Le tamoxifène, un modulateur sélectif des récepteurs oestrogéniques, est un médicament largement utilisé depuis plus de vingt ans pour le traitement et la prévention du cancer du sein. Plusieurs études ont rapporté que l’administration aiguë du tamoxifène pouvait réduire certains courants K+ cardiaques. Cette observation suggère que les femmes traitées de façon chronique avec le tamoxifène risquent d’avoir une prolongation de leur intervalle QT, favorisant ainsi le développement de torsades de pointes. Puisque in vivo, le tamoxifène est largement métabolisé et son effet est attribué à celui du 4hydroxy-tamoxifène (4OH-tamoxifène), nous avons d'abord vérifié si les effets du tamoxifène sur la repolarisation pouvaient être dus au 4OH-tamoxifène. À l'aide de la méthode de patch-clamp, nous avons étudié l’effet aigu du 4OH-tamoxifène sur les courants K+ présents au niveau ventriculaire chez la souris femelle. En premier lieu, nous avons démontré que les souris traitées avec le 4OH-tamoxifène présentaient une diminution des courants K+ comparativement aux souris intactes. Fait intéressant, le prétraitement des myocytes avec l’antagoniste des récepteurs oestrogéniques, le ICI 182,780, ou l’inhibiteur de la synthèse protéique, l'actinomycine D, n’a pas modifié les effets du 4OH-tamoxifène. Ces résultats suggéraient que les effets du 4OH-tamoxifène sur les courants potassiques ne soient pas liés à la transcription génomique et n’implique pas les récepteurs aux œstrogènes. Bien que l’administration aiguë du 4OH-tamoxifène diminue les courants K+ cardiaques, l’absence de troubles au niveau du rythme cardiaque chez les femmes traitées à long terme exclu la possibilité de conclure que le traitement chronique avec le tamoxifène augmente la durée de l’intervalle QT. L'accès à des souris femelles et des cobayes nous a permis de démontrer que contrairement au traitement en aigu, les courants et les canaux K+ cardiaques sont augmentés en chronique. Les oestrogènes associés à une diminution des courants K+ d’une part et nos résultats obtenus avec le tamoxifène d’autre part suggèrent qu’en bloquant les récepteurs oestrogéniques, le tamoxifène puisse prévenir les effets inhibiteurs des oestrogènes sur les courants K+. Cette association œstrogènes- tamoxifène- récepteurs oestrogéniques et courants K+ nous a encouragées à approfondir encore nos études et vérifier l’influence des hormones sexuelles féminines sur la repolarisation ventriculaire. Une troisième étude a été ainsi réalisée chez des souris femelles ovariectomisées et des souris déficientes en récepteurs oestrogéniques α ou β afin de vérifier le rôle des oestrogènes et des récepteurs oestrogéniques sur la repolarisation ventriculaire. Nos résultats ont révélé clairement que l’absence des oestrogènes entraîne une augmentation de la densité du courant K+ transitoire indépendant du Ca2+ (Ito) et de l’expression du canal Kv4.3 et ces effets sont médiés par les REα. Ces données soutiennent davantage notre conclusion que l’inhibition des récepteurs oestrogéniques est responsable de l’augmentation des courants/canaux K+ et suggèrent fortement qu’ils jouent un rôle dans la régulation de la repolarisation ventriculaire. Elles soulignent aussi l'importance de vérifier le statut hormonal des animaux utilisés pour des études touchant l'électrophysiologie cardiaque. Dans la dernière partie de cette thèse nous avons vérifié les effets de la grossesse et du système nerveux autonome sur les différents paramètres électrocardiographiques et plus particulièrement sur le rythme cardiaque chez la souris. Nos données ont montré que, comme chez la femme enceinte, la grossesse est associée à une augmentation du rythme cardiaque. De plus, l'augmentation des niveaux des hormones féminines pourrait affecter l’automatisme et l’activité électrique cardiaque. Ces différentes études ont augmenté les connaissances sur la régulation hormonale de l'électrophysiologie cardiaque et aideront aux avancements des recherches chez les femmes. / Tamoxifen is a selective estrogen receptor modulator widely used in the treatment and prevention of breast cancer from more than 20 years. Other studies have reported that acute exposure to tamoxifen can reduce cardiac K+ currents. However, in vivo tamoxifen is largely metabolized and most of its activity is attributable to its major metabolite, 4- hydroxytamoxifen (4OH-tamoxifen). In our first study, we investigated the acute effects of 4OH-tamoxifen on cardiac K+ currents in mice. Using the patch-clamp technique, we found that, as with tamoxifen, short-term exposure to 4OH-tamoxifen reduced K+ currents in the mouse ventricle even in the presence of the selective oestrogen receptor antagonist, ICI-182,780, or the inhibitor of RNA synthesis, actinomycin D. These results suggest an inhibition independent of the intracellular oestrogen receptor and the protein synthesis. However, women receiving long-term tamoxifen therapy do not experience cardiac arrhythmias although acute perfusion of tamoxifen has been shown to inhibit cardiac K+ currents. This observation suggests that chronic tamoxifen treatment does not negatively modulate cardiac K+ currents. Therefore, in order to investigate the absence of cardiac arrhythmias in women, we examined the effects of long term tamoxifen therapy associated with low level of estrogen on ventricular K+ currents and channels expressed in mouse and guinea pig heart. Female mice and guinea pigs were treated with placebo or tamoxifen pellets for 60 days. Our results show an increase of the densities of K+ currents and the expression of their channels. Conditions with high oestrogen levels are associated with reduced K+ currents both in the heart and the uterus. Thus, conceivably, tamoxifen might prevent the inhibitory effects of oestrogen on K+ channels by blocking the oestrogen receptors, which would explain the reported increase in K+ currents. These findings could contribute to explain the absence of cardiac arrhythmia with long-term tamoxifen therapy. These association estrogen- tamoxifen and estrogen receptor lead us to study the influence of estrogens and estrogen receptors on ventricular repolarization. Accordingly, we assessed the involvement of estrogens and ER on K+ currents in mouse using ovariectomised (OVX), ER-knockout (ERKOα) or ERβ-knockout (ERKOβ) female mice. These experiments show that the absence of estrogen is associated with an increase of the density of the Ca2+-independent transient outward, Ito, the mRNA and protein expression of Kv4.3. These results vi obtained with ERKO mice suggest that estrogens regulate ventricular repolarization and ER mediates this effect. The last part of this thesis was to determine whether pregnancy elicits a change in the heart rate in mice and whether pregnancy-related changes are due to the cardiac conduction system rather than a change in autonomic tone. Our results revealed that pregnancy accelerates the resting heart rate and the AV node conduction time in the presence and absence of autonomic nervous system input suggesting an intrinsic mechanism. Moreover, Hormonal changes that occur during pregnancy are likely to be involved in these adaptations of the heart to pregnancy. These studies provide a new insight to understand the hormonal regulation of cardiac electrophysiology.

La 7β-hydroxy-épiandrostérone, stéroïde endogène dérivant de la DHEA, présente des propriétés anti-inflammatoires. En effet, elle module la voie des prostaglandines (PGs) en inhibant la production de la PGE2 pro-inflammatoires et en augmentant la production de la 15-Deoxy-∆12,14-PGJ2 cyto-protectrice in vivo et in vitro. Les faibles doses de 7β-hydroxy-épiandrostérone (1nM, 10nM, 100nM) pour lesquelles ces effets sont observés, suggèrent une liaison à un récepteur spécifique. L’inflammation et la production des PGs jouent un rôle important dans le développement et la prolifération des tumeurs mammaires estrogéno-dépendantes. Le 17β-estradiol (E2), en se fixant sur les récepteurs des estrogènes (REs), induit la production de PGE2 et la prolifération cellulaire dans ces cellules tumorales. De ce fait, notre objectif était de tester les effets de la 7β-hydroxy-épiandrostérone sur la prolifération (comptage avec exclusion au bleu trypan), le cycle cellulaire et l’apoptose (cytométrie de flux) dans les lignées cellulaires de cancer du sein MCF-7 (REα+, REβ+, GPR30+) et MDA-MB-231 (REα-, REβ+, GPR30+) et d’identifier une(des) cible(s) potentielle(s) dans ces cellules (transactivation) et dans des cellules négatives pour les REs nucléaires SKBr3 (GPR30+) (études de prolifération). Cette étude a montré que la 7β-hydroxy-épiandrostérone exerce des effets anti-estrogéniques dans les cellules MCF-7 et MDA-MB-231 associés à une inhibition de la prolifération et un arrêt du cycle cellulaire. Les études de transactivation et de prolifération avec les agonistes spécifiques des REs ont montré une interaction avec le REβ. De plus, les résultats des études de proliférations sur les trois lignées cellulaires suggèrent que la 7β-hydroxy-épiandrostérone pourrait également interagir avec le GPR30. Ces résultats indiquent que ce stéroïde androgène agit comme un anti-estrogène. De plus, c’est la première fois qu’un stéroïde androgène à faible dose montre une action anti-proliférative dans des lignées de cancers du sein. Des études ultérieures restent à réaliser afin de mieux comprendre ces effets observés. / 7β-hydroxy-epiandrosterone, an endogenous androgenic derivative of DHEA, has previously been shown to exert anti-inflammatory action in vitro and in vivo via a shift from prostaglandin E2 (PGE2) to 15-deoxy-∆12,14-PGJ2 production. This modulation in prostaglandin production was obtained with low concentrations of 7β-hydroxy-epiandrosterone (1–100 nM) and suggested that it might act through a specific receptor. Inflammation and prostaglandin synthesis is important in the development and survival of estrogen-dependent mammary cancers. Estrogen induced PGE2 production and cell proliferation via its binding to estrogen receptors (ERs) in these tumors. Our objective was to test the effects of 7β-hydroxy-epiandrosterone on the proliferation (by counting with trypan blue exclusion), cell cycle and cell apoptosis (by flow cytometry) of breast cancer cell lines MCF-7 (ERα+, ERβ +, G-protein coupled receptor 30 : GPR30+) and MDA-MB-231 (ERα-, ERβ +, GPR30+) and to identify a potential target of this steroid in these cell lineages (by transactivations) and in the nuclear ER-negative SKBr3 cells (GPR30+) (by proliferation assays). 7β-hydroxy-epiandrosterone exerted anti-estrogenic effects in MCF-7 and MDA-MB-231 cells associated with cell proliferation inhibition and cell cycle arrest. Moreover, transactivation and proliferation with ER agonists assays indicated that 7β-hydroxy-epiandrosterone interacted with ERβ. Data from proliferation assays on the MCF-7, MDA-MB-231 and SKBr3 cell lines suggested that 7β-hydroxy-epiandrosterone may also act through the membrane GPR30 receptor.These results support that this androgenic steroid acts as an anti-estrogenic compound. Moreover, this is the first evidence that low doses of androgenic steroid exert antiproliferative effects in these mammary cancer cells. Further investigations are needed to improve understanding of the observed actions of endogenous 7β-hydroxy-epiandrosterone.

L’objectif de ce travail de thèse est d’évaluer le potentiel de nouveaux bio-essais in vitro et in vivo basés sur le poisson zèbre pour la biosurveillance de la contamination chimique de l’eau par les xeno-estrogènes. Pour cela, les bio-essais ont été appliqués pour évaluer les effets de polluants aquatiques environnementaux seuls, mais aussi en mélanges simples (reconstitués) et complexes (échantillons environnementaux). L’évaluation d’échantillons d’eau à travers les bioessais in vitro humain (MELN) et poisson zèbre (ZELH-zfERβ2) a montré des différences qualitatives et quantitatives de réponse, non expliquées par les molécules estrogéniques détectées. Afin de mieux comprendre ces différences, l’activité de polluants aquatiques a été caractérisée sur les différents modèles, individuellement et au sein de mélanges de 2 à 12 polluants, combinant molécules estrogéniques et non estrogéniques pour simuler des situations environnementales.Les résultats obtenus montrent que les bio-essais basés sur le poisson zèbre répondent différemment, et parfois de manière opposée, au modèle humain MELN aux mélanges reconstitués. Ces différences s’expliquent par des sensibilités différentes à certaines molécules entrainant des interactions avec la réponse aux xeno-oestrogènes spécifiques à chaque modèle biologique. Dans son ensemble, ce travail montre que les particularités biologiques de chaque bioessai peuvent influencer la réponse des xeno-estrogènes quand présents au sein de mélange avec d’autres polluants. Ces résultats sont discutés au regard de l’utilisation de bio-essais dans l’évaluation de la contamination chimique des masses d’eau. / This PhD thesis aims at assessing the potential of innovative in vitro and in vivo zebrafish based bioassays for biomonitoring of surface water contamination by xeno-estrogens. For this purpose, the bioassays were applied to assess the effect of environmentally relevant surface water pollutants, alone and in simple (artificial) and complex (environmental samples) mixtures. The screening of surface water samples in zebrafish- (ZELH-zfERβ2 cells) and human-based (MELNcells) bioassays revealed qualitative and quantitative differences which could not be entirely explained by the xeno-estrogens identified. To better understand the response of bioassays to complex environmental mixtures, the activity of environmentally relevant surface waterpollutants was characterized across the bioassays, alone and in 2 to 12-component mixtures combining estrogenic and non-estrogenic chemicals to simulate an environmental contamination.The results indicate that zebrafish-based bioassays have a different and even in some cases an opposite response to the simple mixtures compared with the human-based bioassay MELN. These differences are explained by different sensitivity to some pollutants leading to bioassay-specific interactions with estrogen receptor activation. Al together, this work shows that the biological particularities of each bioassay can influence the response to estrogenic chemicals when mixed with other environmental pollutants, opening the discussion regarding their implementation in chemical water biomonitoring.

L’intégrité fonctionnelle de la barrière hémato-encéphalique (BHE) est altérée dans de nombreuses pathologies neurologiques et métaboliques. Les vaisseaux cérébraux sont des tissus cibles des hormones stéroïdes sexuelles mais la contribution respective de ces effecteurs endocriniens et de leurs récepteurs dans l’intégrité de la BHE reste encore à être précisée. Les effets des hormones gonadiques sur l’unité neurovasculaire chez la souris ont été étudiés, en se concentrant sur l’aire préoptique médiane de l’hypothalamus, une région cérébrale hormono-sensible. L’augmentation de la perméabilité de la BHE chez des souris mâles et femelles gonadectomisés. Elle est associée chez le mâle à une désorganisation des jonctions serrées et une diminution de l’expression des protéines les constituant, à une activation des cellules gliales, et à une augmentation de l’expression de molécules inflammatoires, la supplémentation en testostérone permettant la restoration. Les récepteurs des androgènes et des estrogènes peuvent ainsi être impliqués dans la régulation hormono-dépendante du transport paracellulaire. La lignée de souris transgéniques sélectivement invalidées pour le récepteur neural des androgènes, a permis de mettre en évidence l’effet délétère de l’absence de ce récepteur sur l’intégrité de la BHE et des jonctions serrées. Pour compléter, un modèle ex vivo de tranches d’hypothalamus a permis d’appréhender les effets à court terme de la testostérone sur la BHE. Ces données soulèvent des questions sur les effets délétères potentiels des perturbateurs endo-criniens sur l'intégrité BBB et l'apparition de maladies neurologiques et métaboliques associées. / Functional integrity of the blood-brain barrier (BBB) is compromised in many neurological and metabolic pathologies. Cerebral blood vessels are target tissue for sex steroid hormones but the relative contribution of these endocrine effectors and their receptors in the BBB integrity are still unclear. Effects of gonadal hormones on the mouse neurovascular unit were studied, focusing on the hypothalamic medial preoptic area, a highly sensitive brain area to gonadal steroid hormones. BBB permeability increased in both gonactectomized male and female, is associated with tight junction disorganization and lower expression of tight junction proteins, glial activation, and up-regulation of inflammatory molecules in male. Testosterone supplementation restores the BBB impermeability, tight junction integrity, and almost completely abrogated the inflammatory features. Androgen and estrogen receptor may be involved in testosterone-induced regulation of the formation and maintenance of tight junction in males. Studying the involvement of these receptors using a trans-genic mice line selectively lacking neural AR in the CNS, highlighted the negative effect of this dele-tion on the BBB and TJ integrity. To complete, ex vivo slices of male mouse hypothalamus allowed to assess short-term molecular mechanisms of testosterone on the BBB structure and function.These data raise questions about the potential deleterious effects of endocrine disruptors on the BBB integrity and the occurrence of neurological and metabolic diseases.

Les estrogènes et les bêtabloquants transitent quotidiennement par les réseaux d’assainissement et les stations d’épuration des eaux résiduaires urbaines. Une première partie de ce travail a consisté à développer des méthodes pour analyser ces micropolluants émergents dans les boues de station d’épuration et les matières en suspension. L’efficacité des traitements épuratoires a ensuite été évaluée vis-à-vis de l’élimination de ces molécules. En règle générale, les 5 estrogènes étudiés (estrone, 17α- et 17β-estradiol, estriol, 17α-éthinylestradiol) sont plutôt bien éliminés par les stations d’épuration avec des efficacités d’élimination généralement supérieures à 90%. Pour les 10bêtabloquants analysés (acébutolol, aténolol, bêtaxolol, bisoprolol, métoprolol, nadolol, oxprénolol,propranolol, sotalol et timolol), des comportements différents ont été observés. Alors que l’acébutololet le nadolol sont éliminés (abattements moyens supérieurs à 80%), d’autres molécules comme lesotalol et le propranolol ne sont que peu impactées par les traitements épuratoires (abattements moyens inférieurs à 20%). Pour les autres bêtabloquants étudiés, des abattements intermédiaires (entre 40 et 70%) sont observés. Excepté le propranolol, qui est le plus hydrophobe des bêtabloquants étudiés, les molécules ciblées dans cette étude s’adsorbent peu sur les matières en suspension (en moyenne 90% des molécules se trouvent dans la phase dissoute) et ne sont pas concentrées dans les boues ; les abattements mesurés correspondent donc, sauf pour le propranolol,à une biodégradation et pas à un transfert des micropolluants vers les boues. Les molécules résiduelles non éliminées par le traitement épuratoire rejoignent le milieu aquatique récepteur. Les rejets de station d’épuration représentent en effet une source de contamination pour les milieux aquatiques et l’impact de ces rejets est visible, notamment en termes d’augmentation des concentrations de micropolluants mesurées dans le milieu. Néanmoins, les faibles concentrations mesurées ne semblent pas individuellement représenter de risque environnemental majeur ; seul le propranolol a présenté sur 4 des 15 sites étudiés un quotient de risque supérieur à 1 ce qui indique un risque environnemental probable. Cependant, même si le risque associé à une molécule est faible,chaque molécule présente dans l’environnement contribue au potentiel toxique global des substances présentes dans l’environnement. / Estrogens and beta blockers are daily excreted by human beings and wastewater treatmentplants are recognised as the main pathway of these emerging micropollutants to the aquaticenvironment. This study aims at analyzing 5 estrogens (estrone, 17α- and 17β-estradiol, estriol, 17α-ethynylestradiol) and 10 beta blockers (acebutolol, atenolol, betaxolol, bisoprolol, metoprolol, nadolol, oxprenolol, propranolol, sotalol et timolol) in urban wastewater treatment plants and surface waters.First of all, methods were developed for the analysis of target molecules in sewage sludge and suspended particulate matters. Then, estrogens and beta blockers were studied in urban wastewater treatment plants. Generally, wastewater treatments are efficients to remove estrogens fromwastewater with mean removal rates above 90%. For beta blockers, acebutolol and nadolol areefficiently removed (mean removal rates of about 80%), while sotalol and propranolol are hardlyimpacted by wastewater treatment (mean removal rates below 20%). Other studied beta blockerspresent intermediate removal rates (between 40 and 70%). Except propranolol which is the lesshydrophilic molecule among the different studied beta blockers, target molecules are not adsorbed onsuspended particulate matters (mean proportion of 90% of the target molecules are present in the dissolved phase) and are not concentrated into sludge. So, calculated removal rates correspond,except for propranolol, to biodegradation and not to transfer into sludge. Residual molecules which are not removed by wastewater treatment reach the aquatic environment. The impact of wastewater treatment plants on the receiving rivers was studied showing a clear increase of target molecules concentrations near the wastewater treatment plants outfall. However, only propranolol presented an environmental risk ratio in the range or above 1 showing a possible environmental risk in 4 studied receiving waters out of 15. Never the less, even if no specific toxic effects are pointed out, each molecule contributes to the overall toxic potential of the substances present in the aquatic environment.

L’imagerie moléculaire avec des biomarqueurs radiomarqués par des émetteurs de positons est couramment utilisée dans les cancers mammaires infiltrants pour la stadification initiale ou en cas de récidive, et également pour l’évaluation de la réponse tumorale en situation néoadjuvante et métastatique. Après quelques notions générales sur les cancers mammaires et le rôle alloué à l’imagerie moléculaire, les résultats des travaux axés sur l’imagerie moléculaire des cancers mammaires que j’ai encadrés et auxquels j’ai contribués au sein de l’équipe de Médecine Nucléaire de l’Institut Curie - Saint-Cloud sont présentés. Ces études ont évalué la valeur de la Tomographie par Emission de Positons au FluoroDesoxyGlucose (TEP-FDG) en cas de suspicion biologique de récidive, ou pour la stadification initiale et l’évaluation de la réponse tumorale à la Chimiothérapie NéoAdjuvante (CNA) des cancers mammaires inflammatoires. Notre équipe a également étudié la valeur pronostique de la réponse tumorale à l’hormonothérapie par la TEP-FDG, en situation métastatique. La problématique de l’évaluation précoce de la réponse tumorale à la CNA par l'imagerie moléculaire m’a amené à étudier un modèle murin transgénique de cancer mammaire avec d’autres biomarqueurs que le FDG, à savoir la FLuoroThymidine (FLT) et le pertechnetate. Des outils de quantification de la charge tumorale ont pu être développés et ont permis d’évaluer la réponse tumorale à des drogues cytotoxiques lors d’un suivi longitudinal, mais ce travail s’est heurté aux limites de l’imagerie préclinique. Les résultats des études cliniques sur l’évaluation précoce de la réponse tumorale à la CNA sont ensuite exposés, avec le FDG comme biomarqueur en insistant sur l’influence du phénotype moléculaire sur les paramètres définissant une réponse métabolique. L’état des connaissances et les perspectives avec d’autres biomarqueurs que le FDG, à savoir la FLT et le FluoroEStradiol (FES), pour étudier respectivement la prolifération cellulaire tumorale et la présence et la fonctionnalité des récepteurs aux estrogènes, puis l’imagerie en développement de l’Human Epidermal Growth Factor Receptor-2 (HER2), destinés à la fois à la sélection de patients candidats à des thérapies innovantes et à la prédiction et l’évaluation de la réponse tumorale aux thérapies sont discutées. / Molecular imaging with biomarkers radiolabeled by positron emitters is commonly used in invasive breast cancers for initial staging or restaging, and for assessment of tumor response in neoadjuvant and metastatic settings. After general concepts of breast cancers and of the place of molecular imaging, results of studies I supervised and to which I contributed within the nuclear medicine team from Curie Institute - Saint-Cloud focused on molecular imaging in breast cancers are presented. These studies assessed the value of Positron Emission Tomography using FluoroDeoxyGlucose (FDG-PET) in recurrence suspected on tumor marker rising and in staging and assessment of tumor response to neoadjuvant chemotherapy (NACT) in inflammatory breast cancers. Moreover our team has studied the prognostic value of tumor response to endocrine therapy by FDG-PET in metastatic breast cancers. The problem of early assessment of tumor response to NACT by molecular imaging has led me to study a transgenic mouse model with other biomarkers than FDG, namely FLuoroThymidine (FLT) and pertechnetate. Quantification tools of tumor burden have been developed and allowed assessment of tumor response to cytotoxic drugs during a longitudinal follow-up of this model, but several limitations of preclinical imaging were encountered. Results of clinical studies on early assessment of tumor response to NACT with FDG as a biomarker are exposed, with emphasis on the influence of the molecular subtype on parameters defining a metabolic response. State of the art and perspectives with FLT and FluoroEStradiol (FES), as biomarkers of proliferation and of estrogen receptors respectively, then imaging of Human Epidermal Growth Factor Receptor-2 (HER2), for both selection of patients to innovative therapies and prediction and assessment of tumor response to systemic therapies are discussed.

Les estrogènes jouent un rôle primordial dans le développement et le fonctionnement des tissus reproducteurs par leurs interactions avec les récepteurs des estrogènes ERα et ERβ. Ces récepteurs nucléaires agissent comme facteurs de transcription et contrôlent l’expression des gènes de façon hormono-dépendante et indépendante grâce à leurs deux domaines d’activation (AF-1 et AF-2). Une dérégulation de leur activité transcriptionnelle est souvent à l’origine de pathologies telles que le cancer du sein, de l’endomètre et des ovaires. Alors que ERα est utilisé comme facteur pronostic pour l’utilisation d’agents thérapeutiques, l’importance de la valeur clinique de ERβ est encore controversée. Toutefois, des évidences récentes lui associent un pouvoir anti-tumorigénique en démontrant que sa présence favorise l’inhibition de la progression de ces cancers ainsi que l’efficacité des traitements. En combinaisons avec d’autres études, ces observations démontrent que bien que les deux isoformes partagent une certaine similitude d’action, les ERs sont en mesure d’exercer des fonctions distinctes. Ces différences sont fortement attribuables au faible degré d’homologie observé entre certains domaines structuraux des ERs, comme le domaine AF-1, ce qui fait en sorte que les différents sites de modifications post-traductionnelles (MPTs) présents sur les ERs sont très peu conservés entre les isoformes. Or, l’activité transcriptionnelle ligand-dépendante et indépendante des ERs est hautement régulée par les MPTs. Elles sont impliquées à tous les niveaux de l’activation des ERs incluant la liaison et la sensibilité au ligand, la localisation cellulaire, la dimérisation, l’interaction avec l’ADN, le recrutement de corégulateurs transcriptionnels, la stabilité et l’arrêt de la transcription. Ainsi, de par leur dissimilitude, les ERs seront différemment régulés par la signalisation cellulaire. Comme un débalancement de plusieurs voies de signalisation ont été associées à la progression de tumeurs ER-positives ainsi qu’au développement d’une résistance, une meilleure compréhension de l’impact des MPTs sur la régulation spécifique des ERs s’avère essentielle en vue de proposer et/ou développer des traitements adéquats pour les cancers gynécologiques. Les résultats présentés dans cette thèse ont pour objectif de mieux comprendre les rôles des MPTs sur l’activité transcriptionnelle de ERβ qui sont, contrairement à ERα, très peu connus. Nous démontrons une régulation dynamique de ERβ par la phosphorylation, l’ubiquitination et la sumoylation. De plus, toutes les MPTs nouvellement découvertes par mes recherches se situent dans l’AF-1 de ERβ et permettent de mieux comprendre le rôle capital joué par ce domaine dans la régulation de l’activité ligand-dépendante et indépendante du récepteur. Dans la première étude, nous observons qu’en réponse aux MAPK, l’AF-1 de ERβ est phosphorylé au niveau de sérines spécifiques et qu’elles jouent un rôle important dans la régulation de l’activité ligand-indépendante de ERβ par la voie ubiquitine-protéasome. En effet, la phosphorylation de ces sérines régule le cycle d’activation-dégradation de ERβ en modulant son ubiquitination, sa mobilité nucléaire et sa stabilité en favorisant le recrutement de l’ubiquitine ligase E6-AP. De plus, ce mécanisme d’action semble être derrière la régulation différentielle de l’activité de ERα et ERβ observée lors de l’inhibition du protéasome. Dans le second papier, nous démontrons que l’activité et la stabilité de ERβ en présence d’estrogène sont étroitement régulées par la sumoylation phosphorylation-dépendante de l’AF-1, processus hautement favorisé par l’action de la kinase GSK-3. La sumoylation de ERβ par SUMO-1 prévient la dégradation du récepteur en entrant en compétition avec l’ubiquitination au niveau du même site accepteur. De plus, contrairement à ERα, SUMO-1 réprime l’activité de ERβ en altérant son interaction avec l’ADN et l’expression de ses gènes cibles dans les cellules de cancers du sein. Également, ces recherches ont permis d’identifier un motif de sumoylation dépendant de la phosphorylation (pSuM) jusqu’à lors inconnu de la communauté scientifique, offrant ainsi un outil supplémentaire à la prédiction de nouveau substrat de la sumoylation. En plus de permettre une meilleure compréhension du rôle des signaux intracellulaires dans la régulation de l’activité transcriptionnelle de ERβ, nos résultats soulignent l’importance des MPTs dans l’induction des différences fonctionnelles observées entre ERα et ERβ et apportent des pistes supplémentaires à la compréhension de leurs rôles physiopathologiques respectifs. / Estrogens play a pivotal role in reproductive physiology through direct interaction with the estrogen receptors ERα and ERβ, which belong to the nuclear hormone receptor family of ligand-activated transcription factors. Harbouring two activation domains (AF-1 and AF-2), gene expression can be controlled by ERs either in a hormone-dependent and/or independent manner. Disruption of ER transcriptional regulation is associated with pathological events such as breast and endometrial cancers. While ERα is considered a strong predictive factor in endocrine therapy of reproductive cancers, the clinical value of ERβ is still debated, although greater expression of ERβ has been associated with a favourable outcome since recent evidence has associated ERβ with anti-tumorigenic properties and a better response to anti-estrogenic compounds. Along with others studies, those individual outcomes indicate that even though the two receptors can exert similar roles by sharing resemblances in terms of structure and general response to hormone, they can also carry out distinct functions. These variations can be attributed to the fact that most of the structural domains shared by ERs exhibit a low level of homology, especially at the AF-1 domain. Consequently, the majority of the post-translational modifications sites (PTMs) on ERs are not shared between both isoforms. In fact, ligand-induced and ligand-independent activities of ERs are critically influenced by PTMs. PTMs controls the multiple aspects of ER-dependent activation by modulating ERs ligand binding, specificity, cellular localization, dimerization, interaction with their cognate DNA response element, combinatory recruitment of transcriptional coregulators, stability and transcriptional arrest. Hence, by their discrepancies, ERs will be differently influenced by the cellular environment. Furthermore, as the deregulation of different signalling pathway in cancers is associated with ER-dependant tumour progression and in the acquisition of a therapeutic resistant phenotype, it is crucial to understand the how PTMs affect ERs transactivation in order to eventually propose and/or develop adequate treatment. The results presented in this thesis were carried out with the objective of gaining a better understanding of PTM’s roles on ERβ transcriptional control which, as opposed to ERα, remain unclear. We demonstrate here a dynamic regulation of ERβ by phosphorylation, ubiquitination and sumoylation. Furthermore, as all the newly identified PTM are located within de AF-1 domain of ERβ, our results highlight the key role of this domain in the regulation of ligand-dependent and independent transcriptional properties of this receptor. The first study shows that in response to MAPK, specific serine residues in the AF-1 of ERβ are phosphorylated and play an important role in the regulation of ERβ ligand-independent activity by the ubiquitin-proteasome pathway. In fact, the activation-degradation cycle of ERβ induced by MAPK is regulated upon phosphorylation of these serines coordinating ERβ ubiquitination, subnuclear mobility and stability by promoting the recruitment of the ubiquitin ligase E6-AP. Moreover, this molecular process plays part in the differential regulation of ERα and ERβ activity upon proteasome inhibition. In the second paper, we demonstrate that ERβ activity and stability in presence of estrogen is closely regulated by the phosphorylation-dependent sumoylation of the AF-1 domain, amplified by GSK-3 action. SUMO-1 attachment prevents ERβ degradation by competing with ubiquitin at the same acceptor site and dictates ERβ transcriptional inhibition, as opposed to ERα, by altering estrogen-responsive target promoter occupancy and gene expression in breast cancer cells. Furthermore, these findings uncover a novel phosphorylated sumoylation motif (pSuM) and offer a valuable tool to predict novel SUMO substrates under protein kinase regulation. In combination to our better understanding on how intracellular signals controls ERβ transcriptional activity, our results highlight the significant role of PTMs in ERs isoforms discrepancies and allows supplementary comprehension of their respective physiopathologicals roles.

Les estrogènes confèrent aux femmes une protection cardiovasculaire jusqu’à la ménopause. En effet, la perte des fonctions ovariennes engendre plusieurs désordres du profil lipidique qui s’accompagnent d’une accumulation de triglycérides au foie appelée stéatose hépatique. Le retrait des estrogènes perturbe de nombreuses voies de contrôle de la cholestérolémie, provoquant simultanément une hypercholestérolémie et une stéatose hépatiques. Toutefois, à ce jour, les mécanismes d’action du retrait des estrogènes sur le métabolisme du cholestérol favorisant le stockage de triglycérides au foie demeurent imprécis. À cet égard, les travaux de cette thèse visaient à clarifier l’ensemble des effets du retrait des estrogènes sur le métabolisme du cholestérol pouvant mener à la pathogenèse de la stéatose hépatique. Lors de la première étude, l’ovariectomie (Ovx) chez la rate, un modèle bien établi de la stéatose, avait permis d’identifier la voie d’assemblage des lipoprotéines à très faible densité (VLDL) comme élément contributif à la stéatose. La voie des VLDL reliant étant également une voie de transport du cholestérol, l’étude suivante a été réalisée afin de comprendre le rôle du cholestérol alimentaire sur les lipides hépatiques. Dans cette deuxième étude, le modèle de la diète riche en lipides et en cholestérol (HFHC), aussi reconnu pour induire une stéatose hépatique, a permis d’établir des liens étroits entre le métabolisme du cholestérol et celui des lipides hépatiques. Étonnamment, de manière similaire à l’Ovx, la diète HFHC perturbait la voie d’assemblage des VLDL. En outre, les données recueillies au cours de ces travaux indiquaient qu’une dysrégulation du métabolisme des acides biliaires avait contribué à la sévérité de la stéatose hépatique induite par cette diète HFHC. Dans la continuité de ces deux premiers projets, nous nous sommes intéressés aux effets concomitants du retrait des estrogènes et d’une diète HFHC sur la stéatose hépatique. De manière intéressante, lorsque combinés, l’Ovx et la diète HFHC potentialisaient non seulement l’accumulation de lipides hépatiques, mais également les perturbations moléculaires des voies sous-jacentes à la stéatose, dont l’assemblage des VLDL et de la sécrétion d’acides biliaires. Dans l’ensemble, les données présentées dans la revue de littérature et dans les trois études reliées à cette thèse indiquent qu’une dysrégulation du métabolisme du cholestérol en réponse au retrait des estrogènes entraîne des complications favorisant l’accumulation de lipides dans le foie. / Estrogens confer to women a cardiovascular protection until menopause. Indeed, the loss of ovarian functions leads to several lipid disorders along with hepatic triglycerides accumulation called hepatic steatosis. Estrogen withdrawal disrupts several cholesterol metabolism pathways that results in both hypercholesterolemia and hepatic steatosis. However, to date, the precise mechanisms by which estrogen withdrawal affect cholesterol metabolism pathways that favour lipid storage in the liver are unclear. In this regard, works in the present thesis aimed at elucidate the effects of estrogen withdrawal on cholesterol metabolism involved in hepatic steatosis pathogenesis. In the first study, estrogen withdrawal by ovariectomy (Ovx), a well established model for hepatic steatosis and hypercholesterolemia, had enabled the identification of very low density lipoprotein (VLDL) pathway as a contributory element for hepatic steatosis. Since the VLDL pathway relates lipids and cholesterol metabolism, we conducted the second study to explore the role of dietary cholesterol on hepatic lipids. In the second study, the high fat/high cholesterol (HFHC) diet, also recognized as a model for hepatic steatosis development, was used to explore links between cholesterol metabolism and hepatic fat accumulation. Surprisingly, HFHC diet also disrupted the VLDL pathway. Additionally, data provided in this study indicated that a dysregulation of bile acids metabolism might have contributed to the severity of hepatic steatosis induced by the HFHC diet. As a continuation of these projects, we were interested in the concomitant effects of estrogen withdrawal and HFHC diet on hepatic lipid accretion. Interestingly, when combined, Ovx and HFHC diet not only potentiated hepatic lipid accumulation but also molecular disruptions involved in underlying pathways for hepatic steatosis including the VLDL pathway and bile acid secretion. Overall, data presented in the review of litterature and provided by the three studies related to the present thesis indicate that cholesterol metabolism dysregulation following estrogen withdrawal result in complications that favour hepatic lipid accumulation.

La barrière intestinale est la plus grande surface de contact entre le milieu extérieur et le milieu intérieur. Outre ses fonctions d'absorption des nutriments, elle exerce un rôle important de défense contre les agents indésirables (toxines, bactéries) contenus dans la lumière intestinale. Une augmentation de la perméabilité intestinale a été observée chez les patients atteints du syndrome de l'intestin irritable (SII) ou des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI). Cette hyperperméabilité intestinale est contemporaine d'une hypersensibilité viscérale à la distension de la paroi intestinale. Des travaux récents rapportent également une augmentation de l'activité protéolytique du contenu intestinal dans le cadre de ces deux pathologies. Les estrogènes, par leurs propriétés anti-inflammatoires et leur capacité à moduler la perméabilité intestinale par activation de leurs récepteurs (REs) peuvent contribuer à l'amélioration des symptômes associés à ces pathologies digestives. Une variété de traitements médicaux a été utilisée pour la prise en charge thérapeutique du SII et de MICI. Cependant, les patients questionnent les cliniciens sur des conseils diététiques susceptibles d'améliorer leur qualité de vie. Ainsi, l'objectif de ce travail était d'évaluer les effets et les mécanismes d'action impliqués, d'un traitement par du germe de soja fermenté (SG) sur l'hyperalgésie viscérale et l'hyperperméabilité intestinale dans des modèles animaux mimant le SII et les MICI afin de proposer des futures allégations santé à ce produit. Le rationnel de l'évaluation de cet ingrédient était basé sur sa composition intéressante, à savoir, sa teneur en composés à propriétés estrogéniques (isoflavones) et sa capacité à inhiber les protéases (BBI). Dans un premier temps, nous avons montré qu'un traitement oral de 15 jours par le SG diminue de façon significative l'hypersensibilité viscérale, l'hyperperméabilité intestinale ainsi que l'augmentation de l'activité protéolytique induites par un stress de contrainte chez le rat. La diminution de la perméabilité intestinale implique une surexpression de l'occludine, protéine des jonctions serrées. De même, le traitement par du SG réduit la densité des mastocytes au niveau du côlon. Tous les effets préventifs du SG sauf ceux sur l'activité protéolytique sont estrogéno-dépendants car bloqués par l'antagoniste des REs. Dans un second temps, nous avons montré qu'un traitement préventif par le SG pendant 15 jours présente des effets protecteurs vis-à-vis d'une inflammation intestinale induite par du TNBS. Le SG atténue la sévérité de l'inflammation, l'hyperperméabilité, l'hypersensibilité et l'augmentation de l'activité protéolytique induites par la colite. Les effets anti-inflammatoires du SG sont à la fois dépendants des phytoestrogènes et du contenu de l'ingrédient en BBI. En conclusion, ces données sont prometteuses pour une future utilisation du SG dans la gestion thérapeutique du SII et des MICI comme traitement adjuvant / The intestinal barrier is the largest area of contact between the external environment and internal environment. In addition to its function of nutrient absorption, the intestinal barrier plays a key role of defense against noxious agents (toxins, bacteria) contained in the intestinal lumen. An increase in intestinal permeability was observed in patients with irritable bowel syndrome (IBS) or inflammatory bowel disease (IBD). This intestinal hyperpermeability was often associated with visceral hypersensitivity to colorectal distension. Recent studies also report an increase in the proteolytic activity in patients with IBS or IBD. Estrogens, through their anti-inflammatory properties and their ability to modulate intestinal permeability by activating estrogen receptors (ERs), can play an important role in these digestive diseases. A variety of medical therapies have been used for treatment of IBS and IBD. However, patients question clinicians about dietary suggestions to improve their symptoms and quality of life. Thus, the aim of this study was to evaluate the effects and mechanisms of action involved of a treatment with fermented soy germ (SG) on visceral hyperalgesia, intestinal hyperpermeability in animal models mimicking the IBS and IBD. The evaluation of this ingredient was based on its interesting composition, i.e its content of isoflavones and a family of serine protease inhibitors known as BBI. Initially, we demonstrated that an oral treatment of 15 days by SG significantly reduces visceral hypersensitivity, intestinal hyperpermeability and increased proteolytic activity induced by acute stress in the rat. Decreased intestinal permeability is due to overexpression of occludin, a transmembrane tight junction protein. Similarly, treatment with SG reduces the density of colonic mast cells. All preventive effects of SG except those on the proteolytic activity are estrogen-dependent because blocked by the antagonist of ERs. In a second step, we demonstrated that a treatment for 15 days with SG induces protective effects against intestinal inflammation induced by TNBS. SG reduces the severity of colitis, decreases TNBS-induced hyperpermeability, hypersensitivity and increased proteolytic activity. The anti-inflammatory effects of SG are estrogen and/or BBI dependent. In conclusion, these data are promising for future use of the SG as adjuvant therapy in IBS and IBD management

La résistance aux anti-aromatases (AAs) constitue un obstacle thérapeutique majeur dans le traitement des cancers du sein RE+. Les objectifs de ce travail étaient : (i) de caractériser les événements moléculaires associés à la résistance acquise aux AAs ; (ii) d’identifier de manière globale de nouveaux profils de miRNAs spécifiquement associés à la résistance aux AAs. Notre étude a mis en évidence le rôle central de la voie Akt/mTOR dans la résistance acquise et de novo aux AAs dans des modèles cellulaires, mais également dans des échantillons de patientes ayant récidivé sous anastrozole. La combinaison d’un AA avec le MK-2206, inhibiteur d’Akt ou avec la rapamycine, inhibiteur de mTOR, augmente la sensibilité à l’AA dans les cellules contrôles et est suffisante pour surmonter la résistance et restaurer la sensibilité à l'hormonothérapie dans les cellules résistantes. Notre travail propose également un modèle de résistance acquise aux AAs basé sur la sélection de cellules « cancer-initiating-like » dotées de propriétés d'auto-renouvellement, d’une résistance intrinsèque aux AAs et d’une sensibilité au MK-2206. Notre étude à grande échelle des miRNAs a identifié la voie Akt/mTOR comme une des cibles privilégiées de ces miRNAs. Nous avons identifié et validé trois miRNAs dérégulés capables de moduler le statut d’activation de la voie Akt/mTOR, qui représentent des cibles potentielles. En conclusion, notre projet a mis en évidence de nouvelles voies de signalisations ciblées par ces miRNAs et de nouveaux évènements moléculaires, qui représentent des candidats potentiels dans la résistance aux AAs / Resistance to aromatase inhibitors (AIs) remains a major drawback in the treatment of ER+ breast cancers. Our objectives were (i) to characterize molecular events associated with acquired AI resistance (ii) to capture a global view of the miRNA expression profiles associated with AI resistance. Our results showed the major role of the Akt/mTOR pathway in both de novo and acquired resistance to AI in cellular models and also in breast tumors of patients who relapsed under anastrozole. Combining AI with the Akt inhibitor MK-2206 or with the mTOR inhibitor rapamycin increased sensitivity to this AI in the control cells and was sufficient to overcome resistance and restore sensitivity to endocrine therapy in the resistant cells. Our findings propose a model of AI-acquired resistance based on the selection of cancer-initiating-like cells possessing self-renewing properties, intrinsic resistance to AI and sensitivity to MK-2206. Our large-scale study identified the Akt/mTOR pathway as one of the main targets of the deregulated miRNAs. We identified and validated three miRNAs able to modulate the Akt/mTOR activation status, suggesting these miRNAs as potential targets. To conclude, our project identified new miRNA-targeted signaling pathways and new molecular events, representing strong candidates in the mediation of AI resistance