Durante la fertilización el núcleo del espermatozoide queda inmerso en el citoplasma del ovocito, y seguidamente, se transforma en el pronúcleo masculino. La formación del pronúcleo masculino se refiere al proceso de recambio de las proteínas básicas (polipéptidos especializados) que compactan el DNA (cromatina espermática) por histonas de tipo somático y/o embrionarias. Éste recambio es un prerequisito para que la interacción (recombinación) entre ambos genomas parentales ocurra a fin de generar una cromatina potencialmente activa. De forma habitual, estos cambios bioquímicos que se producen durante la remodelación de la cromatina espermática son referidos al proceso de descondensación del núcleo espermático.En particular, la remodelación de la cromatina del espermatozoide de Xenopus laevis ha sido ampliamente estudiada. En ovocitos y huevos de Xenopus se ha demostrado que la nucleoplasmina (NPL) es responsable de remover y recambiar las proteínas específicas (X e Y) del núcleo espermático por las histonas somáticas H2A y H2B siendo el resultado la reconstitución de una cromatina somática en el pronúcleo masculino. Por otro lado, la NPL es activa en remodelar la cromatina de los espermatozoides de diversas especies, tales como: Drosophila, algunos invertebrados marinos (es el caso de Mytilus y Spisula), peces (Salmón y Caballa), e incluso es capaz de remodelar la cromatina del espermatozoide humano. En Drosophila, Mytilus y Spisula se han identificado las proteínas responsables de la descondensación de la cromatina espermática de sus respectivas especies. La caracterización de éstas proteínas establece similitud con la NPL de Xenopus y por esta razón han sido referidas como NPL-like. Sobre estos antecedentes se ha planteado que la NPL de Xenopus tendría un rol funcional universal y sería el modelo de molécula responsable de la remodelación de la cromatina del espermatozoide.Dependiendo de la naturaleza de las proteínas específicas o especializadas que se asocian al DNA para su compactación; la cromatina espermatica puede organizarse entre dos tipos extremos: como núcleohistona (las proteínas especializadas son histonas o histonas modificadas) o como núcleoprotamina (las proteínas especializadas son del tipo de las protaminas). Entre estos dos tipos, la cromatina espermática puede organizarse en una amplia variedad de formas considerando que los polipéptidos especializados corresponde a un grupo de proteínas diversas; éstos tipos de cromatina podrían ser referidos a un amplio grupo intermedio. Considerando éste breve análisis sobre la organización de la cromatina espermática es evidente que el modelo de la remodelación de la cromatina espermática mediada por la NPL o NPL-like ha sido planteado sobre la remodelación de la cromatina espermática del tipo núcleoprotamina. Un antecedente adicional se refiere al hecho que la NPL es muy poco eficiente en remodelar la cromatina espermática de Rana catesbeiana, la cual corresponde a un tipo de cromatina organizada como núcleohistona. En base a estas consideraciones, el objetivo de está Tesis fue determinar la presencia de una molécula tipo NPL en los ovocitos de Holothuria tubulosa (Echinodermata), la cromatina espermática de ésta especie se organiza en forma de núcleohistona con la presencia adicional de una proteína específica denominada 0. La hipótesis general que se plantea es que los mecanismos y las moléculas responsables de la remodelación de la cromatina espermática deben ser diferentes dependiendo del tipo de organización de la cromatina del espermatozoide.Los resultados demuestran que los extractos de ovocitos de Holothuria tubulosa exhaustivamente fraccionados no contienen NPL o NPL-like. Pero alternativamente identificamos y caracterizamos en forma parcial una proteína que funcionalmente in-vitro es responsable de la remoción de la proteína específica 0 del núcleo espermático, y en ésta situación produce descondensación de la cromatina del espermatozoide. Ésta proteína ha sido denominada PR0 por su actividad funcional como proteína que remueve la 0 espermática. Por otro lado, la NPL de Xenopus es incapaz de remodelar la cromatina del espermatozoide de Holothuria tubulosa, pero es capaz de remodelar la cromatina espermática que contiene protamina típica (núcleoprotamina). Por lo contrario, la PR0 no remodela la cromatina de tipo núcleoprotamina.La conclusión principal de la Tesis es que el ovocito de Holothuria tubulosa debe poseer un mecanismo de remodelación de su cromatina espermática diferente y alternativo al descrito en Xenopus laevis. Los mecanismos de remodelación de la cromatina espermática podrían estar relacionados con las proteínas especializadas que organizan la cromatina del núcleo del espermatozoide. Por último, la carencia de NPL o NPL-like en los ovocitos de Holothuria tubulosa cuestionan el rol universal asignado a la NPL como molécula responsable de la remodelación de la cromatina del espermatozoide. / The sperm nucleus following fertilization remains into the egg cytoplasm, and subsequently, it results in sperm nuclear decondensation and formation of a functional male pronucleus. This includes the replacement of sperm nuclear basic proteins (specialized polypeptides) involved in DNA condensation in sperm nuclei (spermatic chromatin) by somatic and/or embryonic histones. This event is a prerequisite so that the interaction (recombination) among both parental genomes occurs in order to generate a functional chromatin. In a customary way, these biochemical changes that are produced during the remodeling of the spermatic chromatin are associated to the process of decondensation of the spermatic nuclei.In particular, the remodeling of the sperm chromatin of Xenopus laevis has been widely studied. In oocytes and eggs of Xenopus has been demonstrated that nucleoplasmin (NPL) is responsible for removal and replacement of the specific proteins (X and Y) of the spermatic nuclei by somatic H2A and H2B histones being the result the reconstitution of a somatic chromatin in the male pronuclei. On the other hand, NPL is active in remodeling the sperm chromatin of various kinds, such as: Drosophila, some marine invertebrates (as is the case of Mytilus and Spisula), fish (Salmon and Mackerel), and even it is able to remodel the human sperm chromatin. In Drosophila, Mytilus and Spisula have been identified the responsible proteins for the sperm chromatin decondensation of their respective kinds. The characterization of these proteins establishes similarity with the NPL of Xenopus and for this reason have been considered as NPL-like. On these precedents it has been suggested that the NPL of Xenopus would have a universal functional role and would be the responsible molecule for remodeling the sperm chromatin.Depending on the nature of the specialized or specific proteins that are associated to the DNA packing; the sperm chromatin can be organized in two extreme types: as nucleohistone (the specialized proteins are histones or modified histones) or as nucleoprotamine (the specialized proteins are of the type of the protamines). Among these two types, the spermatic chromatin can be organized in a wide variety considering that the specialized polypeptides correspond to a group of diverse proteins; these types of chromatin could be referred to as a wide intermediate group. Taking into account this short analysis on the organization of the sperm chromatin is evident that the remodeling model of the sperm chromatin mediated by the NPL or NPL-like it has been based on the remodeling of the spermatic chromatin of the type nucleoprotamine. An additional precedent is referred to cause that the NPL is very little efficient in remodeling the sperm chromatin of Rana catesbeiana, the which one corresponds to a form of chromatin organized as nucleohistone.By these considerations, the purpose of this Thesis was determined the presence of a molecule type NPL in the Holothuria tubulosa (Echinodermata) oocytes, the spermatic chromatin of this kind is organized in the form of nucleohistone with the additional presence of a specific protein named 0. The general hypothesis is that the mechanisms and the responsible molecules for the remodeling of the sperm chromatin should be different depending on the type on organization on the sperm chromatin.The results demonstrate that the extracts of Holothuria tubulosa oocytes thoroughly fractioned do not contain NPL or NPL-like. But alternatively we identify and characterize in partial form a protein that functionally in-vitro is responsible for the removal of the specific protein 0 of the spermatic nuclei, and in this situation produces decondensation of the sperm chromatin. This protein has been termed PR0 due to its functional activity as a protein that removes the spermatic 0. On the other hand, the NPL of Xenopus is unable to remodel the sperm chromatin of Holothuria tubulosa, but it is able to remodel the sperm chromatin that contains typical protamine (nucleoprotamine). On the contrary, the PR0 does not remodel the chromatin of the type nucleoprotamine.The essential conclusion of the Thesis is that the Holothuria tubulosa oocyte must possess a remodeling mechanism of its sperm chromatin different and alternative that to described for Xenopus laevis. The remodeling mechanisms of the sperm chromatin could be related to the specialized proteins that organize the sperm chromatin. Finally, the lack of NPL or NPL-like in the Holothuria tubulosa questions the universal role assigned to the NPL as responsible molecule for the remodeling of the sperm chromatin.

Orientador: Maria Denise Lopes / Resumo: O objetivo deste estudo foi o de avaliar os efeitos da criopreservação sobre a qualidade e fertilidade do sêmen de cão. Para isso foram realizados dois experimentos. No primeiro experimento foram colhidos 4 ejaculados de 5 cães (n=20), os quais foram avaliados no sêmen fresco, resfriado e descongelado. A motilidade total (MT), progressiva (MP) e porcentagem de rápidos (RAP) por sistema computadorizado e por citometria de fluxo, a fluidez da membrana plasmática [Yo-Pro 1 (YP) e merocianina 540 (M540)], a translocação da fosfatilidil serina (FS) (anexina V e FITC-PSA), integridade da membrana plasmática e acrossomal (iodeto de propídeo (IP) combinado ao FITC-PSA), potencial da membrana mitocondrial (JC1), lipoperoxidação dos lipídeos de membrana (LPO, C11-BODIPY) e apoptose (CellEvent®). O sêmen do cão que apresentou melhores resultados numéricos em todas as análises foi escolhido para ser utilizado separadamente para as inseminações (cão 1) e o sêmen dos demais 4 cães foram utilizados em pool. Foram inseminadas 20 cadelas (2 IAs/cadela), por via transcervical (TCIA) sendo 10 delas com o cão 1 e 10 com o pool. Foram utilizadas 2 concentrações espermáticas (160 e 450 x 106 espermatozoides/TCIA). Houve diferença para os índices de motilidade (p < 0,01) entre o sêmen fresco e resfriado quando comparados ao descongelado para todos os índices avaliados, (MT = 87,00 ± 1,24; 88,15 ± 1,38; 72,55 ± 6,26); (MP = 69,95 ± 1,28 ; 71,75 ± 1,91; 56,30 ± 6,00) e (RAP = 83,15 ± 1,94; 81,55 ±... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-07-06T18:04:49Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 909533 bytes, checksum: 6baed208f90f67624120c4e48d7b27aa (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-06T18:04:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 909533 bytes, checksum: 6baed208f90f67624120c4e48d7b27aa (MD5) Previous issue date: 2017-02-22 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Inúmeras biotécnicas visam obter melhores índices de viabilidade espermática pós-descongelamento. Diferenças de características bioquímicas e funcionais entre espécies, ejaculados, estações do ano, animais, e outros, não possibilitaram o desenvolvimento de um protocolo definitivo. O presente estudo objetivou avaliar os efeitos da inclusão de colesterol na criopreservação do sêmen asinino sobre a viabilidade espermática in vitro pós-descongelamento. Vinte e cinco ejaculados de cinco jumentos foram divididos em dois tratamentos experimentais: T1: controle sem adição de ciclodextrina carregada com colesterol – (CCC); e T2 com adição de CCC. As avaliações seminais pós- descongelamento foram divididas em duas fases (1 e 2). Na fase 1 avaliou-se os efeitos da incorporação ou não de 1,5 mg de CCC aos espermatozoides, avaliando a cinética espermática dos espermatozoides no pós- descongelamento. As amostras descongeladas dos dois tratamentos foram submetidas ao Computer Assisted Sperm Analyser (CASA) e obteve-se as variáveis motilidade total (MT, %), motilidade progressiva (MP, %), velocidade curvilinear (VCL, μm/s), velocidade progressiva (VSL, μm/s), velocidade de trajeto (VAP, μm/s), linearidade (LIN, %), retilinearidade (STR, %), amplitude de deslocamento lateral da cabeça (ALH, μm) e frequência de batimentos (BCF, Hz). Na fase 2 as amostras dos dois tratamentos foram submetidas à incubação com diferentes sondas e posterior análise por citometria de fluxo para avaliação: da integridade da membrana plasmática e acrossomal (FITC-PSA), do estresse oxidativo citoplasmático (DHE), da peroxidação dos lipídios de membrana (BODIPY 581/591 ), da organização da bicamada lipídica (M540), do potencial de membrana mitocondrial (JC-1) e da apoptose celular (Yo-Pro). Os resultados relativos à avaliação da cinética espermática dos tratamentos experimentais mostraram que os parâmetros MT, MP, VCL, VSL, VAP, ALH, e BCF apresentaram maiores valores (p<0,05) no T1 (29,92 ± 13,82; 12,44 ± 6,03; 64,45 ± 9,65; 43,50 ± 7,30; 52,02 ± 8,17; 2,65 ± 0,48; 7,67 ± 0,76) em relação ao T2 xiv (17,33 ± 7,18; 5,33 ± 2,69; 46,16 ± 8,16; 31,83 ± 6,73,; 38,76 ± 7,63; 1,63 ± 0,43; 6,51 ± 1,76). Não foram observadas diferenças nos ejaculados (p>0,05) entre o T1 e T2 para as variáveis LIN (67,60 ± 1,28 e 68,74 ± 1,61) e STR (83,55 ± 0,81 e 81,91 ± 1,05). Na fase 2, a incorporação de colesterol resultou em maior (p<0,05) porcentagem de células com integridade de membrana acrossomal e plasmática dos espermatozoides (21,42 ± 12,94), bem como maior (p<0,05) potencial de sua membrana mitocondrial (15,49 ± 12,36). Não houve diferença (p>0,05) entre o T1 e T2 em relação à peroxidação dos lipídeos de membrana (669,81 ± 337,87 e 743,42 ± 417,26) e quanto à desorganização da membrana plasmática (8163,07 ± 1929,75 e 7068,01 ± 3680,08). A incorporação de colesterol resultou em maior (p<0,05) produção de espécies reativas de oxigênio citoplasmático (%) no T2 (3,73 ± 1,64) em relação ao T1 (2,10 ± 1,20). Além disso, a incorporação do colesterol se mostrou eficaz em aumentar (p<0,05) a porcentagem de células vivas pós descongelamento (23,67 ± 12,46) em relação ao grupo que não recebeu o tratamento (12,69 ± 8,84). Não houve diferença (p>0,05) entre T1 e T2 em relação à prevenção dos eventos semelhantes a apoptose nos espermatozoides (23,28 ± 9,81 e 22,08 ± 12,24). A incorporação de colesterol ao sêmen melhora os parâmetros seminais in vitro do sêmen descongelado de jumentos da raça Pêga. / Many biotechniques are directed to obtain better rates of sperm viability after thawing. Differences in biochemical and functional characteristics between species, ejaculates, seasons of the year, among animals, and others, preclude a definitive protocol. The objective of this study was to evaluate the effects of cholesterol inclusion on cryopreserved Pêga donkey spermatozoa and sperm viability in vitro post-thawing. Twenty five ejaculates of five donkeys were divided in two experimental treatments, T1: control, without addition of cyclodextrin loaded cholesterol – (CCC) and T2: treated with addition of CCC. Post-thawing seminal evaluations were divided into two phases (1 and 2). The effects of incorporation (T2) or not (T1) of 1.5 mg of CCC to the semen on sperm kinetics of post-thawing spermatozoa were evaluated. In phase 1, samples of the two treatments were submitted to the Computer Assisted Sperm Analyzer (CASA) and the kinetic characteristics: total motility (MT, %), progressive motility (MP, %), curvilinear velocity (VCL, μm/s), progressive velocity (VSL, μm/s), trajectory velocity (VAP, μm/s), linearity (LIN, %), rectilinearity (STR, %), amplitude of lateral head displacement (ALH, μm) and beating frequency (BCF, Hz) were obtained. In phase 2, samples of the two treatments were submitted to incubation with different probes and later analysed by flow cytometry to evaluate the plasma and acrosomal membrane integrity (FITC-PSA), cytoplasmic oxidative stress (DHE), plasma membrane lipid peroxidation (BODIPY 581/591 ), lipid bilayer organization (M540), mitochondrial membrane potential (JC-1) and cellular apoptosis (Yo-Pro). Results regarding the evaluation of spermatic kinetics of the experimental treatments showed the parameters MT, MP, VCL, VSL, VAP, ALH and BCF were higher (p<0,05) in T1 (29,92 ± 13,82; 12,44 ± 6,03; 64,45 ± 9,65; 43,50 ± 7,30; 52,02 ± 8,17; 2,65 ± 0,48; 7,67 ± 0,76) in relation to T2 (17,33 ± 7,18; 5,33 ± 2,69; 46,16 ± 8,16; 31,83 ± 6,73; 38,76 ± 7,63; 1,63 ± 0,43; 6,51 ± 1,76). No differences were shown (p> 0.05) between T1 e T2 for the LIN (67,60 ± 1,28 e 68,74 ± 1,61) and STR (83,55 ± 0,81 e 81,91 ± 1,05) variables. In phase xvi 2, the incorporation of cholesterol resulted in greater (p <0.05) percentage of integrity on the spermatozoa acrosomal and plasma membrane (21,42 ± 12,94), as well as higher (p<0.05) potential of its mitochondrial membrane (15,49 ± 12,36). No difference was detected (p>0.05) between T1 e T2 in relation to membrane lipid peroxidation (669,81 ± 337,87 e 743,42 ± 417,26) and plasma membrane disorganization (8163,07 ± 1929,75 e 7068,01 ± 3680,08). Cholesterol incorporation resulted in higher (p<0.05) production of reactive cytoplasmic oxygen species % in T2 (3,73 ± 1,64) in relation to the T1 (2,10 ± 1,20) spermatozoa. In addition, cholesterol incorporation was effective in increasing (p<0.05) the percentage of post-thaw live cells (23,67 ± 12,46) in relation to T1 (12,69 ± 8,84). No difference was detected (p>0.05) between T1 e T2 regarding the prevention of apoptosis-like events in spermatozoa (23,28 ± 9,81 e 22,08 ± 12,24). The incorporation of cholesterol to the semen improves seminal parameters of in vitro of post-thawing donkey semen.

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / A leptina tem um papel importante na regulação do sistema reprodutivo além de seu papel principal na regulação do peso corporal e ingestão alimentar. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da administração de leptina durante o período neonatal na função testicular da prole adulta. Vinte e quatro filhotes de 12 mães foram divididos em 2 grupos: Grupo leptina: injetados com 50 L de leptina (80ng/gPC, subcutânea) nos primeiros 10 dias de vida e Grupo Controle: injetados com o mesmo volume de solução salina. Todos os animais foram sacrificados aos 90 dias de vida. Parâmetros analisados: consumo alimentar, massa corporal, crescimento linear, data de início da puberdade, perfil lipídico, níveis séricos de estradiol e testosterona, expressão gênica (PCR em tempo real) e expressão proteica (Western blot) de ObRa, OBRb, aromatase, AR, ER, morfometria testicular, número, morfologia e viabilidade de espermatozoides. Os dados foram expressos como média erro padrão. A significância estatística foi determinada pelo teste t de Student. A Injeção de leptina levou a uma redução (p&#8804;0,008) no consumo alimentar a partir do dia 26 ao 40 e do dia 70 em diante, enquanto que a massa corporal (p&#8804;0,03) e o crescimento linear (p&#8804;0,05) foram reduzidos do dia 26 até o dia 45. O peso da hipófise (p&#8804;0,0006), hipotálamo (p&#8804;0,01), próstata (p&#8804;0,003), testículo (p&#8804;0,008) e epidídimo (p&#8804;0,004) e bexiga (p&#8804;0,009) foram significativamente reduzidos pela injeção de leptina. A Injeção de leptina adiantou o início da puberdade (C=45,0 0,3; L=41,6 0,3; dias, P&#8804;0,0001). Em relação ao perfil lipídico, a administração de leptina gerou um aumento nos níveis séricos de TG (C= 116,5 15,9; L=172,6 19,7; ng/dL, P&#8804;0,05) e uma redução nos níveis de HDL (C=33 1,5; L = 24 3,5; ng/dL, P&#8804;0,02). Os níveis séricos de testosterona também foram reduzidos pela leptina (C=5,2 1,0; L=1,1 0,3; ng/mL, P&#8804;0,003). Todos os genes avaliados por PCR em tempo real mostraram um aumento na sua expressão: Obra (C=0,32 0,04; L=0,69 0,16; P&#8804;0,04), OBRb (C=0,37 0,06; L=0,71 0,16; P&#8804;0,03), AR (C=0,28 0,02; L=0,71 0,16; P&#8804;0,02), Aromatase (C=0,31 0,04; L=0,53 0,09; P&#8804;0,04), ER-&#945; (C=0,79 0,03; L=0,93 0,03; P&#8804;0,01), ER-&#946; (C=0,29 0,03; L=0,73 0,16; P&#8804; 0,02). Por outro lado, a expressão proteica de OBR (C=4,4 0,29; L=6,6 0,84; P&#8804;0,05), ER-&#945; (C=0,4 0,02; L=0,6 0,05; P&#8804;0,03) e aromatase (C=0,4 0,03; L=0,5 0,02; P&#8804;0,04) aumentaram, enquanto que a expressão proteica de AR (C=0,16 0,01; L=0,09 0,01; P&#8804;0,009) foi reduzida pela administração de leptina. A análise morfométrica mostrou que a leptina levou a um aumento da área total do túbulo seminífero (C=64,6 3,1; L=56,1 2,1;&#956;m, P&#8804;0,01), aumento da área luminal (C=40,6 2,3; L= 48,7 0,9; &#956;m P&#8804; 0,004) e na altura do epitélio (C=21,5 1,2; L=24,6 1,1; &#956;m, P&#8804;0,03), enquanto que o comprimento do túbulo seminífero foi reduzido no grupo tratado (C=2200 350; L= 1100 110;cm, P&#8804;0,006). A administração de leptina levou a um aumento no número total de espermatozoides (C=20x107 2x107; L=30x107 5x107;Cls/mL, P&#8804;0,009) e no número de anormalidades (C=40,6 1,9; L=45,8 1,2, P&#8804;0,049). Podemos concluir que a leptina tem um papel importante na morfologia e função testicular. A leptina parece ter efeito direto neste tecido uma vez que a expressão gênica e proteica de OBR, AR, ER e aromatase foram alterados pela administração da leptina. / Leptin has an important role in regulating the reproductive system besides its main role in the regulation of body weight and food intake. The aim of this study was to evaluate the effect of leptin administration during the neonatal period in the testis function of the adult offspring. Twenty-four pups from 12 dams were separated into 2 groups: Leptin group: injected with 50&#956;L of leptin (80ng/gBW, subcutaneous); control group: injected with the same volume of saline solution for the first 10 days of life. All animals were killed at 90 days of life. Parameters analyzed: Body weight, linear growth and food consumption; onset of puberty, lipid profile, testosterone and estradiol serum levels, gene (Real time PCR) and protein expression (Western blot) of OBRa, OBRb, aromatase, AR, ER, testicular morphometry, spermatozoa number, morphology and viability. Data were expressed as mean standard error. Statistical significance was determined by students t-test. Leptin injection led to a reduction in food consumption (p&#8804;0.008) from day 26 to 40 and from day 70 onward while body weight (p&#8804;0.03) and linear growth (p&#8804;0.05) were reduced from 26 to 45 days of life. Pituitary (p&#8804;0.0006), hypothalamus (p&#8804;0.01), prostate(p&#8804;0.003), testis (p&#8804;0.008), epididymis(p&#8804;0.004) and bladder (p&#8804;0.009) weights were significantly reduced by leptin injection. Leptin injection also advanced the onset of puberty (C=45.0 0.3; L=41.6 0.3; days, P&#8804;0.0001). In relation to lipid profile, leptin administration led to an increase in TG (C=116.5 15.9; L=172.6 19.7; ng/dL, P&#8804;0.05) and a reduction in HDL (C=33 1.5; L=24 3.5; ng/dL, P&#8804;0.02) serum levels. Testosterone serum levels (C=5.2 1.0; L=1.1 0.28; ng/mL, P&#8804;0.003) were also reduced by leptin. All gene evaluated by real time PCR showed an increase in its expression: OBRa (C=0.32 0.04; L=0.69 0.16; P&#8804;0.04), OBRb (C=0.37 0.06; L=0.70 0.16; P&#8804;0.03), AR (C=0.28 0.02; L=0.71 0.16; P&#8804;0.02), Aromatase (C=0.31 0.04; L=0.53 0.09; P&#8804;0.04), ER-&#945; (C=0.79 0.03; L=0.92 0.03; P&#8804;0.01), ER-&#946; (C=0.29 0.03; L=0.7286 0.16; P&#8804;0.02). On the other hand, the protein expression of OBR (C=4.4 0.29; L=6.6 0.84; P&#8804;0.05), ER-&#945; (C=0.4 0.02; L=0.44 0.02; P&#8804;0.03) and aromatase (C=0.4 0.03; L=0.5 0.01;AU, P&#8804;0.04) were increased while AR (C=0.16 0.01; L=0.09 0.01; P&#8804;0.009) was reduced by leptin administration. The morphometric analysis showed that leptin led to an increase in the total area (C=64.6 3.1; L=56.1 2.1; &#956;m P&#8804;0.01) and luminal areas (C=40.6 2.3; L=48.7 0.9; &#956;m P&#8804;0.004) and in the epithelial height (C=21.5 1.2; L=24.6 1.1; &#956;m P&#8804;0.03), while the length of seminiferous tubule was reduced (C=2200 350; L= 1100 110; cm P&#8804;0.006). Leptin administration led to an increase in the total number of spermatozoa (C=20x107 2x107; L=30x107 5x107; P&#8804;0.009) and in the number of abnormalities (C=40.6 1.9; L=45.8 1.2; P&#8804;0.049). We can conclude that leptin has an important role in the morphology and testis function. The leptin effect seems to be direct in this tissue since the gene and protein expression of OBR, AR, ER and aromatase and spermatozoa number were changed by leptin administration.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The seminal plasma is particularly important in sperm protection against damage caused by reactive oxygen species (ROS). The paraoxonase type 1 (PON1) is a multi-enzymatic complex with antioxidant properties, preventing the increase of ROS quantities, thus protects cell membranes and neutralizes the effects of lipid oxidation. The objective of this study was to correlate the influence of PON1 activity with the CASA system parameters and sperm viability (membrane integrity acrosome integrity, functionality of mitochondria and DNA fragmentation) of swine semen in natura, and investigate the PON1 expression (mRNA) in testicle and epididymis (head, body and tail) tissue of boars. The sperm fraction (FE) presented the major PON1 activity and males 81, 80 and 79 (P<0.05) showed the highest enzyme activity. But, when comparing the differences between the ejaculate samples, our study showed differences (P<0.05) between males 81 and 92 in FE and sperm post fraction (PF). However, when the ejaculated was diluted (1:1), it has presented 44% average reduction in the activity of PON1. The activity of PON1 in FE showed positive correlation with sperm concentration, curvaceous distance, curvy velocity and DNA integrity (P<0.05), and also showed negative correlation with straightness and linearity parameters advised by the CASA system. The mRNA expression was observed only in the body portion of the epididymis. The FE is the part of the ejaculate that more PON1 activity and presented the parameters DCL, VCL, STR and LIN, together, with concentration and sperm viability (integrity of DNA) are those who showed the greatest association with the enzyme. Already the PON1 was only expressed (Mrna) in the body of epididymis pig breeder. / O plasma seminal é particularmente importante na proteção do espermatozoide contra os danos causados pelas espécies reativas ao oxigênio (EROs). A paraoxonase tipo 1 (PON1) é um complexo multienzimático com propriedades antioxidantes, impedindo o aumento da quantidade de EROs, o que confere proteção às membranas celulares e neutraliza os efeitos da oxidação lipídica. O estudo objetivou correlacionar a influência da atividade de PON1 com os parâmetros de avaliação do sistema Computer Assisted Semen Analysis (CASA) e a viabilidade espermática (integridade de membrana, integridade de acrossoma, funcionalidade de mitocôndria e fragmentação do DNA) do sêmen suíno in natura e investigar a expressão da PON1 (RNAm) no tecido do testículo e epidídimo (cabeça, corpo e cauda) do reprodutor suíno adulto. A fração espermática (FE) apresentou a maior atividade de PON1 e os machos 81, 80 e 79 (P<0,05) apresentaram a maior atividade de PON1. Já em relação a comparação entre as diferentes amostras do ejaculado, nosso estudo demonstrou diferenças (P<0,05) nos machos 81 e 92 em relação a FE e a fração pós-espermática (FP). Entretanto, quando o ejaculado foi diluído (1:1) apresentou redução média de 44% na atividade da PON1. A atividade de PON1 na FE apresentou uma correlação positiva com a concentração espermática, DCL, VCL e IDNA (P<0,05) e apresentou correlação negativa para os parâmetros de STR e LIN assessorados pelo sistema CASA. A expressão de RNAm somente foi observada para a porção do corpo do epidídimo. A FE é a parte do ejaculado que mais apresentou atividade da PON1 e os parâmetros DCL, VCL, STR e LIN, juntamente, com concentração e viabilidade espermática (integridade de DNA) são os que apresentaram a maior associação com a enzima. Já a PON1 foi somente expressa (RNAm) no corpo de epidídimo do reprodutor suíno.

Submitted by CARMEN CECÍLIA SICHERLE null (carmensicherle@terra.com.br) on 2016-09-27T16:44:19Z No. of bitstreams: 1 Carmen C Sicherle Tese Semen congelado e inseminação artificial em cães.pdf: 1290427 bytes, checksum: 577b12487088c3d576b6d6746216a3bf (MD5) / Rejected by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo a orientação abaixo: O arquivo submetido está sem a ficha catalográfica. A versão submetida por você é considerada a versão final da dissertação/tese, portanto não poderá ocorrer qualquer alteração em seu conteúdo após a aprovação. Corrija esta informação e realize uma nova submissão contendo o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2016-09-28T16:11:22Z (GMT) / Submitted by CARMEN CECÍLIA SICHERLE null (carmensicherle@terra.com.br) on 2016-09-28T16:23:19Z No. of bitstreams: 1 Carmen C Sicherle Tese final completa.pdf: 1312682 bytes, checksum: dd7bc1c4c462c9d0da09cfa142d48ea4 (MD5) / Rejected by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: A data (mês) que consta na capa e folha de rosto do trabalho deve ser a mesma que consta na folha de aprovação. Corrija estas informações e realize uma nova submissão contendo o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2016-09-28T16:27:18Z (GMT) / Submitted by CARMEN CECÍLIA SICHERLE null (carmensicherle@terra.com.br) on 2016-09-28T16:38:54Z No. of bitstreams: 1 Carmen C Sicherle Tese completa.pdf: 1312570 bytes, checksum: 9e105448cb368db57c02753ea8a7cf32 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-09-28T17:14:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 sicherle_cc_dr_bot.pdf: 1312570 bytes, checksum: 9e105448cb368db57c02753ea8a7cf32 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-28T17:14:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 sicherle_cc_dr_bot.pdf: 1312570 bytes, checksum: 9e105448cb368db57c02753ea8a7cf32 (MD5) Previous issue date: 2016-08-03 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste estudo foi o de avaliar os efeitos da criopreservação sobre a qualidade e fertilidade do sêmen de cão. Para isso foram realizados dois experimentos. No primeiro experimento foram colhidos 4 ejaculados de 5 cães (n=20), os quais foram avaliados no sêmen fresco, resfriado e descongelado. A motilidade total (MT), progressiva (MP) e porcentagem de rápidos (RAP) por sistema computadorizado e por citometria de fluxo, a fluidez da membrana plasmática [Yo-Pro 1 (YP) e merocianina 540 (M540)], a translocação da fosfatilidil serina (FS) (anexina V e FITC-PSA), integridade da membrana plasmática e acrossomal (iodeto de propídeo (IP) combinado ao FITC-PSA), potencial da membrana mitocondrial (JC1), lipoperoxidação dos lipídeos de membrana (LPO, C11-BODIPY) e apoptose (CellEvent®). O sêmen do cão que apresentou melhores resultados numéricos em todas as análises foi escolhido para ser utilizado separadamente para as inseminações (cão 1) e o sêmen dos demais 4 cães foram utilizados em pool. Foram inseminadas 20 cadelas (2 IAs/cadela), por via transcervical (TCIA) sendo 10 delas com o cão 1 e 10 com o pool. Foram utilizadas 2 concentrações espermáticas (160 e 450 x 106 espermatozoides/TCIA). Houve diferença para os índices de motilidade (p < 0,01) entre o sêmen fresco e resfriado quando comparados ao descongelado para todos os índices avaliados, (MT = 87,00 ± 1,24; 88,15 ± 1,38; 72,55 ± 6,26); (MP = 69,95 ± 1,28 ; 71,75 ± 1,91; 56,30 ± 6,00) e (RAP = 83,15 ± 1,94; 81,55 ± 1,53; 64,30 ± 7,68). Em relação a fluidez da membrana espermática houve diferença na porcentagem da população de células íntegras (CI) e de células com aumento de fluidez de membrana (CIMF) (p < 0,01) entre o sêmen fresco e resfriado quando comparados ao descongelado, (CI = 78,29 ± 6,22; 75,76 ± 6,60; 23,02 ± 9,12); (CIMF = 18,33 ± 5,54; 22,55 ± 6,49; 71,78 ± 9,85). Sobre a identificação da translocação da FS houve diferença (p < 0,01) na porcentagem de células íntegras nos 3 momentos avaliados (CI = 79,90 ± 7,95; 63,50 ± 4,66; 27,19 ± 9,22). A porcentagem de células apresentado a membrana plasmática e acrossomal íntegras foi diferente (p < 0,01) também entre o sêmen fresco e resfriado quando comparados ao descongelado (MPAI = 85,71 ± 6,22; 70,37 ± 6,43; 30,87 ± 9,90). Quanto ao potencial da membrana mitocondrial houve diferença (p < 0,01) na porcentagem de células com alto potencial mitocondrial nos 3 momentos avaliados (APM = 85,15 ± 2,76; 60,52 ± 3,31; 38,06 ± 6,40). A LPO da membrana plasmática foi diferente (p < 0,05) no sêmen congelado quando comprado ao resfriado mas não teve diferença entre o sêmen fresco e resfriado e do fresco ao congelado. Não foi observada qualquer diferença, nos momentos estudados, na atividade da caspase. O cão 1 foi significamente melhor para os índices de integridade de membrana plasmática e acrossomal e potencial mitocondrial. Pelo calculo da resposta média do animal e limites mínimos e máximos, apesar de não haver diferença, observamos que o animal 1 apresentou melhores valores pós descongelação para todas os testes realizados. O aumento na concentração espermática foi positivo e observamos 50% de prenhez no grupo inseminado com o pool de sêmen utilizando a concentração de 450 x 106. Nenhuma gestação foi observada nas TCIA com o sêmen do cão 1. Em conclusão a criopreservação leva a alterações estruturais e funcionais da célula espermática, o que explica a sua sobrevivência curta após a descongelação. As mudanças semelhantes a crio-capacitação podem estar relacionadas a outros fatores, como as proteínas do plasma seminal que ainda não são totalmente conhecidas nesta espécie. O processo de apoptose pode ser iniciado com a abertura dos poros mitocondriais durante o processo de congelação/descongelação, o que libera fatores pro-apoptóticos no citoplasma celular. O potencial mitocondrial não está relacionado com a motilidade dos espermatozoides, mas sim com a sobrevivência do espermatozoide. Melhores resultados de gestação puderam ser obtidos quando mais de 100 x 106 de espermatozoides móveis e morfologicamente íntegros for utilizados por TCIA. Não houve relação entre a qualidade seminal, avaliada pelas técnicas aqui descritas, e a fertilidade. / The aims of the study were to assess individual characteristics and sperm concentration of cryopreserved semen characteristics using different structural and functional analysis and dog fertility. Twenty ejaculates were collected from 5 dogs and sperm were cryopreserved by one-step protocol. To better understand dog semen quality after thawing five healthy mature dogs were used to the one-step sperm cryopreservation protocol. Sperm analysis was performed at three time points: after collection, refrigeration, and after thawing, by computer sperm motility analysis (total [TM] and progressive motility [PM], and rapid sperm), membrane damage (membrane fluidity and viability - Yo-Pro 1 and merocianina 540, phosphatidyl serine translocation – annexin – V – propidium iodide - PI, acrosomal and membrane integrity FITC-PSA – PI), mitochondrial potential (JC-1), membrane lipid peroxidation, LPO (BODIPY 581/591 C11) and apoptosis (kit CellEventTM Caspase-3/7- FITC Green Flow Cytometry), evaluated by flow cytometry. Twenty bitches were inseminated by transcervical intrauterine (TCAI), twice using 2 sperm concentration (160 and 450 x 106 spermatozoa/TCAI). A decrease on frozen/thawed semen comparing to fresh and cooled semen occurred for the parameters of total and progressive motility (TM 87.00 ± 1.24, 88.15 ± 1.38, 72.55 ± 6.26; PM 69.95 ± 1.28, 71.75 ± 1.91, 56.30 ± 6.00, fresh cooled and frozen/thawed respectively P < 0.01), percentage of rapids (83.15 ± 1.94, 81.55 ± 1.53, 64.30 ± 7.68 P < 0.01), membrane fluidity and cell viability (78.29 ± 6.22, 75.76 ± 6.60, 23.02 ± 9.12 P < 0.01) and acrosomal and membrane integrity (85.71 ± 6.22, 70.37 ± 6.43, 30.87 ± 9.90 P < 0.01). Sperm cells were affect for cooling and freezing process when analyzed for the translocation of phosphatidyl serine (79.90 ± 7.95, 63.50 ± 4.66, 27.19 ± 9.22 P < 0.01) and high mitochondrial potential (85.15 ± 2.76, 60.52 ± 3.31, 38.06 ± 6.40 P < 0.01). For LPO significant difference was observed in semen after thawing only comparing to cooled semen (16.57 ± 5.44, 16.22 ± 2.43, 23.00 ± 4.13 P < 0.05). No difference on caspase activity was observed. Dog 1 was significantly better for the parameters of plasma membrane and acrosome integrity and mitochondrial potential. By calculating the average of the animal response and minimum and maximum limits, although there is no difference, we observed that the semen from Dog 1 displayed better post thaw values for all analyzes. The pregnancy rate was 0% for dog 1 and 50% for pool at concentration 450 x 106 spermatozoa. In conclusion, cryopreservation leads to structural and functional changes in sperm cell, which explains their short survival after thawing. The cryo-capacitation like changes can be related to others factors, as the seminal plasma proteins that are not know yet on this species. Apoptosis process can be initiated with the opening of mitochondrial pores during the freezing/thaw process, which releases pro-apoptotic factor on the cytoplasm. The mitochondrial potential is not related to sperm motility but sperm survival. Although the dog 1 displayed better sperm quality, no pregnancy was observed, which makes us to rethink the prediction of fertility of semen samples by commonly used parameters. The concentration dose used for AI procedures must consider motility and sperm viability to satisfactory pregnancy rates. / FAPESP: 2013/02050-5

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / A leptina tem um papel importante na regulação do sistema reprodutivo além de seu papel principal na regulação do peso corporal e ingestão alimentar. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da administração de leptina durante o período neonatal na função testicular da prole adulta. Vinte e quatro filhotes de 12 mães foram divididos em 2 grupos: Grupo leptina: injetados com 50 L de leptina (80ng/gPC, subcutânea) nos primeiros 10 dias de vida e Grupo Controle: injetados com o mesmo volume de solução salina. Todos os animais foram sacrificados aos 90 dias de vida. Parâmetros analisados: consumo alimentar, massa corporal, crescimento linear, data de início da puberdade, perfil lipídico, níveis séricos de estradiol e testosterona, expressão gênica (PCR em tempo real) e expressão proteica (Western blot) de ObRa, OBRb, aromatase, AR, ER, morfometria testicular, número, morfologia e viabilidade de espermatozoides. Os dados foram expressos como média erro padrão. A significância estatística foi determinada pelo teste t de Student. A Injeção de leptina levou a uma redução (p&#8804;0,008) no consumo alimentar a partir do dia 26 ao 40 e do dia 70 em diante, enquanto que a massa corporal (p&#8804;0,03) e o crescimento linear (p&#8804;0,05) foram reduzidos do dia 26 até o dia 45. O peso da hipófise (p&#8804;0,0006), hipotálamo (p&#8804;0,01), próstata (p&#8804;0,003), testículo (p&#8804;0,008) e epidídimo (p&#8804;0,004) e bexiga (p&#8804;0,009) foram significativamente reduzidos pela injeção de leptina. A Injeção de leptina adiantou o início da puberdade (C=45,0 0,3; L=41,6 0,3; dias, P&#8804;0,0001). Em relação ao perfil lipídico, a administração de leptina gerou um aumento nos níveis séricos de TG (C= 116,5 15,9; L=172,6 19,7; ng/dL, P&#8804;0,05) e uma redução nos níveis de HDL (C=33 1,5; L = 24 3,5; ng/dL, P&#8804;0,02). Os níveis séricos de testosterona também foram reduzidos pela leptina (C=5,2 1,0; L=1,1 0,3; ng/mL, P&#8804;0,003). Todos os genes avaliados por PCR em tempo real mostraram um aumento na sua expressão: Obra (C=0,32 0,04; L=0,69 0,16; P&#8804;0,04), OBRb (C=0,37 0,06; L=0,71 0,16; P&#8804;0,03), AR (C=0,28 0,02; L=0,71 0,16; P&#8804;0,02), Aromatase (C=0,31 0,04; L=0,53 0,09; P&#8804;0,04), ER-&#945; (C=0,79 0,03; L=0,93 0,03; P&#8804;0,01), ER-&#946; (C=0,29 0,03; L=0,73 0,16; P&#8804; 0,02). Por outro lado, a expressão proteica de OBR (C=4,4 0,29; L=6,6 0,84; P&#8804;0,05), ER-&#945; (C=0,4 0,02; L=0,6 0,05; P&#8804;0,03) e aromatase (C=0,4 0,03; L=0,5 0,02; P&#8804;0,04) aumentaram, enquanto que a expressão proteica de AR (C=0,16 0,01; L=0,09 0,01; P&#8804;0,009) foi reduzida pela administração de leptina. A análise morfométrica mostrou que a leptina levou a um aumento da área total do túbulo seminífero (C=64,6 3,1; L=56,1 2,1;&#956;m, P&#8804;0,01), aumento da área luminal (C=40,6 2,3; L= 48,7 0,9; &#956;m P&#8804; 0,004) e na altura do epitélio (C=21,5 1,2; L=24,6 1,1; &#956;m, P&#8804;0,03), enquanto que o comprimento do túbulo seminífero foi reduzido no grupo tratado (C=2200 350; L= 1100 110;cm, P&#8804;0,006). A administração de leptina levou a um aumento no número total de espermatozoides (C=20x107 2x107; L=30x107 5x107;Cls/mL, P&#8804;0,009) e no número de anormalidades (C=40,6 1,9; L=45,8 1,2, P&#8804;0,049). Podemos concluir que a leptina tem um papel importante na morfologia e função testicular. A leptina parece ter efeito direto neste tecido uma vez que a expressão gênica e proteica de OBR, AR, ER e aromatase foram alterados pela administração da leptina. / Leptin has an important role in regulating the reproductive system besides its main role in the regulation of body weight and food intake. The aim of this study was to evaluate the effect of leptin administration during the neonatal period in the testis function of the adult offspring. Twenty-four pups from 12 dams were separated into 2 groups: Leptin group: injected with 50&#956;L of leptin (80ng/gBW, subcutaneous); control group: injected with the same volume of saline solution for the first 10 days of life. All animals were killed at 90 days of life. Parameters analyzed: Body weight, linear growth and food consumption; onset of puberty, lipid profile, testosterone and estradiol serum levels, gene (Real time PCR) and protein expression (Western blot) of OBRa, OBRb, aromatase, AR, ER, testicular morphometry, spermatozoa number, morphology and viability. Data were expressed as mean standard error. Statistical significance was determined by students t-test. Leptin injection led to a reduction in food consumption (p&#8804;0.008) from day 26 to 40 and from day 70 onward while body weight (p&#8804;0.03) and linear growth (p&#8804;0.05) were reduced from 26 to 45 days of life. Pituitary (p&#8804;0.0006), hypothalamus (p&#8804;0.01), prostate(p&#8804;0.003), testis (p&#8804;0.008), epididymis(p&#8804;0.004) and bladder (p&#8804;0.009) weights were significantly reduced by leptin injection. Leptin injection also advanced the onset of puberty (C=45.0 0.3; L=41.6 0.3; days, P&#8804;0.0001). In relation to lipid profile, leptin administration led to an increase in TG (C=116.5 15.9; L=172.6 19.7; ng/dL, P&#8804;0.05) and a reduction in HDL (C=33 1.5; L=24 3.5; ng/dL, P&#8804;0.02) serum levels. Testosterone serum levels (C=5.2 1.0; L=1.1 0.28; ng/mL, P&#8804;0.003) were also reduced by leptin. All gene evaluated by real time PCR showed an increase in its expression: OBRa (C=0.32 0.04; L=0.69 0.16; P&#8804;0.04), OBRb (C=0.37 0.06; L=0.70 0.16; P&#8804;0.03), AR (C=0.28 0.02; L=0.71 0.16; P&#8804;0.02), Aromatase (C=0.31 0.04; L=0.53 0.09; P&#8804;0.04), ER-&#945; (C=0.79 0.03; L=0.92 0.03; P&#8804;0.01), ER-&#946; (C=0.29 0.03; L=0.7286 0.16; P&#8804;0.02). On the other hand, the protein expression of OBR (C=4.4 0.29; L=6.6 0.84; P&#8804;0.05), ER-&#945; (C=0.4 0.02; L=0.44 0.02; P&#8804;0.03) and aromatase (C=0.4 0.03; L=0.5 0.01;AU, P&#8804;0.04) were increased while AR (C=0.16 0.01; L=0.09 0.01; P&#8804;0.009) was reduced by leptin administration. The morphometric analysis showed that leptin led to an increase in the total area (C=64.6 3.1; L=56.1 2.1; &#956;m P&#8804;0.01) and luminal areas (C=40.6 2.3; L=48.7 0.9; &#956;m P&#8804;0.004) and in the epithelial height (C=21.5 1.2; L=24.6 1.1; &#956;m P&#8804;0.03), while the length of seminiferous tubule was reduced (C=2200 350; L= 1100 110; cm P&#8804;0.006). Leptin administration led to an increase in the total number of spermatozoa (C=20x107 2x107; L=30x107 5x107; P&#8804;0.009) and in the number of abnormalities (C=40.6 1.9; L=45.8 1.2; P&#8804;0.049). We can conclude that leptin has an important role in the morphology and testis function. The leptin effect seems to be direct in this tissue since the gene and protein expression of OBR, AR, ER and aromatase and spermatozoa number were changed by leptin administration.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-08-01T15:31:24Z No. of bitstreams: 1 Andre Mariano Batista.pdf: 715032 bytes, checksum: 92e93d004a4a86c672f3ad4c9e8e4af1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-01T15:31:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andre Mariano Batista.pdf: 715032 bytes, checksum: 92e93d004a4a86c672f3ad4c9e8e4af1 (MD5) Previous issue date: 2009-02-12 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Sperm processing methods are routinely applied on the in vitro fertilization (IVF) systems for various species with the objective to remove seminal plasma/crioprotectant and to increase sperm quality. Aiming at study the sperm viability after use of the Swim-up or density gradient methods (Percoll® and CapriPure®) in frozen-thawed goat semen samples for use in assisted reproduction, six Boer goat semen samples were collected. Following, the samples were evaluated for concentration, progressive motility and morphology, diluted, packaged in straws (0.25 mL), frozen using machine and stored in liquid nitrogen. After thawing (37 oC for 30 s), sperm of all six goat were mixed-up making a pool and then were evaluated for progressive motility, membrane integrity (PI/DCF), acrossomal integrity (FITC/PNA) and mitochondrial membrane potential (JC-1). After that, the pool was split into two aliquots for the accomplishment of the sperm selection using the methods Swim-up and Percoll® (Experiment 1) and centrifugation in Percoll® and CapriPure® density gradient (Experiment 2). After use of each method of selection, the analyses was proceeded it from progressive motility, membrane integrity, acrossomal integrity and of mitochondrial integrity. Exp. 1 evidenced lower percentage of progressive motility spermatozoa (P<0.05) with intact plasma membrane (P<0.01) after use of Swim-up method, when compared with samples submitted to sperm preparation with Percoll®. In the Exp. 2, Percoll® gradient determined reduction (P<0.05) in percentage of acrosome intact spermatozoa when compared with percentage of the sample immediately after thawing, not having significant difference (P>0.05) if comparing submitted samples with the CapriPure® gradient. There were significant differences in the percentage of spermatozoa with high mitochondrial membrane potential inthe samples of semen submitted the selection using Percoll® (P<0.05) and CapriPure® (P<0.01), density gradients, when compared with the values of samples evaluated immediately after thawing. However, there were no significant difference (P<0.05) in the high mitochondrial membrane potential values between Percoll® and CapriPure® density gradients. On the basis the results of mobile spermatozoa and with the intact plasma membrane, are possible to conclude that to select viable sperm of frozen goat semen samples should use density gradient methods and CapriPure® is a good alternative to Percoll®. / Métodos de processamento espermático são rotineiramente utilizados nos sistemas de fertilização in vitro (FIV) de várias espécies, com o objetivo de remover o plasma seminal/crioprotetores e aumentar a qualidade espermática. Visando estudar a viabilidade espermática após utilização dos métodos Swim-up ou gradiente de densidade (Percoll® e CapriPure®) em amostras criopreservadas de sêmen caprino para uso em reprodução assistida, foram colhidas amostras de sêmen de seis reprodutores Boer. A seguir, as amostras foram avaliadas (motilidade progressiva, concentração, e morfologia), submetidas a duas lavagens em solução Tris, diluídas, envasadas em palhetas (0,25 mL), criopreservadas em máquina e armazenadas em botijão criobiológico (-196 oC). Após descongelação (37 oC; 30 segundos),procedeu-se à formação do pool das amostras dos reprodutores de cada dia de congelação e, a seguir, a avaliação de integridade de membrana (IP/DCF), integridade acrossomal (FITC/PNA) e potencial de membrana mitocondrial (JC-1). Em seguida, o pool foi dividido em duas alíquotas para a realização da seleção espermática utilizando os métodos Swim-up e Percoll® (Experimento 1) e centrifugação em gradiente de densidade Percoll® e CapriPure® (Experimento 2). Após utilização de cada método de seleção, procederam-se às análises de motilidade progressiva, concentração, integridade de membrana, integridade acrossomal e potencial de membrana mitocondrial. No Exp. 1 foram constatados menores porcentuais de espermatozóides portadores de motilidade progressiva (P<0,05) e de espermatozóides com membranas intactas (P<0,01) após utilização do método Swim-up, quando comparado as amostras submetidas à preparação espermática com Percoll®. No Exp. 2, o gradiente de Percoll® determinou redução (P<0,05) no porcentual de espermatozóides portadores de acrossoma intacto quando comparado ao porcentual da amostra imediatamente após a descongelação, não havendo diferença significativa (P>0,05) ao se comparar às amostras submetidas ao gradiente CapriPure®. Houve diferença significativa nos porcentuais de espermatozóides com alto potencial de membrana mitocondrial nas amostras de sêmen submetidas à seleção utilizando os gradientes de densidade Percoll® (P<0,05) e CapriPure® (P<0,01), quando comparado aos valores das amostras avaliadas imediatamente após a descongelação. No entanto, nenhuma diferença (P>0,05) foi observada entre os porcentuais de espermatozóides com alto potencial de membrana mitocondrial das amostras submetidas à seleção utilizando os gradientes de densidade Percoll® e CapriPure®. Com base nos resultados de espermatozóides móveis e com membranas intactas, é possível concluir que, para selecionar espermatozóides viáveis de amostras congeladas de sêmen caprino, deve-se usar a centrifugação em gradiente de densidade, e que o CapriPure® é uma boa alternativa ao uso doPercoll®.

A ausência de trabalhos verificando a melhor concentração de espermatozoides para se congelar o sêmen de cachaços em palhetas de 0,5 mL, gerou a necessidade deste estudo. Foi proposto, por meio deste expererimento, encontrar uma quantidade ideal, ou seja, uma concentração em que se consiga congelar o maior número de espermatozoides por palheta, sem aumentar os danos já causados pelo processo de criopreservação dos espermatozoides de cachaços. Diante disso, foram realizadas 5 coletas de 5 cachaços (n=25), utilizando apenas a fração rica do ejaculado. Estes foram divididos em cinco concentrações espermáticas diferentes, a saber: 100, 200, 300, 600 e 800x106 espermatozoides/mL e congelados em palhetas de 0,5mL. Após o processo de criopreservação, realizado por um sistema automatizado, as plalhetas foram acondicionadas em botijão criogênico. Para as análises, 2 palhetas de cada concentração foram descongeladas em banho maria (37ºC por 30 segundos) e submetido às avaliações das características de motilidade por meio do CASA, citometria de fluxo para a análise da integridade das membranas acrossomal e plasmática, potencial mitocondrial, peroxidação lipídica e fluidez da membrana espermática (capacitação), além da morfologia espermática por microscopia de contraste de interferência diferencial de fase. As variáveis avaliadas foram submetidas à análise de variância e ao teste de média PDDIF, ao nível de 5%. O aumento da concentração espermática, na palheta de 0,5mL, afetou significativamente (p<0,05) a motilidade total e progressiva, velocidade progressiva, velocidade de trajeto, linearidade, retilinearidade, frequência de batimento flagelar e hiperativação. O aumento do número de espermartozoides na palheta não alterou (p>0,05) a porcentagem de células que apresentavam simultaneamente a integridade das membranas plasmática e acrossomal e com potencial mitocondrial (MIAIAP), o aumento não influenciou (p>0,05) as variáveis peroxidação lipídica, capacitação e morfologia espermática. Baseado nos resultados, pode-se sugerir a congelação de até 300x106 espermatozoides/mL, na palheta de 0,5 mL, sem maiores danos à motilidade e integridade das membranas espermáticas. / The lack of studies veryfing the best concentration of sperm to freeze the boar semen in 0.5 ml straws, bring forth necessity for this study. The experiment proposed to find an optimal amount, in other words a concentration that is possible to freeze the higher number of spermatozoa per straw without increasing the damage already caused by the process of cryopreservation of boar spermatozoa. Therefore, there were 5 semen collections of 5 boars (n = 25) using only the rich fraction of the ejaculate. They were divided into five different sperm concentrations, namely 100, 200, 300, 600 and 800x106 sperm/mL and frozen in 0.5 mL straw. After the cryopreservation process, carried out by an automated system, straws were placed in cryogenic cylinders. For the analysis, two straws of each concentration were thawed in water bath (37°C for 30 seconds) and subjected to evaluations of motility characteristics through CASA, flow cytometry to analyze the integrity of the acrosome and plasma membrane, mitochondrial potential, peroxidation and lipid fluidity of sperm membrane (capacitation), and the sperm morphology by phase differential interference contrast microscopy. The variables were subjected to analysis of variance and the average test PDDIF, at 5%. The increased sperm concentration, in the 0.5mL straw, affected significantly (p <0.05) total and progressive motility, progressive velocity, path velocity, linearity, straightness, flagellar beat frequency and hyperactivation. The increase in the spermatozoa number, in 0,05 mL straw, did not change (p> 0.05) the percentage of cells that simultaneously showed the integrity of plasma and acrosomal membranes and with high mitochondrial potential (MIAIHM), the increase did not affect (p> 0.05) the lipid peroxidation variables, training and sperm morphology. Based on the results, it can be suggested to freeze with 300x106 spermatozoa/mL, in 0.5 mL straw, without major damage to the integrity and motility of the sperm membrane.

O objetivo deste trabalho foi avaliar mediante testes in vitro as características espermáticas de partidas de sêmen bovino e o impacto sobre a fertilidade quando utilizadas em um programas de IATF. Foram realizados 4 experimentos que serão descritos em forma de artigos científicos. No artigo 1 comparam-se a qualidade do sêmen determinada por métodos subjetivos e objetivos para a análise espermática in vitro de partidas de sêmen bovino. Foram analisadas 80 partidas de sêmen de dois touros, através de análises convencionais (motilidade subjetiva, vigor e morfologia espermática), de acordo com os resultados foram estabelecidos 3 grupos: Alta qualidade (A), Boa qualidade (B) e Qualidade questionável (Q). Posteriormente foram analisados os resultados das análises objetivas usando sondas fluorescentes por microscopia de epifluorescência para determinar a integridade de membranas plasmática, acrossomal e potencial de membrana mitocondrial (%PIAIA); e usando o sistema computadorizado de avaliação da motilidade espermática (CASA), o efeito foi avaliado mediante ANOVA e Tukey 5%. Posteriormente, foram utilizadas 67 partidas para determinar a concordância em determinar a qualidade seminal de acordo com três métodos de avaliação seminal: (1) Análise subjetiva considerando a Motilidade subjetiva, vigor e morfologia espermática (2) Análise pelo CASA levando em consideração a MT, VCL, VSL e VAP e (3) Análise por sondas fluorescentes considerando a %PIAIA. Foram realizadas análises de correlação de Pearson e análise de concordância (significância do Kappa). No artigo 2 foram utilizadas 18 partidas de sêmen classificadas de acordo com o índice de fertilidade de cada touro em dois grupos: de Alta (n=9) e Baixa fertilidade (n=9). A classificação do escore foi proporcionada pela central com base em dados provenientes de 33.198 serviços por IATF. As partidas foram submetidas às análises convencionais, CASA, análise por sondas fluorescentes para avaliar a porcentagem de PIAIA em microscopia de epifluorescência e produção de marcadores mitocondriais por sondas fluorescentes na citometria de fluxo. Foram realizadas análises de correlação de Pearson todas as características espermáticas e os efeitos entre grupos de fertilidade foram avaliados mediante ANOVA e Tukey 5%. No artigo 3 o objetivo determinar a relação entre qualidade espermática medida pela produção de marcadores mitocondriais e integridade das estruturas espermáticas com a taxa de prenhez (TP%) resultante de um programa de inseminação artificial e tempo fixo (IATF). Neste estudo, 29 partidas de sêmen convencional usadas para inseminar 4.795 vacas da raça Nelore submetidas ao mesmo protocolo de IATF, e após o diagnóstico de prenhez foram classificadas em três grupos: Alta fertilidade (A) com TP &ge;60%, Média fertilidade (M) TP entre 53,0 e 59,9% e de Baixa fertilidade (B) TP &lt;52,2%. Doses de sêmen das mesmas partidas foram descongeladas a 37&deg;C durante 30 segundos e submetidas às análises convencionais, CASA, análise por sondas fluorescentes para avaliar a porcentagem de PIAIA em microscopia de epifluorescência e produção de marcadores mitocondriais por sondas fluorescentes na citometria de fluxo. Foram realizadas análises de correlação de Spearman para todas as características espermáticas e os efeitos entre grupos de fertilidade foram avaliados mediante ANOVA e Tukey 5%. No artigo 4 o objetivo foi determinar as subpopulações pela morfometria espermática em partidas de sêmen com diferente escore de fertilidade. Foram utilizadas 13 partidas de sêmen de 6 touros, sendo três touros de alto escore de fertilidade (n=9) e três de baixo escore de fertilidade (n=9). Duas palhetas de cada partida foram descongeladas e uma alíquota foi depositada em formol salino (4%) e posteriormente foi feito a análise por gota húmida para aquisição de 200 imagens da cabeça espermática que foram processadas pelo programa Imagem J para determinação da morfometria, os dados foram submetidos a análise multivariada de agrupamento para formação de subpopulações pelo método de Wards e posteriormente o efeito do grupo de fertilidade foi avaliado por ANOVA e Tukey 5%. Os resultados mostraram que os marcadores da função mitocondrial são bons indicadores da função e qualidade espermática; no entanto a heterogeneidade do sêmen bovino, com subpopulações espermáticas com boa e má qualidade, varia entre touros e entre partidas do mesmo touro e gera confusão na resposta de algumas análises. Determinou-se também, que a presença de subpopulações espermáticas (SBP) com variação na morfometria da cabeça (SBP1, SBP2, SBP3 e SBP4), sendo que a SBP4 foi associada com baixo escore de fertilidade. A conclusão geral é que a qualidade seminal impacta na fertilidade in vivo em bovinos. Sendo que a morfometria da cabeça espermática e funcionalidade das mitocôndrias teve maior impacto. No entanto, todas as características de qualidade espermática devem ser avaliadas em conjunto para determinar o potencial de fertilidade de uma amostra seminal. / The objective of this study was to evaluate the sperm characteristics of bovine semen and the impact on fertility when used in an IATF program. Four experiments were carried out and described in the form of scientific articles. In article 1. We compared the semen quality determined by subjective and objective methods for the in vitro sperm analysis of bovine semen. According to the results, three groups were analyzed: high quality (A), good quality (B) and high quality (A), Questionable quality (Q). Subsequently, the results of objective analyzes using fluorescence probes by epifluorescence microscopy were analyzed to determine the integrity of plasma, acrosomal membrane and mitochondrial membrane potential (% PIAIA); And using the computerized sperm motility evaluation system (CASA), the effect was evaluated using ANOVA and Tukey 5%. Afterwards, 67 matches were used to determine the agreement to determine seminal quality according to three methods of seminal evaluation: (1) Subjective analysis considering subjective motility, vigor and sperm morphology (2) Analysis by CASA taking into consideration the TM, VCL, VSL and VAP and (3) Analysis by fluorescent probes considering % PIAIA. Pearson correlation analysis and concordance analysis (Kappa significance) were performed. In article 2, 18 sets of semen were classified according to the fertility index of each bull in two groups: High fertility (n = 9) and Low fertility (n = 9). The classification of the score was provided by the central office based on data from 33,198 services by IATF. The semen were subjected to conventional analyzes, CASA, fluorescent probe analysis to evaluate the percentage of PIAIA in epifluorescence microscopy and production of mitochondrial markers by fluorescent probes in flow cytometry. Pearson correlation analyzes were performed on all sperm characteristics and effects between fertility groups were evaluated using ANOVA and Tukey 5%. In article 3 the objective was to determine the relationship between sperm quality measured by the production of mitochondrial markers and the integrity of the spermatic structures with the pregnancy rate (TP%) resulting from an artificial insemination and fixed time (IATF) program. In this study, 29 departures of conventional semen used to inseminate 4,795 Nelore cows submitted to the same IATF protocol, and after diagnosis of pregnancy were classified into three groups: High fertility (A) with TP &ge; 60%, Average fertility ( M) TP between 53.0 and 59.9% and Low fertility (B) TP &lt;52.2%. Semen doses of the same departures were thawed at 37 &deg; C for 30 seconds and subjected to conventional, CASA, fluorescent probe analysis to evaluate the percentage of PIAIA in epifluorescence microscopy and production of mitochondrial markers by fluorescent probes in flow cytometry. Spearman correlation analyzes were performed on all sperm characteristics and effects between fertility groups were evaluated using ANOVA and Tukey 5%. In article 3, 18 sets of semen were classified according to the fertility index of each bull in two groups: High (n = 9) and Low fertility (n = 9). The classification of the score was provided by the central office based on data from 33,198 services by IATF. The matches were subjected to conventional analyzes, CASA, fluorescent probe analysis to evaluate the percentage of PIAIA in epifluorescence microscopy and production of mitochondrial markers by fluorescent probes in flow cytometry. Pearson correlation analyzes were performed on all sperm characteristics and effects between fertility groups were evaluated using ANOVA and Tukey 5%. In article 4 the objective was to determine subpopulations by sperm morphometry in semen matches with different fertility scores. Seventeen sets of six bulls were used, three bulls with a high fertility score (n = 9) and three with a low fertility score (n = 9). Two straws of each set were thawed and an aliquot was deposited in saline formaldehyde (4%) and then the wet analysis was performed to acquire 200 images of the spermatic head that were processed by the Image J program to determine morphometry, the data were submitted to a multivariate cluster analysis for clusters by the Ward\'s method and later the effect of the fertility group was evaluated by ANOVA and Tukey 5%. The results showed that markers of mitochondrial function are good indicators of sperm function and quality; However, the heterogeneity of bovine semen, with good and poor quality sperm subpopulations, varies between bulls and between straws and creates confusion in the response of some analyzes. It was also determined that the presence of sperm subpopulations (SBP) with variation in head morphometry (SBP1, SBP2, SBP3 and SBP4), and SBP4 was associated with a low fertility score. The overall conclusion is that seminal quality influences in vivo fertility in cattle. Being that the morphometry of the spermatic head and functionality of the mitochondria had greater impact. However, all sperm quality characteristics should be evaluated together to determine the fertility potential of a seminal sample.