Made available in DSpace on 2015-05-14T16:53:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-13Bitstream added on 2015-05-14T16:59:00Z : No. of bitstreams: 1 000829164.pdf: 1229097 bytes, checksum: c02b3e98095839e2ebc9ba29eeeeba97 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O silenciamento por RNA é um mecanismo conservado de resposta a moléculas de RNA dupla fita (dsRNA) presente em todos eucariontes, que desempenha papéis fundamentais na regulação da expressão gênica, na resistência a vírus e no controle da transposição de elementos móveis. Sabe-se que proteínas de diferentes origens, viral ou endógena, são capazes de suprimir o silenciamento por RNA, mas o mecanismo de ação da maioria delas não é totalmente compreendido. Um desses supostos supressores endógenos é uma proteína do tipo calmodulina denominada rgs-CaM (regulator of gene silencing CaM) que foi identificada em plantas de tabaco. Calmodulinas são proteínas que desempenham papéis importantes na sinalização mediada por cálcio em células eucarióticas e regulam a atividade de inúmeras proteínas com diversas funções celulares. Recentemente, porém, foi demonstrado que a rgs-CaM está envolvida na resposta de contra-defesa da planta aos supressores virais. Deste modo, os dados disponíveis na literatura sobre a função da rgs-CaM permanecem contraditórios. Pensando nisso, o presente trabalho teve como objetivo caracterizar funcionalmente a proteína rgs-CaM de tabaco. Para tal, diferentes abordagens foram utilizadas: estudo de interação com a proteína viral HC-Pro, localização subcelular desta interação, identificação de proteínas endógenas que interagem com a rgs-CaM, e análise funcional de plantas de tabaco transgênicas com superexpressão ou silenciadas para o gene que codifica a rgs-CaM. Análises estruturais da rgs-CaM expressa em Escherichia coli e analises in silico revelam uma proteína rica em hélices alfa, dotada de dois domínios globulares ligados por uma longa hélice α, e apresentando apenas 3 sítios de ligação para o íon cálcio. A presença desse íon ocasiona mudança na estrutura secundária da proteína. Deste modo, o fluxo e a ligação de Ca2+ pela rgs-CaM parece ser um ponto chave ... / RNA silencing is a conserved mechanism activated by double-stranded RNA molecules (dsRNA) that is present in eukaryotes. It plays basic roles in the regulation of gene expression and in host resistance to viruses and transposons. It is known that proteins of different origins, viral or endogenous, are able to suppress RNA silencing, but the mechanism of action of most of them are not fully understood. One of these endogenous suppressor is a protein called rgs-CaM (regulator of gene silencing CaM), which is a calmodulin-like protein (CaM) identified in tobacco plants. Calmodulins are proteins that play important roles in calcium signaling in eukaryotic cells and able to regulate the activity of numerous proteins with diverse cellular functions. Recently, however, rgs-CaM was shown to be a protein involved in the plant response to counterattack viral suppressors. Thus the data available in the literature about rgs-CaM function still contradictory. Taking these into consideration, the objective of this work was to functionally characterize the tobacco rgs-CaM. For such, different approaches were used: study of its interaction with the viral HC-Pro protein, the subcellular localization of this interaction, identification of endogenous proteins that interact with rgs-CaM and functional analysis of transgenic tobacco plants overexpressing or silenced for rgs-CaM. Structural analysis of the rgs-CaM expressed in Escherichia and in silico analysis revealed a protein rich in alpha helix, possessing two globular domains connected by a long alpha helix, and three binding sites for calcium. The presence of calcium led to a change in rgs-CaM secondary structure, suggesting that the flux and binding of Ca2+ by rgs-CaM may be a key point for its funtion during virus-plant interaction. The results of in vivo interaction employing BiFC showed no interaction between rgs-CaM and HC-Pro in the tested conditions, suggesting a possible ...

Made available in DSpace on 2015-05-14T16:53:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-26Bitstream added on 2015-05-14T16:58:58Z : No. of bitstreams: 1 000822105.pdf: 1203927 bytes, checksum: 777ff3545f9d68b597faed4db3fe6c67 (MD5) / A exposição das plantas a diferentes estresses bióticos e abióticos interferem com os padrões de expressão de diversos genes. Estudos sobre a expressão diferencial de genes em plantas de tomate infectadas com Pepper yellow mosaic virus (PepYMV gênero Potyvirus) revelaram a repressão de um gene que codifica um receptor do tipo LRR-RLK (leucine-rich repeat receptor-like kinase). Este mesmo receptor, porém, não figura no rol de receptores induzidos pela infecção do tomateiro por um Tospovirus, sugerindo um comportamento diferencial deste gene frente à infecção por outras espécies virais. Os LRR-RLKs constituem um grupo diverso de proteínas ancoradas na membrana plasmática que permitem à célula reconhecer e responder ao ambiente extracelular, sendo um componente da via de transdução de sinal. Este estudo teve como objetivos caracterizar molecular e funcionalmente o gene que codifica um LRR-RLK (recentemente denominado SOBIR1) em plantas de tomate (Solanun lycopersicum) infectadas pelos vírus PepYMV e Tomato chlorotic spot virus (TCSV), gênero Tospovirus, com o intuito de desvendar uma possível participação desse receptor no desencadeamento da resposta de defesa durante a infecção por essas duas espécies virais. A caracterização molecular do gene SlSOBIR1 foi obtida através da análise do perfil de expressão do receptor frente às infecções pelos vírus PepYMV e TCSV e em resposta ao estresse mecânico por meio da técnica de PCR em tempo real. Em paralelo, os níveis de expressão de SlSOBIR1 em diferentes órgãos/ tecidos da planta, bem como a localização subcelular de seu produto foi investigada e uma árvore filogenética foi construída. Nos estudos funcionais foi verificado o efeito da superexpressão do gene SlSOBIR1 em plantas de tabaco infectadas com cada uma das espécies virais. Além disso, investigou-se a expressão de genes de defesa previamente selecionados e espécies reativas de ... / The exposure of plants to various biotic and abiotic stresses interferes with the expression patterns of different host genes. Studies on differential gene expression in tomato plants infected with Pepper yellow mosaic virus (PepYMV) revealed the repression of a gene encoding a leucine-rich repeat receptor-like kinase (LRR-RLK). However, this receptor didn’t figure among the receptors induced in tomato during the infection of a viral species belonging to the Tospovirus genus, suggesting a differential behavior of this gene in response to other virus species. LRR-RLKs constitute a diverse group of proteins anchored in the plasma membrane allowing the cell to recognize and respond to the extracellular environment, being a component of the signal transduction pathway. This study aimed to perform a molecular and functional characterization of the gene encoding such a LRR-RLK from tomato (Solanum lycopersicum) (recently nominated SlSOBIR1) infected by PepYMV and Tomato chlorotic spot virus (TCSV), Tospovirus genus, in order to reveal a possible implication of this receptor in triggering defense responses during infection by these two viral species. Molecular characterization of SlSOBIR1 was acquired through the determination of its expression profile in response to PepYMV and TCSV infection, respectivelly, and to mechanical wounding employing real-time PCR. In parallel, SlSOBIR1 expression levels on different tomato organs/tissues were determined and protein subcellular localization investigated, and a phylogenetic tree was constructed. In functional studies, the effect of SlSOBIR1 overexpression in tobacco plants infected with each virus species was observed. Furthermore, we investigated the expression of previously selected defense genes and determined reactive oxygen species accumulation in SlSOBIR1-overexpressors. The results revealed that the expression of SlSOBIR1 is modulated differently in tomato plants infected PepYMV (repression) ...

Made available in DSpace on 2015-05-14T16:53:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-11-21Bitstream added on 2015-05-14T16:58:55Z : No. of bitstreams: 1 000827166.pdf: 2711198 bytes, checksum: 14a654bafad8ddebe5152c38e41bb114 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Associação Ibero-Americana de Pós-grados (AUIP) / O tumor venéreo transmissível – TVT é objeto de numerosas investigações, apesar disso, existem lacunas que necessitam estudos. Há TVTs com graus variados de agressividade, portanto, alguns não respondem aos protocolos terapêuticos convencionais. Dando a entender que há modificações progressivas do seu perfil biológico. Técnicas como cultura celular, citometria de fluxo e a biologia molecular oferecem subsídios para se identificar e quantificar essas modificações, inclusive predizer comportamento biológico de tumor. O objetivo foi quantificar a expressão dos genes BAX, BCL2, TP53 e MDR1 em células de TVT primário e in vitro antes e depois da vincristina, a fim de identificar modificações quanto à resistência a agressividade e o tratamento. Foram obtidas 18 amostras de TVT caninos, para se estabelecer 8 culturas primárias. Logo depois se realizou testes de citotoxicidade, sobrevivência, apoptose, curva de crescimento e análise de expressão dos genes BAX, BCL2, TP53 e MDR1. Quando se comparou as células de TVT tratadas com vincristina, com aquelas que não receberam o tratamento, houve diferença estatística em relação às taxas de citotoxicidade, sobrevivência, e fases do ciclo celular, G1, Sub G1 e S. Sobre a expressão do gene MDR-1 a mesma diferença foi observada quando se comparou grupos de células tratadas e não tratadas. Nessa situação, o que se espera encontrar seria a baixa expressão do gene TP53, entretanto, ocorreu o oposto, qual seja alta expressão do gene TP53. Nessa situação acredita-se que tenha ocorrido o mecanismo regulador de apoptose. Quanto aos genes BAX e BCL-2 não foram observadas diferença estatística entre os grupos. Nesse caso, parecer não ter ocorrido a regulação esperada, do BAX pelo TP53. Acredita-se que houve mutação do TP53. Dados pouco relatados em TVT. Apesar de dados iniciais, podem concluir que estão relacionados à malignidade do tumor e resistência a quimioterapia / Transmissible venereal tumor - TVT has been subject of numerous investigations, despite this, there are gaps that need studies. There TVTs with varying degrees of aggressiveness, so some do not respond to conventional treatment protocols. Implying that there is progressive alteration of their biological profile. Techniques such as cell culture, flow cytometry and molecular biology offer subsidies to identify and quantify these changes, including predicting the biological behavior of the tumor. The objective was to quantify the gene expression BAX, BCL2, TP53 and MDR1 in primary TVT cells and in vitro before and after vincristine, in order to identify changes regarding the aggressiveness and resistance to therapy. 18 samples of TVT canines were obtained to establish 8 primary cultures. After was performed cytotoxicity tests, survival, apoptosis, growth curve and analysis of expression of genes BAX, BCL2, p53 and MDR1. When comparing the TVT cells treated with vincristine, with those who did not receive treatment, there was statistical difference in relation to cytotoxicity rates, survival, and cell cycle phases, G1, Sub G1 and S. About the MDR-1 gene expression, the same difference was observed when comparing cells treated and untreated groups. In this situation, what would be expected at the low expression of the TP53 gene, however, was the opposite, in other words high expression of TP53 gene. In this situation it is believed that there has been a regulatory mechanism of apoptosis. In BAX and BCL-2 genes were not observed statistical difference between the groups, in this case, appears to have not occurred the regulation expected of BAX by TP53. It is believed that there TP53 mutation. Data low reported on TVT. Although initial, data may conclude that are related to tumor malignancy and chemotherapy resistance / FAPESP: 2012/19285-2

Made available in DSpace on 2015-05-14T16:53:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-12-04Bitstream added on 2015-05-14T16:58:53Z : No. of bitstreams: 1 000826973.pdf: 1421350 bytes, checksum: cb9046da915832bdb24f2e31bcc45a06 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste estudo foi quantificar a abundância de genes associados com a competência de desenvolvimento em oócitos (GDF-9, BMP15 e OOSP1) e nas células do cumulus (GREM1, PTGS2, PFKP, AREG, EREG, HAS2, VCAN, PTX3, ADAM10 e ADAM17), a partir de oócitos imaturos (VG), maturados in vivo (MIVO) e cultivados em meio de MIV com diferentes macromoléculas (SFB, BSA ou PVA), diferentes concentrações de EGF ou pré-cultivados com butirolactona I (BLI) antes da MIV. O delineamento experimental consistiu de três experimentos de MIV de oócitos bovinos, a saber: experimento 1, complexos cumulus-oócito maturados em meio de cultivo contendo 10% de SFB ou 1 mg/mL de PVA ou 4 mg/mL de BSA; experimento 2, complexos cumulus-oócito maturados em meio de cultivo contendo EGF (nas concentrações de 0, 10 e 100 ng/mL); e experimento 3, complexos cumulus-oócito maturados in vitro na ausência (BL0) ou presença de pré-maturação com 10 μM de BLI ( BL12, 12 horas de pré-maturação e 12 horas de MIV; BL24, 24 horas de prématuração e 24 horas de MIV). A quantidade relativa de transcritos para o gene GREM1, PTGS2, PFKP e AREG foi maior do que (P<0,05) nas células do cumulus de oócitos MIVO, nos experimentos 1 e 2 e para o gene GREM1 no experimento 3. No experimento 1, o grupo SFB exibiu maior (P<0,05) abundância de transcritos de GREM1 e AREG entre os grupos MIV. No experimento 2, a adição de 10 ng/mL ao meio de MIV propiciou uma regulação positiva de EREG. No experimento 3, BL12 apresentou maior (P<0,05) abundância de AREG e o BL24 de EREG e PTX3. Entre os grupos de MIV, o gene GREM1 foi expresso em maior quantidade (P<0,05) no BL12. Não houve diferença estatística nos experimentos 1, 2 e 3 entre os grupos de oócitos MIV, MIVO e VG para os genes GDF9, BMP15 e OOSP1. Conclui-se que, a utilização de diferentes macromoléculas, diferentes concentrações de EGF e a realização de précultivo com BLI altera a transcrição nas células ... / The aim of this study was to quantify the abundance of genes associated with the development of oocyte competence in oocytes (GDF-9, BMP15 and OOSP1) and in cumulus cells (GREM1, PTGS2, PFKP, AREG, EREG, HAS2, VCAN, PTX3, ADAM10 and ADAM-17) of immature oocytes (GV), in vivo matured (IVMO) and cultured in IVM medium with different macromolecules (FCS, BSA or PVA), different EGF concentrations or pre-cultured with butyrolactone I (BLI) before IVM. The experimental design consisted of three IVM experiments of bovine oocytes, namely: experiment 1, cumulus-oocyte complex matured in culture medium containing 10% FCS or 1 mg/mL PVA or 4 mg/mL BSA; Experiment 2, cumulus-oocyte complex matured in culture medium containing EGF (at concentrations of 0, 10 and 100 ng/mL); and Experiment 3, cumulus-oocyte complex in vitro matured in the absence (BL0) or presence of pre-maturation with 10 μM de BLI (BL12, 12 hours of pre-maturation and 12 hours of IVM, BL24, 24 hours of pre-maturation and 24 hours of IVM). The relative amount of transcripts for GREM1, PTGS2, PFKP and AREG gene was larger than (P <0.05) in cumulus cells of IVMO oocytes in experiments 1 and 2 and for GREM1 gene in experiment 3. In experiment 1, the FCS group exhibited higher (P <0.05) abundance of transcripts of GREM1 and AREG among MIV groups. In experiment 2, the addition of 10 ng/ml to the IVM medium provided an upregulation of EREG. In experiment 3, BL12 showed higher (P <0.05) abundance of AREG and BL24 of EREG and PTX3. Among IVM groups, the GREM1 gene was expressed in larger quantities (P <0.05) in BL12. There was no statistical difference in experiments 1, 2 and 3 among groups of oocytes IVM, IVMO and GV for GDF9, BMP15 and OOSP1 genes. It was concluded that the use of different macromolecules, different EGF concentrations and the performance of pre-culture with BLI change the transcription in the cumulus cell of genes associated with oocyte competence / FAPESP: 2011/20514-3

Made available in DSpace on 2015-05-14T16:53:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-06Bitstream added on 2015-05-14T16:58:40Z : No. of bitstreams: 1 000828889.pdf: 1474303 bytes, checksum: 5e90c0d81b102049672685d3cfea7b62 (MD5)

Made available in DSpace on 2015-06-17T19:34:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-03. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-18T12:49:22Z : No. of bitstreams: 1 000834161.pdf: 716809 bytes, checksum: 0cae0a3abda0df8b6418716966cb1c84 (MD5) / O Brasil se consolidou como um dos principais produtores e exportadores mundiais de carne. Entretanto, diversas culturas (animal/vegetal) têm competido com a bovinocultura por espaço e importância na balança comercial brasileira. Assim, o melhoramento genético animal tem tido, no Brasil, papel fundamental na pecuária de corte de forma a manter crescentes os níveis de produção ocupando o mesmo espaço e a baixo custo. A eficiência alimentar é uma característica produtiva de extrema importância, porém não está sendo considerada nos programas de avaliação genética no país, devido ao fato de a mensuração ser onerosa e tardia. Nesse cenário a genética molecular pode contribuir para a implementação da seleção dessa característica em programas de melhoramento por meio da identificação de genes importantes para eficiência alimentar. O presente estudo objetivou comprovar o padrão de expressão de genes diferencialmente expressos previamente identificados por sequenciamento de RNA (RNA-seq) em animais extremos para eficiência alimentar. Nesse contexto foi adotada a metodologia de PCR quantitativo em tempo real (qPCR) a fim de estabelecer uma relação quantitativa entre nível de expressão gênica e a eficiência alimentar em uma população experimental de 83 animais da raça Nelore avaliados para diferentes medidas de eficiência alimentar. Um subgrupo composto por 20 animais extremos para o consumo alimentar residual (CAR) foi avaliado quanto ao padrão de expressão global pela tecnologia de RNA-seq para identificação de genes diferencialmente expressos (DE). A partir dos genes DE identificados foram selecionados seis genes candidatos (PPP1R26, FABP1, FADS2, RGS2, SLC2A5 e UCP2) com base nos valores de Fold Change e sua função metabólica para a característica em estudo. As qPCR foram realizadas para identificar associações entre o nível de expressão dos seis genes alvo com as medidas de ... / Brazil is one of the leading producer and exporter of meat. However, different livestock and plant production have been competing with cattle for space and importance in Brazilian trade balance. Thus, the animal breeding has played a key role in beef cattle to increase production levels occupying the same space at lower costs. Feed efficiency is a productive trait of extreme importance, but it has not been considered in genetic evaluation programs in our country. This is probably due to the fact that the measurement is costly and late. In this scenario molecular genetics may contribute to the implementation of this trait in breeding programs by identifying candidate genes for feed efficiency. The present study aimed to confirm the differential gene expression levels of candidate genes previously identified by RNA sequencing (RNA-seq) in extreme groups of animals evaluated for feed efficiency. We adopted the real time quantitative PCR methodology (qPCR) to verify a quantitative relationship between the level of gene expression and feed efficiency in an experimental population of 83 Nelore cattle evaluated for different feed efficiency traits. A subgroup composed of 20 animals extreme for Residual Feed Intake (RFI) was evaluated for overall standard of expression by RNA-seq technology to identify genes differentially expressed (DE). From the identified DE genes six candidate genes were selected (PPP1R26, FABP1, FADS2, RGS2, SLC2A5 and UCP2) based on fold change values and its metabolic function related to feed efficiency. The qPCR analyses were performed to confirm association between the expression level of the six target genes with measures of feed efficiency. It was observed association between the FABP1 gene with residual feed intake and dry matter intake (P <0.05). Also, the SLC2A5 gene was associated with Kleiber index measurements and relative growth rate (P <0.05). In both cases an increase in the expression level was associated ...

Made available in DSpace on 2015-06-17T19:34:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-25. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-18T12:49:13Z : No. of bitstreams: 1 000829952.pdf: 2186504 bytes, checksum: 0fe5b3ab3f81a06b3bdec5cf05d69c8a (MD5) / O Eucalyptus é um dos gêneros mais importantes no setor florestal mundial. Por esse motivo, programas de melhoramento genético florestal são desenvolvidos no intuito de aumentar a produtividade, introduzir características desejáveis e reduzir impactos ambientais. No entanto, características deletérias podem ser incorporadas em determinados cruzamentos nos ciclos de melhoramento, seja por endogamia biparental ou segregação de loci heterozigóticos. As anomalias são um exemplo deste efeito e podem acarretar perdas na produção de mudas, na produtividade e atrasos no desenvolvimento de genótipos elite. Portanto, a identificação e caracterização de genes relacionados às anomalias são muito importantes nos programas de melhoramento. Ao realizar um cruzamento controlado entre dois indivíduos de Eucalyptus grandis, a empresa Suzano Papel e Celulose detectou uma anomalia com segregação mendeliana de 3 (normais) :1 (anormais) na progênie. As plântulas anômalas morrem em poucos meses e diferem significativamente em algumas características morfológicas, como altura, diâmetro da base do caule, dimensões e forma do limbo foliar e número de ramificações laterais. Estudos prévios permitiram identificar uma marca molecular ligada à anomalia que apresentou identidade com genes da superfamília Bet v1, família PR10 (pathogenesis-related protein 10). No entanto, não era claro o envolvimento desta família gênica no desenvolvimento da anomalia. Neste cenário, o presente trabalho teve como objetivo a identificação e caracterização dos genes envolvidos na anomalia detectada. Genes e vias metabólicas, diferencialmente expressos entre os fenótipos contrastantes, demonstraram elevada atividade em processos relacionados à resposta de defesa nas plantas anormais. Tais resultados sugerem que a anomalia é causada pela ativação inadequada do sistema imune da planta (resposta autoimune) associado à incompatibilidade ... / Eucalyptus is one of the most important genus in worldwide forestry culture. For this reason forest improvement programs are developed aiming the increase of productivity, the introduction of desirable traits and the reduction of environmental impacts. However deleterious traits can be incorporated in certain crossings through the recurrent improvement cycles either by biparental inbreeding or by segregation of the heterozygous loci. Anomalies are an example of this deleterious effect and they can cause losses in seedling production, productivity and delays in the elite genotypes development. Thus, the identification and characterization of genes related to the anomalies are very important in forest improvement programs. In a controlled cross between two Eucalyptus grandis individuals, the Suzano Papel and Celulose SA company has detected an anomaly with Mendelian segregation ratio of 3 (normal) :1 (abnormal) in the progeny. Abnormal seedlings die in a few months and show significant difference in some morphological characteristics, such as height, stem-base diameter, dimensions and shape of leaf lamina, and number of branches. Previous studies allowed the identification of a molecular marker related to the anomaly that showed identity with Bet v1 superfamily genes, PR10 family (pathogenesis-related protein 10). However, it was not clear the involvement of this gene family in the anomaly. In this scenario, the present study aimed to identify and characterize the genes involved in the detected anomaly. Genes and metabolic pathways, differentially expressed between the contrasting phenotypes, showed high activity of process related to defense response in abnormal plants. These results suggest that the anomaly is caused by the inappropriate activation of the immune system of the plant (autoimmune response) associated with genetic incompatibility. The gene families of thaumatin-like proteins, Bet v1 proteins, and chitinase class I proteins ...

Made available in DSpace on 2015-06-17T19:34:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-25. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-18T12:48:55Z : No. of bitstreams: 1 000831510.pdf: 612514 bytes, checksum: dc6899b84194e33253d906ed14ea10eb (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A incidência de câncer de mama (CM) tem aumentado de maneira alarmante nos últimos anos. Diversas pesquisas conduziram à descoberta de amphiregulin (AREG) como um oncogene, tendo sua expressão relacionada com diversos tipos de cânceres. Nosso grupo evidenciou a ação do T3 sobre diferentes genes em células de câncer de mama, por meio de microarray, porém nesse estudo não foi avaliado o mecanismo de ação pelo qual o T3 regula a expressão desses genes e o envolvimento de ER. A relação entre a expressão de AREG e a presença de HT permanece desconhecida, portanto, o objetivo do presente estudo foi verificar a ação nuclear e extra-nuclear do T3 na expressão gênica do oncogene AREG em linhagens celulares de adenocarcinoma de mama, MCF-7 e MDA-MB-231. As linhagens celulares foram submetidas ao tratamento com 10-8M de T3 nos tempos de 10', 30', 1h e 4h, na presença ou ausência de Fulvestrant (ICI 182,780), inibidor de ER, Actinomicina D (ACTD) - inibidor da expressão gênica, Ciclohexamida (CHX), inibidor da síntese protéica, e LY294002 - inibidor da via PI3K. O mRNA de AREG foi analisado pela técnica de RT-PCR. Para a análise dos dados foi utilizado ANOVA complementado com teste de Tukey e adotado significância mínima de 5%. O T3 elevou os níveis de expressão gênica de AREG, em relação ao grupo controle, nas duas linhagens celulares, independente dos tempos de incubação. Nosso trabalho confirma que a expressão gênica de AREG está aumentada na presença T3, em ambas as linhagens e em todos os tempos estudados. Os dados desse estudo indicam que T3 pode agir por meio de ER, diminuindo a expressão de AREG após 30' de tratamento nas células MCF-7 e não alterando a expressão desse gene nas células MDA-MB-231, as quais não possuem ER. Além disso, podemos sugerir que a ação de T3 sobre a expressão gênica de AREG ocorre de forma indireta. O T3 mantém a expressão de AREG mesmo após ... / The incidence of breast cancer (BC) has increased alarmingly in recent years. Several studies have been lead to the discovery of amphiregulin (AREG) as an oncogene, with its expression related to various cancer types. Our group showed the action of T3 on different genes in BC cells using microarray, but the mechanism which T3 regulates the expression of these genes and the involvement of ER have not been evaluated yet. The relationship between the expression of AREG and the presence of TH remains unknown, therefore, the aim of this study was to verify the nuclear and extra-nuclear action of T3 on AREG gene expression in breast adenocarcinoma cell lines, MCF-7 and MDA-MB-231. The cell lines were subjected to treatment with 10-8M T3 at the times 10', 30', 1h and 4h in the presence or the absence of Fulvestrant (ICI 182,780) - ER inhibitor, Actinomycin D (ACTD) - inhibitor of gene expression, cycloheximide (CHX) - inhibitor of protein synthesis, and LY294002 - inhibitor of PI3K pathway. The AREG mRNA levels were analyzed by RT-PCR. For data analysis we used ANOVA followed by the post hoc Tukey's test with a significance level of 5%. T3 increased AREG gene expression levels, compared to the control group in both cell lines, regardless of the incubation times. Our study confirms that AREG gene expression is increased in the presence of T3 in both cell lines and at all the times studied. The data from this study indicate that T3 might act through ER, decreasing AREG expression after 30' treatment in MCF-7 cells and did not alter the expression of this gene in MDA-MB-231 cells, which lack ER. Furthermore, we suggest that T3actionon AREG gene expression occurs indirectly. The T3 maintains AREG expression even after the inhibition of transcription. And, the PI3K pathway activation by T3 is required for the modulation of AREG in both cell lines studied / FAPESP: 2009/15607-2

Made available in DSpace on 2015-06-17T19:34:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-08-04. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-18T12:48:38Z : No. of bitstreams: 1 000828456_20160101.pdf: 422063 bytes, checksum: 8476834ceb55ae5bce2c637566dd5def (MD5) Bitstreams deleted on 2016-01-04T10:26:22Z: 000828456_20160101.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-01-04T10:28:15Z : No. of bitstreams: 1 000828456.pdf: 2122241 bytes, checksum: 622d6ebfa87551ddad978a95d5a84bc8 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A endometriose é uma doença crônica multifatorial, inflamatória, estrógeno-dependente, que afeta entre 8 a 10% das mulheres em idade reprodutiva e caracterizada por tecido similar ao endométrio (glândula e estroma) fora da cavidade uterina. Embora a sua etiologia seja pouco conhecida, evidências recentes indicam que alterações epigenéticas estão envolvidas na sua patofisiologia. Esta hipótese é apoiada pelos achados envolvendo padrões alterados de metilação do DNA em genes específicos, bem como pelos níveis alterados de expressão de componentes da maquinaria epigenética nas lesões endometrióticas, quando comparadas ao endométrio eutópico da mesma paciente ou ao endométrio de mulheres que não apresentam a doença. Assim, um melhor entendimento do papel dos mecanismos epigenéticos na patogênese e progressão da endometriose tem se tornado necessário, podendo contribuir para a identificação de marcadores diagnósticos e para o delineamento de novas abordagens terapêuticas, que trariam benefícios e melhor qualidade de vida para as mulheres que apresentam esta condição. Neste contexto, este estudo buscou a identificação de genes diferencialmente metilados candidatos a biomarcadores na endometriose. Os resultados obtidos foram organizados em dois artigos científicos. O primeiro artigo teve como objetivo investigar o perfil diferencial de metilação do DNA na endometriose intestinal em comparação com amostras pareadas de endométrio eutópico da mesma paciente. Para isso, foi empregada uma abordagem em larga escala baseada em microarranjos contendo 27.800 ilhas CpG, que resultou na identificação de 546 genes hipermetilados e 871 genes hipometilados. A análise in silico para a classificação funcional dos genes diferencialmente metilados permitiu identificar conjuntos de genes com funções de fatores de transcrição, remodeladores da cromatina entre outras classes funcionais. Após a realização de uma ... / The endometriosis is a multi-factorial and chronic disease affecting 5% to 10% of women in reproductive age characterized by endometrium-like tissue (gland and stromma) outside uterine cavity. Although its etiology is poorly understood, recent evidences have indicated that epigenetic alterations are implicated in the pathophysiology. This hypothesis has been supported by findings surrounding altered DNA methylation pattern of specific genes, as well as by altered levels of expression of epigenetic machinery components in endometriotic lesions compared to eutopic endometrium from the same patient or endometrium of women free of disease. Thus, a better understanding of the role of epigenetic mechanisms in the pathogenesis and progression of endometriosis has become necessary and may contribute to the identification of diagnostic markers and for designing new therapeutic approaches that could benefit and improve the quality of life of women with this condition. In this context, this study aimed to identify differentially methylated genes as candidate biomarkers in endometriosis. The results could be organized in two papers. The first study aimed to investigate the profile of differential DNA methylation in intestinal endometriosis compared to eutopic endometrium of paired samples from the same patient. For this, we carried out a large-scale approach based on microarray containing 27,800 CpG islands, resulting in the identification of 546 genes as hypermethylated and 871 genes as hipomethylated. In silico analysis for the functional classification of differentially methylated genes enabled us to identify sets of genes with functions of transcription factors, chromatin remodeling, besides other functional classes. After conducting a comparative assessment with data available in other large-scale studies of literature, it was possible to recognize recurrent alteratons evolving 227 hypermethylated and 322 hypomethylated ...

Made available in DSpace on 2015-06-17T19:34:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-10-09. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-18T12:48:37Z : No. of bitstreams: 1 000830930_20161009.pdf: 528336 bytes, checksum: 2584c6b09449ed93f647987c98b7c1c6 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-10-10T12:18:28Z: 000830930_20161009.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-10-10T12:19:00Z : No. of bitstreams: 1 000830930.pdf: 2248627 bytes, checksum: accddf23493d2bfab5e3f401310fb7d7 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Alterações epigenéticas, incluindo as alterações da metilação do DNA, das modificações de histonas e da atividade de RNAs não codificadores, são eventos frequentes em células tumorais e estão associados às mudanças da estrutura da cromatina e dos níveis de expressão gênica. O gene RASSF1, localizado em 3p21.3, é responsável pela transcrição de sete variantes a partir de regiões promotoras distintas, associadas a duas ilhas CpG. Dentre os transcritos estão RASSF1A e RASSF1C, codificados por regiões promotoras diferentes, e que têm sido descritos na literatura como codificadores de proteínas com funções celulares opostas: RASSF1A é caracterizado como supressor tumoral e é frequentemente silenciado por metilação anormal em vários tipos de câncer, enquanto RASSF1C tem sido associado a atividades oncogênicas, e não há relatos de metilação de ilha CpG associada à sua região promotora. Com a finalidade de investigar uma possível associação entre parâmetros clínicos e histopatológicos em pacientes diagnosticadas com câncer de mama e o padrão de metilação de RASSF1A e RASSF1C, foram analisadas 84 amostras de carcinomas mamários pela técnica de MS-PCR (Methylation-Specific Polymerase Chain Reaction). Para RASSF1A, foi encontrada uma frequência de metilação de 84,5% das amostras, enquanto que para RASSF1C todas as amostras apresentaram alelos exclusivamente não-metilados, o que sugere uma regulação de expressão diferente da observada para RASSF1A. Devido ao fato de 75 das 84 amostras utilizadas serem diagnosticadas como carcinomas ductais invasivos, as análises estatísticas incluíram apenas esse subtipo histológico. Não foi encontrada diferença estatística significativa para as características clínicas/histopatológicas e presença/ausência de metilação de RASSF1A. Foi também analisado o padrão de metilação das ilhas CpGde RASSF1 em 17 linhagens celulares derivadas de carcinomas ... / Alterações epigenéticas, incluindo as alterações da metilação do DNA, das modificações de histonas e da atividade de RNAs não codificadores, são eventos frequentes em células tumorais e estão associados às mudanças da estrutura da cromatina e dos níveis de expressão gênica. O gene RASSF1, localizado em 3p21.3, é responsável pela transcrição de sete variantes a partir de regiões promotoras distintas, associadas a duas ilhas CpG. Dentre os transcritos estão RASSF1A e RASSF1C, codificados por regiões promotoras diferentes, e que têm sido descritos na literatura como codificadores de proteínas com funções celulares opostas: RASSF1A é caracterizado como supressor tumoral e é frequentemente silenciado por metilação anormal em vários tipos de câncer, enquanto RASSF1C tem sido associado a atividades oncogênicas, e não há relatos de metilação de ilha CpG associada à sua região promotora. Com a finalidade de investigar uma possível associação entre parâmetros clínicos e histopatológicos em pacientes diagnosticadas com câncer de mama e o padrão de metilação de RASSF1A e RASSF1C, foram analisadas 84 amostras de carcinomas mamários pela técnica de MS-PCR (Methylation-Specific Polymerase Chain Reaction). Para RASSF1A, foi encontrada uma frequência de metilação de 84,5% das amostras, enquanto que para RASSF1C todas as amostras apresentaram alelos exclusivamente não-metilados, o que sugere uma regulação de expressão diferente da observada para RASSF1A. Devido ao fato de 75 das 84 amostras utilizadas serem diagnosticadas como carcinomas ductais invasivos, as análises estatísticas incluíram apenas esse subtipo histológico. Não foi encontrada diferença estatística significativa para as características clínicas/histopatológicas e presença/ausência de metilação de RASSF1A. Foi também analisado o padrão de metilação das ilhas CpGde RASSF1 em 17 linhagens celulares derivadas de ...