Hamburg, Univ., Diss., 2002. / Computerdatei im Fernzugriff.

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Hamburg, Universiẗat, Diss., 2002.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2012-10-22T20:41:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 233944.pdf: 1100842 bytes, checksum: 8f71501c988a448dd4c0ad24a83d09cd (MD5) / Poli(3-hidroxibutirato), P(3HB), é um biopolímero acumulado por muitos microrganismos como reserva de carbono e energia, em determinadas condições. Possui propriedades termoplásticas semelhantes às dos plásticos petroquímicos e a vantagem de ser biocompatível e completamente biodegradável. Entretanto, possui custo elevado de produção frente aos plásticos convencionais, o que limita seu uso. Algumas estratégias de produção de P(3HB) por Ralstonia eutropha foram estudadas, com o objetivo de aumentar a produção do polímero, visando a redução de seus custos. Neste trabalho teve-se por objetivo a melhoria das condições de cultura para o crescimento e produção de P(3HB) por R. eutropha em diferentes substratos. Uma das estratégias utilizadas foi a realização de cultivos a diferentes temperaturas. Além da utilização de um substrato de baixo custo, um novo método de extração de P(3HB) também foi estudado, visando a redução de poluentes e o custo de produção. Primeiramente, a modelagem matemática do crescimento da bactéria foi utilizada para estimar os parâmetros: velocidade específica máxima de crescimento ( max), tempo da fase lag ( ) e aumento logarítmico da população (A), utilizando-se resíduo amiláceo e glicose (padrão) como substrato. Utilizaram-se três modelos primários de crescimento e o modelo de Gompertz Modificado, foi o que melhor se ajustou às curvas de crescimento da bactéria, nas diferentes fontes de carbono testadas. Pelo modelo de Gompertz Modificado foi possível prever o momento da limitação de nitrogênio nas culturas. Não houve ajuste de nenhum dos modelos secundários aos parâmetros de crescimento µ e A nos substratos testados, somente foi possível modelar o efeito da variação da temperatura sobre o parâmetro , nos cultivos em resíduo amiláceo, com suplementação. Foi estudada a produção de P(3HB) nos substratos de glicose e resíduo amiláceo, e também a suplementação do meio de cultivo com óleo de soja, visando aumentar a produção de polímero. O resíduo amiláceo mostrou-se uma boa fonte de carbono para a produção de P(3HB). A suplementação aumentou o conteúdo de biopolímero em 6,1 e 8% nos cultivos a 30 e 35°C, respectivamente e, nos cultivos em glicose o aumento foi de 11,7 e 13,7% a 30 e 35°C, respectivamente. Nos cultivos a 35°C, a quantidade de P(3HB) e de células foram superiores em relação ao cultivo a 30°C. Foi possível desenvolver um método de extração simples, utilizando somente clorofórmio como solvente, juntamente com os processos de agitação e aquecimento. O melhor tempo determinado para a extração foi de 2 horas, visto que o filme de P(3HB) apresentou 98% de pureza e 94% de recuperação, com menor cristalinidade, maior estabilidade térmica e alta massa molar, em relação aos outros tempos de extração testados. A caracterização também foi realizada para os filmes de P(3HB) dos cultivos em resíduo amiláceo que apresentaram propriedades muito próximas aos obtidos em glicose. Somente os cultivos com suplementação de óleo apresentaram características diferentes. Poly(3-hydroxybutyrate), P(3HB), is a biopolymer accumulated by many microorganisms , as carbon and energy storage, under established conditions. P(3HB) has thermoplastic properties similar to those of the conventional plastics and the advantage of being biocompatible and totally biodegradable. However, its high cost of production related to conventional plastics limits its use. Some strategies for production of P(3HB) by Ralstonia eutropha were studied, aiming to increase polymer production, and seeking costs reduction. In this work, the target was to improve the culture conditions for growth and production of P(3HB) by Ralstonia eutropha in different substratum. One of the strategies was to use different culture temperatures. Beyond the utilization of a low cost substrate, a new extraction method was studied, aiming the reduction of pollutant and production costs. Firstly, the mathematical modeling of bacteria growth was used to estimate the following parameters: specific maximun growth rate ( max), time of lag phase ( ) and logarithmic increase of population (A), using starchy waste and glucose (standard) as carbon source. Three primary growth models were used, and the ´Modified Gompertz´ model was present the bets fit to the growth curves of the bacteria, on the different carbon sources tested. Through the ´Modified Gompertz´ model, it was possible to estabish the moment of nitrogen limitation in the culture. There was no adjustment of any of the secondary models to the growth parameters and A on the tested substrate. It was only possible to model the effect of temperature variation over the parameter, on the cultures in starchy waste, with supplementation. The production of P(3HB) was carried out on glucose and starchy waste, and also the supplementation of the culture with soybean oil, aiming to increase P(3HB) production. The starchy waste showed to be a good carbon source for P(3HB) production. The supplementation increased the P(3HB) content in 6.1 and 8% in the cultures at 30 and 35ºC, respectively and the increase in the glucose cultures was of 11.7 and 13.7% in the cultures at 30 and 35ºC. In the cultures at 35ºC, the P(3HB) and cell contents were superior when compared to the cultures at 30ºC. A simple extraction method was developed using only chloroform as solvent in association with agitation and heating. The best time verified for the extraction was of 2 hours, because the P(3HB) film showed 98% of purity and 94% of recuperation, with lower crystallinity, higher thermal stability and high molar mass. The characterization was also realized for the P(3HB) films produced on starchy waste cultures and they presented characteristics very similar to those obtained on glucose. Only the cultures with soybean oil showed different characteristics.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química / Made available in DSpace on 2012-10-22T19:10:30Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Os polímeros biodegradáveis possuem propriedades similares aos plásticos convencionais e têm a vantagem de serem degradados no solo em poucos meses pela ação de microrganismos. O poli(3-hidroxibutirato) - P(3HB) é um poliéster produzido e acumulado como reserva de energia por inúmeras bactérias, na forma de grânulos localizados no interior das células. A proposta deste trabalho foi sintetizar P(3HB) com o cultivo da bactéria Ralstonia eutropha na presença de diferentes concentrações de ácido oléico (AO), em diferentes temperaturas, avaliando seu efeito sobre o crescimento celular e a síntese do polímero. Os resultados demonstraram que o acréscimo de ácido oléico contribuiu para o aumento da velocidade específica de crescimento e a produtividade em células em condições balanceadas a 30ºC, em frascos agitados. Em biorreator, a adição de ácido oléico proporcionou a maior produtividade e conversão de substrato em polímero. Com a adição de 3,0g/L de ácido oléico ou equivalente em óleo de canola, o aumento da quantidade de P(3HB) produzido chegou a 100% quando adicionado nas duas fases. O aumento crescente de ácido oléico levou à formação de polímeros menos cristalinos, com redução no grau de cristalinidade de 70,4% (0g/L de AO) para 52,5% (3,0g/L de AO). Uma redução de 11ºC na temperatura de fusão (Tm )em relação à amostra controle foi observada para o polímero sintetizado com 3,0 g/L de AO. A temperatura de início de degradação (Ti) variou entre 280-283,9ºC para as concentrações de 0 a 1,5g/L de AO. Com a adição de 3,0g/L de AO a Ti caiu para 270ºC. Para avaliar a biodegradação, os filmes preparados por evaporação de solvente, em várias composições, foram enterrados no fundo de copos de Becker contendo solo envelhecido. As amostras permaneceram enterradas por 0, 7, 14 e 21dias. A análise visual para taxa de biodegradação foi: 3,0g/L de AO > 1,5g/L de AO > 0,9g/L de AO # 0,3g/L de AO > 0g/L de AO. Com 0,9 e 3,0g/L de AO após 7 dias de degradação em solo houve uma diminuição acentuada na entalpia de fusão e no grau de cristalinidade. Em decorrência das propriedades físicas inferiores do P(3HB), a última parte do presente trabalho teve como objetivo preparar blendas de P(3HB)/PCL e estudar a biodegradação dessas misturas em solo. A poli (e-caprolactona) (PCL) age como plastificante polimérico, melhorando a processabilidade da blenda. Foi possível concluir que as blendas com alto teor de P(3HB) degradam mais rápido do que o P(3HB) puro. Os resultados das análises de calorimetria exploratório diferencial (DSC) indicaram um aumento do grau de cristalinidade e aumento da temperatura de fusão, o que sugere que a degradação se inicia na parte amorfa e que está ocorrendo simultaneamente um processo de recristalização, formando cristais mais perfeitos, que se fundem a uma temperatura superior. As análises termogravimétricas evidenciaram uma diminuição da estabilidade térmica tanto para o P(3HB) como para as blendas, independentemente da sua composição, ao longo do tempo de degradação. De uma forma geral, os resultados mostram uma mudança drástica na cinética de biodegradação em solo das blendas a partir de 50% de P(3HB) na blenda. The environmental impact caused by the disposal of plastics has motivated the development of biodegradable and biocompatible materials. Polyhydroxyalkanoates have been attracting much attention in recent years as biodegradable and biocompatible thermoplastics with potential applications ranging from agricultural implements to biomedical applications. One example of this kind of material is poly(3-hydroxybutyrate), P(3HB) a bacterial storage compound that are synthesized and deposited intracellularly in the form of inclusion bodies ("granules") and might amount up to 90% of the cellular dry weight. The results showed that supplementation with oleic acid of cultures producing P(3HB) increased the growth rate and the cell productivity in balanced condition at 30ºC in shake flasks. In bioreactor, the addition of oleic acid gave the best productivity and polymer yield (Y pol/S). With 3,0 g/L of oleic acid or equivalent in canole oil, the polymer production was 100% increased, if added in both phases. The crystallinity was reduced from c.a 70% (0 g/L of oleic acid) to c.a 52% (3,0 g/L of oleic acid). A reduction of 11ºC in melting temperature (Tm) was observed for the polymer synthesized with 3,0 g/L of oleic acid. The onset temperature (Ti) of degradation varied between 280-284ºC for 0 to 1,5 g/L of oleic acid. With 3,0 g/L of oleic acid, the Ti decreased to 270ºC. To evaluate the biodegradation, the films prepared by casting, in various compositions, were buried in Beckers with soil for 0, 7, 14 and 21 days. The visual analysis for biodegradation was: 3,0 g/L of oleic acid > 1,5 g/L of oleic acid > 0,9 g/L of oleic acid # 0,3 g/L of oleic acid > 0 g/L of oleic acid. With 0,9 and 0,3 g/L of oleic acid, after 7 days of degradation in soil, the melting enthalpy and the crystallinity degree were diminished. Considering the low properties of P(3HB), the last part of this work aimed to prepare P(3HB)/PCL blend and to study their biodegradability. PCL acts as plasticizer, improving the blend characteristics. It was possible to conclude that blends with high content of P(3HB) was degraded faster than the homopolymer P(3HB). The results of DSC showed an increase in the crystallinity degree, which suggests that the degradation starts in the amorphous phase and it is occurring a recrystallization process, simultaneously, with crystals more perfects with higher Tm. The TGA analyses showed that thermal stability decreased for P(3HB) and for blends, despite their composition, as long as the biodegradation proceeded. In general, the results presented a radical change in biodegradation kinetics in soil for blends over 50% of P(3HB) in their composition.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química / Made available in DSpace on 2012-10-24T01:16:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 257945.pdf: 4275959 bytes, checksum: 73f6737902445ce4bdfb3bc4e51d2175 (MD5) / Polihidroxialcanoatos (PHAs) são polímeros sintetizados por vários microrganismos e armazenados na forma de reserva de energia e carbono. Sua produção se dá sob condições desfavoráveis de crescimento, como limitação de nitrogênio ou fósforo, e na presença de excesso de fonte de carbono. Poli(3-hidroxibutirato) (P(3HB)) é o polímero mais estudado dentre os PHAs, possuindo características próximas às encontradas no polipropileno. Os PHAs chamam atenção devido à sua biodegradabilidade e possibilidade de substituição dos plásticos petroquímicos. Embora os PHAs apresentem vantagens ambientais sobre os plásticos de origem petroquímica, a sua principal desvantagem é o alto custo de produção, principalmente relativo ao substrato, recuperação e extração do polímero. Neste trabalhou teve-se por objetivo a melhoria das condições de cultivo para o crescimento e produção de P(3HB) por R. eutropha em diferentes temperaturas, seguido de um estudo de extração, caracterização e recuperação do polimero obtido. Os experimentos foram conduzidos em culturas em biorreator utilizando como microrganismo produtor a bactéria Ralstonia eutropha DSM 545. O processo foi dividido em duas fases sendo a primeira um crescimento balanceado e a segunda um crescimento desbalanceado com carência de nitrogênio para acúmulo intracelular do polímero. Primeiramente, a modelagem matemática do crescimento da bactéria foi utilizada para estimar os parâmetros: velocidade específica de crescimento ( max), tempo da fase lag ( ) e aumento logarítmico da população (A), posteriormente definiu-se a melhor temperatura de cultivo para o crescimento e produção de P(3HB) por Ralstonia eutropha. Os modelos de Gompertz Modificado e o Logístico foram ajustados às curvas de crescimento. O modelo que melhor se ajustou aos dados experimentais foi o Modelo de Gompertz Modificado. Não foi possível a obtenção de um modelo secundário que descrevesse a influência da temperatura sobre os parâmetros de crescimento µ, e A, nas diferentes temperaturas de cultivo testadas. A temperatura que proporcionou as melhores condições de cultivo tanto para o crescimento quanto para a produção de P(3HB) foi a temperatura de 32,5ºC, onde nesta condição obteve-se uma produção de P(3HB) de 70,3% em 26,5 horas de cultivo, com uma produtividade de 0,47 g.L-1h-1. O estudo da respirometria como alternativa para definição do estado fisiológico da célula e como ferramenta indicativa de limitações de nutrientes durante a produção de P(3HB) também foi realizado deste trabalho. Foi observado que, para concentrações de substrato inferiores a 12g/L, a cultura começa a sofrer uma desaceleração na sua velocidade específica de respiração (QO2), tornamdo-se um fator limitante na produção de P(3HB). Foi possível visualizar também, através do acompamamento da velocidade específica de respiração, o momento em que começa a ocorrer a limitação de nitrogênio e, consequentemente, o início da produção de P(3HB), isto é indicado através do início da sua desaceleração, o que passa a ser mais acentuado a partir do momento em que ocorre a exaustão do nitrogênio no meio. Como última parte deste estudo, foram realizados testes em diferentes condições de pré-tratamentos celular antes da extração, e testes durante a extração variando-se o tempo e a temperatura, utilizando como solvente o carbonato de propileno. Nesta etapa, observou-se que o melhor resultado foi obtido nas extrações realizadas com pré-tratamento de pH e temperatura de extração a 130ºC/30 min onde obte-se um peso molecular de 1,3.106g/mol, com uma recuperação e pureza de 96,3% e 94,6%. O conjunto de dados obtidos neste trabalho é bastante relevante para a melhoria do processo de produção de P(3HB) Polyhydroxyalkanoates (PHAs) are polymers synthesized by various microorganisms and stored as reserve of energy and carbon. Their production occurs under unbalanced growth conditions, such as limitation of nitrogen or phosphorus and excess of carbon source. Polyhydroxybutyrate (P(3HB)) is the most studied polymer among the PHAs since its physical properties are remarkably similar to those of polypropylene. The PHAs are important due to their biodegradability and also because the possibility to use them rather than petrochemical plastics. Although PHAs show ecological advantages over petrochemical plastics, their main disadvantage is the high cost of production, mainly due to the polymer substrate, recovery and extraction. In this work, the target was to improve the culture conditions for growth and production of P(3HB) by Ralstonia eutropha in different temperatures, following by the study of extraction, characterization and recovery of the polymeric obtained. The experiments were carried out in a bioreactor using Ralstonia eutropha DSM 545. The process was divided in two phases. The first phase was characterized by balanced growth conditions and the second one occurred under unbalanced growth conditions such as limitation of nitrogen in order to produce intracellular polymer accumulation. Firstly, the mathematical modeling of bacteria growth was used to estimate the following parameters: maximum specific growth rate ( max), time of lag phase ( ) and logarithmic increase of population (A). After, the best cultivation temperature was defined in order to produce P(3HB) by Ralstonia eutropha. The growth models "Modified Gompertz" and "Logistic" was fit to the growth curves. The best model fitted to the experimental data was Modified Gompertz. It was not possible to find a secondary model able to describe the influence of temperature over growth parameters µmax, and A in the different cultivation temperatures tested. The best cultivation temperature for growth and for P(3HB) production was 32.5°C, in which 70.3% of P(3HB) was produced in 26.5 hours of cultivation, with productivity of 0.47 g.L-1h-1. The respirometry study, as a alternative for definition of the physiologic state of the cell and also as a toll which give indication of nutrients limitation during the P(3HB) production, was done in this work too. It was observed that when the concentration of substrate was under 12g/L, the culture start to suffer a slowdown of its specific respiration rate (QO2), becoming itself a limiting factor of P(3HB) production. It was also possible to see, following the specific respiration rate, the exactly moment when begins the nitrogen limitation and, consequently, the P(3HB) production phase. This phase is indicated by the decrease of QO2 value, followed by the acceleration of this diminution when the exhaustion of nitrogen occurs in the media. In the last step of this study, tests were made in different conditions of cellular pre-treatment before extraction and tests were made during the extraction under different time and temperature conditions, using propylene carbonate as a solvent. In this step, it was observed that the best results was found when the extractions were made with pre-treatment of pH and temperature of extraction at 130°C/30 min which was obtained molecular weight of 1.3 x 106g/mol and recuperation and purity of the 96.3% and 94.6%, respectively. The set of the data obtained in this work is enough relevant to the improvement of the P (3HB) production process. .

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-graduação em Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2012-10-21T10:43:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Polihidroxialcanoatos (PHAs) são polímeros sintetizados por vários microrganismos e armazenados na forma de reserva de energia e carbono. Sua produção se dá sob condições desfavoráveis de crescimento, como limitação de nitrogênio ou fósforo, e na presença de excesso de fonte de carbono. Polihidroxibutirato P(3HB) é o polímero mais estudado dentre os PHAs, possuindo características próximas às encontradas no polipropileno. Os PHAs chamam atenção devido à sua biodegradabilidade e possibilidade de substituição dos plásticos petroquímicos. Embora os PHAs apresentem vantagens ambientais sobre os plásticos de origem petroquímica, a sua principal desvantagem é o alto custo de produção, principalmente relativo ao substrato, recuperação e extração do polímero. A utilização de resíduos agro-industriais é uma possibilidade atrativa para a diminuição deste custo, pois o reduz com relação ao substrato. Este trabalho teve como objetivo estudar a viabilidade da utilização de melaço cítrico como substrato para a produção de PHA. Os experimentos foram conduzidos em culturas descontínuas em frascos aletados e biorreator utilizando como microrganismo produtor à bactéria Ralstonia eutropha DSM 545. O processo foi dividido em duas fases sendo a primeira um crescimento balanceado e a segunda um crescimento

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos. / Made available in DSpace on 2012-10-20T11:04:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 197135.pdf: 1218237 bytes, checksum: 2e286818cfdb73116aedefa3217cc82f (MD5) / Poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) [P(3HB-co-3HV)] é um biopolímero acumulado por muitos microrganismos, como reserva de carbono e energia, em condições desbalanceadas do meio. Possui propriedades termoplásticas semelhantes às dos plásticos petroquímicos e a vantagem de ser biocompatível e completamente biodegradável. Entretanto, possui custo elevado de produção frente aos plásticos convencionais, o que limita seu uso. Diversas estratégias de produção de P(3-HB-co-3HV) por Ralstonia eutropha foram estudadas, com o objetivo de aumentar a produção de polímero, visando à redução de seus custos. A alimentação do elemento limitante, fosfato, durante a fase de produção, aumentou o acúmulo de polímero. Demonstrou-se que a melhor velocidade de produção de biomassa (rx) a ser mantida na fase de produção é de 0,02 gXr.L-1h-1. O monitoramento do potencial redox indicou as mudanças metabólicas do microrganismo e sinalizou o momento da limitação da cultura. Esta sinalização facilita o processo produtivo, permitindo que as alimentações de fosfato e ácido propiônico sejam realizadas a partir do momento exato do início da fase de produção, sem desperdício de co-substrato. Estudou-se a utilização de suplementos nutricionais na produção de polímero, como o ácido linoleico e oleico, na concentração de 0,3 g.L-1, os quais mostraram-se eficientes, levando a um aumento de cerca de 11% de acúmulo de polímero. Óleos vegetais que possuem esses ácidos graxos em sua composição também foram testados, na concentração equivalente a 0,3 g ácido oleico.L-1, em frascos agitados. Os óleos de canola e oliva apresentaram os maiores aumentos de produção de polímero. Por fim, a caracterização dos polímeros produzidos em biorreator neste estudo, mostrou que suas propriedades térmicas são semelhantes às do biopolímero comercial.

Hydrogenasen sind essentielle Enzyme im mikrobiellen H2-Kreislauf und werden als vielversprechende Katalysatoren in biologisch basierten H2-Technologien angesehen. Ein entscheidender Nachteil vieler Hydrogenasen ist ihre hohe O2-Sensitivität. Die membrangebundene Hydrogenase (MBH) aus Ralstonia eutropha ist eines der wenigen Beispiele für Hydrogenasen, die in Gegenwart von O2 katalytisch aktiv sind. Die molekularen Ursachen dieser O2 Toleranz sind bislang ungeklärt. In bisherigen Studien wurde lediglich das [NiFe]-Zentrum und dessen Umgebung auf Faktoren untersucht, die die O2-Toleranz des Enzyms hervorrufen könnten. In dieser Arbeit wurde daher der Fokus auf die kleine Untereinheit der MBH gelegt, in der sich drei elektronentransferierende Fe-S Cluster befinden. Die ligandierenden Aminosäuren dieser Fe-S Cluster wurden mittels ortsspezifischer Mutagenese verändert und die resultierenden MBH-Varianten physiologisch, biochemisch, spektroskopisch und elektrochemisch charakterisiert. Dabei wurde gezeigt, dass die O2-Toleranz der MBH maßgeblich auf einer Modifikation eines dieser drei Fe-S Cluster beruht. In der direkten Umgebung des zum aktiven Zentrum nächstgelegenen Fe-S Clusters befinden sich sechs statt vier Cysteine, wie in O2 sensitiven [NiFe]-Hydrogenasen. Die beiden zusätzlichen Cysteine um dieses proximale Cluster wurden gegen Glycine ausgetauscht, die an der entsprechenden Position in O2-sensitiven Hydrogenasen zu finden sind. Der Austausch der zusätzlichen Cysteine führte in vivo und in vitro zu einer erhöhten O2 Sensitivität der MBH. In EPR-spektroskopischen Untersuchungen wurde beobachtet, dass diese MBH-Variante veränderte elektronische Eigenschaften aufweist. Statt des für O2-tolerante Hydrogenasen typischen EPR-Spektrums wurde ein Signal detektiert, welches in O2-sensitiven Hydrogenasen zu finden ist. Anhand der Ergebnisse wurde ein Modell erstellt, das erklärt, wie eine modifizierte Fe-S Clusterkette zur O2-Toleranz von Hydrogenasen beiträgt. / Hydrogenases are essential for H2 cycling in microbial metabolism and serve as valuable blueprints for H2-based biotechnological application. Like many metalloproteins, most hydrogenases are extremely oxygen-sensitive and prone to inactivation by even traces of O2. The O2-tolerant membrane-bound [NiFe]-hydrogenase of Ralstonia eutropha is one of the few examples that have established a mechanism enabling H2 uptake in the presence of ambient O2. The molecular mechanisms of this O2 tolerance are not yet unravelled. However, up to date, only the large subunit harbouring the [NiFe] active site has been in the focus of studies on O2 tolerance. In the present study, the role of the small subunit with its electron relay, consisting of three Fe-S clusters, was investigated. Amino acid residues involved in coordination of all three clusters were exchanged, and the resulting MBH variants were investigated with physiological, biochemical, electrochemical and spectroscopic methods. It is shown that the rare feature of O2 tolerance is crucially related to a modification of the electron transfer chain. The Fe-S cluster proximal to the catalytic centre is surrounded by six instead of the four conserved coordinating cysteines. Removal of the two additional cysteines renders the protein O2-sensitive in vivo and in vitro. Electron paramagnetic resonance spectroscopy of this MBH variant revealed a signal resembling the spectrum usually detected in O2-sensitive [NiFe]-hydrogenases. The data imply that the major mechanism of O2 tolerance is based on the reductive removal of oxygenic species guided by the unique architecture of the electron transport chain rather than a restricted access of O2 to the active site.

Nicotinamide cofactors in their reduced and oxidised forms are important redox agents in biology. Of about 3000 dehydrogenases available to date, many require these cofactors for their activity. Dehydrogenases are of interest to chemists as they offer asymmetric catalysis to yield chiral products. The requirement of dehydrogenases for nicotinamide cofactors necessitates research into finding the best way of recycling the oxidised or reduced forms of these cofactors. Electrocatalytic NAD(P)H oxidation and NAD(P)⁺ reduction on standard electrodes is problematic due to unwanted side reactions and high overpotential requirements, but in Nature efficient enzyme catalysts are available to facilitate these reactions. The focus of this Thesis, the Soluble Hydrogenase of R. eutropha (SH) is a multimeric bidirectional hydrogenase that couples H2 oxidation to the reduction of NAD⁺ to NADH. Protein Film Electrochemistry (PFE) has been employed to study NAD⁺-reducing catalytic moieties of the SH for the first time. It is shown that SH subunits on an electrode are able to catalyse NADH oxidation and NAD⁺ reduction efficiently with minimal overpotential, which is significant because in vivo, NAD(H) cycling is coupled to 2H⁺/H₂ cycling and these reactions are closely spaced in potential. Substrate affinities and inhibition constants for the SH, determined using PFE are discussed in the context of the SH function and the related catalytic domains of respiratory Complex I. A range of molecules that are known to inhibit the related Complex I have been investigated for their ability to inhibit the SH moieties: the similarity between inhibition constants is consistent with structural and functional similarity between the SH and Complex I. The ability of the SH moieties to sustain NAD(H) catalysis in the presence of O₂ is also demonstrated and is consistent with the requirement for the SH to function under aerobic conditions and to reactivate the inactivated hydrogenase moiety by supplying low potential electrons from NADH. Engineered variants of the SH, designed to enhance the affinity towards NADP⁺, were investigated for the first time, using PFE. Electrochemical characterisation of the variants is presented and results are discussed alongside findings on the wild type SH. The variants are shown to exhibit NADP⁺ reduction, and to have higher affinity towards NADP⁺ than the wild type SH. The first efficient NADP⁺ reduction and NADPH oxidation is observed for one of the variants on a graphite electrode and the best variant showed a K_M of 1.7 mM for NADP⁺. This Thesis also provides evidence for the ability of moieties of the SH to be used in cofactor regeneration systems. Two novel systems are demonstrated. The first involves H₂ driven NADH recycling based on the NAD⁺-reducing moiety of the SH immobilised on graphite particles together with a hydrogenase or platinum, with electrons from H₂ passed from the hydrogenase through the graphite to the NAD⁺-reducing moiety. The second involves an electrode modified with the NAD⁺-reducing moiety of the SH, and is demonstrated as an electrochemical NADH recycling system coupled with NADH-dependent pyruvate reduction to lactate by lactate dehydrogenase. The ability of variants of the SH to catalyse NADP⁺ reduction suggests that it may also be possible to use these systems for recycling NADPH for catalysis of important biotransformation reactions by NADPH-dependent dehydrogenases.