Orientador: Jesus Aparecido Ferro / Coorientador: José Belasque Júnior / Banca: Rui Leite Pereira / Banca: Poliana Fernanda Gachetto / Resumo: A citricultura é uma das principais atividades do agronegócio brasileiro, porém o aumento de doenças na última década tem causado grandes prejuízos a toda a cadeia produtiva. A doença cancro cítrico, causada pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) é um grave problema para o setor, não havendo até o momento método eficaz para o seu controle. Nesse estudo, utilizando RNASeq, foram analisados os perfis transcricionais de dois genótipos hospedeiros contrastantes à doença: laranja doce Pêra-Rio (PR) moderadamente resistente, e Lima Ácida Galego (LG), altamente suscetível, 24, 48 e 72 horas após a infecção com Xac, no intuito de identificar genes das plantas envolvidos na interação patógeno-hospedeiro. Foram encontrados 6.330, 3.478 e 6.795 genes diferencialmente expressos (GDEs) na espécie moderadamente resistente PR, 24, 48 e 72 horas após a inoculação com Xac, respectivamente, quando comparados com seus controles. Na espécie altamente suscetível Limão Galego foram identificados 1.491, 5.621 e 2.145 GDEs após 24, 48 e 72 horas da inoculação com Xac, respectivamente. Através do programa Blast2GO, genes e vias metabólicas de fotossíntese, sinalização celular, síntese hormonais, fatores de transcrição, entre outros, foram encontrados. Esse estudo revelou diferenças associadas à resistência e desenvolvimento a nível molecular em PR e LG em resposta ao cancro cítrico, demonstrando que na espécie moderadamente resistente há uma maior ativação dos mecanismos de defesa. Tais estudos podem ser utilizados para o desenvolvimento de plantas de citros com adequado nível de resistência ao cancro cítrico / Abstract: The citrus agribusiness is very important to the Brazilian economy, but the increase of diseases in the last decade has caused great economic losses to the sector. The citrus canker, caused by the bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), is a serious disease that attacks all citrus species economically important worldwide and there is not an effective method for its control. In this study, RNASeq was used to analyze the transcriptional profiles of two contrasting citrus genotypes regarding citrus canker susceptibility: sweet orange Pêra Rio (PR), moderately resistant, and Mexican lime 'Galego' (ML), highly susceptible. Gene expression were performed in a HiScanSQ System (Illumina) using total RNA isolated from leaves collected 24, 48 and 72 hours after Xac inoculation, with leaves inoculated with water been used as control. It were found 6,330, 3,478 and 6,795 differentially expressed genes (DGEs) in moderately resistant PR specie at 24, 48 and 72 hours after Xac inoculation, respectively, when compared with their controls. In the specie highly susceptible ML, it was identified 1,491, 5,621 and 2,145 DGEs after 24, 48 and 72 hours after Xac inoculation, respectively. Through the program Blast2GO, genes and metabolic pathways related to photosynthesis, cell signaling, hormone synthesis, transcription factors, among others, were found as involved in plant defense. This study revealed differences at the molecular level between PR and ML in response to citrus canker, showing that in the specie moderately resistant there is a greater activation of host defense mechanisms. Such informations can be used for the development of citrus plants with an adequate level of resistance to citrus canker / Mestre

Orientador: Ticiana Sidorenko de Oliveira Capote / Resumo: A engenharia tecidual voltada ao tecido ósseo tem como objetivo proporcionar uma reparação que apresente propriedades físicas e biológicas similares ao osso natural com restabelecimento adequado das suas funções. Neste contexto, materiais aloplásticos baseados em biopolímeros como a fibroína da seda (FS) e celulose bacteriana (CB) têm proporcionado a síntese de excelentes biomateriais para reparação óssea. Esses biopolímeros são biocompatíveis, possuem características mecânicas interessantes, apresentam uma lenta taxa de degradação in vivo, além da capacidade de serem modificados quimicamente. Para conferir a estes biopolímeros uma melhor bioatividade com intuito de potencializar a eficácia local da reparação óssea, o objetivo do presente estudo consistiu em sintetizar uma membrana à base de FS e outra à base de CB, sendo cada uma associada à hidroxiapatita e anticorpo anti-proteína morfogenética óssea (anti-BMP-2). Para tanto, estas membranas foram caracterizadas físico-quimicamente e, para análise do potencial destas membranas na reparação óssea, foram realizados ensaios in vitro para investigação de citotoxicidade, genotoxicidade e mutagenicidade, além de expressão gênica desses materiais. As membranas à base de CB obtiveram resultados da caracterização físico-quimicamente mais satisfatórios em relação à FS e os testes seguintes foram realizados apenas com a membrana de CB. A membrana de CB associada à hidroxiapatita não demonstrou citotoxicidade, genotoxicidade e mutageni... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Tissue engineering related to the bone tissue aims to provide a repair that presents similar physical and biological properties to the natural bone with adequate restoration of its functions. In this context, alloplastic materials based on biopolymers such as silk fibroin (SF) and bacterial cellulose (BC) have provided the synthesis of excellent biomaterials for bone repair. These biopolymers are biocompatible, have interesting mechanical characteristics, have a slow rate of degradation in vivo, and the ability to be chemically modified. In order to give these biopolymers better bioactivity to potentiate the local effectiveness for bone repair, the aim of the present study was to synthesize a SF-based and BC-based membrane, each of them was associated with hydroxyapatite and antibody anti-bone morphogenetic protein (anti-BMP-2). The membranes with immobilized anti-BMP-2 are expected to be effective in capturing endogenous BMP-2, conferring a different therapeutic approach and potential use for bone tissue engineering. For this purpose, these membranes were physico-chemically characterized and, in order to analyze the potential of these membranes in bone repair, in vitro assays were performed to investigate cytotoxicity, genotoxicity, mutagenicity and gene expression of these materials. The BC-based membranes obtained physically-chemically characteristics more satisfactory than the SF, and the next tests were performed only on the BC membrane. The BC membrane associated with h... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Ana Cláudia Pavarina / Abstract: Este estudo avaliou longitudinalmente a expressão de genes de virulência de isolados clínicos de Candida albicans de pacientes com candidose oral tratados com Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana (aPDT) ou Nistatina (NIS). Inicialmente, a especificidade de primers da literatura e novos primers desenhados para os genes de virulência de C. albicans ALS1, CAP1, CAT1, EFG1, HWP1, LIP3, PLB1, SAP1, SAP4, SOD1, SOD5 e ACT1 (gene de controle) foi avaliada através de análises in silico e in vitro. Para a análise in silico, foi realizada uma busca no Pubmed por artigos com sequências de primers que avaliaram a expressão gênica de C. albicans. Em seguida, a homologia dos primers foi analisada (BLAST e ClustalW2) assim como a presença de estruturas secundárias (Mfold). Novos primers foram desenhados (Beacon Designer™) a partir de sequências obtidas do "Candida Genome Database". Os primers foram sintetizados e testados in vitro pela técnica de PCR utilizando um painel de DNA genômico de diferentes espécies de Candida, com seus produtos visualizados em gel de agarose. Reações de qPCR foram realizadas para determinar a concentração ótima e a eficiência dos primers. Para a análise da expressão gênica, os pacientes foram submetidos à aPDT [6 sessões com aplicações do fotossensibilizador Photoditazine™ (200 mg/mL) no palato e na prótese por 20 minutos com posterior aplicação de luz LED (660 nm - 50 J/cm²)] ou submetidos ao tratamento convencional [bochechos de um minuto com 1 mL da solução de ... (Complete abstract click electronic access below) / Resumo: This study evaluated longitudinally the expression of Candida albicans virulence genes on clinical isolates from patients with oral candidiasis treated with Antimicrobial Photodynamic Therapy (aPDT) or Nystatin (NIS). First, specificity of primers from the literature and newly designed primers for C. albicans virulence genes ALS1, CAP1, CAT1, EFG1, HWP1, LIP3, PLB1, SAP1, SAP4, SOD1, SOD5 and ACT1 (control gene) was evaluated through in silico and in vitro analyzes. For in silico analysis, a Pubmed search was performed for studies with primer sequences that evaluated gene expression of C. albicans. Then, the homology of these primers was checked (BLAST and ClustalW2) as well as the presence of secondary structures (Mfold). New primers were designed (Beacon Designer ™) from sequences obtained from the "Candida Genome Database". The primers were synthesized and tested in vitro by PCR using a panel of genomic DNA from different Candida species, with their products visualized on agarose gel. qPCR reactions were performed to determine primers' optimal concentration and efficiency. For gene expression analysis, patients were submitted to aPDT (6 sessions with applications of Photoditazine™ photosensitizer (200 mg/mL) on the palate and dentures for 20 minutes with subsequent application of LED (660 nm - 50 J / cm² )] or conventional treatment [1 minute mouthwash with 1 mL of Nystatin solution (100.000 UI/ mL) four times a day for 15 days]. Microbiological cultures were taken at the ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Orientador: Daisy Maria Fávero Salvadori / Banca: Elza Tieme Sakamoto Hojo / Banca: Raquel Alves dos Santos / Banca: Camila Correa / Banca: Débora Damasceno / Resumo: Nas últimas décadas, a incidência de indivíduos com sobrepeso ou obesos vem aumentando exponencialmente. Hoje, a obesidade é considerada pela Organização Mundial da Saúde como uma epidemia mundial, com graves consequências que podem levar à morte. A obesidade é uma desordem multifatorial que envolve fatores hereditários, ambiente e estilo de vida, e suas consequências não são apenas sociais ou psicológicas, mas estão principalmente relacionadas à presença de co-morbidades como a hipertensão arterial, diabetes tipo II, doenças cardiovasculares e vários tipos de câncer. Portanto, o controle da obesidade é um desafio para a manutenção da saúde humana, atraindo o interesse de inúmeros pesquisadores que buscam o entendimento dos mecanismos associados ao seu desenvolvimento, bem como novos métodos terapêuticos e de prevenção. Com base nessas premissas, o presente estudo objetivou avaliar a associação entre alterações genéticas e a obesidade, com especial foco para a presença de danos no DNA e para o perfil de expressão e polimorfismos gênicos. A casuística do estudo incluiu 300 mulheres cadastradas na lista de espera para a realização de cirurgia bariátrica e 300 mulheres saudáveis, eutróficas, pareadas por idade. O teste do cometa foi utilizado para avaliação de danos primários no DNA de células sanguíneas; os polimorfismos dos genes da grelina (GHRL)e leptina (LEP)e dos seus receptores (GHSR e LEPR), da interleucina 6(IL-6) e da serotonina (5-HT2C) foram analisados pela técnica de RT-PCR; o perfil de expressão gênica em linfócitos foi avaliado pela metodologia do DNA microarray e a expressão dos genes adiponectina (ADIPOQ) e leptina (LEP) em adipócitos foi avaliada pela técnica de qRT-PCR. Os resultados mostraram que a frequência dos polimorfismos dos genes GHRL(rs26802), GHRS(rs572169), LEP(rs7799039), LEPR(rs 1137101), IL-6 (rs1800796) e 5-HT2C ... / Abstract: In the last decades, the incidence of overweight and obesity has increased worldwide. Nowadays, obesity is considered by the World Health Organization as a global epidemic with severe consequences that can lead to death. Obesity is a multifactorial disorder which involves different factors such as genetic, environment and life style, and its consequences are not only social or psychological, but are also related to the presence of comorbidities such as hyperthension, type 2 diabetes, heart diseases and many types of cancer. Therefore, obesity control has become a challenge for the human health maintenance, catching the attention of researchers that are trying to understand the mechanisms associated to its development, as well as therapeutical and preventive methods. Based on the information above, the present study aimed to evaluate the association between genetic alterations and obesity, with special focus on the presence of DNA damage, gene expression profiling and genetic polymorphisms. Our study included 300 morbid obese women registered for the bariatric surgery and 300 healthy eutrophic women, matched by age. The comet assay was used to assess primary DNA damage in blood cells; the genetic polymorphisms of ghrelin (GHRL), leptin (LEP) and their receptors (GHSR and LEPR), interleukin-6 (IL-6) and serotonin receptor (5-HT2C) were evaluated by the RT-PCR; gene expression profiling in lymphocytes was assessed by DNA microarrays; and adiponectin (ADIPOQ) and leptin (LEP) gene expression in adipocytes were evaluated by qRT-PCR. Our results showed that the frequencies of GHRL (rs26802), GHRS (rs572169), LEP (rs7799039), LEPR (rs 1137101), IL-6 (rs1800796) and 5-HT2C (rs 3813929) polymorphisms were not different between obese and control groups. However, obese presented higher levels of primary DNA damage (single and double strand breaks, alkali-labile sites and oxidative damage) than eutrophic women, indepedent on ... / Doutor

Esquistossomose é uma doença crônica e debilitante. Schistosoma representa a única classe de trematódeos com vida dióica. Um contínuo pareamento com o macho é essencial para a maturação sexual do sexo feminino. Fêmeas adultas provenientes de infecções uni-sexuadas são subdesenvolvidas, apresentam atrofia do tamanho e um sistema reprodutivo imaturo. Para estudar os mecanismos envolvidos no pareamento de vermes adultos foram utilizadas duas plataformas de microarranjos distintas: uma composta por 4 mil sondas de cDNA dupla fita produzida pelo nosso grupo de pesquisas e outra composta por 44 mil sondas de oligonucleotideos desenhadas pelo nosso grupo e produzida pela empresa Agilent Technologies. Com a plataforma de 4 mil sondas detectamos 113 transcritos diferencialmente expressos em fêmeas adultas mantidas separadas de seus respectivos pares durante 24 horas de cultivo in vitro quando comparadas com fêmeas adultas pareadas; para 10 destes genes obtivemos uma confirmação adicional da expressão diferencial por transcrição reversa fita específica seguida de PCR em Tempo Real. Observamos também os efeitos do pareamento no perfil de expressão gênica de machos adultos mantidos separados de seus respectivos pares durante 24 horas de cultivo in vitro; foram encontrados 152 transcritos diferencialmente expressos. Com a plataforma de 44 mil sondas foi detectada a expressão de 5.798 genes transcricionalmente ativos em verme adulto, em um conjunto de 19.907 genes únicos representados nesta plataforma. A análise do conjunto de genes \"no match\" mostrou que em 156 genes ocorria expressão senso e anti-senso; para 6 destes transcritos obtivemos uma confirmação adicional da expressão nas duas fitas por transcrição reversa fita específica seguida de PCR em Tempo Real. Adicionalmente foram identificados 2717 transcritos diferencialmente expressos em fêmeas separadas de seus respectivos pares durante 13 dias de cultivo in vitro, quando comparadas com fêmeas mantidas pareadas. Para as análises com machos separados durante 13 dias foram encontrados 243 transcritos diferencialmente expressos. Por fim, realizamos estudos com o objetivo de observar os genes que podem estar correlacionados com o contato físico do pareamento (macho e fêmea) e genes que podem ser regulados pela possível difusão de proteínas e hormônios secretados no meio, para os quais a mudança do nível de expressão não dependa da necessidade de contato entre o macho e a fêmea. Sabe-se que o contato direto da fêmea com o macho é necessário para manter a atividade reprodutiva feminina e observamos que o re-pareamento pode restabelecer o perfil de expressão gênica de fêmeas ou machos separados. Além disso, observamos que fêmeas separadas e depois mantidas na presença do macho, porém sem re-pareamento, apresentam uma expressão gênica diferente das fêmeas separadas e depois mantidas na ausência de machos, sugerindo que algum fator secretado pelo macho no meio regula a expressão. Este trabalho representa uma importante contribuição no entendimento da relação macho-fêmea em nível molecular. / Schistosomiasis is a chronic and debilitating disease. Schistosoma represents the only class of trematodes with a dioecious life. A continuous pairing with the male is essential for female sexual maturation. Adult females from uni-sexual infections are underdeveloped, have body atrophy and an immature reproductive system. To study the mechanisms involved in pairing of adult worms two microarray platforms were used: one comprised by 4000 cDNA probes and printed by our research group and another comprised by 44 000 oligonucleotide probes designed by our group and printed by Agilent Technologies Company. With the 4000-probes platform we detected 113 transcripts differentially expressed in adult females kept separated from their mates during 24 hours in vitro when compared with paired adult females; for 10 of these genes we obtained additional confirmation of differential expression by Real Time RT-PCR. We also observed the effects of pairing on the gene expression profile of adult males kept separate from their mates during 24 hours in vitro, where we found 152 differentially expressed transcripts. With the 44 000-probes platform we detected the expression of 5798 genes in adult worms, out of a set of 19 907 unique genes represented on this platform. Analysis of the \"no match\" genes showed that 156 have transcription from the sense and anti-sense strands; for 6 of them we obtained additional confirmation of expression by strand specific Real Time RT-PCR. Additionally, we identified 2717 differentially expressed transcripts in females separated from their mates during 13 days in vitro when compared to females that remained paired. In the analysis of males separated for 13 days we found 243 differentially expressed transcripts. Finally, we performed a study aimed at observing genes which might be correlated to physical contact pairing (male and female) and compared to genes that might be regulated by the possible diffusion of secreted proteins and hormones in the medium, for which the change of expression level does not depend on physical contact between male and female. It is known that direct female-male contact is needed to keep the female reproductively activity and we observed that repairing can restore the gene expression profile of females or males that were kept separated. Furthermore, we observed that females separated and then maintained in the presence of male, but without re-pairing, have a different gene expression from the separated females kept without males, suggesting that some male secreted factors might be involved in gene regulation. This work represents an important contribution to the understanding of male-female relation at the molecular level

O agonista beta-adrenérgico ractopamina (RAC) modifica a composição da carcaça suína por aumentar a massa muscular e reduzir a deposição de gordura. O objetivo neste estudo foi avaliar os efeitos do tempo de fornecimento de RAC sobre o desempenho, concentração de ureia plasmática (CUP), características de carcaça e expressão gênica dos receptores beta- adrenérgicos (beta-AR) e das isoformas da cadeia pesada de miosina (MyHC) em suínos em terminação. Oitenta suínos, machos castrados (PV inicial = 69,42 ± 1,24 kg), foram utilizados em um experimento em blocos completos casualizados com cinco tratamentos, oito repetições por tratamento e dois animais por unidade experimental (baia). Os tratamentos consistiram de rações sem RAC (controle) ou com 10 ppm de RAC fornecidas por 7, 14, 21 ou 28 dias préabate. O PV individual e o consumo de ração por baia foram obtidos para determinar o ganho diário de peso (GDP), o consumo diário de ração (CDR) e a conversão alimentar (CA). Amostras de sangue foram coletadas para determinação da CUP. No final do experimento, os animais (PV final = 102,46 ± 1,44 kg) foram abatidos e amostras de pelos e do músculo Longissimus dorsi coletadas. As carcaças foram avaliadas 24 horas post-mortem. As amostras de pelos foram utilizadas para detecção da mutação no gene do receptor de rianodina do tipo 1 (RYR1). A expressão gênica dos beta-AR (subtipos beta1 e beta2) e das isoformas MyHC (I, IIa, IIx/d e IIb) foi quantificada nas amostras de músculo. As análises estatísticas foram realizadas apenas com os animais homozigotos dominantes para a mutação no gene do RYR1. O aumento no período de fornecimento de RAC não afetou (P > 0,05) o PV final, o GDP e o CDR, porém resultou em melhora linear (P < 0,01) na CA. Melhoras (P < 0,05) nas médias semanais de GDP e CA foram observadas durante os primeiros 21 dias de fornecimento de RAC, no entanto, o crescimento animal declinou (P < 0,05) na 4ª semana de tratamento. A CUP apresentou efeito quadrático (P < 0,01) com o aumento na duração do fornecimento de RAC. Houve aumento linear (P <= 0,01) no peso da carcaça quente, na profundidade do músculo Longissimus dorsi, na área de olho de lombo e na relação carne:gordura com o aumento na duração do tratamento com RAC. Não foram detectados efeitos da RAC (P > 0,05) sobre a expressão gênica dos beta1-AR e das isoformas MyHC IIa e MyHC IIx/d, porém o aumento no período de fornecimento de RAC tendeu a reduzir linearmente (P = 0,08) a expressão gênica dos beta2-AR. Embora os níveis de RNAm da isoforma MyHC I tenham sido reduzidos linearmente (P < 0,01), a expressão gênica da isoforma MyHC IIb aumentou linearmente (P < 0,01) com o aumento na duração do tratamento com RAC. Portanto, as melhores respostas de desempenho e carcaça ocorreram quando a RAC foi fornecida por 21 e 28 dias, respectivamente. Além disso, o agonista alterou a expressão gênica das isoformas MyHC, e é possível que a ação da RAC esteja relacionada com a população de beta2-AR. / The beta-adrenergic agonist ractopamine (RAC) modifies the swine carcass composition by increasing muscle mass and decreasing fat deposition. The objective in this study was to evaluate the effects of RAC feeding duration on performance, plasma urea nitrogen (PUN) concentration, carcass traits, and gene expression of beta-adrenergic receptors (beta-AR) and myosin heavy chain (MyHC) isoforms in finishing pigs. Eighty barrows (initial BW = 69.42 ± 1.24 kg) were used in a randomized complete block design experiment with five treatments, eight replicates per treatment, and two animals per experimental unit (pen). The dietary treatments consisted of diets containing no RAC (control) or 10 ppm RAC fed for 7, 14, 21, or 28 days before slaughter. Individual pig BW and pen feed disappearance were obtained to determine average daily gain (ADG), average daily feed intake (ADFI), and feed to gain ratio (F:G). Blood samples were collected for determination of PUN concentrations. At the end of the experiment, pigs (final BW = 102.46 ± 1.44 kg) were slaughtered and hair and Longissimus dorsi muscle samples collected. The carcasses were evaluated 24 hours postmortem. Hair samples were used to detect the mutation of the ryanodine receptor type 1 (RYR1) gene. Gene expression of beta-AR (beta1- and beta2-subtypes) and MyHC isoforms (I, IIa, IIx/d, and IIb) was quantified in the muscle samples. Statistical analyses were performed using only the homozygous dominant pigs for the RYR1 gene mutation. Increasing RAC feeding period did not affect (P > 0.05) final BW, ADG, and ADFI, but resulted in a linear improvement (P < 0.01) in F:G. Average weekly improvements (P < 0.05) in ADG and F:G were observed during the first 21 days of RAC feeding, however, animal growth declined (P < 0.05) in the 4th week of treatment. The PUN concentrations showed a quadratic effect (P < 0.01) as RAC feeding duration increased. There were linear increases (P <= 0.01) in hot carcass weight, Longissimus dorsi muscle depth, loin eye area, and muscle to fat ratio as RAC treatment duration increased. No effects of RAC feeding (P > 0.05) were detected for beta1-AR and for isoforms of MyHC IIa and MyHC IIx/d gene expression, but increasing RAC feeding period tended to linearly decrease (P = 0.08) beta2-AR gene expression. Even though mRNA levels of MyHC I isoform decreased linearly (P < 0.01), gene expression of MyHC IIb isoform increased linearly (P < 0.01) as RAC treatment duration increased. Therefore, greater growth and carcass responses occurred when RAC was fed for 21 and 28 days, respectively. Furthermore, the agonist altered the MyHC gene expression and the RAC action may be related to the beta2-AR population.

O objetivo do presente estudo foi testar a hipótese de que polimorfismo na região que codifica o sistema de dois componentes FimSR e seus níveis de transcrição influenciaria expressão de fímbrias e a capacidade de adesão de Porphyromonas gingivalis. Foram avaliadas 21 cepas clínicas e as cepas de referência 33277 (fimbriada) e W83 (não fimbriada). A presença de cápsula foi determinada em 13/21 cepas e de fímbrias em 15/21. Todas as cepas foram capazes de aderir às células (eficiência de 1,2 a 6,1%). Não houve correlação entre os genótipos fimA, presença de fímbrias / cápsula e perfis de macrorestrição por PFGE. Diferenças na transcrição de fimA não podem ser atribuídas a diferenças na região promotora de fimSR. fimA foi regulado positivamente após interação com células epiteliais na maioria das cepas. Os dados indicam que a regulação de fimA é cepa específica. Cepas não-fimbriadas podem apresentar outras estratégias para aderir às células, sugerindo que, além das fímbrias, outras estruturas poderiam desempenhar um papel na interação dessa espécie com as células. / The aim of this study was to test the hypothesis that polymorphism in genes encoding the two-component system FimSR and their transcription levels would influence the expression of fimbriae and adhesion of Porphyromonas gingivalis. We evaluated 21 clinical strains and reference strains 33277 (fimbriate) and W83 (non fimbriated). The presence of a capsule was determined in 13/21 strains and the presence of fimbriae in 15/21. All strains were able to adhere to the cells (efficiency from 1.2 to 6.1%). There was no correlation between genotypes fimA, presence of fimbriae / capsule and macrorestriction profiles by PFGE. Differences in transcription of fimA could not be attributed to differences in the promoter region of fimS. fimA was upregulated after interaction with epithelial cells in most strains. The data indicate that regulation of fimA is strain specific. Non-fimbriated strains may have other strategies to adhere to epithelial cells, suggesting that in addition to fimbriae, other structures could play a role in the interaction of that specie with cells.

Para a transformação tradicional da levedura Saccharomyces cerevisiae são empregadas cepas hospedeiras que devem necessariamente conter um marcador de auxotrofia, de forma que as células transformadas possam ser selecionadas posteriormente por complementação gênica. Em nosso trabalho construímos um vetor, que dispensa a necessidade destas marcas de auxotrofia, permitindo transformar cepas de leveduras selvagens e, portanto, até mesmo algumas cepas de interesse industrial. Este vetor é composto por um cassete de expressão de interesse (promotor, gene estrutural e terminador) ladeado por dois fragmentos do gene CAN1 de S. cerevisiae. Uma vez que as extremidades deste fragmento, são homólogas às sequências do gene CAN1 da levedura a ser transformada, este irá causar a disrupção genética na região homóloga. Por sua vez, o gene CAN1, quando funcional, é responsável pela permease do aminoácido arginina. Este aminoácido é análogo à canavanina, que entra na célula pelo mesmo mecanismo da arginina, e é uma droga com efeito letal à S. cerevisiae. Após a introdução deste novo vetor, a célula torna-se resistente à canavanina, por impedir a entrada de arginina e, consequentemente de canavanina na célula, permitindo a seleção dos transformantes e mantendo a informação genética adicional clonada 100% estável. Em nosso trabalho, para analisar esta proposta, empregamos o cassete de expressão em que a sequência sinal e estrutural da glicoamilase encontram-se clonadas sob a regulação das sequências promotoras e terminadoras da PGK de S. cerevisiae. Obtivemos sucesso na transformação, tanto de uma cepa de laboratório com marcas auxotróficas, como de células de cepas selvagens, sem nenhuma marca de auxotrofia , utilizadas em processos industriais, FTPT e HTYM-81 que originalmente são sensíveis à canavanina. / Traditionally auxotrophic mutants of Saccharomyces cerevisiae are used as host cells for transformation since the selection of transformants is based on genetic complementation by a marker gene carried on the vector. In this work a vector was constructed which overcomes the need for auxotrophic mutants allowing selection of transformed wild-type strains, including some strains of industrial interest. The vector contains an expression cassette (promoter, structural gene and terminator) which is flanked by two fragments of the CAN 1 gene of S. cerevisiae. Since the ends of this fragment are homologous to the host <i.CAN 1 gene, it disrupts that gene upon transformation. The CAN 1 gene codes for the permease of the amino acid arginine which is analogous to canavanine and enters the cell by the same mechanism. Canavanine, however, is a lethal drug for S. cerevisiae. Since tranformants become resistant to canavanine, because no permease is synthesized, and thus canavanine cannot enter the cell, transformants are easily selected and the additional cloned genetic information is 100% stable. In this work, we employed the expression cassette containing the signal and the coding sequences of glucoamylase of Aspergillus awamori under the control of the promoter and the terminator of phophoglycerate kinase (PGK) of S. cerevisiae. We successfully transformed a laboratory yeast strain carrying auxotrophic markers, as well as two wild-type strains, employed in industrial processes, which originally were sensitive to cananvanine.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-27Bitstream added on 2014-06-13T18:31:20Z : No. of bitstreams: 1 lopes_em_me_jabo.pdf: 835472 bytes, checksum: 48c547e9e24f7be820745ae3b251a2e3 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O Brasil é considerado mundialmente o segundo maior produtor de soja, com perspectiva para a safra de 2011 /2012 entre 72,18 e 73,29 milhões de hectares. Bactérias do tipo B.elkanii, fixadoras de nitrogênio, estabelecem uma relação simbiótica com a soja convertendo o nitrogênio atmosférico em amônia, que é o composto assimilável pela planta. Essas bactérias diazotróficas, do tipo Bradyrrizobium elkanii, têm a capacidade de sintetizar e acumular polihidroxibutirato (PHB), homopolímero de origem afilática com propriedades semelhantes aos dos polipropilenos utilizado para a produção de plástico biodegradável. Linhagens mutantes para o aumento na síntese e acúmulo de polímero foram desenvolvidas e testadas visando interesse biotecnológico da aplicação comercial das mesmas. O objetivo foi analisar a fixação biológica do nitrogênio (nifH e fixN ), conversão de amônia em aminoácidos (glnA e glnB) e acúmulo de polímero ( phbA, phbB e phbC) através da analise por PCR em tempo real. .As linhagens mutantes apresentaram expressão positiva e significativa para os genes de acúmulo e síntese de PHB in vitro; já em simbiose, apresentaram expressão negativa para os mesmos considerando a competição das vias de acúmulo de polímero e fixação biológica do nitrogênio. Frente ao potencial biotecnológico da aplicação industrial de polímeros de origem bacteriana, a análise por meio desta abordagem foi de fundamental importância para utilização futura e aprimoramento das linhagens mutantes de B. elkanii, bem como a análise expressão permitiu o conhecimento de interações metabólicas no processo de simbiose / Brazil is considered the world's second largest soybean producer, with prospects for the harvest of 2011/2012 between 72.18 and 73.29 million hectares. B.elkanii type bacteria, nitrogen fixing, establishing a symbiotic relationship with soybean converting atmospheric nitrogen into ammonia, which is the compound assimilated by the plant. These diazotroph, Bradyrrizobium elkanii type, have the ability to synthesize and accumulate polyhydroxybutyrate (PHB), homopolymer afilática source with similar properties to the polypropylenes used for the production of biodegradable plastics. Mutant strains for the increase in polymer synthesis and accumulation have been developed and tested in order biotechnological interest of commercial application of the same. The aim was to analyze the biological nitrogen fixation (nifH and fixN), conversion of ammonia into amino acids (glnA and glnB) and accumulation of polymer (phbA, phbB and phbC) by PCR analysis in real time. . The mutant strains exhibited significant and positive expression of genes for the synthesis of PHB accumulation and in vitro, whereas in symbiosis showed negative expression for them considering the competition of the process of accumulation of polymer and biological nitrogen fixation. Front of the biotechnological potential of the industrial application of polymers of bacterial origin, the analysis by this approach was crucial for future use and improvement of mutant strains of B. elkanii and expression analysis allowed the understanding of metabolic interactions in the process of symbiosis

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-26Bitstream added on 2014-06-13T20:16:38Z : No. of bitstreams: 1 goncalves_mcm_me_jabo.pdf: 755871 bytes, checksum: 00a7ca290b99eaeb7742fdd22cdc3c6c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A glicoproteína S1 do vírus da broquite infecciosa (VBI) além de ser altamente variável é responsável pela adsorção com os receptores das células hospedeiras e pela indução de anticorpos vírus-neutralizantes e inibidores da hemaglutinação em galinhas. A disponibilidade desse tipo de proteína pode contribuir com o imunodiagnóstico e com a imunoprofilaxia da bronquite infecciosa aviária. O presente estudo foi conduzido com a finalidade de fazer a clonagem e a expressão do gene da glicoproteína S1 derivada da estirpe M41 do VBI no sistema constituído pelo vetor pFLDa – Picchia pastoris. O cDNA completo do gene S1 foi preparado a partir do RNA extraído do líquido alantóide infectado com a estirpe M41 do VBI e o amplicon obtido pela PCR foi clonado no vetor de expressão pFLDa. O plasmídeo foi linearizado e usado na transformação da linhagem GS115 de Picchia pastoris por eletroporação. Foi avaliada a influência da composição do meio de cultura sobre a produção de biomassa e a expressão da proteína recombinante S1 durante a fase de indução. A produção da proteína S1 recombinante foi detectada somente no compartimento intracelular, embora o vetor pFLDa seja capaz de direcionar a síntese de uma proteína heteróloga para a via secretora. A proteína recombinante foi caracterizada imunoquimicamente como uma banda de aproximadamente 90 kDa e com reatividade específica para os anticorpos monoclonais anti-polihistidina. Concluindo, o sistema hospedeiro de células da levedura P. pastoris com o vetor pFLDa usado nesse estudo comprovou ser um método eficaz para a produção no compartimento intracelular da proteína recombinante S1 da estirpe M41 do VBI, com potencial para futura utilização em técnicas de imuno-diagnóstico da bronquite infecciosa aviária. / The glycoprotein (S1) of infectious bronchitis virus (IBV) has been shown to be highly variable and responsible for attachment to the receptor in host cellular membrane, induction of neutralizing and haemagglutination-inhibiting antibodies in chickens. Thus, the availability of such protein can contribute to the immuno-diagnosis and immunoprofilaxis of avian infectious bronchitis. The present study was carried out aiming to clone and to express the gene of S1 glycoprotein from M41 strain fo IBV in the system constituted by pFLDa vector – Picchia pastoris. Full length cDNA of IBV S1 glycoprotein was prepared from RNA extracted from infected allantoic fluid and the amplicon generated by PCR was cloned into yeast expression vector pFLDa to construct the plasmid of pFLDa - S1 - IBV. This plasmid was linearized and then transformed in Picchia pastoris GS115 by electroporation. The recombinant yeast clones were cultivated and selected. The influence of media composition on biomass and in the production of recombinant S1 during induction phase was studied. The production of recombinant S1 protein was detected only in the intra-cellular compartment, though the pFLDa vector would direct the synthesis for the secretor pathway. The recombinant protein was characterized by SDS-PAGE and Western-Blotting as a band of a molecular weight of approximately 90 kDa with specific reactivity against anti-Histidina monoclonal antibodies. The use of complex media promotes an increase in biomass, but no soluble S1 recombinant protein was produced. Concluding, the yeast system composed by pFLDa - P. pastoris was efficient to express intra-cellularly the recombinant S1 protein of M41 strain of IBV which has a potential to be used in the immuno-diagnosis of avian infectious bronchitis.