El objetivo del presente trabajo consistió en valorar el efecto de las células epiteliales del oviducto porcino y del cumulus oophorus sobre distintos parámetros relacionados con la fecundación in vitro en la especie porcina. Las variables estudiadas fueron el porcentaje de penetración, el número medio de espermatozoides por ovocito, el porcentaje de formación de pronúcleo masculino, el porcentaje de monospermia, el porcentaje de cigotos divididos a las 48 horas postfecundación, el porcentaje de blastocistos, el número medio de núcleos por blastocisto, la resistencia de la zona pelúcida a la digestión con pronasa y la densidad y distribución de los gránulos corticales en los diferentes grupos experimentales. / The objective of this experimental work was to study the effect of porcine epithelial oviductal cells and cumulus cells on several parameters related to in vitro fertilization in pigs. Studied variables were rate of penetration, mean number of sperm cells per penetrated oocyte, rate of male pronuclear formation, cleavage rate at 48h postinsemination, blastocyst formation rate, mean number of cells per blastocyst, resistance of zona pellucida to pronase digestion and density and distribution of cortical granules in the different experimental groups.

Con el presente trabajo se ha pretendido investigar la influencia de diversos factores relacionados con el cocultivo de los gametos porcinos, sobre los resultados de la fecundación" in vitro" (AV), fundamentalmente con la intención de mejorar la eficacia actual del sistema de AV en cuanto a la consecución de embriones viables (fecundaciones monospérmicas). Para ello, se han utilizado 129 hembras porcinas prepúberes a las que se indujo la ovulación mediante un tratamiento con 1250 U.I. de PMSG y 750 U.I. de HCG. El tratameinto empleado resultó eficaz para los fines perseguidos en un 80'62% de las hembras y el número medio de ovocitos recogidos fue de 19'07 + 1'52 por animal, utilizándose un total de 1984 ovocitos.En relación a las condiciones del sistema de fecundación, el primer factor investigado ha sido el tiempo de cocultivo, entendido como tiempo de contacto entre los gametos. En las dos experiencias realizadas, utilizando tiempos de 4, 6 u 8 horas (experiencia la), o de 1, 2, 3 ó 4 horas (experiencia lb), los mejores resultados se obtuvieron tras 4 horas de cocultivo, ya que los porcentajes de penetración de mantuvieron altos con respecto al máximo alcanzado a las 8 horas (82,68 vs. 93,96%), mientras que los de monospermia no disminuyeron excesivamente con respecto a los obtenidos con tiempos de cocultivo menores, teniendo en cuenta que la concentración de espermatozoides empleada fue intencionadamente elevada (12 x 105 esp/ml). El segundo factor analizado fue la concentración espermática. Se utilizaron concentraciones de 3, 6 y 12 x 105 esp vivos/ml, deduciéndose de los resultados que la mayor efectividad en nuestro sistema correspondía a la concentración de 6 x lO 5 esp/ml, ya que los porcentajes de penetración fueron significativamente diferentes a los obtenidos con la concentración espermática más alta (71'62% vs. 76'83%), y los porcentajes de monospermia tampoco se diferenciaron de los obtenidos con la concentración espermática más baja (62'26 vs. 68'08%). El tercer factor estudiado ha sido la influencia de la presencia o ausencia en el medio de cocultivo del "cumulus" expandido que acompaña al ovocito en la ovulación. Por los resultados obtenidos, se puede pensar que la presencia estas células junto con la correspondiente matriz intrecelular de ácido hialúrico es altamente beneficiosa para la mejora del rendimiento de la FIV debido a que los porcentajes de penetración en los ovocitos denudados (53'69 fueron menores (p<0'0l) que los obtenidos en los ovocitos con "cumulus" (69'10%), mientras que los porcentajes de monospermia fueron superios (p < 0'01) en el segundo caso (39'45% vs. 60'97%). Por último, se ha investigado el efecto de la reducción del volumen medio de cocultivo más comúnmente utilizado (2 mI) a otro menor (0'4 n obteniéndose resultados equivalentes en ambos casos para los porcentajes penetración, pero mayores porcentajes de monospermia (p<0'05) con volumen de 0'4 mI (57'53% vs. 78'12%). Del conjunto de los resultados se deduce que los porcentajes de penetración y polispermia en la AV porcina son consecuencia de la influencia de diferentes factores, entre los que se encuentran el tiempo de cocultivo, concentración espermática, la presencia del "cumulus oophorus" y el volumen de medio de cocultivo utilizados. / In the present work, we have investigated the influence of differen factors, related to porcine gametes coculture, on the results of "in vitro" fertilization (IVF). We have try to improve the efficiency of the current system to get viable embryos (monospermic fertilizations). 129 prepuberal gilts have been used after the induction of ovulation by administration of 1250 I.U. of PMSG followed, 55 hours later, by 750 I.U. of HCG. The results showed that the best moment for the recovery of oocytes was 44 h after HCC administration. In the same way, the treatment followed was effective for the required objectives in 80.62% of the studied females and the medium number of recovered oocytes was 19.07 + 1.52 per animal, giving a total number 01 1984 oocytes used. In relation with the conditions of the fertilization system, the first investigated factor was the coculture time, understanding it as contact time between gametes. To study the effect of this factor, two experiences were realized; fot the first one, 4, 6 or 8 hours of coculture time were used (experience lb) The best results were obtained at 4 hours of coculture, because the percentage of penetration was maintained high (82.68%) and, at the same time, the percentage of monospermy increased (p<O.Ol), although the sperm concentration employed was deliberately high (12 x lOS spx/ml). The second investigated factor was the sperm concentration. The results showed that, among the used concentrations (3, 6 and 12 x lO 5 alive spz/ml), the maximum effectiveness in our system was obtained for the concntration of 6 x lOS spz/ml, since the percentage of penetration was not signficatively different of that obtained with the highest sperm concentration The third studied factor was the influence of the presence or absence of the expanded ."cumulus", which is shed with the oocytes at the ovulation, in the coculture medium. The presence of these cells joined with the intercellular matrix of hialuronic acid was highly beneficious for the improvement of the IVF, because of the percentage of penetration with the denuded oocytes (53.69%) was lower (p<0.01) than that obtained with the .cumulus" enclosed oocytes (69.16%), and the percentage of monospermy was higher (p<0.01) at the second case (39.45% vs. 60.97%). Finally, the percentage of penetration and monspermy was investigated using two different coculture medium volume, one the commonly used by other authors (2 ml) and another minor volume (0.4 mI). The results showed that the percentage of monospermy was higher (p<0.01) with the 0.4 mI volume (57.53 vs.78312%). We may deduce from the total results that the percentages of and monospermy in porcine IVF are due to the influence of different factors, some of them being the coculture time, the sperm concentrarían, the presence of "cumulus". and the coculture medium volume.

La fecundación en mamíferos consiste básicamente en la fusión de los gametos masculino y femenino para formar un zigoto capaz de dar lugar a un nuevo individuo. Hasta ahora, la mayoría de las investigaciones encaminadas al esclarecimiento de este proceso se han centrado en el estudio de la biología de ambos gametos como células aisladas, o bien en el estudio de los diversos mecanismos que tienen lugar durante la interacción de ambos. Sin embargo, se ha dejado un poco de lado a otro elemento fundamental y sin el cual el resto de estudios pueden resultar incompletos: el microambiente en el que tiene lugar el encuentro entre los gametos, es decir, el fluido y las células oviductales que secretan ciertos componentes de dicho fluido. La fase folicular tardía o etapa inmediatamente preovulatoria, es el momento en el que el oviducto se encuentra preparado para el encuentro de los gametos y para que se produzca la fecundación. Debido a la importancia de los factor es implicados en la unión de gametos que han de estar presentes en este momento preciso del ciclo estral y a la escasez de información acerca de los mismos, centramos nuestro estudio en esta fase. Para ello, se abordó el análisis de los componentes oviductales y sus características fundamentalmente desde cuatro perspectivas: (1) efecto del fluido oviductal (FO) sobre la resistencia a la digestión enzimática de la zona pelúcida en 9 especies, (2) fraccionamiento del FO bovino en base a su capacidad de unión a heparina, (3) análisis proteómico del FO y (4) análisis de la expresión génica del oviducto porcino. / Fertilization in mammals is basically the merging of male and female gametes to form a zygote that can give rise to a new individual. So far, most research aimed at clarifying this process have focused either on the study of the biology of the spermatozoon and the oocyte as isolated cells or in the study of the various mechanisms that occur during the interaction of both. However, it has been partially left to one side to another key element without which the other studies may be incomplete: the microenvironment in which the meeting takes place between the gametes, ie the fluid and the oviductal cells that secrete some components of such a fluid. The late follicular phase or immediately pre-ovulatory phase is the time when the oviduct is prepared for the meeting of gametes and fertilization occurs. Due to the importance of the factors involved in the gametes interaction which must be present at this precise moment of the estrous cycle and the scarcity of information about them, we focused our study on this phase. To do so, it was addressed the analysis of oviductal components and features mainly from four perspectives: (1) effect of oviductal fluid (OF) on the resistance to enzymatic digestion of the zona pellucida in 9 species, (2) fractionation of the bovine oviductal fluid based on their ability to bind to heparin, (3) proteomic analysis of OF and (4) gene expression analysis of pig oviduct.