Yes / Understanding skin metabolism is key to improve in vitro to in vivo extrapolations used to inform risk assessments of topically applied products. However, published literature is scarce and usually covers a limited and non-representative number of donors. We developed a protocol to handle and store ex vivo skin samples post-surgery and prepare skin S9 fractions to measure the metabolic activity of Phase II enzymes. Preincubation of an excess of cofactors at 37 °C for fifteen minutes in the S9 before introduction of the testing probe, greatly increased the stability of the enzymes. Using this standardised assay, the rates of sulphation (SULT) and glucuronidation (UGT) of 7-hydroxycoumarin, methylation (COMT) of dopamine and N-acetylation (NAT) of procainamide were measured in the ng/mg protein/h (converted to ng/cm2/h) range in eighty-seven individuals. Glutathione conjugation (GST) of 1-chloro-2,4-dinitrobenzene was assessed in a smaller pool of fifty donors; the metabolic rate was much faster and measured over six minutes using a different methodology to express rates in μg/mg protein/min (converted to μg/cm2/min). A comprehensive statistical analysis of these results was carried out, separating donors by age, gender and metabolic rate measured.

Le mélanome métastatique est le cancer de la peau le plus agressif. Bien que son taux d’incidence soit inférieur à 1%, plus de 75% des décès associés à un cancer de la peau lui sont attribués. Au cours des dernières années, de nouvelles stratégies thérapeutiques ont permis d’améliorer la survie des patients. Cependant, des mécanismes de résistance à ces traitements se développent dans la majorité des cas, conduisant à une phase de rechute, et une survie à 5 ans inférieure à 20%. Des modèles d’étude expérimentaux sont nécessaires afin de comprendre les mécanismes impliqués dans l’apparition de ces résistances et développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Différents modèles in vitro sont actuellement utilisés pour le développement de drogues anti-tumorales, tels que celui du sphéroïde. Bien qu’il permette de reproduire l’organisation tridimensionnelle d’une tumeur, l’absence de microenvironnement tumoral empêche l’étude des interactions entre les cellules tumorales et celui-ci alors que ces facteurs jouent un rôle primordial dans la croissance tumorale et le développement de métastases. Dans ce contexte, mes travaux ont porté sur le développement et la caractérisation d’un modèle ex vivo de mélanome humain complet permettant l’étude de l’évolution d’une tumeur dans le tissu sain et l’évaluation de composés pharmacologiques. Les travaux réalisés ont tout d’abord conduit au développement d’un modèle de cancer cutané basé sur la combinaison d’un modèle de sphéroïde de lignée cellulaire de mélanome humain et du modèle de peau humaine ex vivo NativeSkin®, développé par la société Genoskin. Une procédure a été développée et validée pour permettre l’implantation reproductible d’un sphéroïde dans le derme des explants de peau. Parallèlement, j’ai développé une approche d’imagerie in situ par microscopie à feuille de lumière après transparisation des modèles. J’ai également développé une stratégie d’analyse d’images permettant la caractérisation quantitative de l'évolution du sphéroïde implanté en 3 dimensions et de suivre la dispersion des cellules du tumorales au sein de l’explant de peau. La caractérisation histologique du modèle implanté a révélé de façon très inattendue une perte progressive de l’intégrité du sphéroïde après implantation, associée à une diminution rapide de la prolifération des cellules le constituant et l’apoptose massive des cellules situées à sa périphérie. Ce phénomène a été observé de façon similaire lors de l’implantation de sphéroïdes produits à partir de différents types cellulaires. Afin de comprendre ces résultats, j’ai étudié l’implication potentielle de différents paramètres dans l’induction de la mortalité cellulaire observée tels que les conditions d’implantation, les facteurs synthétisés par le modèle et la contrainte mécanique exercée par le derme. Les résultats obtenus suggèrent que les facteurs sécrétés par les modèles après implantation du sphéroïde ont un effet antiprolifératif sur les sphéroïdes de mélanome et qu’ils induisent la mortalité des cellules situées à sa périphérie. Par ailleurs, l’application d’une contrainte mécanique extérieure sur les sphéroïdes de mélanome entraîne la perte de la cohésion de leur structure. Enfin, l’implantation de sphéroïdes dans le derme de biopsies de peau préalablement desséchées, induisant une perte de la viabilité cellulaire, a conduit à des résultats opposés à ceux observés avec de la peau normale : la structure des sphéroïdes reste cohésive et la prolifération des cellules est maintenue en périphérie du sphéroïde sans qu’aucune apoptose massive ne soit observée. L'ensemble de ces travaux semble suggérer que la mortalité du sphéroïde pourrait être, en partie, la conséquence d’une contrainte mécanique exercée par la peau sur le sphéroïde et/ou de facteurs produits par la peau durant sa culture. Ces données ouvrent des perspectives intéressantes dans le domaine de l’ingénierie tissulaire pour l’évaluation pharmacologique de composés thérapeutiques. / Malignant melanoma is the most aggressive form of skin cancer. Although it only occurs in less than 1%, it is responsible for more than 75% of skin cancer-related deaths. Furthermore, melanoma incidence has constantly increased during the last decades. New therapies such as targeted therapy and immunotherapy have emerged over the past years, significantly improving the overall survival rates of patients with advanced melanoma stages. However, resistance to those treatments develops in most cases, leading to relapse with a 5-years survival of those patients under 20%. Experimental models are needed in order to better understand the molecular events underlying these resistance mechanisms, and to develop new therapeutic strategies. MultiCellular Tumor spheroid is an increasingly recognized 3D in vitro model for pharmacological evaluation. Although this model accurately reproduces the 3D architecture, cell-cell interaction and cell heterogeneity found in microtumor in vivo, spheroids lack tumor-microenvironment interactions, which play a key role in tumor growth and metastasis development. In this context, the aim of my project was to develop and characterize a fully ex vivo human melanoma model for the study of tumor growth within the skin and the evaluation of antitumor drugs. Our approach relies on the combination of human melanoma cell lines grown in Multicellular Tumor Spheroids and the NativeSkin® model, an ex vivo human skin model produced by the biotechnology company Genoskin. Hence, I developed and validated a method to reproducibly implant one spheroid into the dermal compartment of skin explants cultured ex vivo. In parallel I have developed in situ imaging strategies based on light-sheet microscopy (SPIM, “Selective Plane Illumination Microscopy”) after optical clearing of the implanted skin biopsies. I also developed analytic methods to allow for the quantitative characterization of the spheroids evolution in 3 dimensions as well as tumor cells dispersal within the dermis of skin explants. Histological characterization of the implanted models over time revealed a progressive loss of the spheroids integrity after implantation associated with a rapid decrease in cell proliferation and massive apoptosis of the cells located in the peripheral layers. These results were shared by implanted spheroids made from different cell types. Further experiments were conducted in order to better understand these results and evaluate the impact of different parameters on the implanted microtumors viability such as the implantation procedure conditions, factors synthesized by the model after spheroid implantation and external mechanical stress. Results suggest that factors produced by the implanted models have an antiproliferative effect on melanoma spheroids and induce mortality in the peripheral layers of the spheroids. Moreover, results show that mechanical stress applied on melanoma spheroids induces loss of their cohesion. Finally, implantation of spheroids within the dermis of previously dessicated biopsies for 7 days, causing loss of skin cells viability, led to opposite results than in normal skin: spheroids maintain both a cohesive structure and proliferation in the peripheral cells without any massive apoptosis. Overall, this work led to the validation of a methodology to reproducibly implant spheroids into an ex vivo skin explant and the setup of an optical clearing technique necessary for in situ imaging of the implanted spheroid. Histological characterization unexpectedly revealed spheroids cells death following their implantation. Results suggest that this mortality could be partly related to mechanical stress exerted on the spheroids by the skin and/or by factors produced by the skin during culture. These data open new perspectives in the research field of tissue engineering for antitumoral pharmacology.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2017-01-02T16:51:48Z No. of bitstreams: 2 Tese - Bruno Junior Neves - 2016.pdf: 19331549 bytes, checksum: a7cd8b65a0a68a6cc99718604d4a6aa4 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-01-03T09:47:27Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Bruno Junior Neves - 2016.pdf: 19331549 bytes, checksum: a7cd8b65a0a68a6cc99718604d4a6aa4 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-03T09:47:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Bruno Junior Neves - 2016.pdf: 19331549 bytes, checksum: a7cd8b65a0a68a6cc99718604d4a6aa4 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-11-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Schistosomiasis is a serious endemic disease caused by trematodes of the genus Schistosoma. Currently the control of this disease is based solely on the administration of praziquantel. However, its extensive use has raised concerns about the emergence of resistant worms and the need of discovering new anti-schistosomal drugs. Given the above, the main goal of this study was to design new S. mansoni thioredoxin glutathione reductase (SmTGR) inhibitors showing antischistosomal activity through cheminformatics tools and to repurpose new drugs for schistosomiasis employing bioinformatics tools. At the stage of drug design, binary QSAR models were constructed and validated to predict inhibitory activity of SmTGR, a validated target in schistosomes. From the individual models, consensus and consensus rigor models and were generated (CCRs = 0.87 and 0.91, respectively) and used for the virtual screening of 150,000 compounds. At the end of this process, 29 compounds were prioritized and purchased for biological evaluation. As a result, two new hits representing new molecular scaffolds showed EC 50 ≤ 3.5 µM to schistosomula and ≤ 6.0 µM for adult female worms, low cytotoxicity against WSS-1 mammalian cells (IC50 > 16 µM) and low reactivity with cysteine proteases (IC50 > 100 µM). In the second part of this work, that is drug repositioning, 2,114 proteins of S. mansoni were used in a search for orthologs in therapeutic drug target databases (DrugBank, TTD and STITCH). As a result, 215 drugs were predicted to interact with 49 schistosome proteins, of which 47 had already anti-schistosomal activity reported in the literature. Then, principal component analysis (PCA) and k-means showed that 115 drugs were in the chemical space of known anti-schistosomal agents, increasing the overall confidence of predictions. Among them, paroxetine (PAR), an antidepressant drug predicted to inhibit serotonin transporter proteins of S. mansoni (SmSERTs) presented antischistosomal activity against schistosomula (EC50 = 2.5 µM) and adult worms (EC50 = 5.1 µM and 9.9 µM for males and females respectively) of S. mansoni. Lastly, molecular docking studies with SmSERT-A and its ortholog in humans (hSERT) explored the molecular basis for antischistosomal activity of PAR and provided information for the design of more potent and selective analogs. / A esquistossomose é uma doença endêmica grave causada por trematódeos do gênero Schistosoma. Atualmente o controle desta doença é baseado exclusivamente no uso do fármaco praziquantel. Todavia, seu uso extensivo tem levantado a preocupação quanto ao surgimento de vermes resistentes e a necessidade de descobrir novos fármacos esquistossomicidas. Face ao exposto, o objetivo deste trabalho foi planejar novos inibidores da enzima tiorredoxina glutationa redutase de S. mansoni (SmTGR) com atividade esquistossomicida utilizando ferramentas de quimioinformática e reposicionar novos fármacos para esquistossomose utilizando ferramentas de bioinformática. No estudo de planejamento de fármacos, modelos de QSAR binários foram construídos e validados para predição da atividade inibitória da SmTGR, um alvo validado em esquistossomos. A partir dos modelos individuais, modelos de consenso e consenso rigoroso foram construídos (CCRs = 0,87 e 0,91, respectivamente) e utilizados na triagem virtual de 150 mil compostos. Ao final deste processo, 29 compostos foram priorizados e adquiridos para avaliação biológica. Como resultado, dois novos hits representando novos scaffolds moleculares apresentaram EC50 ≤ 3,5 µM para esquistossômulos e ≤ 6,0 µM para fêmeas de vermes adultos, baixa citotoxicidade em células WSS-1 de mamíferos (IC50 > 16 µM) e baixa reatividade com cisteíno proteases (IC50 > 100 µM). No estudo de reposicionamento de fármacos, 2.114 proteínas de S. mansoni foram utilizadas em uma busca por ortólogos em bases de dados de alvos terapêuticos de fármacos (DrugBank, TTD e STITCH). Como resultado, 215 fármacos foram preditos para interagir com 49 proteínas do esquistossomo, dos quais 47 já tinham atividade esquistossomicida reportada na literatura. Em seguida, a análise de componentes principais (PCA) e k-means demonstrou que 115 fármacos estavam dentro do espaço químico de agentes esquistossomicidas conhecidos, atribuindo maior confiabilidade as predições. Dentre eles, a paroxetina (PAR), um fármaco antidepressivo predito para inibir proteínas transportadoras de serotonina do S. mansoni (SmSERTs), apresentou atividade esquistossomicida em esquistossômulos (EC50 = 2,5 µM) e vermes adultos (EC50 = 5,1 μM e 9,9 μM para machos e fêmeas) de S. mansoni. No final, estudos de docagem molecular com a SmSERT-A e seu ortólogo em humanos (hSERT) exploraram as bases moleculares para a atividade esquistossomicida da PAR e forneceram informações para o planejamento de novos análogos mais potentes e seletivos.

Submitted by Cássia Santos (cassia.bcufg@gmail.com) on 2015-03-27T14:27:58Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Laís Cristina da Silva - 2014.pdf: 4002977 bytes, checksum: c54a0aa96c3be46a95b8df8e9a407c1d (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-03-27T15:49:49Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Laís Cristina da Silva - 2014.pdf: 4002977 bytes, checksum: c54a0aa96c3be46a95b8df8e9a407c1d (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-27T15:49:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Laís Cristina da Silva - 2014.pdf: 4002977 bytes, checksum: c54a0aa96c3be46a95b8df8e9a407c1d (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-09-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The main predictive models of absorption of potential new drugs in preclinical stage are focused on the gastrointestinal mucosa, given the predominance of this pathway in drug administration. Often, the fraction absorbed (Fa) can be predicted in ex vivo models (p.e. Ussing chambers), in vitro (p.e. Caco-2 cells monolayers), intestinal perfusion studies in situ and in vivo absorption. In the present study, from an adaptation of Snapwell ™ inserts, a new ex vivo model to evaluate the permeability of substances passively absorbed is proposed. High permeable drugs (metoprolol, caffeine and theophylline) and low permeable drugs (atenolol, ranitidine and cimetidine) were maintained in an incubator at 37 ° C under constant stirring (60 rpm) and carbogenic atmosphere (5% CO2). The viability of the jejunal membrane (52 Ω.cm2 ± 8.0) was observed remaining above 20 Ω.cm2 for 120 min incubation, under all conditions evaluated, including the addition of co-solvents (1% DMSO and 1% EtOH). Values of apparent permeability coefficients obtained (Papp) were characteristic of ex vivo permeation studies (3.8 to 12.6 x10-6 cm / s). Strong correlation was observed between the data obtained here versus data intestinal perfusion in vivo (r = 0.89), as well as the fraction absorbed in humans (r = 0.85), reported in the literature. Additionally, the model features high sensitivity and accuracy compared to other commonly used models in classification permeability of substances. In line, we can infer that the MTSSNAPWELL model demonstrates, yet, potential application in studies of screening for selection of low molecular weight, such as potential phytochemicals, as well as their synthetic analogues evaluated with low amount of sample (ca 10 mg). / Os principais modelos preditivos da absorção de potenciais novos fármacos na etapa pré-clinica são focados na mucosa gastrointestinal, haja vista a predominância desta via na administração medicamentosa. Frequentemente, a fração absorvida (Fa) pode ser predita em modelos ex vivo em câmaras de Ussing, in vitro em monocamadas de células Caco-2, perfusão intestinal in situ e estudos de absorção in vivo. No presente estudo, a partir de uma adaptação do aparato Snapwell™, um novo modelo ex vivo de avaliação da permeabilidade para substâncias absorvidas por difusão passiva é proposto. Substâncias de alta (metoprolol, cafeína e teofilina) e baixa (atenolol, ranitidina e cimetidina) permeabilidade, foram mantidos em incubadora à 37OC, sob agitação constante (60 rpm) e atmosfera carbogênica (5% CO2). A viabilidade da membrana jejunal (52 ± 8,0 Ω.cm2) foi observada mantendose acima de 20 Ω.cm2 por até 120 min de incubação, sob todas condições avaliadas incluindo a adição de co-solventes (DMSO 1% e EtOH 1%). Os valores de coeficientes de permeabilidade aparente obtidos (Papp) mostraram-se característicos de estudos ex vivo de permeação (3,8 – 12,6 x10-6 cm/s). Forte correlação foi observada entre os dados aqui obtidos versus dados de perfusão intestinal in vivo (r = 0,89), assim como da fração absorvida em humanos (r = 0,85), relatados na literatura. Adicionalmente, o modelo apresenta elevada sensibilidade e precisão frente aos demais modelos comumente utilizados na classificação da permeabilidade de substâncias. Em consonância, pode-se inferir que o modelo MTSSNAPWELL demonstra, até o momento, potencial aplicação em estudos de screening para seleção de moléculas de baixo peso molecular, tais como potenciais fitofármacos, assim como seus análogos sintéticos avaliados com baixa quantidade de amostra (c.a. 10 mg).

Siekiant efektyvaus propolio fenolinių junginių poveikio odoje, svarbu sumodeliuoti veiksmingai šiuos junginius atpalaiduojančias ir tiekiančias į odą puskietes sistemas su propolio produktais. Darbo tikslas – pagrįsti puskiečių formų su propolio produktais modeliavimo principus, optimizuoti eksperimentines puskietes formas ir suformuluoti kokybės modelį, remiantis biofarmaciniais tyrimais. Įvertinta atskirų fenolinių rūgščių (vanilo, kavos, p-kumaro, ferulo rūgšties) ir vanilino skvarba į žmogaus odą ex vivo iš vandeninės propolio ištraukos ir eksperimentinių propolio puskiečių formų: tepalo, vanduo-aliejus tipo kremo, hidrogelio, aliejus-vanduo tipo gelifikuoto kremo. Patvirtintas aktyvus puskietės sistemos vaidmuo, atpalaiduojant ir darant įtaką propolio veikliųjų junginių skvarbai į odą. Įvertintas tirtų fenolinių junginių pasiskirstymas odos sluoksniuose (epidermyje ir dermoje), kuris susietas su skirtingu jų lipofiliškumu. Santykinai lipofiliniai junginiai (ferulo ir p-kumaro rūgštis) kaupėsi epidermyje, o santykinai hidrofiliniai junginiai (vanilo rūgštis ir vanilinas) migravo į dermą. Kavos rūgštis, kurios tirtuose propolio produktuose yra mažesnis kiekis negu kitų fenolinių rūgščių, nustatyta tik epidermyje. Pritaikytas eksperimentų planavimas vaisto formų sudėties optimizavimui. Optimizavimo parametrai leido prognozuoti propolio veikliųjų junginių atpalaidavimą iš tirtų puskiečių sistemų. / In order to achieve a desired effect of propolis phenolic compounds in the skin, it is important to develop semisolid systems with propolis products that would efficiently release and deliver these compounds into the skin. The aim of the study is to justify the modeling principles of semisolid formulations with propolis products, to optimize experimental semisolid formulations, and to formulate a quality model based on biopharmaceutical studies. The penetration of individual phenolic acids (vanillic, caffeic, p-coumaric, and ferulic) and vanillin from aqueous propolis extract and experimental propolis semisolid formulations (ointment, water-in-oil cream, hydrogel, and oil-in-water gelified cream) into the human skin ex vivo have been evaluated. An active role of the semisolid system in releasing and influencing the penetration of propolis active compounds into the skin has been confirmed. The distribution of investigated phenolic compounds in the layers of skin (epidermis and dermis) was evaluated and linked to different lipophilicity. Relatively lipophilic compounds (ferulic and p-coumaric acids) accumulated in the epidermis and relatively hydrophilic compounds (vanillic acid and vanillin) migrated to the dermis. Caffeic acid, which was present in analyzed propolis products at lower quantities as compared with other phenolic acids, was determined only in the epidermis. The design of experiments was applied for the optimization of the composition of dosage forms. Optimization... [to full text]

La richesse de la peau en cellules présentatrices d'antigènes fait de ce tissu un site prometteur pour la vaccination. Des différences dans les réponses humorales et cellulaires induites par voie transcutanée et intradermique, en comparaison des voies conventionnelles, sont observées in vivo chez l'Homme. Ces observations mettent en évidence la mauvaise compréhension des mécanismes immunitaires induits dans la peau. Un modèle ex vivo d'explant de peau humaine nous a permis d'étudier les évènements précoces de l'immunité innée induits suite à l'administration d'un antigène par voie cutanée. Nous avons mis en évidence un nouveau mécanisme induit en réponse à une stimulation par des agonistes de TLRs. Nous montrons que la production de la cytokine IL- 32 par les kératinocytes contribue à l'activation des cellules de Langerhans. Une analyse protéomique des modifications induites dans le micro-environnement cutané, suite à l'administration intradermique d'un vaccin Influenza, nous a permis d'établir une signature de la réponse inflammatoire cutanée. Nous observons l'expression de protéines impliquées dans l'immunité cutanée mais également dans l'adhésion cellulaire, le métabolisme des glucides et des lipides. Enfin, nous avons observé la capacité de la méthode de rupture de la barrière cutanée « Cyanoacrylate Skin Surface Stripping » (CSSS), utilisée par la voie transcutanée, à induire la surexpression de cytokines et chimiokines cruciales pour la mise en place d'une réponse immunitaire cutanée. Ces données sont importantes pour l'amélioration de la compréhension des mécanismes immunitaires induits dans la peau et pour la mise en place de nouvelles stratégies vaccinales. / Skin richness in immune cells in antigen presenting cells make the skin a promising site for vaccination strategies. Differences in humoral and cellular responses induced in vivo were observed in humans, between studies using intradermal and transcutaneous vaccine administration compared to conventional routes. Theses results highlight that immune molecular mechanism induced in the skin remains poorly understood. An ex vivo human skin explant model was used to analyze early immune events induced after cutaneous antigen administration. We have demonstrated, for the first time, the role of IL-32 produced by keratinocytes in Langerhans cell activation, after TLRs agonists skin cells stimulation. A proteomic analysis of modifications induced in skin microenvironment, after intradermal Influenza vaccine administration, showed the detection of new protein biomarkers from cells adhesion signalling and carbohydrates and lipids metabolism associated with known protein biomarkers from cutaneous inflammatory. In addition, we have observed the ability of the Cyanoacrylate Skin Surface Stripping (CSSS) method, a mild skin disruption method, to promote cytokines and chemokines overexpression by epidermal cells, which are crucial in cutaneous immune response establishment. Theses results allow the better comprehension in immune molecular and cellular mechanism induced in the skin and the development of new vaccination strategies.

Dans le but d’améliorer le traitement des éventrations, cette thèse porte sur la biomécanique de la paroi abdominale. Plusieurs aspects de son comportement ont été étudiés: de la paroi globale aux constituants, de la paroi passive ex vivo sous chargement contrôlé à la paroi active in vivo sous chargement physiologique et enfin de la paroi saine des volontaires non-malades à la paroi lésée des patients en pré-opératoire. Un protocole a été développé pour évaluer la contribution des composants de la paroi abdominale humaine ex vivo à sa réponse mécanique globale. Les spécimens sont sollicités par pression après dissection successive des différents composants. L’analyse par stéréo-corrélation des déformations de la surface interne a montré que la gaine des rectus abdominis joue un rôle important dans la réponse de la paroi abdominale antérieure. Les examens in vivo ont permis de considérer la paroi abdominale in situ de 11 volontaires non-malades et pour la première fois de patients souffrant d’éventration (n=4) en pré-opératoire. Géométrie externe et interne, élasticité des muscles et raideurs locales ont été mesurées lors d’activités physiologiques. Les paramètres mécaniques mesurés sur les patients restent soit dans l’étendue de mesure des valeurs des volontaires non malades, soit sont plus faibles. Dans le futur, l’inclusion d’autres patients et des examens post-opératoires seront poursuivis. On disposera alors de données quantitatives de la paroi abdominale couvrant l’état sain, lésé et réparé. Des modèles numériques pourront être développés. Ils permettront d’estimer l’influence de paramètres mécaniques et géométriques sur le comportement de la paroi abdominale / This thesis focuses on the biomechanics of the abdominal wall in order to help improving the treatment of incisional hernias. Several aspects of its response werestudied: from global wall to components, from passive wall ex vivo subjected to controlled loading to active wall in vivo under physiological loading and finally from intact wall of healthy volunteers to incised wall of herniated patients before repair surgery. A protocol was developed to assess the contribution of the components of the human abdominal wall ex vivo to the global mechanical response. The specimens were loaded by air pressure after dissection of different components. The strain analysis of the internal surface by stereo-correlation highlighted the importance of the rectus abdominis sheath in the response of the anterior abdominal wall. The in vivo examinations considered the entire abdominal wall in situ of 11 healthy volunteers and for the first time herniated patients before surgery (n=4). External and internal geometry, muscle elasticity and local stiffness were measured during various physiological activities. Mechanical parameters measured on patients remain either in the range of values obtained with healthy volunteers or lower. In the future, the inclusion of other patients and post-operative examinations will be conducted. This will provide quantitative data for the healthy, incised and repaired abdominal wall and support the development of numerical models to estimate the influence of mechanical and geometrical parameters on the behavior of the abdominal wall

La trisomie 21 est la première cause de retard mental, phénotype majeur de la maladie. Elle est due à la présence d’un chromosome 21 supplémentaire. De nombreux gènes sont présents sur ce chromosome mais quelques-uns ont été proposés comme candidats pour les phénotypes neurocognitifs associés à la maladie, notamment le gène Dyrk1a. Il code pour une sérine-thréonine kinase, DYRK1A, à rôle majeur dans le développement cérébral et l’activité synaptique. Le cortex préfrontal sous-tend un ensemble de fonctions cognitives supérieures dont les fonctions exécutives et est impliqué dans la régulation du comportement émotionnel et de l’humeur, composantes largement affectées dans la trisomie 21. Ce travail de thèse a permis de caractériser des défauts majeurs de la transmission et la plasticité synaptique glutamatergique au sein du cortex préfrontal de deux modèles murins différents de trisomie 21: le modèle mBACtgDyrk1a surexprimant le gène murin Dyrk1a et le modèle Ts65Dn surexprimant 130 gènes de l’analogue murin du chromosome 21 dont Dyrk1a. Un autre versant de l’étude a concerné l’utilisation d’un composé inhibiteur de l’activité DYRK1A ou d’autres cibles cellulaires pour corriger les altérations préfrontales observées, constituant ainsi de nouvelles pistes thérapeutiques pour les phénotypes neurocognitifs associés à la trisomie 21. / Down syndrome is the major cause of mental retardation, the main phenotype of the pathology. It is due to an extra chromosome 21. Many genes have been proposed as candidates for the neurocognitive phenotypes of Down syndrome, notably Dyrk1a. It encodes the serine-threonine kinase DYRK1A which is involved in brain development and synaptic functions. The prefrontal cortex mediates higher cognitive functions, such as executive functions and emotional regulation. This study highlighted major deficits in prefrontal cortex glutamatergic transmission and plasticity of two mouse models for Down syndrome: the overexpressing Dyrk1a mBACtgDyrk1a model and the Ts65Dn model, overexpressing around 130 murine orthologous genes of HSAS21 chromosome. Another aspect of this study was the development of new effective therapeutic strategy for Down syndrome neurocognitive phenotypes based on DYRK1A or other cellular targets activity inhibition.

Les syndromes septiques restent à ce jour un problème majeur de santé publique. Une importante immunodépression est observée lors des syndromes septiques, affectant notamment les lymphocytes T, acteurs majeurs de la réponse immunitaire. En effet, après avoir subi une apoptose massive ils présentent d'importantes altérations fonctionnelles et phénotypiques, associées à un mauvais pronostic. Cependant les mécanismes impliqués dans le développement de ces altérations lymphocytaires induites par le sepsis (ALIS) sont encore mal connus. Le but de ce travail était d'étudier ces mécanismes à travers la mise au point de modèles ex-vivo. Nous avons optimisé un test de mesure de la réponse proliférative des lymphocytes T, utilisable pour le diagnostic des immunodéficiences primaires, comme pour l'étude expérimentale et clinique des ALIS. Nous avons développé un premier modèle ex vivo, reposant sur l'incubation de cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) en présence de LPS, suivie d'une stimulation spécifique des lymphocytes T via leur TCR. Ce modèle récapitule des mécanismes indirects potentiellement impliqués dans l'induction des ALIS, impliquant les monocytes. Puis, nous avons mis au point un modèle qui repose sur l'incubation de PBMC en présence d.IL-10, suivie d'une stimulation des lymphocytes T par des anticorps anti-CD2/CD3/CD28. Ce modèle pourrait reproduire des mécanismes directs et indirects impliqués dans l'induction des ALIS. Nos résultats nous ont permis d'améliorer la compréhension des mécanismes en jeux dans les ALIS et d'en souligner la complexité. Les modèles ex-vivo présentés pourraient permettre d'évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques / Sepsis remains a major public healthcare issue. During sepsis, an important immunodepression develops, affecting particularly the T lymphocytes, major players of the immune response. Following a massive apoptosis, T lymphocytes display important functional and phenotypical alterations, which are associated with higher risk of secondary infections and higher mortality. Mechanisms involved in the induction of such alterations are not fully understood. The aim of this study was to analyze those mechanisms through the development of ex vivo models. We optimized a test to measure T lymphocytes proliferative response, which can be used for the diagnosis of primary immunodeficiencies, as well as to clinically and experimentally study sepsis induced T lymphocytes alterations (SILA). First, we set up a model consisting in an incubation of PBMC (peripheral blood mononuclear cells) with LPS followed by specific T lymphocytes stimulation via its TCR. This model recapitulates indirect mechanisms likely to participate in SILA induction, mediated by monocytes. Then, we set up a model consisting in PBMC incubation with IL-10 followed by T lymphocytes stimulation with anti-CD2/3/28 antibody coated beads. This model may recapitulate direct and indirect mechanisms involved in SILA induction. Our results allowed us to improve the understanding of the mechanisms involved in SILA induction and to highlight its complexity. The ex-vivo models that we developed could be used for the evaluation of new therapeutic strategies

L'émergence des thérapies ciblées dans le traitement des cancers a rendu indispensable la mise au point de marqueurs plus spécifiques et sensibles pour la surveillance des patients. Dès le stade invasif, des cellules tumorales peuvent passer dans le sang où elles constituent les Cellules Tumorales Circulantes (CTC). Les CTC sont accessibles par une simple prise de sang, évitant les biopsies invasives. De plus, elles représentent le seul matériel tumoral résiduel après traitement. C'est la raison pour laquelle les CTC constituent un axe de recherche très actif avec plus de 400 essais cliniques incluant ces cellules comme biomarqueurs. Ces essais apportent des renseignements importants sur le risque de récidive ou de progression métastatique, et ont pour objectif de pouvoir gérer en temps réel la conduite thérapeutique. Cependant, les CTC potentiellement métastatiques ne représentent qu'une fraction très minoritaire de ces cellules circulantes. Les technologies existantes, essentiellement basées sur une simple numération, ne suffisent pas pour guider efficacement la stratégie thérapeutique. Ce projet a évalué un ensemble de critères pouvant être utile pour la prise de décisions thérapeutiques pertinentes, adaptées à chaque patient, et la mesure de l'efficacité des traitements. Ce projet sera centre sur le mélanome. Les stades d'évolution de ce cancer sont bien définis, et dans les stades avances, le risque de développer des métastases est très élevé et la détection précoce de celles-ci est un enjeu important. Par ailleurs, ce cancer bénéficie de rapides progrès thérapeutiques, les CTC constituent donc un outil intéressant pour tester l'efficacité de ces nouveaux traitements. / The emergence of targeted therapies in cancer treatment has made essential the development of more specific and sensitive markers for monitoring patients. At the invasive stage, tumor cells can pass to blood. These cells are called Circulating Tumor Cells (CTC). CTCs are accessible through a simple blood test, avoiding invasive biopsies. Moreover, they represent the only residual tumor after treatment. It is why CTCs are a very active center of research with more than 400 clinical trials involving these cells as biomarkers. These tests provide important information on the risk of recurrence or metastatic progression and aim to manage in real time the therapeutic conduct. But the CTC potentially metastatic represents only a fraction very minority of these circulating cells. Existing technologies, mainly based on simple enumeration, are not enough to effectively guide therapeutic strategy. This project has evaluated a set of criteria to make appropriate therapeutic decisions, adapted to each patient, and able to measure the effectiveness of treatments. This project will focus on melanoma. Evolution stages of this cancer are well defined, and in advanced stages, the risk of developing metastases is very high and the early detection is an important issue. Moreover, CTC could be is an interesting tool to test the effectiveness of these new treatments.