por insulação testicular (tratado), assim como as relações com o status antioxidante. Observou-se diminuição da motilidade, vigor, turbilhonamento e aumento na porcentagem de defeitos maiores e menores, e de lesões na membrana acrossomal e plasmática em espermatozoides ejaculados no grupo tratado. Essas diferenças não foram observadas em espermatozoides epididimais. Uma maior atividade enzimática da glutationa peroxidase e da glutationa redutase foi observada no plasma seminal do grupo tratado. Foi verificado uma diminuição de espermatozoides com alto potencial de membrana mitocondrial no grupo tratado, indicando que o metabolismo mitocondrial parece estar envolvido no quadro de estresse oxidativo. Um terceiro estudo foi conduzido para verificar o efeito do estresse térmico na integridade da cromatina espermática, na protaminação do DNA espermático e na ativação de vias apoptóticas em testículo ovino. Em espermatozoides provenientes do ejaculado, houve um aumento da porcentagem de células com suscetibilidade a fragmentação da cromatina no grupo tratado; não observado em espermatozoides epididimais. Uma alta porcentagem de espermatozoides com fragmentação de DNA grau III (ensaio COMETA) e aumento do número de cópias de mRNA da proteína de transição 1 (TNP1) em espermatozoides provenientes do ejaculado, foi observada no grupo tratado. Já em espermatozoides provenientes do epidídimo, a PRM1 apresentou maior expressão no 30ο dia do ciclo espermático comparado a 7ο dia, enquanto que a TNP1 comportou-se de maneira contrária. Em relação a ativação de vias apoptóticas em testículo ovino, a proteína anti-apoptótica Bax foi imuno-identificada em espermatócitos e a Blc-2 em espermátides, sem diferença entre os grupos. Em conclusão, a alta susceptibidade dos espermatozoides ovinos a peroxidação lipídica altera o status oxidativo ocasionando um quadro de estresse oxidativo, principal causador de dano a cromatina. Adicionalmente, o estresse oxidativo induzido por estresse térmico prejudica os atributos espermáticos e aumenta a suscetibilidade dos espermatozoides a fragmentação de DNA. / Sperm DNA fragmentation is referred as one of the main causes of male\'s infertility. Among the etiologies of abnormalities on DNA integrity the action of reactive oxygen species (ROS), protamination failures and apoptosis are considered the most important. The known sensitivity of ram´s sperm to reproductive biotechnologies could be a result of a higher susceptibility to the action of ROS or changes in sperm protamination triggered by oxidative stress induced by heat stress. This would increase the susceptibility of sperm DNA to fragmentation. Initially, the ram sperm quality, seminal protamine gene expression and oxidative status were evaluated in semen samples of different levels of susceptibility to lipid peroxidation (low, medium, high and very high). There was an increase on glutathione peroxidase and decreased glutathione reductase enzymes' activity in groups with high and very high susceptibility to lipid peroxidation. However, only catalase showed increased immunodetection. An increase on total defects and damaged acrosomal and plasmatic membranes were observed in the group showing the highest susceptibility to lipid peroxidation. Also, the percentage of sperm with low mitochondrial membrane potential, the percentage of sperm susceptible to chromatin damage and the number of copies of protamine 1 (PRM1) mRNA were increased in the group showing higher susceptibility to lipid peroxidation. The second study evaluated sperm\'s attributes from the epididymis and ejaculated sperm subjected to heat stress induced by testicular insulation (treated group), as well as correlations with the antioxidant status. We observed decrease on motility, vigor, and mass motility and increase on the percentages of sperm showing major and minor defects, and damaged plasma and acrosome membranes in the treated group. These differences were not observed in epididymal sperm. Increased enzymatic activities of glutathione peroxidase and glutathione reductase were observed in the treated group. Mitochondrial metabolism appeared to be involved in the oxidative homeostasis imbalance. This was effectively observed by a decrease on the percentage of sperm with high mitochondrial membrane potential in the treated group. A third study was conducted to determine the effect of heat stress induced by testicular insulation on the integrity of chromatin, protamination and apoptotic activation pathway in ram testis. An increase on the percentage of sperm with susceptibility to chromatin fragmentation in the treated group was observed. However, the previous findings were not observed in epididymal sperm. A higher percentage of sperm showing DNA fragmentation level III (Comet assay) and an increase on the number of copies of transition protein 1(TNP1) mRNA were observed in the treated group. In epididymal sperm, a higher expression of the PMR1 gene was observed on the 30th day of the espermatogenic cycle, while TNP1 behaved contrarily. In the testicular samples, the anti-apoptotic protein Bax was detected only in spermatocytes while Bcl-2 was observed singularly in spermatids, with no difference between groups. In conclusion, the disruption of oxidative homeostasis may be exacerbated by the higher susceptibility of ram\'s sperm to lipid peroxidation, which could be the main etiology of chromatin damage. In addition, oxidative stress induced by heat stress impairs sperm attributes and DNA integrity.

O objetivo deste trabalho foi avaliar mediante testes in vitro as características espermáticas de partidas de sêmen bovino e o impacto sobre a fertilidade quando utilizadas em um programas de IATF. Foram realizados 4 experimentos que serão descritos em forma de artigos científicos. No artigo 1 comparam-se a qualidade do sêmen determinada por métodos subjetivos e objetivos para a análise espermática in vitro de partidas de sêmen bovino. Foram analisadas 80 partidas de sêmen de dois touros, através de análises convencionais (motilidade subjetiva, vigor e morfologia espermática), de acordo com os resultados foram estabelecidos 3 grupos: Alta qualidade (A), Boa qualidade (B) e Qualidade questionável (Q). Posteriormente foram analisados os resultados das análises objetivas usando sondas fluorescentes por microscopia de epifluorescência para determinar a integridade de membranas plasmática, acrossomal e potencial de membrana mitocondrial (%PIAIA); e usando o sistema computadorizado de avaliação da motilidade espermática (CASA), o efeito foi avaliado mediante ANOVA e Tukey 5%. Posteriormente, foram utilizadas 67 partidas para determinar a concordância em determinar a qualidade seminal de acordo com três métodos de avaliação seminal: (1) Análise subjetiva considerando a Motilidade subjetiva, vigor e morfologia espermática (2) Análise pelo CASA levando em consideração a MT, VCL, VSL e VAP e (3) Análise por sondas fluorescentes considerando a %PIAIA. Foram realizadas análises de correlação de Pearson e análise de concordância (significância do Kappa). No artigo 2 foram utilizadas 18 partidas de sêmen classificadas de acordo com o índice de fertilidade de cada touro em dois grupos: de Alta (n=9) e Baixa fertilidade (n=9). A classificação do escore foi proporcionada pela central com base em dados provenientes de 33.198 serviços por IATF. As partidas foram submetidas às análises convencionais, CASA, análise por sondas fluorescentes para avaliar a porcentagem de PIAIA em microscopia de epifluorescência e produção de marcadores mitocondriais por sondas fluorescentes na citometria de fluxo. Foram realizadas análises de correlação de Pearson todas as características espermáticas e os efeitos entre grupos de fertilidade foram avaliados mediante ANOVA e Tukey 5%. No artigo 3 o objetivo determinar a relação entre qualidade espermática medida pela produção de marcadores mitocondriais e integridade das estruturas espermáticas com a taxa de prenhez (TP%) resultante de um programa de inseminação artificial e tempo fixo (IATF). Neste estudo, 29 partidas de sêmen convencional usadas para inseminar 4.795 vacas da raça Nelore submetidas ao mesmo protocolo de IATF, e após o diagnóstico de prenhez foram classificadas em três grupos: Alta fertilidade (A) com TP ≥60%, Média fertilidade (M) TP entre 53,0 e 59,9% e de Baixa fertilidade (B) TP <52,2%. Doses de sêmen das mesmas partidas foram descongeladas a 37°C durante 30 segundos e submetidas às análises convencionais, CASA, análise por sondas fluorescentes para avaliar a porcentagem de PIAIA em microscopia de epifluorescência e produção de marcadores mitocondriais por sondas fluorescentes na citometria de fluxo. Foram realizadas análises de correlação de Spearman para todas as características espermáticas e os efeitos entre grupos de fertilidade foram avaliados mediante ANOVA e Tukey 5%. No artigo 4 o objetivo foi determinar as subpopulações pela morfometria espermática em partidas de sêmen com diferente escore de fertilidade. Foram utilizadas 13 partidas de sêmen de 6 touros, sendo três touros de alto escore de fertilidade (n=9) e três de baixo escore de fertilidade (n=9). Duas palhetas de cada partida foram descongeladas e uma alíquota foi depositada em formol salino (4%) e posteriormente foi feito a análise por gota húmida para aquisição de 200 imagens da cabeça espermática que foram processadas pelo programa Imagem J para determinação da morfometria, os dados foram submetidos a análise multivariada de agrupamento para formação de subpopulações pelo método de Wards e posteriormente o efeito do grupo de fertilidade foi avaliado por ANOVA e Tukey 5%. Os resultados mostraram que os marcadores da função mitocondrial são bons indicadores da função e qualidade espermática; no entanto a heterogeneidade do sêmen bovino, com subpopulações espermáticas com boa e má qualidade, varia entre touros e entre partidas do mesmo touro e gera confusão na resposta de algumas análises. Determinou-se também, que a presença de subpopulações espermáticas (SBP) com variação na morfometria da cabeça (SBP1, SBP2, SBP3 e SBP4), sendo que a SBP4 foi associada com baixo escore de fertilidade. A conclusão geral é que a qualidade seminal impacta na fertilidade in vivo em bovinos. Sendo que a morfometria da cabeça espermática e funcionalidade das mitocôndrias teve maior impacto. No entanto, todas as características de qualidade espermática devem ser avaliadas em conjunto para determinar o potencial de fertilidade de uma amostra seminal. / The objective of this study was to evaluate the sperm characteristics of bovine semen and the impact on fertility when used in an IATF program. Four experiments were carried out and described in the form of scientific articles. In article 1. We compared the semen quality determined by subjective and objective methods for the in vitro sperm analysis of bovine semen. According to the results, three groups were analyzed: high quality (A), good quality (B) and high quality (A), Questionable quality (Q). Subsequently, the results of objective analyzes using fluorescence probes by epifluorescence microscopy were analyzed to determine the integrity of plasma, acrosomal membrane and mitochondrial membrane potential (% PIAIA); And using the computerized sperm motility evaluation system (CASA), the effect was evaluated using ANOVA and Tukey 5%. Afterwards, 67 matches were used to determine the agreement to determine seminal quality according to three methods of seminal evaluation: (1) Subjective analysis considering subjective motility, vigor and sperm morphology (2) Analysis by CASA taking into consideration the TM, VCL, VSL and VAP and (3) Analysis by fluorescent probes considering % PIAIA. Pearson correlation analysis and concordance analysis (Kappa significance) were performed. In article 2, 18 sets of semen were classified according to the fertility index of each bull in two groups: High fertility (n = 9) and Low fertility (n = 9). The classification of the score was provided by the central office based on data from 33,198 services by IATF. The semen were subjected to conventional analyzes, CASA, fluorescent probe analysis to evaluate the percentage of PIAIA in epifluorescence microscopy and production of mitochondrial markers by fluorescent probes in flow cytometry. Pearson correlation analyzes were performed on all sperm characteristics and effects between fertility groups were evaluated using ANOVA and Tukey 5%. In article 3 the objective was to determine the relationship between sperm quality measured by the production of mitochondrial markers and the integrity of the spermatic structures with the pregnancy rate (TP%) resulting from an artificial insemination and fixed time (IATF) program. In this study, 29 departures of conventional semen used to inseminate 4,795 Nelore cows submitted to the same IATF protocol, and after diagnosis of pregnancy were classified into three groups: High fertility (A) with TP ≥ 60%, Average fertility ( M) TP between 53.0 and 59.9% and Low fertility (B) TP <52.2%. Semen doses of the same departures were thawed at 37 ° C for 30 seconds and subjected to conventional, CASA, fluorescent probe analysis to evaluate the percentage of PIAIA in epifluorescence microscopy and production of mitochondrial markers by fluorescent probes in flow cytometry. Spearman correlation analyzes were performed on all sperm characteristics and effects between fertility groups were evaluated using ANOVA and Tukey 5%. In article 3, 18 sets of semen were classified according to the fertility index of each bull in two groups: High (n = 9) and Low fertility (n = 9). The classification of the score was provided by the central office based on data from 33,198 services by IATF. The matches were subjected to conventional analyzes, CASA, fluorescent probe analysis to evaluate the percentage of PIAIA in epifluorescence microscopy and production of mitochondrial markers by fluorescent probes in flow cytometry. Pearson correlation analyzes were performed on all sperm characteristics and effects between fertility groups were evaluated using ANOVA and Tukey 5%. In article 4 the objective was to determine subpopulations by sperm morphometry in semen matches with different fertility scores. Seventeen sets of six bulls were used, three bulls with a high fertility score (n = 9) and three with a low fertility score (n = 9). Two straws of each set were thawed and an aliquot was deposited in saline formaldehyde (4%) and then the wet analysis was performed to acquire 200 images of the spermatic head that were processed by the Image J program to determine morphometry, the data were submitted to a multivariate cluster analysis for clusters by the Ward\'s method and later the effect of the fertility group was evaluated by ANOVA and Tukey 5%. The results showed that markers of mitochondrial function are good indicators of sperm function and quality; However, the heterogeneity of bovine semen, with good and poor quality sperm subpopulations, varies between bulls and between straws and creates confusion in the response of some analyzes. It was also determined that the presence of sperm subpopulations (SBP) with variation in head morphometry (SBP1, SBP2, SBP3 and SBP4), and SBP4 was associated with a low fertility score. The overall conclusion is that seminal quality influences in vivo fertility in cattle. Being that the morphometry of the spermatic head and functionality of the mitochondria had greater impact. However, all sperm quality characteristics should be evaluated together to determine the fertility potential of a seminal sample.

A filogenia dos diferentes grupos de Cnidaria permanece de certa forma pouco resolvida, uma vez que não há um consenso de quais são as relações entre as diferentes classes e ordens que compõem o filo. A espermiotaxonomia vem sendo utilizada como critério filogenético em diversos grupos de Metazoa. Para Cnidaria são poucos os trabalhos descrevendo a morfologia do sistema reprodutor masculino e do espermatozoide em nível de microscopia de luz e de microscopia eletrônica de transmissão. Exemplares das espécies Tamoya haplonema e Chiropsalmus quadrumanus (Cubozoa), Lychnorhiza lucerna e Chrysaora lactea (Scyphozoa), foram coletados próximos ao Centro de Biologia Marinha da Universidade de São Paulo e junto às bases do Instituto Oceanográfico da USP (Base de Cananéia e Base de Ubatuba) nos meses de agosto a outubro de 2014 e de abril a junho de 2015. Amostras das espécies Carukia barnesi, Chironex fleckeri e Chiropsella bronzie (Cubozoa) e Cassiopea sp. (Scyphozoa) foram coletadas ao longo da costa leste australiana de março a maio de 2016. Para a descrição histológica e histoquímica da gônada masculina, amostras do tecido gonadal foram fixadas em paraformaldeído 4% preparado com água do local da coleta e tampão fosfato de sódio 0,2M por 24 horas e as amostras foram processadas de acordo com o protocolo para historesina. Fragmentos da gônada masculina foram fixados em solução Karnovsky modificado (glutaraldeído 2,5% e 0,08% de paraformaldeído em tampão cacodilato de sódio 0,1 M, pH 7,4) e solução de Glutaraldeído (2.5% glutaraldeido em tampão cacodilato de sódio 0.1M em água do mar filtrada a vácuo, pH 7.2-7.4). Em seguida as amostras foram processadas de acordo com protocolo de microscopia eletrônica transmissão. Na presente dissertação é descrito de forma comparada o processo de espermatogênese dos cubozoários T. haplonema e C. quadrumanus através da histologia e histoquímica evidenciando o ciclo gonadal de ambos (capítulo 1). Descreve-se a espermatogênese e morfologia do espermatozoide, através da microscopia de luz e ultraestrutura para as espécies de Cubozoa T. haplonema, C. quadrumanus, Carukia barnesi, Chironex fleckeri e Chiropsella bronzie (Capítulo 2). Para as espécies de Scyphozoa Lychnorhiza lucerna, Chrysaora lactea e Cassiopea sp. descreve-se o processo de espermatogênese através da microscopia de luz e da microscopia eletrônica de transmissão, além do aspecto macroscópico da gônada masculina (Capítulo 3). Adicionalmente, nas considerações finais, é ressaltada a morfologia comparada dos espermatozoides de todas as espécies aqui estudadas evidenciando possíveis características únicas de cada classe, enumerando eventuais caracteres diagnósticos dos espermatozoides das espécies estudadas (Capítulo 4) / The phylogeny of the different groups of cnidarians remains elusive, since there is no consensus of what are the relationships between the different classes and orders that comprise the phylum. The spermiotaxonomy has been used as phylogenetic criteria in different groups of Metazoa. For Cnidaria there are few studies describing the morphology of the male reproductive system and sperm at the level of light microscopy and transmission electron microscopy. Specimens of the species Tamoya haplonema and Chiropsalmus quadrumanus (Cubozoa), Lychnorhiza lucerna and Chrysaora lactea (Scyphozoa), were collected near the Marine Biology Center of the University of São Paulo and near the bases of the Oceanographic Institute of USP (Cananéia and Ubatuba Bases) from August to October 2014 and from April to June 2015. Samples of the species Carukia barnesi, Chironex fleckeri and Chiropsella bronzie (Cubozoa) and Cassiopea sp. (Scyphozoa), were collected along the Australian east coast from March to May 2016. For histological and histochemistry description of the male gonads, samples were fixed in 4% paraformaldehyde prepared with water from the collection site and sodium phosphate buffer 0.2M for 24 hours. After that, the samples were processed following the protocol for historesin. Fragments of male gonads were fixed in modified Karnovsky solution (2.5% glutaraldehyde and 0.08% paraformaldehyde in 0.1 M sodium cacodylate buffer, pH 7.4) and glutaraldehyde (2.5% glutaraldehyde in cacodylate buffer 0.1M sodium in seawater vacuum Millipore filtered, pH 7.2-7.4). Then the samples were processed according to transmission electronic microscopy protocol. In this dissertation it is described the comparative spermatogenesis of the cubozoans T. haplonema and C. quadrumanus, under histology and histochemistry, showing the gonadal cycle (Chapter 1). We also describe the spermatogenesis and sperm morphology, under light microscopy and ultrastructure, for the Cubozoa species T. haplonema, C. quadrumanus, Carukia barnesi, Chironex fleckeri and Chiropsella bronzie (Chapter 2). For the Scyphozoa species, Lychnorhiza lucerna, Chrysaora lactea and Cassiopea sp., we describe the spermatogenesis process, under light transmission electronic microscopy, describing the macroscopic structure of the male gonad (Chapter 3). Additionally, in the final chapter, it is highlighted the comparative morphology of sperm of all species studied, evidencing possible unique features of each class, enumerating possible sperm characters (Chapter 4)

Submitted by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2017-09-08T11:57:20Z No. of bitstreams: 1 KarinaRibeiroModestoDissertacao2017.pdf: 6705375 bytes, checksum: 161944cc6fbeb260f63db5fea9e61056 (MD5) / Approved for entry into archive by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2017-09-08T11:57:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 KarinaRibeiroModestoDissertacao2017.pdf: 6705375 bytes, checksum: 161944cc6fbeb260f63db5fea9e61056 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-08T11:57:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 KarinaRibeiroModestoDissertacao2017.pdf: 6705375 bytes, checksum: 161944cc6fbeb260f63db5fea9e61056 (MD5) Previous issue date: 2017-03-31 / Recent discoveries points towards seminal plasma playing a major role in directing processes on mammalian spermatozoa as well as influencing offspring development prior to and after birth. Amongst the candidates for such role, recent data has brought the extracellular vesicles (EVs) into the field. Aiming to characterize EVs present on the intraluminal fluid of different segments of the epididymis, such as cauda and caput in male Wistar rats, this research assessed the influence of sexual developmental stages on the concentration and size distribution of epididymal EVs. The individuals were also grouped in terms of sexual developmental stages, clustered as ???prior to puberty, ???puberty???, and ???post-puberty???. TRPS based analysis showed a significant shifts in concentration and diameter of such EVs between clustering groups as well as epididymal segment groups. Caput epididymal EVs were found presenting reduced concentration and reduced diameter when compared to cauda epididymis EVs. Regarding the more sexually developed individuals, those showed higher EVs counts than ???prior to puberty??? ones. Additional findings suggest that post-puberty epididymal EVs are enlarged in comparison to the two other groups. Such data might serve a purpose of better comprehending the processes regarding spermatic maturation and capacitation (fertilization), offering findings that bring up clinically important issues regarding male epigenesis and father-to-offspring effects. / Evid??ncias crescentes t??m apontado para a import??ncia do conte??do presente no plasma seminal de mam??feros sobre as c??lulas esperm??ticas bem como sobre o desenvolvimento da prole durante os per??odos pr?? e p??s-natal. Entre os mediadores aparentemente envolvidos nesse processo, podemos citar as ves??culas extracelulares (VEs). Com o objetivo de caracterizar as VEs presentes no l??quido intraluminal de diferentes compartimentos do epid??dimo, cabe??a e cauda, de ratos machos da linhagem Wistar, o presente trabalho avaliou a influ??ncia da idade sobre a concentra????o e a distribui????o de tamanho dessas ves??culas nos compartimentos do epid??dimo. Para isso, utilizou-se tr??s grupos de ratos em idades distintas, sendo um grupo com indiv??duos em idade pr??-p??bere, um grupo com indiv??duos em idade p??bere e um grupo com indiv??duos em idade p??s-p??bere. A contagem de part??culas por detec????o de pulso resistivo ajust??vel (TRPS) revelou diferen??as importantes na concentra????o e no di??metro dessas VEs, tanto em fun????o do segmento anat??mico epididim??rio, quanto em fun????o da idade dos indiv??duos. A cabe??a do epid??dimo apresentou menor concentra????o de part??culas em compara????o com a cauda, bem como part??culas com di??metro menor. Com rela????o a idade, os ratos mais velhos apresentaram maior concentra????o de VEs quando comparados com os ratos imaturos sexualmente. Al??m disso, foi observado que as VEs presentes no ducto epididim??rio dos ratos p??s-p??beres possui tamanho maior que as VEs dos outros dois grupos experimentais. Os resultados aqui obtidos podem servir para uma melhor compreens??o dos processos que englobam tanto a matura????o e capacita????o esperm??tica em si, oferecendo propriedades clinicamente relevantes, quanto processos da espermatog??nese masculina e poss??veis efeitos epigen??ticos transgeracionais.

A ausência de trabalhos verificando a melhor concentração de espermatozoides para se congelar o sêmen de cachaços em palhetas de 0,5 mL, gerou a necessidade deste estudo. Foi proposto, por meio deste expererimento, encontrar uma quantidade ideal, ou seja, uma concentração em que se consiga congelar o maior número de espermatozoides por palheta, sem aumentar os danos já causados pelo processo de criopreservação dos espermatozoides de cachaços. Diante disso, foram realizadas 5 coletas de 5 cachaços (n=25), utilizando apenas a fração rica do ejaculado. Estes foram divididos em cinco concentrações espermáticas diferentes, a saber: 100, 200, 300, 600 e 800x106 espermatozoides/mL e congelados em palhetas de 0,5mL. Após o processo de criopreservação, realizado por um sistema automatizado, as plalhetas foram acondicionadas em botijão criogênico. Para as análises, 2 palhetas de cada concentração foram descongeladas em banho maria (37ºC por 30 segundos) e submetido às avaliações das características de motilidade por meio do CASA, citometria de fluxo para a análise da integridade das membranas acrossomal e plasmática, potencial mitocondrial, peroxidação lipídica e fluidez da membrana espermática (capacitação), além da morfologia espermática por microscopia de contraste de interferência diferencial de fase. As variáveis avaliadas foram submetidas à análise de variância e ao teste de média PDDIF, ao nível de 5%. O aumento da concentração espermática, na palheta de 0,5mL, afetou significativamente (p<0,05) a motilidade total e progressiva, velocidade progressiva, velocidade de trajeto, linearidade, retilinearidade, frequência de batimento flagelar e hiperativação. O aumento do número de espermartozoides na palheta não alterou (p>0,05) a porcentagem de células que apresentavam simultaneamente a integridade das membranas plasmática e acrossomal e com potencial mitocondrial (MIAIAP), o aumento não influenciou (p>0,05) as variáveis peroxidação lipídica, capacitação e morfologia espermática. Baseado nos resultados, pode-se sugerir a congelação de até 300x106 espermatozoides/mL, na palheta de 0,5 mL, sem maiores danos à motilidade e integridade das membranas espermáticas. / The lack of studies veryfing the best concentration of sperm to freeze the boar semen in 0.5 ml straws, bring forth necessity for this study. The experiment proposed to find an optimal amount, in other words a concentration that is possible to freeze the higher number of spermatozoa per straw without increasing the damage already caused by the process of cryopreservation of boar spermatozoa. Therefore, there were 5 semen collections of 5 boars (n = 25) using only the rich fraction of the ejaculate. They were divided into five different sperm concentrations, namely 100, 200, 300, 600 and 800x106 sperm/mL and frozen in 0.5 mL straw. After the cryopreservation process, carried out by an automated system, straws were placed in cryogenic cylinders. For the analysis, two straws of each concentration were thawed in water bath (37°C for 30 seconds) and subjected to evaluations of motility characteristics through CASA, flow cytometry to analyze the integrity of the acrosome and plasma membrane, mitochondrial potential, peroxidation and lipid fluidity of sperm membrane (capacitation), and the sperm morphology by phase differential interference contrast microscopy. The variables were subjected to analysis of variance and the average test PDDIF, at 5%. The increased sperm concentration, in the 0.5mL straw, affected significantly (p <0.05) total and progressive motility, progressive velocity, path velocity, linearity, straightness, flagellar beat frequency and hyperactivation. The increase in the spermatozoa number, in 0,05 mL straw, did not change (p> 0.05) the percentage of cells that simultaneously showed the integrity of plasma and acrosomal membranes and with high mitochondrial potential (MIAIHM), the increase did not affect (p> 0.05) the lipid peroxidation variables, training and sperm morphology. Based on the results, it can be suggested to freeze with 300x106 spermatozoa/mL, in 0.5 mL straw, without major damage to the integrity and motility of the sperm membrane.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-02-08T14:39:09Z No. of bitstreams: 1 Felipe Costa Almeida.pdf: 906567 bytes, checksum: 56e2db3d9385785462dcff3582c0c339 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-08T14:39:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Felipe Costa Almeida.pdf: 906567 bytes, checksum: 56e2db3d9385785462dcff3582c0c339 (MD5) Previous issue date: 2013-02-26 / This work aimed to study fertility of sperm obtained from epididymis tail of Nelore bulls and subjected to cryopreservation in extenders with three different concentrations of glycerol, and stabilization times at 5 °C and antioxidants addition to semen extender. Epididymides were obtained from slaughterhouse up to one hour after the death of the animal, placed in individual plastic bags and transported in box at room temperature (28 °C). At the laboratory, spermatozoa were recovered from epididymis tail using flotation technique and then diluted in Tris-yolk egg. In experiment 1 three concentrations of glycerol (3%, 5% and 7%) was evaluated at different stabilization times (0h, 2h and 4h). In the second experiment was evaluated the effect of adding enzymatic antioxidants in epididymal spermatozoa cryopreservation, resulting in following experimental groups: (Control; CAT 50 and 100 U/mL, and SOD 50 and 100 U/mL) at a concentration of 60 x 106 sperm/mL, packaged in straws (0.25 mL) and frozen in automated system. In both experiments, semen samples were thawed at 37 °C/30 sec was evaluated for plasma membrane integrity (PMi), acrosomal integrity (Aci), mitochondrial membrane potential (MMP) and sperm kinematics. In Experiment 1, PMi and Aci analyzes demonstrated values lower (P<0.05) for glycerol 3%, at stabilization time at 4h compared to other times. In kinematic evaluation, sperm values were lower (P<0.05) for BCF parameter in glycerol 3% and 7% groups at 2h of stabilization time compared to glycerol 5%; for ALH, glycerol 3% group in stabilization time at 4h demonstrated lowest (P<0.05) compared to other groups. Glycerol 5% group, settling time 0h, showed lower values (P <0.05) for the hPMM and Aci parameters, when compared to other groups. For IVF experiment, only glycerol 5% at stabilization time at 4h was used. Forty percents of embryonic viability were obtained from oocytes used. In experiment 2, parameters of MT, MP, VCL, VSL, VAP, STR, ALH and BFC did not differ (P> 0.05) between control and treated groups. However, significant differences (P <0.05) were observed between groups for Linearity (LIN) and oscillation index (WOB), being less than 100 SOD treatment (P<0.05) than other groups. Addition of SOD 100 determined lower (P<0.001) percentages of blastocysts post-cleavage. Based on results of kinematic and in vitro fertilization, it is possible to conclude that spermatozoa cryopreservation obtained from epididymis tail of bulls should be performed using extender with glycerol at 5% of concentration and stabilization time at 5 °C during 4h. Addition of CAT concentrations of 50 and 100 U/mL and SOD at concentration of 50 U/mL did not affect the sperm quality. Addition of SOD at a concentration of 100 U/mL reduces fertility of epididymal sperm after cryopreservation. However, it is noteworthy that sperm obtained from epididymis tail of bulls can be successfully used in IVF programs. / Este trabalho teve como objetivo estudar a fertilidade de espermatozoides obtidos da cauda do epidídimo de touros da raça Nelore e submetidos à criopreservação em diluentes com três diferentes concentrações de glicerol, tempos de estabilização a 5 °C e adição de antioxidantes ao diluidor de sêmen. Os epidídimos foram obtidos em matadouro, até uma hora após a morte do animal, colocados em sacos plásticos individuais e transportados em caixa térmica em temperatura ambiente (28 ºC). No laboratório, os espermatozoides foram recuperados da cauda do epidídimo utilizando a técnica de flutuação e, a seguir, diluídos em Tris-gema. No experimento 1 foi avaliado diferentes concentrações de glicerol (3%, 5% e 7%) em diferentes tempos de estabilização (0h, 2h e 4h). No experimento 2 foi avaliado o efeito da adição de antioxidantes enzimáticos na criopreservação de espermatozoides epididimários, constituindo os seguintes grupos experimentais: (Controle; CAT 50 e 100 U/mL; SOD 50 e 100 U/mL), na concentração de 60 x 106 espermatozoides/mL, acondicionados em palhetas (0,25 mL) e congelados em método automatizado. Em ambos os experimentos, as amostras de sêmen foram descongeladas a 37 °C/ 30 s e avaliadas quanto a integridade de membrana plasmática (iMP), integridade acrossomal (iAc), potencial de membrana mitocondrial (PMM) e cinética espermática. No experimento 1, as análises de iMP e iAc apresentaram valores inferiores (P<0,05) para o glicerol 3%, no tempo de 4h em comparação aos demais tempos de estabilização. Na avaliação da cinética espermática, foram encontrados valores inferiores (P<0,05) para o parâmetro BCF nos tratamentos glicerol 3% e 7%, no tempo de 2h em comparação ao do glicerol 5%; para ALH, o grupo glicerol 3%, no tempo 4h de estabilização apresentou menor valor (P<0,05) em relação aos demais grupos. O grupo glicerol 5%, no tempo de estabilização 0h, apresentou valores inferiores (P<0,05) para os parâmetros de aPMM e iAc, quando comparado aos demais grupos. Para a FIV foi utilizado o grupo glicerol 5%, no tempo de estabilização 4h. Foram obtidos 40% de viabilidade embrionária dos oócitos utilizados. No experimento 2, os parâmetros de MT, MP, VCL, VSL, VAP, STR, ALH e BFC não diferiram (P>0,05) entre o grupo controle e os grupos tratados. Todavia, diferenças significativas (P<0,05) foram observadas entre os grupos para Linearidade (LIN) e no índice de oscilação (WOB), sendo o tratamento SOD 100 inferior (P<0,05) aos demais grupos. A adição de SOD 100 determinou ainda menores (P<0,001) porcentagens de blastocistos pós-clivagem. Com base nos resultados de cinética e fertilização in vitro, é possível concluir que a criopreservação de espermatozoides obtidos da cauda do epidídimo de touros deve ser realizada utilizando diluidor com glicerol na concentração de 5% e tempo de estabilização a 5 °C de 4h. A adição de CAT nas concentrações de 50 e 100 U/mL e SOD na concentração de 50 U/mL não influencia na qualidade espermática. A adição de SOD na concentração de 100 U/mL reduz a fertilidade dos espermatozoides epididimários pós-criopreservação. Todavia, ressalta-se que espermatozoides obtidos da cauda do

A criopreservação do sêmen suíno ainda é um desafio devido a extensão dos danos causados pelo choque-frio. Os espermatozoides oriundos da fração rica do ejaculado suíno possuem a membrana plasmática mais estável, são mais resistentes ao choque-frio e a reação acrossomal precoce do que aqueles oriundo da fração total do ejaculado. Com isso, o uso do plasma seminal oriundo dessa fração do ejaculado suíno também poderia aumentar a criotolerância dos espermatozoides suínos e/ou reverter os danos oriundo da criopreservação. Entretanto, a grande maioria das técnicas de avaliação espermática inclui apenas um parâmetro de funcionalidade espermática. Por outro lado, quanto mais características espermáticas analisadas, mais fiel se torna a avaliação quanto ao potencial fertilizante da amostra. Nesse contexto, esse trabalho objetivou a validação de uma técnica de análise espermática por citometria de fluxo para a avaliação simultânea da integridade das membranas plasmática e acrossomal e potencial de membrana mitocondrial. Além de avaliar os efeitos da adição/manutenção do plasma seminal oriundo da fração rica do ejaculado suíno sobre a cinética espermática, integridade das membranas plasmática e acrossomal e potencial de membrana mitocondrial, fluidez e peroxidação das membranas espermáticas, fosforilação do aminoácido tirosina, taxa de fertilidade e de prenhez precoce. A técnica sugerida em nosso trabalho é capaz de detectar (R2 &#61; 0,9356; p &lt; 0,01) simultaneamente os espermatozoides com a membrana plasmática e acrossomal integras e alto potencial de membrana mitocondrial (PIAIA). O plasma seminal da fração rica do ejaculado suíno gera benefícios para a cinética espermática melhorando a motilidade total e progressiva dos espermatozoides descongelados (p &lt; 0,05). Por outro lado, a manutenção/adição de plasma seminal oriundo da fração rica do ejaculado suíno, não é capaz de alterar (p &gt; 0,05) os espermatozoides PIAIA, a fosforilação do aminoácido tirosina, a fluidez e a peroxidação das membranas espermáticas. Entretanto, essas características devem ser cuidadosamente interpretadas, uma vez que, a fluidez e a peroxidação das membranas espermáticas são alteradas (p &lt; 0,05) pelo processo de centrifugação. As taxas de fertilidade e de prenhez precoce também não foram influenciadas (p &gt; 0,05) pela adição de plasma seminal oriundo da fração rica do ejaculado suíno. Portanto, podemos concluir que o plasma seminal da fração rica possui efeito benéfico sobre a fisiologia dos espermatozoides pós-descongelação, melhorando a criopreservação do sêmen suíno. / Boar semen cryopreservation is still a challenge due to the extension of cold shock damage. Boar spermatozoa arising from sperm-rich ejaculate fraction are reported to have a more stable plasma membrane, more resistant to cold shock and premature acrosome reaction than spermatozoa from the whole ejaculate. Thus, seminal plasma arising from whole sperm-rich fraction can increase cryotolerance of boar spermatozoa, and in other domestic species it has the ability to reverse cryopreservation damage. However, the majority of actual sperm evaluation techniques include a single sperm parameter, which makes the sperm characterization of a single population difficult. In this context, this work was performed to validate a sperm flow cytometry fourfold coloration technique for the simultaneous evaluation of plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential. Furthermore, we evaluate the seminal plasma arising from whole sperm-rich fraction effects on sperm kinetics, plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential, tyrosine phosphorylation, membrane fluidity and peroxidation, fertility and early pregnancy rate. The proposed technique is able (R2 &#61; 0.9356; p &lt; 0.01) to simultaneous detection of plasma and acrosomal membrane integrity and high mitochondrial membrane potential (IPIAH). Seminal plasma arising from whole sperm-rich fraction is able to improve (p &lt; 0.05) total and progressive motility. Furthermore, seminal plasma arising from whole sperm-rich fraction maintenance/addition was not able to improve (p &gt; 0.05) the IPIAH sperm population, tyrosine phosphorylation, membrane fluidity and peroxidation. However, these sperm characteristics need to be carefully interpreted, once, membrane fluidity and peroxidation could be influenced (p &lt; 0.05) by centrifugation. Fertility and early pregnancy rate we not improved (p &gt; 0.05) by seminal plasma addition. Therefore, we concluded that sperm fourfold coloration can be used to evaluate simultaneously plasma and acrosomal membranes integrity and mitochondrial membrane potential and that whole sperm-rich fraction seminal plasma can be beneficial to post-thawed sperm physiology, thereby improving boar semen cryopreservation.

A fragmentação do DNA espermático é uma das principais causas de infertilidade nos machos. Alterações na integridade do DNA podem ser decorrentes da ação de espécies reativas de oxigênio (EROS), de defeitos na protaminação e da apoptose. A sensibilidade do espermatozoide ovino frente as biotecnologias reprodutivas pode ser resultado de uma alta suscetibilidade a ação de EROS ou alterações na protaminação espermática desencadeadas por estresse oxidativo induzido por estresse térmico, tornando o espermatozoide mais suscetível a fragmentação de DNA. Com o objetivo de entender mais este processo, foi realizado um primeiro experimento para avaliar o status oxidativo, os atributos espermáticos e a expressão gênica de proteínas envolvidas nos processos de protaminação em diferentes níveis de suscetibilidade a peroxidação lipídica (baixo, médio, alto e altíssimo) em sêmen ovino. Foi observado um aumento da atividade enzimática da glutationa peroxidase e uma diminuição da atividade enzimática da glutationa redutase no plasma seminal no grupo com suscetibilidade a peroxidação lipídica alta e altíssima. Com relação a catalase, não foi verificado esse aumento, no entanto houve maior imunodetecção desta enzima. Em relação a condição espermática, observou-se um aumento na porcentagem de defeitos totais e lesões nas membranas acrossomal e plasmática, além de porcentagens menores de espermatozoides com baixo potencial de membrana mitocondrial no grupo com maior suscetibilidade a peroxidação lipídica. Este mesmo grupo também apresentou alta suscetibilidade ao dano da cromatina e aumento do número de cópias do gene da protamina 1 (PRM1) em espermatozoides. O segundo experimento avaliou os atributos de espermatozoides provenientes do ejaculado e do epidídimo frente ao estresse térmico induzido por insulação testicular (tratado), assim como as relações com o status antioxidante. Observou-se diminuição da motilidade, vigor, turbilhonamento e aumento na porcentagem de defeitos maiores e menores, e de lesões na membrana acrossomal e plasmática em espermatozoides ejaculados no grupo tratado. Essas diferenças não foram observadas em espermatozoides epididimais. Uma maior atividade enzimática da glutationa peroxidase e da glutationa redutase foi observada no plasma seminal do grupo tratado. Foi verificado uma diminuição de espermatozoides com alto potencial de membrana mitocondrial no grupo tratado, indicando que o metabolismo mitocondrial parece estar envolvido no quadro de estresse oxidativo. Um terceiro estudo foi conduzido para verificar o efeito do estresse térmico na integridade da cromatina espermática, na protaminação do DNA espermático e na ativação de vias apoptóticas em testículo ovino. Em espermatozoides provenientes do ejaculado, houve um aumento da porcentagem de células com suscetibilidade a fragmentação da cromatina no grupo tratado; não observado em espermatozoides epididimais. Uma alta porcentagem de espermatozoides com fragmentação de DNA grau III (ensaio COMETA) e aumento do número de cópias de mRNA da proteína de transição 1 (TNP1) em espermatozoides provenientes do ejaculado, foi observada no grupo tratado. Já em espermatozoides provenientes do epidídimo, a PRM1 apresentou maior expressão no 30&omicron; dia do ciclo espermático comparado a 7&omicron; dia, enquanto que a TNP1 comportou-se de maneira contrária. Em relação a ativação de vias apoptóticas em testículo ovino, a proteína anti-apoptótica Bax foi imuno-identificada em espermatócitos e a Blc-2 em espermátides, sem diferença entre os grupos. Em conclusão, a alta susceptibidade dos espermatozoides ovinos a peroxidação lipídica altera o status oxidativo ocasionando um quadro de estresse oxidativo, principal causador de dano a cromatina. Adicionalmente, o estresse oxidativo induzido por estresse térmico prejudica os atributos espermáticos e aumenta a suscetibilidade dos espermatozoides a fragmentação de DNA. / Sperm DNA fragmentation is referred as one of the main causes of male\'s infertility. Among the etiologies of abnormalities on DNA integrity the action of reactive oxygen species (ROS), protamination failures and apoptosis are considered the most important. The known sensitivity of ram´s sperm to reproductive biotechnologies could be a result of a higher susceptibility to the action of ROS or changes in sperm protamination triggered by oxidative stress induced by heat stress. This would increase the susceptibility of sperm DNA to fragmentation. Initially, the ram sperm quality, seminal protamine gene expression and oxidative status were evaluated in semen samples of different levels of susceptibility to lipid peroxidation (low, medium, high and very high). There was an increase on glutathione peroxidase and decreased glutathione reductase enzymes&#39; activity in groups with high and very high susceptibility to lipid peroxidation. However, only catalase showed increased immunodetection. An increase on total defects and damaged acrosomal and plasmatic membranes were observed in the group showing the highest susceptibility to lipid peroxidation. Also, the percentage of sperm with low mitochondrial membrane potential, the percentage of sperm susceptible to chromatin damage and the number of copies of protamine 1 (PRM1) mRNA were increased in the group showing higher susceptibility to lipid peroxidation. The second study evaluated sperm\'s attributes from the epididymis and ejaculated sperm subjected to heat stress induced by testicular insulation (treated group), as well as correlations with the antioxidant status. We observed decrease on motility, vigor, and mass motility and increase on the percentages of sperm showing major and minor defects, and damaged plasma and acrosome membranes in the treated group. These differences were not observed in epididymal sperm. Increased enzymatic activities of glutathione peroxidase and glutathione reductase were observed in the treated group. Mitochondrial metabolism appeared to be involved in the oxidative homeostasis imbalance. This was effectively observed by a decrease on the percentage of sperm with high mitochondrial membrane potential in the treated group. A third study was conducted to determine the effect of heat stress induced by testicular insulation on the integrity of chromatin, protamination and apoptotic activation pathway in ram testis. An increase on the percentage of sperm with susceptibility to chromatin fragmentation in the treated group was observed. However, the previous findings were not observed in epididymal sperm. A higher percentage of sperm showing DNA fragmentation level III (Comet assay) and an increase on the number of copies of transition protein 1(TNP1) mRNA were observed in the treated group. In epididymal sperm, a higher expression of the PMR1 gene was observed on the 30th day of the espermatogenic cycle, while TNP1 behaved contrarily. In the testicular samples, the anti-apoptotic protein Bax was detected only in spermatocytes while Bcl-2 was observed singularly in spermatids, with no difference between groups. In conclusion, the disruption of oxidative homeostasis may be exacerbated by the higher susceptibility of ram\'s sperm to lipid peroxidation, which could be the main etiology of chromatin damage. In addition, oxidative stress induced by heat stress impairs sperm attributes and DNA integrity.

O presente trabalho foi composto de dois estudos distintos. O Estudo I, com um foco conservacionista, teve como objetivo a avaliação e comparação de diferentes métodos de criopreservação de sêmen de bugio-preto (Alouatta caraya). Para tanto, o estudo foi dividido em dois experimentos: Experimento I composto de dois ensaios no primeiro ensaio foram comparados dois diluidores comerciais BotuBOV e Test-yolk buffer (TYB) e no segundo ensaio foram comparados dois métodos de criopreservação de sêmen congelação lenta e vitrificação; Experimento II avaliação dos efeitos da adição de DHA e de Trolox (análogo da vitamina E) ao diluidor para criopreservação de sêmen. O diluidor TYB apresentou melhores resultados quando comparados ao BotuBOV. A congelação lenta apresentou melhores resultados quando comparada à vitrificação. Não houve diferença entre o diluidor controle e os diluidores com Trolox, DHA ou combinação dos dois (DHAT), com exceção da integridade de acrossoma, que foi significativamente menor para o diluidor DHAT. Conclui-se que são necessários mais estudos, com utilização de outras doses de DHA e Trolox, além de outros antioxidantes. O Estudo II, com foco em pesquisa biomédica, teve como objetivo a criopreservação de sêmen de macaco-rhesus (Macaca mulata) e avaliação da qualidade pós-descongelação por meio de fecundação in vitro (FIV). Para tanto, o estudo foi dividido em três experimentos: Experimento I avaliação e comparação de dois métodos de criopreservação de sêmen congelação lenta e vitrificação; Experimento II avaliação e comparação de quatro métodos de preparação do sêmen pós-descongelação lavagem simples (LS), swim-up (SU), separação por gradiente de densidade (SGD) e filtragem em lã de vidro (FLV); Experimento III avaliação da qualidade seminal pós-descongelação por meio de FIV. A congelação lenta apresentou melhores resultados que a vitrificação (p<0,05). LS apresentou os melhores resultados, seguido por SGD e SU, enquanto FLV apresentou os piores resultados. LS e SGD foram utilizados para avaliação da qualidade seminal por meio de FIV, utilizando sêmen fresco como controle. As taxas de fecundação (média±EPM%) para oócitos MI inseminados com sêmen fresco (43.5±16.4) foram significativamente maiores (p<0,05) que LS (2.0±2.0), mas não diferiram de SGD (25.1±14.2). Não houve diferença na taxa de blastocistos (média±EPM%) entre os tratamentos (variação de 0 a 11.9±7.9). As taxas de fecundação para oócitos MII inseminados com sêmen fresco (41.4±3.6) também foram significativamente maiores que SGD e LS (18.4±6.9 e 12.7±7.7, respectivamente), assim como a taxa de blastocistos (64.7±13.6; 4.7±4.7; 30.9±13.8, respectivamente). Conclui-se que, espermatozoides criopreservados foram capazes de fertilizar oócitos e os embriões atingiram o estágio de blastocisto. A SGD selecionou espermatozoides pós-descongelação de melhor qualidade para FIV em macacos-rhesus, quando comparada à LS / This work was divided in two studies. The objective of Study I was to test and compare different cryopreservation methods for sperm from black-and-gold howler monkeys (Alouatta caraya), with a focus on species conservation. The study was divided in two experiments. Experiment I composed of two trials the first trial compared two commercial extenders BotuBOV and Test-yolk buffer (TYB), and the second trial compared two cryopreservation methods slow freezing and vitrification; Experiment II evaluation of the effects of DHA and Trolox (vitamin E analog) as additives to the freezing extender. TYB had better results when compared to BotuBOV. Slow freezing had better results when compared to vitrification. There was no difference between control extender (TYB) and extender containing Trolox, DHA or a combination of both (DHAT), except for acrosome integrity, which was significantly lower for DHAT. In conclusion, more studies are necessary, using other doses of DHA and Trolox, as well as other antioxidants. The objective of Study II was to assess the quality of frozen-thawed sperm from rhesus macaques (Macaca mulatta) by in vitro fertilization (IVF). The study was divided in three experiments. Experiment I evaluation and comparison of two cryopreservation methods slow freezing and vitrification; Experiment II evaluation and comparison of four preparation methods for frozen-thawed sperm simple wash (SW), swim-up (SU), density gradient centrifugation (DGC), and glass wool filtration (GWF); and Experiment III evaluation of frozen-thawed sperm quality by IVF. Slow freezing had better results when compared to vitrification (p<0,05). SW had better results, followed by DGC and SU, while GWF had the worse results. SW and DGC were further evaluated by IVF. Fertilization rates (mean±SEM%) with MI oocytes using fresh sperm were significantly higher (43.5±16.4) than with SW (2.0±2.0) and did not differ from DGC (25.1±14.2). There was no difference in blastocyst rates between treatments (range 0 to 11.9±7.9). Fertilization rates with MII ova were also significantly higher with fresh sperm (41.4±3.6) than DGC and SW (18.4±6.9 and 12.7±7.7, respectively), and more blastocysts developed from MIIs fertilized with fresh sperm (64.7±13.6) than SW and DGC (4.7±4.7 and 30.9±13.8, respectively). In conclusion, frozen-thawed sperm were able to fertilize oocytes and embryos reached the blastocyst stage. DGC yielded better frozen-thawed sperm for IVF in rhesus macaques, when compared with SW

No description available.