O objetivo deste trabalho foi avaliar mediante testes in vitro as características espermáticas de partidas de sêmen bovino e o impacto sobre a fertilidade quando utilizadas em um programas de IATF. Foram realizados 4 experimentos que serão descritos em forma de artigos científicos. No artigo 1 comparam-se a qualidade do sêmen determinada por métodos subjetivos e objetivos para a análise espermática in vitro de partidas de sêmen bovino. Foram analisadas 80 partidas de sêmen de dois touros, através de análises convencionais (motilidade subjetiva, vigor e morfologia espermática), de acordo com os resultados foram estabelecidos 3 grupos: Alta qualidade (A), Boa qualidade (B) e Qualidade questionável (Q). Posteriormente foram analisados os resultados das análises objetivas usando sondas fluorescentes por microscopia de epifluorescência para determinar a integridade de membranas plasmática, acrossomal e potencial de membrana mitocondrial (%PIAIA); e usando o sistema computadorizado de avaliação da motilidade espermática (CASA), o efeito foi avaliado mediante ANOVA e Tukey 5%. Posteriormente, foram utilizadas 67 partidas para determinar a concordância em determinar a qualidade seminal de acordo com três métodos de avaliação seminal: (1) Análise subjetiva considerando a Motilidade subjetiva, vigor e morfologia espermática (2) Análise pelo CASA levando em consideração a MT, VCL, VSL e VAP e (3) Análise por sondas fluorescentes considerando a %PIAIA. Foram realizadas análises de correlação de Pearson e análise de concordância (significância do Kappa). No artigo 2 foram utilizadas 18 partidas de sêmen classificadas de acordo com o índice de fertilidade de cada touro em dois grupos: de Alta (n=9) e Baixa fertilidade (n=9). A classificação do escore foi proporcionada pela central com base em dados provenientes de 33.198 serviços por IATF. As partidas foram submetidas às análises convencionais, CASA, análise por sondas fluorescentes para avaliar a porcentagem de PIAIA em microscopia de epifluorescência e produção de marcadores mitocondriais por sondas fluorescentes na citometria de fluxo. Foram realizadas análises de correlação de Pearson todas as características espermáticas e os efeitos entre grupos de fertilidade foram avaliados mediante ANOVA e Tukey 5%. No artigo 3 o objetivo determinar a relação entre qualidade espermática medida pela produção de marcadores mitocondriais e integridade das estruturas espermáticas com a taxa de prenhez (TP%) resultante de um programa de inseminação artificial e tempo fixo (IATF). Neste estudo, 29 partidas de sêmen convencional usadas para inseminar 4.795 vacas da raça Nelore submetidas ao mesmo protocolo de IATF, e após o diagnóstico de prenhez foram classificadas em três grupos: Alta fertilidade (A) com TP ≥60%, Média fertilidade (M) TP entre 53,0 e 59,9% e de Baixa fertilidade (B) TP <52,2%. Doses de sêmen das mesmas partidas foram descongeladas a 37°C durante 30 segundos e submetidas às análises convencionais, CASA, análise por sondas fluorescentes para avaliar a porcentagem de PIAIA em microscopia de epifluorescência e produção de marcadores mitocondriais por sondas fluorescentes na citometria de fluxo. Foram realizadas análises de correlação de Spearman para todas as características espermáticas e os efeitos entre grupos de fertilidade foram avaliados mediante ANOVA e Tukey 5%. No artigo 4 o objetivo foi determinar as subpopulações pela morfometria espermática em partidas de sêmen com diferente escore de fertilidade. Foram utilizadas 13 partidas de sêmen de 6 touros, sendo três touros de alto escore de fertilidade (n=9) e três de baixo escore de fertilidade (n=9). Duas palhetas de cada partida foram descongeladas e uma alíquota foi depositada em formol salino (4%) e posteriormente foi feito a análise por gota húmida para aquisição de 200 imagens da cabeça espermática que foram processadas pelo programa Imagem J para determinação da morfometria, os dados foram submetidos a análise multivariada de agrupamento para formação de subpopulações pelo método de Wards e posteriormente o efeito do grupo de fertilidade foi avaliado por ANOVA e Tukey 5%. Os resultados mostraram que os marcadores da função mitocondrial são bons indicadores da função e qualidade espermática; no entanto a heterogeneidade do sêmen bovino, com subpopulações espermáticas com boa e má qualidade, varia entre touros e entre partidas do mesmo touro e gera confusão na resposta de algumas análises. Determinou-se também, que a presença de subpopulações espermáticas (SBP) com variação na morfometria da cabeça (SBP1, SBP2, SBP3 e SBP4), sendo que a SBP4 foi associada com baixo escore de fertilidade. A conclusão geral é que a qualidade seminal impacta na fertilidade in vivo em bovinos. Sendo que a morfometria da cabeça espermática e funcionalidade das mitocôndrias teve maior impacto. No entanto, todas as características de qualidade espermática devem ser avaliadas em conjunto para determinar o potencial de fertilidade de uma amostra seminal. / The objective of this study was to evaluate the sperm characteristics of bovine semen and the impact on fertility when used in an IATF program. Four experiments were carried out and described in the form of scientific articles. In article 1. We compared the semen quality determined by subjective and objective methods for the in vitro sperm analysis of bovine semen. According to the results, three groups were analyzed: high quality (A), good quality (B) and high quality (A), Questionable quality (Q). Subsequently, the results of objective analyzes using fluorescence probes by epifluorescence microscopy were analyzed to determine the integrity of plasma, acrosomal membrane and mitochondrial membrane potential (% PIAIA); And using the computerized sperm motility evaluation system (CASA), the effect was evaluated using ANOVA and Tukey 5%. Afterwards, 67 matches were used to determine the agreement to determine seminal quality according to three methods of seminal evaluation: (1) Subjective analysis considering subjective motility, vigor and sperm morphology (2) Analysis by CASA taking into consideration the TM, VCL, VSL and VAP and (3) Analysis by fluorescent probes considering % PIAIA. Pearson correlation analysis and concordance analysis (Kappa significance) were performed. In article 2, 18 sets of semen were classified according to the fertility index of each bull in two groups: High fertility (n = 9) and Low fertility (n = 9). The classification of the score was provided by the central office based on data from 33,198 services by IATF. The semen were subjected to conventional analyzes, CASA, fluorescent probe analysis to evaluate the percentage of PIAIA in epifluorescence microscopy and production of mitochondrial markers by fluorescent probes in flow cytometry. Pearson correlation analyzes were performed on all sperm characteristics and effects between fertility groups were evaluated using ANOVA and Tukey 5%. In article 3 the objective was to determine the relationship between sperm quality measured by the production of mitochondrial markers and the integrity of the spermatic structures with the pregnancy rate (TP%) resulting from an artificial insemination and fixed time (IATF) program. In this study, 29 departures of conventional semen used to inseminate 4,795 Nelore cows submitted to the same IATF protocol, and after diagnosis of pregnancy were classified into three groups: High fertility (A) with TP ≥ 60%, Average fertility ( M) TP between 53.0 and 59.9% and Low fertility (B) TP <52.2%. Semen doses of the same departures were thawed at 37 ° C for 30 seconds and subjected to conventional, CASA, fluorescent probe analysis to evaluate the percentage of PIAIA in epifluorescence microscopy and production of mitochondrial markers by fluorescent probes in flow cytometry. Spearman correlation analyzes were performed on all sperm characteristics and effects between fertility groups were evaluated using ANOVA and Tukey 5%. In article 3, 18 sets of semen were classified according to the fertility index of each bull in two groups: High (n = 9) and Low fertility (n = 9). The classification of the score was provided by the central office based on data from 33,198 services by IATF. The matches were subjected to conventional analyzes, CASA, fluorescent probe analysis to evaluate the percentage of PIAIA in epifluorescence microscopy and production of mitochondrial markers by fluorescent probes in flow cytometry. Pearson correlation analyzes were performed on all sperm characteristics and effects between fertility groups were evaluated using ANOVA and Tukey 5%. In article 4 the objective was to determine subpopulations by sperm morphometry in semen matches with different fertility scores. Seventeen sets of six bulls were used, three bulls with a high fertility score (n = 9) and three with a low fertility score (n = 9). Two straws of each set were thawed and an aliquot was deposited in saline formaldehyde (4%) and then the wet analysis was performed to acquire 200 images of the spermatic head that were processed by the Image J program to determine morphometry, the data were submitted to a multivariate cluster analysis for clusters by the Ward\'s method and later the effect of the fertility group was evaluated by ANOVA and Tukey 5%. The results showed that markers of mitochondrial function are good indicators of sperm function and quality; However, the heterogeneity of bovine semen, with good and poor quality sperm subpopulations, varies between bulls and between straws and creates confusion in the response of some analyzes. It was also determined that the presence of sperm subpopulations (SBP) with variation in head morphometry (SBP1, SBP2, SBP3 and SBP4), and SBP4 was associated with a low fertility score. The overall conclusion is that seminal quality influences in vivo fertility in cattle. Being that the morphometry of the spermatic head and functionality of the mitochondria had greater impact. However, all sperm quality characteristics should be evaluated together to determine the fertility potential of a seminal sample.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-07-27T18:58:25Z No. of bitstreams: 1 carolinamarinhodeassuncao.pdf: 1072103 bytes, checksum: 9a380e0469f7cdaa891cb6b94e580479 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-07-28T12:13:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 carolinamarinhodeassuncao.pdf: 1072103 bytes, checksum: 9a380e0469f7cdaa891cb6b94e580479 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-28T12:13:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 carolinamarinhodeassuncao.pdf: 1072103 bytes, checksum: 9a380e0469f7cdaa891cb6b94e580479 (MD5) Previous issue date: 2016-03-28 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Apesar da grande aplicação do sêmen congelado na bovinocultura, a criopreservação ainda resulta em considerável diminuição da viabilidade e fertilidade espermática. Diversos fatores são responsáveis por essa perda, sendo importante ressaltar os danos causados ao espermatozoide pelo estresse oxidativo. O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito antioxidante resveratrol na criopreservação de sêmen bovino. Foram utilizados oito touros holandeses selecionados previamente por exame andrológico. O sêmen foi diluído em meio Tris-gema-glicerol e divididos nos grupos: R0 (controle- sem antioxidante), R1 (50 μM de resveratrol), R2 (100 μM de resveratrol) e R3 (1000 μM de resveratrol). Os espermatozoides após o descongelamento foram avaliados através da análise de motilidade e vigor espermáticos por microscopia de contraste de fase, parâmetros cinéticos por sistema automatizado (CASA), integridade de membrana plasmática e acrossomal, função mitocondrial e fertilidade in vitro. Os dados foram analisados por ANOVA e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey-Krammer e Student-Newman-Keuls ao nível de significância de 5% através dos programas Statistical Analysis System (SAS Institute, Cay, NC, USA) e Graph Pad Prism versão 5 (Graph Pad Software, California, Estados Unidos). Na análise de motilidade do sêmen por microscopia óptica observou-se maior média (P<0,05) do tratamento R1 em relação a R3, não sendo estes diferentes (P>0,05) do controle e de R2. Entretanto, os resultados da análise de motilidade progressiva pelo CASA mostraram que o tratamento com resveratrol 50 μM apresentou melhor (P<0,05) resultado em relação ao controle e outros tratamentos. Os dados dos parâmetros cinéticos do CASA também revelaram um número maior de espermatozoides com trajetória linear no grupo R1. Há também mais células com membrana plasmática integra no grupo tratado (R1) em relação ao controle. Na análise de função mitocondrial e na produção in vitro de embriões não houve diferença entre controle e tratamento (P>0,05). Conclui-se que o resveratrol na concentração de 50 μM protege a membrana plasmática de células espermáticas e melhora parâmetros cinéticos do sêmen sem alterar a capacidade fecundante do espermatozoide. / Despite the wide application of frozen semen in livestock, cryopreservation yet results in decrease in viability and fertility of sperm. Several factors are responsible for this loss as injuries caused on sperm by oxidative stress. The aim of the study was to evaluate the antioxidant effect of resveratrol on cryopreservation of bovine sperm. We used eight Holstein bulls selected previously by andrological exam. Semen was diluted in Tris-yolk-glycerol extender and distributed in groups: R0 (control - no antioxidant), R1 (50 μM resveratrol), R2 (100 μM resveratrol) and R3 (1000 μM resveratrol). Motility and vigorous thawed bull sperm were evaluated by phase contrast microscopy and kinetics parameters by an automated system (CASA). Plasmatic and acrosomal membrane integrity, mitochondrial function, and in vitro fertilization were also evaluated in thawed sperm. The data were analyzed by ANOVA and averages were compared by Tukey-Krammer and Student-Newman-Keuls tests by the Statistical Analysis System (SAS Institute, Cay, NC, USA) and Graph Pad Prism versão 5 (Graph Pad Software, California, Estados Unidos). The level of 5% was considered significant. With optical microscopy was observed higher sperm motility in treatment R1 than R3, and they were not different (P>0.05) to control and R2. However, the results of progressive motility analysis by CASA showed that treatment with 50 μM resveratrol had better (P <0.05) results than control and other treatments. The data of the kinetic parameters of CASA also revealed greater (P <0.05) number of spermatozoa with linear trajectory in R1 treatment. There is also more (P <0.05) cells with plasma membrane intact in R1 compared to the control. In mitochondrial function analysis and in vitro embryo production no difference was found between treatment and control (P>0.05). We conclude that the resveratrol 50 μM concentration protects the sperm cell plasmatic membrane and improves kinetic parameters without affect fertilization potential of spermatozoa.

Este trabalho teve como objetivo principal avaliar o sêmen da jararaca ilhoa, Bothrops insularis, quanto ao volume, motilidade, vigor e concentração, além de verificar se estes paramentos estão relacionados ao comprimento ou massa dos animais ou se variam ao longo das estações, uma vez que esta espécie possui ciclo reprodutivo sazonal. Para tanto, foram avaliadas amostras de sêmen de 18 machos, com comprimento rostro-cloacal (CRC) variando de 43,5 a 73,70 cm, pertencentes ao plantel do Laboratório de Ecologia e Evolução do Instituto Butantan, entre os meses de agosto de 2012 e maio de 2013. O sêmen de Bothrops insularis apresentou coloração variando de esbranquiçada a amarelada e consistência cremosa e espessa. Foi possível observar amostras de sêmen viáveis em todos os 18 animais avaliados, indicando que animais com CRC igual ou acima de 43,5 cm já são sexualmente maduros. O espermatozoide de Bothrops insularis é filiforme, possui cabeça alongada, fina e com formato pontiagudo, seguindo o padrão morfológico descrito para outros Squamata. Não foi observada nenhuma relação entre o comprimento, massa e cada um dos parâmetros seminais avaliados. Foi observada variação significativa da motilidade e da concentração do sêmen de Bothrops insularis entre as estações, porém o volume e o vigor do sêmen não variaram. Foi no outono, época de cópula da espécie, que o sêmen apresentou as maiores médias para os parâmetros avaliados. / This study aimed to evaluate sperm parameters of the golden lancehead, Bothrops insularis, including appearance, sperm motility, vigor, volume and concentration, determine if these parameters varied with body size or weight and to verify whether these vestments vary throughout seasons, since this species has a seasonal reproductive cycle. Samples of semen of 18 males with snout-vent length (SVL) ranging from 43.5 to 73.70 cm, belonging to the squad of the Ecology and Evolution Laboratory at Instituto Butantan, were collected between August 2012 and May 2013. Sperm color from Bothrops insularis ranged from whitish to yellowish, and a creamy and thick consistency. Viable sperm was observed in samples from all 18 males evaluated, indicating that animals with SVL equal to or above 43.5 cm are sexually mature. Sperm of Bothrops insularis is thready, has elongated, thin and pointed shaped head, following the morphological pattern described for other Squamata. No relationship between length, mass and each of seminal parameters evaluated was observed. Significant variation of concentration and motility of semen from Bothrops insularis between seasons was observed, but volume and vigor did not change. It was during Fall, mating season of the species, that sperm had the highest means for all parameters evaluated.

Submitted by Jakeline Ortega (jakortega@unoeste.br) on 2018-09-21T20:10:17Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Viviane Ribas Pereira PDF.pdf: 2053033 bytes, checksum: 480912202f53c9af07d7ace2942faf4f (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-21T20:10:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Viviane Ribas Pereira PDF.pdf: 2053033 bytes, checksum: 480912202f53c9af07d7ace2942faf4f (MD5) Previous issue date: 2018-04-14 / Difenoconazole, a fungicide of the triazoles group, is widely used during the cultivation of passion fruit, orange, strawberry, papaya and other crops. Respiratory return and in the public health space, as it can affect the population through the consumption of contaminated food. Thus, the present study was evaluated as an experimental challenge on sperm quality, from an experimental model. For this, Wistar males (45 days) were divided into 4 experimental groups (n = 10 / group): control and exposed to 5 (DA), 10 (DB) and 50 (DC) mg / kg / day of diphenoconazole, via gavage for 30 consecutive days. During the exposure period, the animals were followed for clinical signs of toxicity, water and feed intake and body weight. Throughout this period, the reproductive organs, liver and kidneys were collected and weighed. Spermatozoa were submitted to evaluation of motility, morphology, vitality, acrosome and Surface Enhanced Raman Spectroscopy (SERS). The testis and epididymis were scaled for sperm counts. For the original network learning test, the Bayes classifier (BAY), K-Nearest Neighbors (K-NN) and Support Vector Machine (SVM). The results were compared by ANOVA with Tukey posterior test, and the Kruskall-Wallis test with Dunn a posteriori, considering p <0.05. Body weight and reproductive organs, liver and culture are not altered during exposure to the fungicide. The progressive motility, the acrosomal membrane and the percentage of spermatozoa were the variables used in the variables DB and DC in relation to the joint control. Already vitality was only doubled in the DC group. In addition, sperm indices were not tested and were reduced in the three groups exposed. SERS measurements resulted in changes in the sperm bands of the DC group in relation to the control. The computational analysis identified the presence of a standard for the experimental groups with good classification in the SVM test (≥ 80% accuracy). Thus, the exposure of Wistar rats to doses of the difenoconazole fungicide may be reduced by reducing the sperm quality, with the classification pattern of exposure groups. / O difenoconazol, um fungicida do grupo dos triazóis, é amplamente utilizado durante o cultivo de maracujá, laranja, morango, mamão e em outras culturas. Sua intensa utilização traz preocupações ambientais e no âmbito da saúde pública, visto que, pode afetar a população através do consumo de alimentos contaminados. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos da exposição ao difenoconazol sobre a qualidade espermática, de um modelo experimental. Para isso, foram utilizados ratos machos Wistar (45 dias) divididos em 4 grupos experimentais (n=10/grupo): controle e expostos a 5 (DA), 10 (DB) e 50 (DC) mg/kg/dia de difenoconazol, via gavagem por 30 dias consecutivos. Durante o período de exposição, os animais foram acompanhados em relação aos sinais clínicos de toxicidade, consumo de água e ração e peso corpóreo. Ao término deste período, os órgãos reprodutivos, fígado e rins foram coletados e pesados. Os espermatozoides foram submetidos à avaliação da motilidade, morfologia, vitalidade, integridade acrossomal e análise de Espectroscopia de Espalhamento Raman Amplificado em Superfície (SERS). O testículo e o epidídimo direito foram coletados para as contagens espermáticas. Para o teste de aprendizado de máquina foram utilizados quatro algoritmos de reconhecimento de padrões: Artificial Neural Network (ANN), Bayes Classifier (BAY), K-Nearest Neighbors (K-NN) e Support Vector Machine (SVM). Os resultados foram comparados por ANOVA com o teste “a posteriori” de Tukey, e o teste de Kruskall-Wallis, com “a posteriori” de Dunn, considerando p<0,05. O peso corpóreo e dos órgãos reprodutivos, fígado e rins não sofreram alterações significativas após a exposição ao fungicida. A motilidade progressiva, a integridade da membrana acrossomal e a porcentagem de espermatozoides morfologicamente normais foram reduzidas nos grupos DB e DC em relação ao grupo controle. Já a vitalidade foi reduzida apenas no grupo DC. Além disso, os números de espermatozoides no testículo e no segmento cabeça/corpo do epidídimo e a produção diária de espermatozoides foram reduzidos nos três grupos expostos. As medidas de SERS mostraram alterações nas bandas dos espectros dos espermatozoides do grupo DC em relação ao controle. A análise computacional identificou a presença de um padrão para os grupos experimentais com boa classificação no teste SVM (≥ 80% de acurácia). Assim, concluiu-se que a exposição de ratos Wistar a diferentes doses do fungicida difenoconazol pode reduzir a qualidade espermática, com reconhecível padrão de classificação de grupos de exposição.

La congelación de espermatozoides es una técnica que supuso un importante paso para el desarrollo de la reproducción asistida. Esta es una técnica habitual y fundamental en las clínicas de reproducción que ha permitido lograr mejores resultados en las técnicas de reproducción asistida. A pesar de sus ventajas, durante la congelación, el espermatozoide sufre un gran número de alteraciones que dan lugar a la pérdida de función en el espermatozoide debido principalmente a: las bajas temperaturas a las que son sometidos, la cristalización de agua intracelular y los cambios osmóticos como consecuencia de la entrada y salida de crioprotector. Debido a los daños que se han observado, se está comenzando a desarrollar otro tipo de congelación ultrarápida llamada vitrificación, en la que los efectos que produce la entrada y salida de crioprotectores y los cambios de osmolaridad se ven disminuidos. Esta vitrificación es una técnica que consiste en el uso de crioprotectores diferentes y en un descenso de temperaturas brusco. Los primeros ensayos que se llevaron a cabo no resultaron exitosos debido a la poca tolerancia que presentan los espermatozoides a las altas tasas de crioprotector de las que se partieron. Ensayos posteriores en los que se reducía la concentración de crioprotector, se eliminaba el crioprotector permeable y la vitrificación se hacía mediante la aplicación directa de la solución espermática dentro de nitrógeno permitieron obtener mejores resultados. Es por ello que nos propusimos hacer un estudio en tres fases: una primera fase donde se realizara una valoración general de la congelación lenta y buscar un conjunto de biomarcadores útiles para la evaluación del criodaño. Posteriormente una segunda fase, en la que se realizó un estudio comparativo entre la congelación lenta y la vitrificación espermática, testando los biomarcadores elegidos en fase primera. Y, por último, en la tercera fase, un ensayo comparativo dentro de un ciclo de reproducción asistida donde la mitad del ciclo fuera fecundado con espermatozoides congelados y la otra mitad con espermatozoides vitrificados. Los resultados generales obtenidos mostraron que tras la congelación de muestras nomozoospérmicas y de baja calidad hay un conjunto de biomarcadores que dependen del estado inicial de la muestra y otros que dependen de la técnica de congelación. Que además se recomienda incluir en el estudio básico de la muestra seminal la fragmentación del ADN, el daño en el citoesqueleto y en el acrosoma, ya que son indicadores del criodaño. Que la nueva técnica de vitrificación permite criopreservar mejor las muestras seminales que la técnica de congelación lenta. Y que es seguro aplicar la técnica de vitrificación dentro de los ciclos de TRA, ya que se obtienen fecundaciones, desarrollos y niños nacidos normales. / Cátedra Human Fertility, Ivf Spain Foundation

A ocitocina (OT) é um neuropeptídio hipotalâmico, que dentre suas funções na fêmea destaca-se a contração uterina durante o parto e a ejeção do leite. No entanto, estudos vêm demonstrando importantes funções endócrinas e parácrinas no trato reprodutivo masculino. Evidenciando a possível ação conjunta entre OT e a Globulina ligadora de hormônios sexuais (SHBG). Entretanto, em cães não existem informações disponíveis quanto sua atuação. Assim, estudos direcionados aos receptores de ocitocina (OTR) e SHBG e suas funções no sistema reprodutor masculino, mais especificamente na fisiologia espermática, são de suma importância para os conhecimentos da fisiologia reprodutiva para posterior aplicação em biotecnologias reprodutivas em pequenos animais e humanos, fomentando também novas perspectivas para a utilização terapêutica da ocitocina em enfermidades reprodutivas. Portanto, o objetivo deste estudo é verificar a expressão gênica e proteica do OTR e SHBG no testículo e epidídimo de cães, correlacionando tais dados com a qualidade espermática e dosagem de testosterona. Para tal, foram coletados testículos e epidídimos de 26 cães em idade reprodutiva (1 a 5 anos). Após a orquiectomia, foi realizada a coleta dos espermatozoides provenientes da cauda do epidídimo e então, as amostras foram analisadas quanto à motilidade computadorizada do sêmen (CASA), integridade de membrana plasmática (Eosina/Nigrosina), integridade de membrana acrossomal (Fast Green / Rosa Bengala) e atividade mitocondrial (3´3 Diaminobenzidine). A imunolocalização do OTR e SHBG foi realizada através de imunoistoquímica e imunofluorescência. E a análise de expressão gênica, através da Reação em cadeia da polimerase em tempo real (qRT PCR). E da expressão proteica, através do Western Blotting. Foram encontradas correlações significantes e positivas entre as expressões gênicas do OTR e do SHBG, tanto no testículo como no epidídimo. Além disto, a expressão do OTR no testículo correlacionou-se positivamente com espermatozoides com membrana acrossomal íntegra e negativamente com a porcentagem de células com baixa atividade mitocondrial. Já o SHBG do testículo, correlacionou-se positivamente com a concentração de espermatozoides, porcentagens de células com membrana plasmática e acrossomal íntegras, motilidade, motilidade progressiva e velocidade rápida, e negativamente com a porcentagem de células com baixa atividade mitocondrial. Por outro lado, no epidídimo, a expressão gênica do SHBG apresentou correlação positiva com a porcentagem de células com membrana plasmática íntegra e expressão proteica de SHBG no testículo. Quanto a expressão proteica, o OTR no testículo obteve correlação positiva com testosterona e negativa com atividade mitocondrial nula, já no epidídimo, ocorreu correlação positiva com integridade de membrana acrossomal e negativa também com atividade mitocondrial nula. Em relação ao SHBG, houve correlação positiva com a expressão gênica do SHBG no epidídimo, células normais e padrões de velocidade. E na imunoistoquímica foi possível observar a imunomarcação do OTR e SHBG na musculatura lisa e células de Leydig do testículo e OTR na musculatura lisa do epidídimo. No entanto, não houve imunomarcação do SHBG no epidídimo, assim como expressão proteica. Nossos resultados demonstraram que o OTR e SHBG são expressos nos testículos e epidídimos de cães e que estão relacionados a funções espermáticas importantes, sendo essenciais para o sucesso reprodutivo / Oxytocin (OT) is a hypothalamic neuropeptide that plays important and well known roles in the female such as uterine contraction during childbirth and milk ejection. Notwithstanding, studies have shown important endocrine and paracrine functions also in the male reproductive tract, highlighted by the possible joint action between OT and sex hormone-binding globulin (SHBG). In dogs, however, there is no information available with regards to the role of these hormones in the reproductive function. Thus, studies directed to oxytocin (OTR) and SHBG receptors and their functions in the male reproductive system, specifically with regards to sperm physiology. Such knowledge is essential to understand the reproductive physiology for the subsequent use in reproductive biotechnologies in small animals and humans, especially by providing new perspectives for the therapeutic use of oxytocin in reproductive disorders. Therefore, the aim of this study is to assess the gene and protein expression of OTR and SHBG in the testis and epididymis of dogs, correlating these data with sperm quality and testosterone dosage. To this end, testis and epididymis were collected from 26 dogs in reproductive age (1 to 5 years). After orchiectomy, collection of sperm from the cauda epididymis was carried out and then the samples were analyzed for computerized motility of semen (CASA), plasma membrane integrity (eosin / nigrosine), acrosome membrane integrity (Fast Green / rose Bengal) and mitochondrial activity (3\'3 Diaminobenzidine). The immunolocalization of OTR and SHBG was performed by immunohistochemistry and immunofluorescence. Gene expression analysis was performed by real time polymerase chain reaction (qRT - PCR). The protein expression was further assessed by Western Blotting. Significant positive correlations were found between the gene expressions of OTR and SHBG in both the testis and epididymis. Furthermore, the OTR expression in testis was positively correlated to sperm with intact acrosome membrane and negatively to the percentage of cells with low mitochondrial activity. On the other hand, testicular SHBG was positively correlated with sperm concentration, percentage of sperm with intact plasma membrane and acrosome, motility, progressive motility and the percentage of RAPID sperm. Also, negative correlation was found between testicular SHBG and the percentage of cells with low mitochondrial activity. Furthermore, in the epididymis, SHBG gene expression was positively correlated to the percentage of cells with intact plasma membrane and protein expression of SHBG in the testis. In relation to the protein expression, the OTR in the testis correlated positively with blood plasma testosterone and negatively with sperm with no mitochondrial activity. In the epididymis, OTR protein expression correlated positively with sperm showing intact acrosome and negatively with cells with no mitochondrial activity. With regards to SHBG proteins expression, there was a positive correlation to SHBG gene expression in the epididymis, normal cells and some patterns of sperm velocity. In the immunohistochemistry, we observed the OTR and SHBG immunostainings in the smooth muscle and Leydig cells of the testis while, in the epididymis, the OTR immunostaining could be observed only in the smooth muscle. Interestingly, there was no immunostaining or protein expression of SHBG in the epididymis. Our results demonstrated that OTR and SHBG are expressed in the testis and epididymis of dogs and are related to important sperm functions, essential for reproductive success

A capacitação é um pré-requisito fisiológico importante para que a célula espermática fertilize o oócito. O óxido nítrico (NO) é sintetizado in vivo durante a conversão da L-arginina em L-citrulina por reações oxidativas catalisadas pela enzima óxido nítrico sintase (NOS) desempenhando um papel importante na regulação da motilidade e na capacitação dos espermatozoides. Estudos indicam que o NO é capaz de regular a concentração da AMP cíclico e, por conseguinte, através da atividade da adenil ciclase, estimular a capacitação espermática em várias espécies. O objetivo deste estudo foi avaliar a função do NO na capacitação de espermatozoides equinos criopreservados. Três ejaculados foram colhidos de três garanhões (n=9). O sêmen foi diluído em meio Botu-Crio&reg; na concentração final de 200×106 células/mL, envasado em palhetas de 0,5 mL e criopreservado usando um sistema automatizado. Para cada análise, foram descongeladas quatro palhetas da mesma partida e do mesmo garanhão em banho-maria a 37oC/30 s. e em seguida, o sêmen foi submetido à centrifugação em meio FIV. Posteriormente, o sêmen foi incubado neste mesmo meio na presença de L-arginina, com ou sem inibidor da enzima óxido nítrico sintase o (L-NAME), e com ou sem o removedor de NO (azul de metileno) nos tratamentos: 1) C= (FIV); 2) A= L-arginina (10 mM); 3) L = L-NAME (1 mM); 4) M = azul de metileno (100 mM); 5) AL = L-arginina (10 mM) + L-NAME (1 mM); 6) AM = L-arginina (10 mM) + azul de metileno (100 mM). As amostras foram incubadas a 38oC e 5 % de CO2. Após a incubação realizou-se a análise computadorizada da motilidade do espermatozoide e as análises por citometria de fluxo. Para a análise computadorizada da motilidade espermática foram avaliados os tempos de incubação de 0, 60, 120 e 300 min. e para as análises por citometria de fluxo os tempos de 60, 120 e 300 min. Para avaliar a integridade das membranas plasmática e acrossomal usou-se a associação FITC-PSA e IP. Para a detecção da fosforilação do aminoácido tirosina, usou-se o anticorpo antifosfotirosina conjugado a uma fluoresceína (DAF-2). A fim de dosar a quantidade de NO produzido pelo espermatozoide equino criopreservado foi utilizada a sonda DAF e para avaliar a peroxidação lipídica da membrana espermática utilizou a sonda C11-BODIPY. A sonda H33342 foi usada com a finalidade de evitar que partículas do mesmo tamanho e granulosidade da célula espermática fossem incluídas na contagem das análises por citometria de fluxo. Os dados foram analisados por meio da ANOVA e a comparação das médias, dentro de cada tempo, pelo teste de Tukey, com o nível de significância de 5 %, usando o software SAS. A remoção do NO do meio de cultura inibiu a motilidade das células espermáticas em todos os tempos de incubação. A motilidade total e motilidade progressiva foram reduzidas nos grupos M e AM. Os espermatozoides incubados com o removedor do NO apresentaram maior porcentagem de células com membrana plasmática e acrossomal íntegras nos 60 e 120 minutos de incubação (p<0,05). A reação acrossomal foi induzida nos tratamentos que receberam L-arginina (A; AL). Dentro de cada tratamento, a quantidade de NO produzido pelo espermatozoide, a fosforilação do aminoácido tirosina e a peroxidação lipídica não apresentaram diferenças entre os tempos (p>0,05). Foi verificada uma redução destas variáveis nos grupos M e AM (p<0,05). Contudo, a dose de 1 mM de L-NAME, não foi suficiente para inibir a NOS em espermatozoides criopreservados de equinos. A remoção do NO mantém a integridade das membranas plasmática e acrossomal, entretanto inibe totalmente a motilidade espermática, sugerindo um papel benéfico do NO endógeno na manutenção da motilidade dos espermatozoides equinos criopreservados. / Capacitation is an essential physiological prerequisite in order to sperm cell fertilize the oocyte. Nitric oxide (NO) is synthesized in vivo during the conversion of L-arginine in L-citruline by oxidative reactions catalyzed by nitric oxide synthase enzyme (NOS) and plays an important role in regulation of motility and in sperm capacitation. Studies indicated that NO is capable of regulating cAMP concentration and, therefore, by adenylyl cyclase, stimulate sperm capacitation in several species. The aim of this study was to evaluate the function of nitric oxide in cryopreserved equine sperm capacitation.Three ejaculates from three stallions were collected (n=9). Semen samples were diluted with Botu-Crio&reg; extender to a final concentration of 200×106 sperms/mL, and then packaged in 0.5mL straws and cryopreserved using an automated freezing system. For each analysis, four straws from the same batch and the same stallion were thawed in a water bath at 37oC/30 s. washed by centrifugation in FIV medium. Thereafter, samples were incubated in FIV medium in the presence of L-arginine, with or without the inhibitor of nitric oxide sinthase (L-NAME), and with or without the scavenger of NO (Methylene blue) in the following treatments: 1) C = Control (FIV); 2) A = L-arginine 10 mM; 3) L = L-NAME 1mM; 4) M = Methylene blue 100 mM; 5) AL = L-arginine (10 mM) + L-NAME (1 mM); 6) AM = L-argine (10 mM) + Methylene blue (100 mM). The treatments were incubated at 38oC and CO2 at 5 %. After incubation, the computer-assisted sperm motility (CASA) and flow cytometry analyses were performed. For CASA analysis, the incubation times of 0, 60, 120 e 300 min. were evaluated and for flow cytometry analyses times 60, 120 e 300 min. were evaluated. Plasma and acrosomal membranes integrity were evaluated by FITC-PSA and PI association. In order to detect amino acid tyrosine phosphorylation, we used the anti-phosphotyrosine antibody conjugated to a fluorescein (DAF-2). In order to quantify the amount of nitric oxide produced by cryopreserved equine sperm, the fluorescent probe DAF was used, and to evaluate the lipid peroxidation of sperm membrane we used the probe BODIPY-C11. The probe H33342 was used in order to prevent that particles of the same size and granularity of sperm cell were included in the counting of flow cytometry analyses. Data were analyzed by ANOVA and comparison of means within each time by the Tukey test, at a significance level of 5%, using SAS software. Removing NO from the culture medium inhibited the motility of sperm cells at all incubation times. Total and progressive motilities were reduced in both groups, M and AM. Sperms incubated with the scavenger of NO had the highest percentage of cells with intact plasma and acrosomal membranes at 60 and 120 minutes of incubation (p <0.05). Acrosomal reaction was induced in treatments with L-arginine (A, AL). Within each treatment, the amount of NO produced by sperms, the level of amino acid tyrosine phosphorylation and lipid peroxidation had no differences between the times used (p> 0.05). A reduction of these variables in groups M and AM (p <0.05) was observed. However, a dose of 1 mM L-NAME was not sufficient to inhibit NOS in cryopreserved equine sperm. Removal of NO maintains plasma and acrosomal membranes integrity, however completely inhibits sperm motility, suggesting a beneficial role of endogenous NO in the maintenance of motility of cryopreserved equine spermatozoa.

A capacitação é um pré-requisito fisiológico importante para que a célula espermática fertilize o oócito. O óxido nítrico (NO) é sintetizado in vivo durante a conversão da L-arginina em L-citrulina por reações oxidativas catalisadas pela enzima óxido nítrico sintase (NOS) desempenhando um papel importante na regulação da motilidade e na capacitação dos espermatozoides. Estudos indicam que o NO é capaz de regular a concentração da AMP cíclico e, por conseguinte, através da atividade da adenil ciclase, estimular a capacitação espermática em várias espécies. O objetivo deste estudo foi avaliar a função do NO na capacitação de espermatozoides equinos criopreservados. Três ejaculados foram colhidos de três garanhões (n=9). O sêmen foi diluído em meio Botu-Crio&reg; na concentração final de 200×106 células/mL, envasado em palhetas de 0,5 mL e criopreservado usando um sistema automatizado. Para cada análise, foram descongeladas quatro palhetas da mesma partida e do mesmo garanhão em banho-maria a 37oC/30 s. e em seguida, o sêmen foi submetido à centrifugação em meio FIV. Posteriormente, o sêmen foi incubado neste mesmo meio na presença de L-arginina, com ou sem inibidor da enzima óxido nítrico sintase o (L-NAME), e com ou sem o removedor de NO (azul de metileno) nos tratamentos: 1) C= (FIV); 2) A= L-arginina (10 mM); 3) L = L-NAME (1 mM); 4) M = azul de metileno (100 mM); 5) AL = L-arginina (10 mM) + L-NAME (1 mM); 6) AM = L-arginina (10 mM) + azul de metileno (100 mM). As amostras foram incubadas a 38oC e 5 % de CO2. Após a incubação realizou-se a análise computadorizada da motilidade do espermatozoide e as análises por citometria de fluxo. Para a análise computadorizada da motilidade espermática foram avaliados os tempos de incubação de 0, 60, 120 e 300 min. e para as análises por citometria de fluxo os tempos de 60, 120 e 300 min. Para avaliar a integridade das membranas plasmática e acrossomal usou-se a associação FITC-PSA e IP. Para a detecção da fosforilação do aminoácido tirosina, usou-se o anticorpo antifosfotirosina conjugado a uma fluoresceína (DAF-2). A fim de dosar a quantidade de NO produzido pelo espermatozoide equino criopreservado foi utilizada a sonda DAF e para avaliar a peroxidação lipídica da membrana espermática utilizou a sonda C11-BODIPY. A sonda H33342 foi usada com a finalidade de evitar que partículas do mesmo tamanho e granulosidade da célula espermática fossem incluídas na contagem das análises por citometria de fluxo. Os dados foram analisados por meio da ANOVA e a comparação das médias, dentro de cada tempo, pelo teste de Tukey, com o nível de significância de 5 %, usando o software SAS. A remoção do NO do meio de cultura inibiu a motilidade das células espermáticas em todos os tempos de incubação. A motilidade total e motilidade progressiva foram reduzidas nos grupos M e AM. Os espermatozoides incubados com o removedor do NO apresentaram maior porcentagem de células com membrana plasmática e acrossomal íntegras nos 60 e 120 minutos de incubação (p<0,05). A reação acrossomal foi induzida nos tratamentos que receberam L-arginina (A; AL). Dentro de cada tratamento, a quantidade de NO produzido pelo espermatozoide, a fosforilação do aminoácido tirosina e a peroxidação lipídica não apresentaram diferenças entre os tempos (p>0,05). Foi verificada uma redução destas variáveis nos grupos M e AM (p<0,05). Contudo, a dose de 1 mM de L-NAME, não foi suficiente para inibir a NOS em espermatozoides criopreservados de equinos. A remoção do NO mantém a integridade das membranas plasmática e acrossomal, entretanto inibe totalmente a motilidade espermática, sugerindo um papel benéfico do NO endógeno na manutenção da motilidade dos espermatozoides equinos criopreservados. / Capacitation is an essential physiological prerequisite in order to sperm cell fertilize the oocyte. Nitric oxide (NO) is synthesized in vivo during the conversion of L-arginine in L-citruline by oxidative reactions catalyzed by nitric oxide synthase enzyme (NOS) and plays an important role in regulation of motility and in sperm capacitation. Studies indicated that NO is capable of regulating cAMP concentration and, therefore, by adenylyl cyclase, stimulate sperm capacitation in several species. The aim of this study was to evaluate the function of nitric oxide in cryopreserved equine sperm capacitation.Three ejaculates from three stallions were collected (n=9). Semen samples were diluted with Botu-Crio&reg; extender to a final concentration of 200×106 sperms/mL, and then packaged in 0.5mL straws and cryopreserved using an automated freezing system. For each analysis, four straws from the same batch and the same stallion were thawed in a water bath at 37oC/30 s. washed by centrifugation in FIV medium. Thereafter, samples were incubated in FIV medium in the presence of L-arginine, with or without the inhibitor of nitric oxide sinthase (L-NAME), and with or without the scavenger of NO (Methylene blue) in the following treatments: 1) C = Control (FIV); 2) A = L-arginine 10 mM; 3) L = L-NAME 1mM; 4) M = Methylene blue 100 mM; 5) AL = L-arginine (10 mM) + L-NAME (1 mM); 6) AM = L-argine (10 mM) + Methylene blue (100 mM). The treatments were incubated at 38oC and CO2 at 5 %. After incubation, the computer-assisted sperm motility (CASA) and flow cytometry analyses were performed. For CASA analysis, the incubation times of 0, 60, 120 e 300 min. were evaluated and for flow cytometry analyses times 60, 120 e 300 min. were evaluated. Plasma and acrosomal membranes integrity were evaluated by FITC-PSA and PI association. In order to detect amino acid tyrosine phosphorylation, we used the anti-phosphotyrosine antibody conjugated to a fluorescein (DAF-2). In order to quantify the amount of nitric oxide produced by cryopreserved equine sperm, the fluorescent probe DAF was used, and to evaluate the lipid peroxidation of sperm membrane we used the probe BODIPY-C11. The probe H33342 was used in order to prevent that particles of the same size and granularity of sperm cell were included in the counting of flow cytometry analyses. Data were analyzed by ANOVA and comparison of means within each time by the Tukey test, at a significance level of 5%, using SAS software. Removing NO from the culture medium inhibited the motility of sperm cells at all incubation times. Total and progressive motilities were reduced in both groups, M and AM. Sperms incubated with the scavenger of NO had the highest percentage of cells with intact plasma and acrosomal membranes at 60 and 120 minutes of incubation (p <0.05). Acrosomal reaction was induced in treatments with L-arginine (A, AL). Within each treatment, the amount of NO produced by sperms, the level of amino acid tyrosine phosphorylation and lipid peroxidation had no differences between the times used (p> 0.05). A reduction of these variables in groups M and AM (p <0.05) was observed. However, a dose of 1 mM L-NAME was not sufficient to inhibit NOS in cryopreserved equine sperm. Removal of NO maintains plasma and acrosomal membranes integrity, however completely inhibits sperm motility, suggesting a beneficial role of endogenous NO in the maintenance of motility of cryopreserved equine spermatozoa.

El objetivo del presente estudio ha sido evaluar la relación entre los parámetros de la calidad seminal y la capacidad de penetración in vitro de ovocitos homólogos (PIVh) con los resultados in vivo de fertilidad y prolificidad.Se han analizado 60 eyaculados realizando sobre cada uno las medicionesclásicas del espermiograma (motilidad, calidad de movimiento, volumen, concentración espermática, estado del acrosoma, morfoanomalías y tinción vital), pruebas bioquímicas (contenido de ATP, calcio, sodio, potasio, magnesio y zinc), ensayos de la funcionalidad del espermatozoide ( test de endósmosis, test del diacetato de carboxifluoresceína, test ORT) y la valoración mediante un test de penetración in vitro homóloga. Los resultados de la valoración in vitro del semen fueron contrastados con los resultados obtenidos en un ensayo in vivo con inseminaciones homospérmicas.En nuestras condiciones experimentales el estudio de los parámetros demotilidad, morfología, acrosomas y de los test de funcionalidad de la membrana puedeser una herramienta útil, en un primer término, para desechar eyaculados de baja calidad, aunque estas técnicas no alcanzan la sensibilidad suficiente para dar un resultado satisfactorio en la predicción de la fertilidad. Sin embargo, los resultados obtenidos muestran que el test de penetración in vitro es la única técnica de las estudiadas capaz de discriminar adecuadamente los eyaculados que darán lugar a los distintos grupos de fertilidad. / The purpose of the present study was to evaluate the relationship between theparameters of seminal quality and homologous oocytes in vitro penetration capacityversus the reproductive parameters, fertility and litter size which were bothdetermined in a field trial.Sixty boar ejaculates have been analysed, performing on each of them:conventional semen analysis (motility, volume, sperm concentration, normal acrosome, morphology and structural integrity), biochemical parameters (ATP, calcium, sodium, potassium, magnesium and zinc), functional sperm assays (Hypoosmotic swelling test (HOST), Carboxiflorescin Diacetate Test (DCF), Osmotic Resistance Test (ORT)) and the homologous in vitro penetration test. The results observed upon a in vitro semen valoration were checked with those obtained upon a in vivo trial with homospermic insemination.In our experimental conditions the study of motility, morphology, normalacrosomes and functional test may be a good tool, in a first analysis, to get rid of poor seminal quality ejaculates. Still, this analysis is not accurate enough to bring outsatisfactory results to predict the in vivo fertilization capacity. In the light of theseresults only the homologous in vitro penetration test has been found able todiscriminate the different groups of fertility and litter size. None the less an extensive study is required.

Con el presente trabajo se ha pretendido investigar la influencia de diversos factores relacionados con el cocultivo de los gametos porcinos, sobre los resultados de la fecundación" in vitro" (AV), fundamentalmente con la intención de mejorar la eficacia actual del sistema de AV en cuanto a la consecución de embriones viables (fecundaciones monospérmicas). Para ello, se han utilizado 129 hembras porcinas prepúberes a las que se indujo la ovulación mediante un tratamiento con 1250 U.I. de PMSG y 750 U.I. de HCG. El tratameinto empleado resultó eficaz para los fines perseguidos en un 80'62% de las hembras y el número medio de ovocitos recogidos fue de 19'07 + 1'52 por animal, utilizándose un total de 1984 ovocitos.En relación a las condiciones del sistema de fecundación, el primer factor investigado ha sido el tiempo de cocultivo, entendido como tiempo de contacto entre los gametos. En las dos experiencias realizadas, utilizando tiempos de 4, 6 u 8 horas (experiencia la), o de 1, 2, 3 ó 4 horas (experiencia lb), los mejores resultados se obtuvieron tras 4 horas de cocultivo, ya que los porcentajes de penetración de mantuvieron altos con respecto al máximo alcanzado a las 8 horas (82,68 vs. 93,96%), mientras que los de monospermia no disminuyeron excesivamente con respecto a los obtenidos con tiempos de cocultivo menores, teniendo en cuenta que la concentración de espermatozoides empleada fue intencionadamente elevada (12 x 105 esp/ml). El segundo factor analizado fue la concentración espermática. Se utilizaron concentraciones de 3, 6 y 12 x 105 esp vivos/ml, deduciéndose de los resultados que la mayor efectividad en nuestro sistema correspondía a la concentración de 6 x lO 5 esp/ml, ya que los porcentajes de penetración fueron significativamente diferentes a los obtenidos con la concentración espermática más alta (71'62% vs. 76'83%), y los porcentajes de monospermia tampoco se diferenciaron de los obtenidos con la concentración espermática más baja (62'26 vs. 68'08%). El tercer factor estudiado ha sido la influencia de la presencia o ausencia en el medio de cocultivo del "cumulus" expandido que acompaña al ovocito en la ovulación. Por los resultados obtenidos, se puede pensar que la presencia estas células junto con la correspondiente matriz intrecelular de ácido hialúrico es altamente beneficiosa para la mejora del rendimiento de la FIV debido a que los porcentajes de penetración en los ovocitos denudados (53'69 fueron menores (p<0'0l) que los obtenidos en los ovocitos con "cumulus" (69'10%), mientras que los porcentajes de monospermia fueron superios (p < 0'01) en el segundo caso (39'45% vs. 60'97%). Por último, se ha investigado el efecto de la reducción del volumen medio de cocultivo más comúnmente utilizado (2 mI) a otro menor (0'4 n obteniéndose resultados equivalentes en ambos casos para los porcentajes penetración, pero mayores porcentajes de monospermia (p<0'05) con volumen de 0'4 mI (57'53% vs. 78'12%). Del conjunto de los resultados se deduce que los porcentajes de penetración y polispermia en la AV porcina son consecuencia de la influencia de diferentes factores, entre los que se encuentran el tiempo de cocultivo, concentración espermática, la presencia del "cumulus oophorus" y el volumen de medio de cocultivo utilizados. / In the present work, we have investigated the influence of differen factors, related to porcine gametes coculture, on the results of "in vitro" fertilization (IVF). We have try to improve the efficiency of the current system to get viable embryos (monospermic fertilizations). 129 prepuberal gilts have been used after the induction of ovulation by administration of 1250 I.U. of PMSG followed, 55 hours later, by 750 I.U. of HCG. The results showed that the best moment for the recovery of oocytes was 44 h after HCC administration. In the same way, the treatment followed was effective for the required objectives in 80.62% of the studied females and the medium number of recovered oocytes was 19.07 + 1.52 per animal, giving a total number 01 1984 oocytes used. In relation with the conditions of the fertilization system, the first investigated factor was the coculture time, understanding it as contact time between gametes. To study the effect of this factor, two experiences were realized; fot the first one, 4, 6 or 8 hours of coculture time were used (experience lb) The best results were obtained at 4 hours of coculture, because the percentage of penetration was maintained high (82.68%) and, at the same time, the percentage of monospermy increased (p<O.Ol), although the sperm concentration employed was deliberately high (12 x lOS spx/ml). The second investigated factor was the sperm concentration. The results showed that, among the used concentrations (3, 6 and 12 x lO 5 alive spz/ml), the maximum effectiveness in our system was obtained for the concntration of 6 x lOS spz/ml, since the percentage of penetration was not signficatively different of that obtained with the highest sperm concentration The third studied factor was the influence of the presence or absence of the expanded ."cumulus", which is shed with the oocytes at the ovulation, in the coculture medium. The presence of these cells joined with the intercellular matrix of hialuronic acid was highly beneficious for the improvement of the IVF, because of the percentage of penetration with the denuded oocytes (53.69%) was lower (p<0.01) than that obtained with the .cumulus" enclosed oocytes (69.16%), and the percentage of monospermy was higher (p<0.01) at the second case (39.45% vs. 60.97%). Finally, the percentage of penetration and monspermy was investigated using two different coculture medium volume, one the commonly used by other authors (2 ml) and another minor volume (0.4 mI). The results showed that the percentage of monospermy was higher (p<0.01) with the 0.4 mI volume (57.53 vs.78312%). We may deduce from the total results that the percentages of and monospermy in porcine IVF are due to the influence of different factors, some of them being the coculture time, the sperm concentrarían, the presence of "cumulus". and the coculture medium volume.