CAVALCANTE, Ítalo José Mesquita. Descriminação das isoenzimas das adenosina desaminase (ADA) em fluidos corporais humanos. 2010. 125 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2010. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-04-09T13:02:59Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_ijmcavalcante.pdf: 2272178 bytes, checksum: 1a0106a00b7dfd24fb12db6c32ab973e (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-04-09T16:04:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_ijmcavalcante.pdf: 2272178 bytes, checksum: 1a0106a00b7dfd24fb12db6c32ab973e (MD5) / Made available in DSpace on 2012-04-09T16:04:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_ijmcavalcante.pdf: 2272178 bytes, checksum: 1a0106a00b7dfd24fb12db6c32ab973e (MD5) Previous issue date: 2010 / Adenosine deaminase (ADA – E.C.3.5.4.4.) is a fundamental enzyme in the catabolism of the purines. It catalyzes the deamination of adenosine or 2’deoxy-adenosine producing ammonium and inosine or 2’-deoxyinosine, respectively. Its activity is expressed by two isoenzymes presented in three isoforms. ADA1 (36 kDa) and ADA1 bound to CD26 (280kDa) are widely distributed in the body tissues. Their action is particularly important because high levels of 2’deoxy-adenosine are toxic for the immune system cells. ADA2 (100kDa) is normally found in serum and is synthesized only in monocyte-macrophage system. The biological importance of ADA2 is not yet fully clear, especially for its kinetics characteristics. The objective of the present work was to discriminate the isoenzymes of human adenosine deaminase using agarose electrophoresis and by mathematical model proposed by Vale and Almeida (1998). In addition, we performed a study of the profile of ADA tests in State of Ceara (Brazil). Samples of of ascites, pleural and pericardial effusion were submitted to electrophoresis in 1% agarose at 80V for 7 hours. The gel was sliced and each slice was incubated in adenosine (22 or 0,55mM) for 20 hours to detect the ammonium released by enzymatic reaction. The results found from electrophoresis were compatible with the model proposed by Vale and Almeida (1998). The pleural fluid is the most frequently requested for the determination of ADA, followed by ascitic fluid, cerebrospinal fluid, pericardial fluid and serum. We observed that the value of enzymatic activity is influenced by corporal fluid type where the enzyme is localized. These data can be associated with the corporal barrier, like brain barrier. We concluded that the proposed mathematical model could be used in clinical laboratories to discriminate ADA isoenzymes to improve the diagnostic method. / A adenosina desaminase (ADA – E.C.3.5.4.4.) é uma enzima fundamental no catabolismo das purinas. Ela catalisa a desaminação da adenosina ou 2’deoxi-adenosina produzindo amônia e inosina ou 2’-deoxi-inosina, respectivamente. Sua atividade é expressa por 2 isoenzimas presentes em 3 isoformas. A ADA1 (36kDa) ou ADA1 ligada ao CD26 (280kDa) são amplamente distribuídas nos tecidos. Sua ação é particularmente importante porque altos níveis de 2’deoxi-adenosina são tóxicos para as células do sistema imunológico. A ADA2 (100kDa) é normalmente encontrada no soro e sintetizada somente pelo sistema monocítico-macrofágico. A importância biológica da ADA2 ainda não está totalmente estabelecida, principalmente devido as suas características cinéticas. O presente trabalho teve como objetivo discriminar as isoenzimas da adenosina desaminase humana através de eletroforese em gel de agarose e pelo modelo proposto por Vale e Almeida (1998), bem como realizar um estudo descritivo retrospectivo sobre o perfil dos exames de ADA no Estado do Ceará. As amostras de líquido ascítico, pleural e pericárdico foram submetidas à eletroforese em agarose a 1% a 80 V por 7 horas. O gel foi fatiado e cada fatia foi incubada em adenosina (22 ou 0,55mM) por 20 horas para a detecção da amônia liberada pela reação enzimática. Os resultados encontrados a partir da eletroforese foram comparados com os resultados achados pelo modelo de Vale e Almeida (1998). O líquido pleural é o fluido que é mais frequentemente solicitado para a determinação da ADA, seguido pelos líquidos ascítico, cefalorraquidiano, pericárdico e soro. Observamos que os valores de atividade enzimática são influenciados pelo tipo de líquido corporal onde a enzima se encontra, podendo estar relacionada às barreiras corporais, tais como a barreira hematoencefálica. A partir dos resultados obtidos, podemos concluir que o modelo matemático proposto pode ser usado em laboratórios clínicos para discriminar as isoenzimas da ADA.

Orientador: Laurecir Gomes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-20T23:39:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Esquisatto_MarceloAugustoMarretto_M.pdf: 3437086 bytes, checksum: 45a2abbee1080dd2180c685972d21d67 (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: Este trabalho teve por objetivo analisar os componentes da MEC da cartilagem articular bovina de diferentes regiões do joelho (FI, F2, F3, P e T) que suportam forças biomecânicas de diferentes intensidades. A análise das fendas artificiais demonstrou que as regiões apresentaram diferentes padrões para o direcionamento das fibras colagênicas na camada superficial da cartilagem. Apesar disso o conteúdo relativo de colágeno não apresentou diferença significativa. As extrações realizadas com Gu-HCI 4M solubilizaram conteúdos de proteínas e ácido urônico semelhantes em todas as regiões. A quantificação total de GAGs apresentou valores significativamente diferentes. F2, F3 e FI apresentaram os maiores valores e P e T os menores. Os extratos foram submetidos a ultracentrifugação com CsCI e obtidas quatro trações (DI, D2, D3 e D4). A quantificação de proteínas, mais abundante em D4, mostrou diferença significativa entre as regiões. F3, P e FI apresentaram os maiores valores e F2 e T, os menores. A quantificação de ácido urônico, mais abundante em DI, não apresentou diferença significativa. Para análise qualitativa dos PGs na fração DI utilizou-se cromatografia de gel filtração. Três populações de PGs foram isoladas. Os padrões de migração para moléculas de alto peso foram avaliados em gel de agarose-poliacrilamida e as de menor peso em SDS-PAGE. Entre os PGs detectados em SDS-PAGE, P foi a região com maior conteúdo e FI apresentou, somente a população de maior peso. Te F3 apresentaram o padrão de migração mais rápido e polidisperso e P, F2 e FI apresentaram padrões mais lentos. A dimensão dos GAGs dos PGs foram avaliados, em gel de poliacrilarnida com tampão barbital, após digestão com papaína. Duas populações de cadeias de GAGs foram encontradas ( 40 kDa e acima de 150 kDa). O emprego de Chase AC e posterior análise em gel de agarose-poliacrilarnida indicou a presença de CS como único GAG. Para análise qualitativa das populações de proteínas não-colagênicas, em D4, utilizou-se cromatografia de troca iônica com gradiente de NaCI (O - 1,5 M). Em todas as regiões não foi observado material catiôQÍco. O material foi eluído com a concentração de NaCI entre O - 0,6 M e as proteínas analisadas em SDS-P AGE. O Mr das moléculas observadas variou de 190 a 19 kDa e foi detectado fibromodulim em todas as regiões através da coloração CEC-azul de alcian e "immunoblotting". O fibromodulim (60 - 67 kDa) apresentou um comportamento de autoagregação, mais evidente em T e FI / Abstract:The purpose of this work was to analyse cartilage ECM components of five differents regions of knee joint (FI, F2, F3, P and T). These regions withstand different intensities ofbiomechanical forces. The analyses of artificial slits showed differents standars of collagen fibers directions on cartilage superficiallayer. Despite this, the relative content of collagen did not show significant difference. The content of proteins and uronic acid were similar for each region. The total content of GAG showed significant differents values. F2, F3 and FI showed higher and P and T lower values. The extracts were submitted to ultracentrifugation in CsCI gradient, resulting in DI, D2, D3 and D4 ftactions. Proteins were concentrated in D4 fractions. Considering the different regions, more proteins were detected in D4 fractions of F3, P and FI regions, and less in F2 and T. Uronic acid values did not prove significant diference. DI was fractioned through gel filtration chromatography. The analyses offtactions was by agarose-polyacrylamide gel electrophoresis and SDS-P AGE, showing the presence of three . populations of PGs. In SDS-P AGE, two polydisperse bands were detected, probably related to the smali proteoglycans decorin and biglican. These molecules were prominent in P region. In FI region only that one with higher Mr was observed. In, agarose-polyacrylamide, T and F3 showed faster and more polydisperse bands, than P, F2 and FI regions. Considering these last regions, P exhibited a slower band, F2 a, intermediate and FI a faster one. The Mr of GAGs were estimated in P AGE with barbital buffer after papain digestion. Two populations of GAGs were found (~ 40 IeDa and another one larger than 150 kDa). Digestion with chondroitinase AC and analyses by agarose-polyacrilamide gel electrophoresis indicated that CS was the only GAG component present. Non-collagenous proteins present in D4 ftaction were analysed in ion exchange chromatography with NaCI gradient (O - 1.5 M) and SDS-PAGE. For all regions, no material was eluted before the begining of the gradient. The material was eluted with NaCl concentration between O - 0.6 M. The Mr of molecules observed in SDS-PAGE was among 190 - 19 kDa. A polydisperse band (60 - 67 kDa) was detected in all regions. Analyses with CEC-alcian blue and immunoblotting methods, indicated that protein as being fibromodulim. This small proteoglycan showed self-aggregation behaviour, specially in samples from T and FI regions / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Laurecir Gomes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T03:27:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Belline_Paula_M.pdf: 2979545 bytes, checksum: de2fb3922b53b55053aa803bd21c186b (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: Já foram descritos os componentes da matriz extracelular de diferentes cartilagens de mamíferos, mas sobre aves são encontradas poucas informações. Nosso trabalho, teve como objetivo extrair e identificar componentes da matriz extracelular de duas cartilagens articulares de frango (tibiotarso e tarsometatarso). As cartilagens articulares foram homogeneizadas e os componentes extraídos com Gu-HCI4M. Após obtenção do extrato total foi realizada uma ultracentrifugação em gradiente de c1oreto de césio, onde foram obtidas as frações DI, D2, D3 e D4. O conteúdo protéico foi maior na fração D4, onde em tarsometatarso a extração foi mais eficiente (2,64 mg/rnl) do que em tibiotarso (1,6 mglrnl). Com relação à dosagem de ácido urônico, a concentração maior foi encontrada na fração Dl-tarsometatarso (1,52 mglrnl) em relação à Dl-tibiotarso (0,80 mg/rnl). A fração D4 foi aplicada em DEAE-Sephacel em tampão Tris-HCI 20mM pH 7,2 com uréia 7M. O material que se ligou ao DEAE foi eluído com um gradiente de O a 1,5M de NaCI no mesmo tampão. A análise destas frações em SDS-PAGE mostraram que somente em tibiotarso há um componente com 250 kDa, que na presença de 2-Me migra com 59 kDa. Após o teste de "immunoblotting" e CEC/azul de alcian foi possível mostrar que se trata do pequeno proteoglicano fibromodulim, em condições redutoras e não redutoras. Em tarsometatarso a proteina com 59 kDa se apresentou proeminente em condições redutoras. Uma proteína, apresentou uma banda polidispersa em tomo de 70 kDa e foi encontrada em ambas as regiões. Provavelmente, se trata do pequeno proteoglicano decorim. Proteínas não colagênicas com Mr de 46, 36 e 30 kDa foram observadas em ambas regiões. A fração DI foi analisada em Sepharose CL-6B. O perfil cromatográfico de tibiotarso e tarsometatarso foi muito semelhante. Ambas regiões apresentaram um único pico que eluiu logo após o volume morto, com Kav de 0,08. Pela análise em agarosepoliacrilamida nas duas regiões analisadas, pode ser visto uma única população de grandes proteoglicanos. O tipo de glicosaminoglicano presente em cada região foi analisado através de gel de agarose-propileno. O glicosaminoglicano predominante para as duas regiões foi condroitim-sulfato, embora tenha apresentado características diferentes para cada cartilagem. Este resultado foi confirmado após incubação com condroitinase ABC / Abstract: The extracellular matriz (ECM) components of different cartilages of mammals is already kwown, but little information is found for ECM of avian cartilage. The purpose of this work was to identi:fy the components of the ECM of tibiotarsal and tarsometatarsal cartilage of chicken. The cartilage was homogeneized in PBS and the fragments extracted with 4M Gu-HCI. The extract was submitted to ultracentrifugation in CsCI gradient, resulting in DI, D2, D3 e D4 fractions. The protein contents was greater in the D4 fraction and in tarsometatarsal extract the concentration of proteins (2,64 mglml) was larger than in tibiotarsal extract (1,6 mglml). With respect to uronic acid, we found more in Dltarsometatarsal (1,51 mg/ml) than in Dl-tibiotarsal (0,80 mg/ml). D4 fraction was dialysed, applied on DEAE-SepOOcel and eluted with 7M urea in 20mM Tris-HCI pH 7,2. Bound material was eluted with a gradient ranging from O to 1,5M NaCI in the same buffer. SDS-P AGE of DEAE fractions of tibiotarsal cartilage, showed a component with 250 kDa, which in presence of 2-Me appears to migrate as a 59 kDa protein. After immunoblotting and CEC/alcian blue, it was demonstrated to be the small proteoglycan fibromodulin in reducing and non-reducing conditions. In tarsometatarsal fractions this protein, migrating as 59 kDa, was detected only in reducing conditions. Another protein migrating as a polidisperse band around 70 kDa was detected in both cartilages. Probably it is the small proteoglycan decorin. Non-collagenous proteins with 46,36 e 30 kDa were detected in both cartilages. DI fration was analysed in Sepharose CL-6B. The cromatography profiles were similar for tibiotarsal and tarsometatarsal cartilages. Both regions showed only one peak tOOt eluted with Kav=0,08. Analysis of fractions in SDS-P AGE and agarose-polyacrilamide gel electrophoresis showed the presence oflarge proteoglycans in tibiotarsal and tarsometatarsal material. The glicosaminoglycans were analysed in agarose gel electrophoresis for each region. The predominant glicosaminoglycan was condroitin sulfate in both cartilages, but its migration in agarose gel was different for tibiotarsal and tarsometatarsal samples. This result was confirmed using chase ABC digestion / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Edson Rosa Pimentel / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-26T22:10:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Feitosa_VeraLuciaCorrea_D.pdf: 13181802 bytes, checksum: 70be6825d75b6196a433f6da5690e67e (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: Os tendões flexores digitais superficial e profundo de porco foram estudados com o objetivo de identificar diferenças morfológicas e bioquímicas em regiões que exibem diferentes propriedades biomecânicas. O tendão flexor digital superficial foi dividido em três regiões, denominadas de proximal, que passa sob a articulação tibio-tarsal e recebe forças de compressão além das forças de tensão; intermediária, onde predominam apenas forças de tensão e a região distal que contorna a articulação metatarsofalângica onde também atuam forças de compressão. O tendão flexor digital profundo foi dividido nas regiões proximal com predomínio de forças de tensão; distal, região bifurcada em direção aos dígitos contornando a articulação metatarsofalângica e região terminal que se insere nos terceiro e quarto dígitos. Nestas duas últimas regiões atuam forças de compressão. As análises estruturais dos tendões mostraram que nas regiões de compressão os fibroblastos apresentaram-se arredondados, semelhantes a condrócitos e os feixes de colágeno têm uma organização muito complexa, assumindo várias direções e se associando aos proteoglicanos. A distribuição dos feixes de colágeno nas regiões de compressão e tensão pôde ser observada através das análises aos microscópios de polarização e eletrônico de varredura. A morfologia apresentada pelas regiões de tensão é típica de tendão, os feixes de colágeno estão alinhados entre si e os fibroblastos se dispõem paralelamente entre estes feixes. A birremngência mostrou um alto nível de ordem molecular e grau de agregação dos feixes de colágeno em áreas onde houve um predomínio da força de tensão. O dicroísmo linear confirma que as moléculas dos glicosaminoglicanos (GAGs) são paralelo ao eixo maior dos feixes de colágeno. O padrão de "crimp" apresentou uma morfologia regular e mais definida para as regiões de tensão. As fibras elásticas foram encontradas em todas as três regiões, porém com distribuição diferente. Nas regiões de tensão, elas seguem a mesma direção dos feixes de colágeno e em regiões de compressão elas se dispõem em várias direções. As diferentes regiões dos dois tendões foram extraídos com cloreto de guanidina (GuHCI). As dosagens de proteínas e GAGs apresentaram valores significativamente diferentes para todas as regiões dos dois tendões, ocorrendo uma maior concentração nas regiões em que os tendões contornam a articulação. Fracionamento em DEAE-Sephacel de todos os extratos e análise em SDS-PAGE 4-16% com e sem 2-mercaptoetanol evidenciou a presença de componentes polidispersos com Mr em tomo de 94 e 200 kDa. O componente de 67 kDa apareceu em todas as regiões dos dois tendões e, através da digestão enzimática com queratanase e coloração CEC-azul de alcian seguida de coomassie brilliant blue, apresentou um comportamento semelhante ao pequeno proteoglicano fibromodulim. As propriedades de intumescimento apresentadas pelos dois tendões foram típicos de uma matriz colagênica fibrosa. Foi verificado que ocorreu um intumescimento maior em água, nas regiões onde predominam forças de compressão, enquanto as regiões de tensão intumesceram mais quando em contato com o ácido acético 3%. Estes dados de intumescimento foram confirmados pelas dosagens dos GAGs sulfatados após a digestão pela papaína, que apresentou uma maior quantidade de GAG/mg de tecido naquelas regiões sujeitas a forças de compressão. O GAG dermatam sulfato detectado em gel de agarosepropilenodiamino foi encontrado em todas as regiões nos dois tendões, enquanto o condroitim sulfato foi observado principalmente nas regiões de compressão, embora tenha sido verificada pequena quantidade de condroitim sulfato também nas regiões de tensão. A digestão com as condroitinases AC e ABC e posterior análise em gel de garosepropilenodiamino indicou a presença do dermatam sulfato como único GAG. Nossos resultados, mais uma vez vêm reforçar a teoria de que as forças mecânicas podem contribuir para a definição da composição e organização da matriz extracelular / Abstract: The superficial and deep digital flexor tendons of pigs were studied to identify the morphological and biochemical aspects of different regions which have different biomechanical properties. The superficial digital flexor tendon was divided in: proximal, intermediate and distal regions. The proximal and distal regions bear compressive forces while the intermediate region withstands only tensional forces. The deep digital flexor tendon was divided in proximal, distal and terminal regions. The first bears only tensional forces while the distal and terminal regions are under compressive in addition to tensional forces. The structural analysis in both tendons, in the regions under compression, showed the presence of round cells and collagen bundles distributed in several directions, giving to the extracellular matrix a structure similar to a basket-weave pattern. In contrast, in the tensional regions, typical elongated fibroblasts were found following bundles of collagen fibers in parallel arrays. The birremngence images showed the highest degree of molecular order and collagen molecules aggregation in areas where the tensional forces were dominant, compared with areas where compressive forces were also present. The crimp pattern w.as more regular and larger in regions under tension than in compressive regions. The linear dichroism confirmed that the glycosaminoglycans (GAGs) were parallel to the long axis of the collagen fibrils. For biochemical analysis, the different regions were extracted with 4M guanidineHCI. A larger quantity of protein and sulfated GAG were found in the compressive regions. Chromatography in DEAE-Sephacel and analysis in polyacrylamide gel, showed the presence of polydisperse components with Mr around 94 and 200 kDa. A component with 67 kDa was detected in all regions. After keratanase digestion, electrophoresis and staining with alcian blue under specific critical electrolyte concentration conditions, it was proved to contain keratan sulfate. The presence of dermatan sulfate in the 94 kDa component, after 13elimination and electrophoresis in agarose gel, indicated strongly to be the small proteoglycan decorin. This component was found in alI regions, but in regions under compression probably interacts strongly with other matrix components.The swelling properties exhibited by the two tendons were typical for a fibrous collagenic matrix. A larger swelling in water was found for the regions under compression, while the tensional regions were more swollen when embedded in 3% acetic acid. These results were in accordance with the measurements of total GAGs afier papain digestion, where a larger amount of GAG/mg tissue was found in compressive areas. Dermatan sulfate detected in agarose gel was found in alI regions of the two tendons, while chondroitin sulfate was mainly observed in compressive areas. The presence of chondroitin sulfate indicates the presence of the large PG. Our results confirmed anterior studies carried out in wrap around tendons of other specimens of mammals, and once more reinforce the theory that biomechanical forces can contribute towards the composition and organization of the extracellular matrix / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Stephen Hyslo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-27T02:04:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Matthiesen_AlcyrJose_M.pdf: 2439730 bytes, checksum: 195b3aef1010687757fea8a898b4bb9c (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: A difusão de toxinas do sítio de inoculação de veneno é atribuída à ação de enzimas como colagenases, elastases, hemorraginas e hialuronidases que degradam os componentes da lâmina basal e da matriz extracelular. Neste trabalho avaliamos a atividade hialuronidásica de vários venenos animais e investigamos algumas propriedades da enzima encontrada no veneno da cascavel sul americana Crota/us durissus terrificus. A atividade hialuronidásica foi medida por um método turbidimétrico usando-se ácido hialurônico como substrato e também por detecção in situ após SDS PAGE. A hialuronidase foi parcialmente purificada por gel filtração em coluna de Sephacryl S200 HR. O perfil de eluição foi monitorado a 280nm e as frações foram testadas para atividade enzimática. A capacidade de antisoros em neutralizar a enzima foi avaliada medindo-se a atividade residual após co-incubação durante 30 min à 37°C. De modo geral, os venenos investigados possuíam atividade hialuronidásica, com níveis mais altos em venenos de artrópodes [15.3+-4.7 ¿ 166+-19.2 unidades (TRU ou "turbidity reducing units")/mg] do que em serpentes (O - 7.0+-1.7 TRU/mg; média+-E.P.M.; n=3-6). Houve variação dentro e entre espécies e subespécies, conforme observado com os venenos botrópicos e crotálicos, respectivamente. Assim, a atividade hialuronidásica de diferentes amostras de veneno de C. d. terrificus variou de 4.5:tO.5 à 13.2:t4.8 unidades TRU/mg, (n=3-6), enquanto a de C. d. cascavella e C. d. collilineatus era de 25.7:t1.2 e 6.8:t1.1 TRU/mg, respectivamente. A hialuronidase mostrou pH ótimo de 4,0, e atividade máxima na presença de 50-100 mM de NaCI. A enzima perdeu atividade acima de 37°C, e também perdeu 50% de atividade durante as primeiras 6 h em solução (acetato de sódio 0,1 M, pH 6,0, contendo 0,15 NaCI), mas depois se manteve relativamente constante até 24 h, independente da temperatura de incubação (4°C, 25°C, 37°C). A cromatografia do veneno de C. d. terrificus por gel filtração resultou em um pico de atividade hialuronidásica com peso molecular >30.000, o que foi confirmado por eletroforese (SDS-PAGE) seguido por detecção de atividade in situo Com esta técnica, apenas uma banda de atividade foi observada com os diferentes lotes de veneno e o peso molecular foi estimado em -75.000. A atividade da enzima foi inibida de forma dose-dependente por antisoros comerciais (anti-botrópico, anti-crotálico, anti-elapídico e anti-escorpiônico), sendo o anti-escorpiônico o menos eficaz; em altas doses, todos inibiram a atividade em >90%. Estes resultados indicam que há variação nos ní.veis de atividade hialuronidásica no veneno de C. d. terrificus, mas que existe apenas uma isoforma. As propriedades desta enzima se assemelharam às de outras hialuronidases de venenos. A neutralização da atividade enzimática por diferentes antisoros comerciais indicou que há identidade imunológica entre hialuronidases de diferentes venenos / Abstract: Animal venoms contain enzymes capable of degrading basement membrane and extracellular matrix components. We examined the collagenase, elastase and hyaluronidase activities of several venoms and some of the properties of hyaluronidase in Crotalus durissus terrificus (South American rattlesnake) venom. Collagenase and elastase were assayed colorimetrically. Hyaluronidase activity was measured turbidimetrically and by in situ detection following SDS-PAGE. The enzyme was also partially purified by gel filtration on Sephacryl S200 HR. Neutralization of hyaluronidase by antisera was tested by measuring the residual activity afier co-incubation. Arthropod and snake venoms showed similar levels of collagenase; elastase activity varied from O - O.713 ~nm/mg/24 h. The hyaluronidase content of arthropod venoms [15.3+-4.7 to 166:!:19.2 units/mg; mean +-SEM] was higher than in snake venoms (<7.0+-1.7 units/mg; n=3-6). In C. d. terrificus venoms, hyaluronidase activity varied from 4.5+-0.5 to 13.2+-4.8 units/mg (n=3-6). C. d. terrificus hyaluronidase eluted as a single peak afier gel filtration and migrated as a single band (~75 kDa) based on in situ detection afie r SDS-PAGE. The pH optimum was 4.0, with maximum activity in 0.05-0.1 M NaCI. The enzyme lost activity at >37°C and after 6 h in solution (-50% reduction) at 4°C, 25°C and 37°C. Commercial antisera neutralized the enzyme. These propertiesof C. d. terrificus hyaluronidase were similar to those of other venom hyaluronidases / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Ricardo Della Coletta / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-01T23:13:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MartelliJunior_Hercilio_D.pdf: 3278041 bytes, checksum: 0cc24c4b3107647288798f4d02c27e47 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Fibromatose Ggengival Hereditária (FGH) representa uma condição oral incomum, caracterizada por aumento gengival fibrótico e generalizado. Para elucidar algumas características regulatórias que resultam nesta condição, linhagens celulares de fibroblastos de pacientes de uma mesma família com FGH foram isolados e analisados em relação ao efeito de diidrotestosterona (DHT) na proliferação celular e de TGF-ßl, IL-6 e INF-? na expressão e produção de colágeno tipo I, Hsp47, MMP-I e MMP-2. Adicionalmente, analisamos o efeito de DHT na produção de IL-6 e determinamos os níveis de expressão de receptores de andrógenos em fibroblastos de GN e de FGH. Os resultados indicaram que DHT simultaneamente estimulou a proliferação celular e inibiu a produção de IL-6 em fibroblastos de GN e de FGH. A expressão de receptores para andrógenos foi detectada em fibroblastos de GN e de FGH; contudo, a expressão foi maior em fibroblastos de GN. Ensaios de RT-PCR, westem blot, ELISA e enzimografia demonstraram que a expressão e produção de colágeno tipo I e Hsp47 foram significativamente maiores em fibroblastos de FGH comparados a fibroblastos de GN, enquanto a expressão de MMP-I e MMP-2 foram menores em fibroblastos de FGH. A adição de TGF-ßl e IL-6 à fibroblastos de GN e de FGH promoveram um aumento na expressão de colágeno tipo I e Hsp47 e uma diminuição de MMP-I e MMP-2. INF-y reduziu a expressão de colágeno tipo I e Hsp47, apresentando menor efeito na expressão de MMP-I e MMP-2. Estes resultados demostram que DHT coordena a proliferação celular e a produção de IL-6 em fibroblastos de GN e de FGH e que TGF-ßl e IL-6 estimulam a síntese de colágeno e reduzem a atividade proteolítica de fibroblastos de FGH, os quais favorecem o acúmulo de matriz extracelular / Abstract: Hereditary Gingival Fibromatosis (HGF) is an uncommon oral condition characterized by a fibrous gingival enlargement. To further elucidate some of the regulatory features resulting in this condition, the culture characteristics of cell lines of gingival fibroblasts derived from patients ofthe some family with HGF were isolated and analyzed on the effect of DHT on proliferation rate and on the effect of TGF-ßl, IL-6 and INF-? on expression and production of type I collagen, Hsp47, MMP-I and MMP-2. Additionally, we analyzed the effect of DHT on IL-6 production and determined the expression levels of androgen receptors in NG and HGF fibroblasts. The results indicated that DHT simultaneously upregulated the cell stimulates proliferation and downregulated the production of IL-6 production by NG and HGF fibroblasts. Androgen receptor levels was identified in both NG and HGF fibroblasts; however, the levels in NG were higher than those observed in HGF. Our results obtained from RT-PCR, Westem blot, ELISA and enzymography assays demonstrated that the expression and production of type I collagen and Hsp47 were significantly higher in fibroblasts from HGF than from NG, whereas MMP- 1 and MMP-2 expression and production were lower in fibroblasts from HGF patients. Addition of TGF-ßl and IL-6 promoted an increase in type I collagen and Hsp47 and decrease in MMP-I and MMP-2 expression. INF-y reduced both type I collagen and Hsp47 expression, whereas had a slight effect on expression of MMP-I and MMP-2. These results show that DHT coordinates the proliferation and production of IL-6 by NG and HGF fibroblasts and that enhanced TGF-ß1 and IL-6 production simultaneously increase the synthesis and reduce the proteolytic activies of HGF fibroblasts, which favor the accumulation of extracellular matrix / Doutorado / Estomatologia / Doutor em Estomatopatologia

Orientador : Edson Rosa Pimentel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T01:37:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Catalano_Ricardo_M.pdf: 6185165 bytes, checksum: ace65328615f679660b215a5f54c4f1c (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Os tendões em geral, possuem funções importantes relacionadas com a transmissão das forças de tração geradas pela contração muscular para o osso. São estruturas adaptadas à resistir a forças de tração, e em alguns tendões podem resistir também a forças de compressão. A organização dos componentes da matriz extracelular proporcionam ao tendão grande flexibilidade, resistência e uma certa elasticidade. Estas características biomecânicas permitem ao tendão realizar trabalho com eficiência funcional e otimização operacional. A matriz extracelular de tendão é constituída por colágeno, proteoglicanos e proteínas não colagênicas. A organização e distribuição destes componentes são diferentes para diferentes tecidos dependendo da presença de forças de tração e compressão a que estão sujeitas. O objetivo deste trabalho foi analisar a organização estrutural e a composição da matriz extracelular de tendões submetidos a forças periódicas de tração. Para tanto, foram analisados tendões de cauda de ratos suspensos e comparados a ratos controle. Foram realizadas análises bioquímicas de componentes da matriz, e análise morfológica utilizando microscopia de luz normal e polarizada além da microscopia eletrônica de transmissão. As análises revelaram que os tendões caudais sob tração sofrem. modificações estruturais e físico químicas. Foi observado que no caso dos tendões suspensos, ocorreu uma maior compactação e organização das moléculas colagênicas, e que também um dos pequenos proteoglicanos, o decorim provavelmente sofre alterações em sua estrutura / Abstract: Tendons are structures capable of undergoing different adaptations to accomplish their function with efficiency. In this work we have analyzed the modifications in tendons of rat tails, which were submitted to periodic tension forces. Morphological and biochemical analyses were carried out. A waviness aspect of collagen bundles was observed for suspended tendons but not in control tendons. Also higher linear dichroism values were observed for suspended tendons, indicating the existence of a re-arrangement of the collagen bundles when submitted to tension forces. Ultrastructural analysis, showed that in the case of suspended tendons, the diameter of the fibrils of collagen were larger compared with the control. The biochemical analysis, showed no differences between the composition of the extracellular matrix of suspended and control tendons, but it was remarkable the behavior of the polydisperse proteoglycan with 140 kDa, that migrated faster in SDS PAGE, in the case of suspended tendons, indicating probably a diminishing in the size of the glycosaminoglycan chain present in that proteoglycan. It is discussed the possible effect of the polydisperse component in the increased diameter of collagen fibrils in the case of suspended tendons / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Sebastião Roberto Taboga / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T17:27:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Corradi_LaraSilvia_M.pdf: 4218766 bytes, checksum: 31f98a583235b641f6facc93ba1715e1 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: o desenvolvimento e diferenciação da próstata são induzidos por andrógenos; via interações epitélio-mesenquimais, e na vida adulta, a glândula é mantida funcionalmente ativa por interações semelhantes entre o epitélio e o estroma. Descompensações hormonais, geralmente observadas durante a senescência, causam um desequilíbrio destas interações homeostáticas e podem promover o aparecimento de patologias prostáticas. A hiperplasia e o câncer estão entre as doenças que mais fTeqüentemente atingem a próstata e os hormônios androgênicos; juntamente com outros fatores, exercem papel importante na etiologia destas lesões. O entendimento da fisiologia androgênica e sua função no desenvolvimento e manutenção da próstata normal e no envolvimento com as doenças que a afetam é fundamental para a compreensão das interações epitélio-estroma. Na próstata a ação androgênica é acentuada devido à conversão da testosterona em diidrotestosterona pela 5a.- redutase, enzÍma presente, principalmente, em células basais e estromais. Por essas razões, o objetivo deste estudo foi avaliar as alterações na morfologia tissular da próstata ventral do gerbilo adulto (Meriones unguiculatus), incluindo modificações na arquitetura tecidual, na ultra-estrutura celular, além do arranjo das fibras da matriz extracelular, decoITentes do tratamento com finasterida, um inibidor competitivo da enzima 5a.-redutase. Os resultados obtidos após 10 dias de tratamento oral; com 100mglkg/dia de finasterida, revelaram uma intensa reorganização do compartimento estromal e modificações epiteliais frente a nova situação hormonal. O compartimento glandular epitelial reduziu-se de tamanho e teve a atividade sintética diminuída, enquanto no compartimento estromal as fibras de colágeno e as reticulares acumularam-se de maneira marcante na base do epitélio, assumindo fenótipos bem diferentes dos observados na próstata dos animais controle. A camada de músculo liso tornou-se menos compactada, com abundante material granular amorfo e fibras colágenas e reticulares entremeando as células musculares lisas. Além disso, este material granular amorfo também acumulou-se notavelmente na base do epitélio. Algumas das células da camada muscular lisa por sua vez, passaram a apresentar aspecto desdiferenciado, com contorno irregular e espinhoso, enquanto outras mostraram-se bem reduzidas, com citoplasma condensado e várias vesículas de pinocitose na membrana celular. Deste modo, estes resultados permitem indicar que a inibição da atividade enzimática da 5a.-redutase afetou as interações homeostáticas entre epitélio e estroma, o que pode estar potencialmente envolvido com alterações hormonais / Abstract: Prostatic deve1opment and differentiatíon are induced by androgens acting via mesenchymal-epithelial interactions, and during adult life the gland is maintained functionally active by reciprocal homeostatic stromal-epithelial interactions. Hormonal alterations, usually associated with the physical aspects of aging, leads to disruptions of this homeostatic interactions and may initiate and promote several prostate diseases. The benign prostatic hyperplasia and cancer are among the most fi-equently prostatic pathologies and androgens, together with others factors, play important roles in the etíology ofthese lesions in the prostate. Understanding the physiology of androgen production and its role in development and maintenance of the normal prostate and in prostate cancer, it is vital in order to comprehend the complex interactions between epithelium and stroma. Within the prostate, the androgen action is enhanced due to the conversion of testosterone in dihydrotestosterone, by 5a-reductase, an enzyme mostly present in basal and stromal cells. Thus, the objective ofthis study was to analyze the alterations in tissular morphology of the adult gerbil (Meriones unguiculatus) ventral prostate, including modifications in the tissue architecture, cell ultrastructure and extracellular matrix fibers arrangement, following finasteride therapy, a competitive Sa-reductase inhibitor. The data obtained afier oral frnasteride administration, at a dose of 100mglkglday through 10 days revealed a striking reorganization ofthe stromal compartment and epithelial modifications, probably due to the new hormonal situation. The glandular epithelial compartment shrinked and its secretory activity decreased. In the stromal compartment, there was a notable collagen and reticular fibers accumulation around the epitheliurn, which assumed very different phenotypes when compared to the control animaIs' prostate. The smooth musc1e layer underwent a loosening, interspersed with abundant amorphous granular material, collagen and reticular fiber. This amorphous granular material also accumulated in the base of the epithelium. Some smooth musc1e cells exhibited a dedifferentiated aspect with a higWy irregular external contour and numerous spine-like cytoplasmic projections, whereas others were reduced, showing a condensed cytoplasm and many caveolae in the cell surface. ln these regards, the results lend support to conc1ude that the 5a-reductase inhibition affected the homeostatic epithelial-stromal interactíons, what can be critically involved with the alterations of hormonallevels / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Benedicto de Campos Vidal / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T00:11:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paoli_Flaviade_M.pdf: 13532312 bytes, checksum: e1da24a994eb94382a8c6665b5814297 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Dois tendões de frangos com idades de 21 e 41 dias da região tibiotarsus foram utilizados: o tendão calcaneus communis e o tendão flexor digitorum superficialis, que são submetidos a forças compressivas e tensionais, respectivamente. O objetivo deste estudo foi detectar diferenças morfológicas e funcionais, de ordem molecular e de cristalinidade entre esses dois tendões. Tendões que trafegam sobre uma articulação possuem características fibrocartilaginosas em resposta a forças compressivas apresentando grandes quantidades de glicosaminoglicanos livres e organizados com os feixes de colágeno. Por outro lado, tendões que são submetidos a forças tensionais possuem menores quantidades de glicosaminoglicanos, fato esse indicado por uma metacromasia menos evidente na coloração com Azul de Toluidina e por apresentarem valores maiores em testes de intumescimento em ácido acético a 3%. Análises de curvas de birrefringência de forma revelam um maior estado de agregação ordenada e uma maior cristalinidade neste tendão, demonstrada por maiores valores de retardas ópticos. Células do tendão calcaneus communis exibem grandes variações morfológicas, assim como seus núcleos, que possuem formas que vão da fusiforme até a arredondada, semelhantemente a condrócitos. Foi também observado aumento da quantidade de DNA nesses núcleos, com o avanço da idade, comparativamente à quantidade determinada em eritrócitos de frangos, utilizados como controle para os parâmetros geométricos e absorciométricos analisados. Portanto, todos esses dados indicam que estes tendões, por necessitarem de processos adaptativos constantes, possuem uma maior organização e orientação de seus componentes, além de uma alta atividade metabólica de suas células / Abstract: Two tendons of chickens with 21 and 41 days old from tibiotarsus region were utilized: calcaneus communis tendon and fIexor digitorum superficialis tendon that are submitted to compressive and tensional forces, respectively. The aim of this study was to detect morphological and functional differences, related with molecular order _nd crystallinity between these two tendons. Tendons that pass above joints have fibrocartilagenous characteristics in response to compressive forces, presenting high amounts of free glycosaminoglycans and organized with the collagen bundles. Otherwise, tendons subjected to tensional forces have minor glycosaminoglycans amount, in agreement with the decreased metachromasy after toluidine blue staining and with the great values found in the intumescing tests with 3% acetic acid. Form birefringence curves analyses reveal a higher ordered aggregational state and crystallinity in this tendon according to the optical retard values. Cells of the calcaneus communis tendon exhibit great morphological variations, as its nuclei, wich have forms ranging from elongated to round, similar to chondrocytes. Its was also watched an increase on the DNA amount at these nuclei with the ages advance when compared to the amount found in chicken erythrocytes, here utilized as control for the geometric and absorciometric parameter. However, ali these data indicate that these tendons, for needing constant adaptative processes, have a high organization and orientation of their components, besides a high metabolic activity of the cells / Mestrado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Edson Rosa Pimentel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T00:13:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tomiosso_TatianaCarla_M.pdf: 4297076 bytes, checksum: 448864ccd931233cf60f718db755d078 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: A cartilagem articular é um tecido conjuntivo hialino que apresenta células e abundante matriz extracelular, sendo essa composta de colágenos, glicoproteínas não colagênicas e proteoglicanos. Este trabalho teve como objetivo descrever a composição e organização da matriz extracelular de cartilagem articular de avestruz. Esta ave de grande porte e de interesse comercial, quando mantida em cativeiro, tem sido acometida por artrose nas articulações do tarsometatarso com sério comprometimento para a saúde do animal e consequências econômicas. Para tanto consideramos as cartilagens articulares das superfícies proximal e distal do tarsometatarso. A cartilagem proximal foi dividida em porção lateral e intermediária-medial, enquanto que da cartilagem da superfície distal foi analisada só a porção central. As análises estruturais das regiões da cartilagem, coradas com azul de toluidina, mostraram porções meta cromáticas e fibrilares. As fibrilas, intensamente birrefringentes ao exame pela microscopia de polarização, mostraram-se dispostas em várias direções, especialmente na região dista / Abstract: The articular cartilage is a hyaline connective tissue that contains cells and a great amount of extracellular matrix, which is composed of collagen, non-collagenous glycoproteins, and proteoglycans. This work aimed to describe the composition and organization of the extracellular matrix from articular cartilage of ostrich, which is a big bird with commercial importance and that commonly suffers of arthritis at the tarsometatarsical articulations when living in captivity conditions, teading to serious commitments to the animal's health, beyond the economical consequences. For this purpose. we have considered the articular cartilages of the proximal and distal surfaces of the tarsometatarsus. The proximal cartilage was divided into lateral, and intermediary-medial portions. From the distal surface only the central portion was analyzed. Structural analyses after toluidine blue staining showed presence of metachromatic and fibrilar components. The fibrils, intensely birefringent at polarization microscopy. were arranged in many directions, especially in distal cartilage. To extract the extracellular matrix components 4 M guanidinium chloride was utilized. The components were fractionated in DEAE-Sephacel and analyzed by SDS-PAGE. Quantitation of proteins and glycosaminoglycans was done utilizing colorimetric methods. The quantitative analysis revealed that the distal region, which is subjected to higher compressive forces, contaíns more proteins and glycosaminoglycans than the proximal region. The SDS-PAGE analysis of the fractions eluted from the DEAE-Sepachel showed the presence of proteíns with Mr from 17 to 121 kDa. In ali regions, polydisperse components wíth Mr around 67, 80-100, and 250-300 kDa, were found. These components probably correspond to the small proteoglycans fíbromodulin, decorín and biglycan. Glycosaminoglycans analysis in agarose-propylene diamine gel showed only the presence of chondroitin-suftate. The possible decorin found is a proteoglycan of chondroitin-sufate, and not dermatan-sulfate, as observed in other cartilages. Structurally the distal region exhibited ffbí11s arranged in several directions, probably because of a highest compressive strenght / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural