Made available in DSpace on 2015-12-06T22:57:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006 / Proposição: Analisar o perfil dos glicosaminoglicanos sulfatados (GAGs) na uretra de ratas nuligestas ou prenhas submetidas a cesárea, parto normal ou trauma simulado de parto com balão intravaginal, comparando os resultados obtidos após quatro dias e doze semanas dos procedimentos. Métodos: 110 ratas foram distribuidas em onze grupos: Grupos A1 e A2 - ratas nuligestas; Grupos B1 e B2 - ratas nuligestas submetidas a insuflação vaginal; Grupos C1 e C2 - ratas submetidas a cesárea; Grupos D1 e D2 - ratas submetidas a cesárea seguida de insuflação vaginal; Grupos E1 e E2 - ratas prenhas que evoluíram espontaneamente para parto vaginal; Grupo F - ratas sacrificadas no 20° dia de prenhez. Os animais dos grupos A1, B1, C1, D1 e E1 foram sacrificados após quatro dias e, os dos grupos A2, B2, C2, D2 e E2, após doze semanas dos procedimentos. Os GAGs condroitim sulfato (CS), dermatam sulfato (DS) e heparam sulfato (HS) foram extraídos por proteólise e determinados por densitometria após migração eletroforética em gel de agarose. Resultados: Observou-se maior expressão de DS em relação ao HS em todos os grupos. Detectou-se CS apenas no grupo de ratas prenhas (Grupo F). Na avaliação quatro dias após o trauma, observou-se que, nas ratas prenhas (Grupo F), houve quantidade maior de GAGs totais em relação às ratas dos grupos B1, C1, D1 e E1; maior quantidade de HS em comparação às ratas dos grupos A1, B1, C1, D1 e E1 e de DS em relação às do grupo E1. Na avaliação após doze semanas, observou-se quantidade maior de GAGs totais, DS e HS nas ratas do grupo cesárea com trauma (D2) em relação às dos grupos A2, B2, C2 e E2. Conclusões: Houve aumento da quantidade de GAGs totais, DS e HS na uretra de ratas submetidas a trauma com insuflação vaginal após cesárea em relação às ratas nuligestas com ou sem insuflação, ratas pós-cesárea sem insuflação e pós-parto natural, avaliadas doze semanas após o procedimento. Na análise quatro dias após os procedimentos não houve diferença na quantidade de GAGs entre todos os grupos, exceto pelo grupo de ratas prenhas, que apresentou quantidade significativamente maior de GAGs. / Objective: This study was undertaken to evaluate the sulfated glycosaminoglycan (GAGs) profile in the urethra of adult female rats that had a cesarean section, vaginal delivery or intravaginal ballooning by comparing the results 4 days and 12 weeks after the procedures. Methods: 110 rats were divided into 11 groups. Groups A1 and A2: nuliparous rats; Groups B1 and B2: nuliparous rats that had vaginal ballooning; Group C1 and C2: primiparous rats that had cesarean section without vaginal ballooning; Groups D1 and D2: primiparous rats that had cesarean section followed by vaginal ballooning; Groups E1 and E2: primiparous rats that had vaginal delivery and Group F: pregnant rats sacrificed on the 20thday. Groups A1, B1, C1, D1 and E1 were sacrificed four days after the procedures and groups A2, B2, C2, D2 e E2 were sacrificed 12 weeks after the procedures. Thereafter, the urethras of the animals were removed and processed to yield a dry powder from which the GAGs content was determined by densitometry following agarose gel electrophoresis. Results: Dermatan sulfate (DS) was the predominant glycosaminoglycan in all groups. Condroitin sulfate (CS) was found only in group F (pregnant rats). In the evaluation four days after the procedures, results showed a significant increase in total GAGs in group F when compared to groups B1, C1, D1 and E1; a significant increase in HS in group F when compared to groups A1, B1, C1, D1 and E1; and a significant increase in DS in group F when compared to group E1. The evaluation 12 weeks after the procedures indicated a significant increase in total GAGs, DS and HS in group D2 when compared to groups A2, B2, C2 and E2. Conclusions: There was a significant increase in total GAGs, DS and HS in the urethra of rats that had cesarian section plus intravaginal balooning in the evaluation 12 weeks after the prcodures, in comparison with nuliparous rats with or without balooning, primiparous rats that had vaginal delivery and rats that had cesarian section without balooning. The evaluation 4 days after the procedures showed no difference in the level of GAGs between all the groups, except for the group of pregnant rats, which showed a significant increase of GAGs. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Orientador: José Luiz Laus / Coorientador: Marcela Aldrovani Rodrigues / Banca: João Antonio Tadeu Pigatto / Banca: Aline Adriana Bolzan / Resumo: Por objetivos, estudaram-se procedimentos em cultivo celular e se eles alteram a supraorganização da matriz extracelular (MEC) amniótica e da límbica, considerando-se propriedades anisotrópicas dos biopolímeros em comum, isto é, colágenos fibrilares e proteoglicanos. Explantes límbicos de coelhos foram cultivados sobre fragmentos de membrana amniótica (MA) desepitelizada humana, por dois, sete e 15 dias. Fragmentos não cultivados de MA e de limbo foram usados como controles. Avaliaram-se parâmetros de birrefringência em fibras colágenas e de absorção e de dicroísmo linear (LD) em proteoglicanos, da MEC amniótica e da límbica. Todas as análises foram conduzidas em microscópio óptico munido de luz polarizada, filtros monocromadores com diferentes comprimentos de onda e vídeo-câmera. Empregaram-se procedimentos em análise digital de imagens (software Image J®, NIH, USA). Parâmetros de birrefringência revelaram que os graus de paralelismo das fibras colágenas amnióticas foram de 1,02 nos controles, 1,17 nas amostras cultivadas por dois dias, 1,26 nas amostras cultivadas por sete dias e de 1,17 nas amostras cultivadas por 15 dias. Relativamente às fibras límbicas, foram de 1,33, 1,17, 1,25 e 1,44. Os contrastes dos brilhos das birrefringências das fibras amnióticas foram de 2,0 nos controles, 13,25 nas amostras cultivadas por dois dias, 19,26 nas amostras cultivadas por sete dias e de 13,23 nas amostras cultivadas por 15 dias. Relativamente às fibras límbicas, foram de 23,01, 13,39, 19,90 e 30,31. Cores de interferência causadas por dispersão anômala de birrefringência foram detectadas. Procedimentos em cultivo celular alteraram parâmetros absorciométricos relacionados à supraorganização dos proteoglicanos da MEC amniótica e da límbica. As MAs de todas as amostras, exceto as cultivadas por 15 dias, apresentaram-se com valores negativos de DL. Os valores de DL dos limbos de todas as amostras, exceto... / Abstract: The goal of this study was to evaluate whether procedures on cell culture alter the supraorganization of amniotic and limbal extracellular matrix (ECM). Anisotropic properties of fibrillar collagen and proteoglycans were studied, since they correspond to major extracellular biopolymers. Rabbit limbal explants were cultured on denuded human amniotic membrane (AM) for two, seven, and 15 days. Uncultured AM and limbus were used as controls. Birefringence parameters related to the supraorganization of collagen fibers, and spectral absorption and linear dichroism (LD) related to the supraorganization of proteoglycans were evaluated. All samples were evaluated on microscope equipped with polarized light, monochromatic filters with varying wavelengths, and digital video camera. Birefringence, absorbances and LD were quantified by using image analyses software (Image J®, NIH, USA). Studies on birefringence showed that parallelism degrees of amniotic collagen fibers were of 1.02 for the control group, 1.17 for the two days culture, 1.26 for the seven days culture, and 1.17 for the 15 days culture. In relation to limbal collagen fibers, parallelism degrees were of 1.33, 1.17, 1.25, and 1.44. Birefringence brightness contrasts of amniotic collagen fibers were of 2.0 for the control group, 13.25 for the two days culture, 19.26 for the seven days culture, and 13.23 for the 15 days culture. In relation to limbal collagen fibers, birefringence brightnesses were of 23.01, 13.39, 19.90, and 30.31. Interference colors due to anomalous birefringence dispersion were observed. Procedures on cell culture induced alterations in absorbance values related to proteoglycans from amniotic and limbal ECM. In all samples, except on those cultured for 15 days, the amniotic ECM showed negative DL values. The DL of limbal ECM varied between negative and positive values for all, except on two days culture / Mestre

As purinas extracelulares ATP e adenosina têm sido extensivamente estudadas em diferentes modelos e tipos celulares na modulação de várias respostas fisiológicas e patológicas. No entanto, a inosina extracelular, produto da degradação da adenosina pela Adenosina Deaminase (ADA), foi considerada por muito tempo um simples metabólito inativo. Recentemente, diversos trabalho têm demonstrado que este nucleosídeo possui importante papel na regulação de inúmeros processos. As células de Sertóli são as células somáticas dos túbulos seminíferos, e possuem fundamental importância na espermatogênese. Estas células, expressam diferentes purinoreceptores, estando estes envolvidos na regulação de diversas funções destas células relacionadas ao controle do desenvolvimento das células germinativas. No testículo, o TNF-α é produzido pelas espermátides redondas e pelos macrófagos ativados presentes no espaço intersticial. As células de Sertóli expressam os dois receptores descritos para TNF-α, TNF-RI (p55) e TNF-RII (p75), e diversos trabalhos tem descrito a modulação de diferentes funções destas células por esta citocina, incluindo a modulação da produção de NO e da fosforilação das MAPKs. Recentemente, foi descrita a modulação purinérgica da sinalização por TNF-α, bem como, a atividade ATPásica do receptor TNF-R1. Assim, nesta dissertação, foi estudado o efeito do TNF-α nos níveis das purinas extracelulares, além da possível participação purinérgica na sinalização desta citocina, em células de Sertóli em cultura. O tratamento destas células com TNF-α leva a um rápido aumento (5minutos) da concentração extracelular da inosina, que se prolonga até seis horas de incubação, sem alterar a concentração dos demais nucleotídeos e seus metabólitos. A inosina modula a produção de NO e a fosforilação das MAPKs ERK½ e p38 em células de Sertóli em cultura, aparentemente, através de diferentes mecanismos, sendo o primeiro efeito independente do receptor para adenosina A1 e o segundo efeito dependente da ativação deste receptor. Além disso, a inosina extracelular está envolvida na modulação da produção de NO e da fosforilação da MAPK ERK½ em células de Sertóli em cultura pelo TNF-α. A inibição do acúmulo de inosina estimulado pelo TNF-α através da incubação com um inibidor da adenosina deaminase cancela o aumento da produção de NO estimulada por esta citocina. Além disso, o bloqueio do receptor para adenosina A1 por antagonistas específicos impede o aumento na fosforilação da ERK½ estimulada por esta citocina. Assim, nesta dissertação, é descrito um papel intermediário da inosina extracelular na sinalização do TNF-α em células de Sertóli em cultura.

Resumo não disponível

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-13T16:51:24Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 16597 bytes, checksum: c188d7e42b6952425efca3c5a93ee706 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-13T16:51:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 16597 bytes, checksum: c188d7e42b6952425efca3c5a93ee706 (MD5) Previous issue date: 2003-08-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Leveduras presentes na microbiota do ambiente da indústria de queijo possuem propriedades potenciais de interesses biotecnológicos. O banco de leveduras do Laboratório de Fisiologia de Microrganismos (Bioagro – UFV) contém centenas de leveduras obtidas de cinco diferentes laticínios da Zona da Mata de Minas Gerais, das quais 94 foram testadas neste trabalho, sendo a levedura com maior atividade proteolítica extracelular selecionada. Determinaram-se as condições fisiológicas de cultivo dessa levedura que propiciaram atividade proteolítica máxima, bem como caracterizaram-se propriedades química e cinética das proteases extracelulares. Um total de 74 leveduras foram positivas para proteases extracelulares em ágar caseinato de sódio. As leveduras codificadas como 5-BV-ed 4 e 5-BXII- 1 foram isoladas da superfície de queijo tipo Edam e da mesa de manipulação, respectivamente. A levedura 5-BXII- 1 , a qual obteve a maior atividade proteolítica, foi submetida a cultivo em diferentes fontes de nitrogênio, sob diferentes concentrações. Em sulfato de amônio, a constante de afinidade (K S ) foi de 0,012 g.L -1 e a velocidade máxima de crescimento (μ max ), de 0,36 h -1 . Em casaminoácidos, K S foi de 0,20 g.L -1 e μ max , de 0,39 h -1 . Já, em caseína, K S foi de 0,34 g.L -1 e μ max , de 0,54 h -1 . Baixas concentrações de sulfato de amônio induziram maior atividade proteolítica por massa de células em culturas conduzidas sob regime de batelada. Maior atividade proteolítica esteve associada ao crescimento exponencial de leveduras cultivadas em batelada, tendo casaminoácidos como fonte de nitrogênio. Em cultura contínua sob condições limitantes de casaminoácidos, observaram-se resultados antagônicos, isto é, altas vazões específicas de alimentação (correspondentes a altas velocidades específicas de crescimento) resultaram em menor atividade proteolítica, enquanto baixas vazões específicas de alimentação (correspondentes a menores velocidades de crescimento) estiveram associadas às atividades proteolíticas máximas. Atividade proteolítica máxima foi observada na faixa de pH de 7,0 a 8,5 e temperatura de 35 °C. Embora 50% da atividade máxima tenha sido detectada de 45 a 70 °C, a atividade proteolítica em função da concentração do substrato azocaseína seguiu o modelo cinético de Michaelis e Menten. A atividade proteolítica no extrato enzimático foi inibida por EDTA, PMSF e pepstatina e pelos íons metálicos divalentes Co +2 , Mg +2 e Zn +2 e ativada pelo Mn +2 . Esses resultados indicam a presença de proteases da classe das aspartil proteases, metaloproteases e serino proteases no extrato enzimático extracelular da levedura 5-BXII- 1 . / Yeast growing in cheese manufacturing environments possess properties of potential biotechnological interest. The yeast collection at the Microbial Physiology Laboratory (Bioagro-UFV) includes hundreds of yeast collected at five different dairies in the Zona da Mata of Minas Gerais State, ninety-four of which were tested to select that with the highest extracellular proteolytic activity. Growth conditions were optimized for maximum proteolytic activity by the selected yeast and the chemical and kinetic properties of its extracellular proteases were characterized. A total of 74 yeast tested positive for extracellular proteases in sodium caseinate agar. Yeasts 5-BV-ed4 and 5-BXII- 1 were isolated from the surface of Edam cheese and a cheese dairy countertop, respectively. Yeast 5-BXII- 1 presented the highest proteolytic activity and was thus grown on varying concentrations of different nitrogen sources. Nitrogen source half- saturation constants (K s ) and the maximum specific growth rates (μ max ) were xv0.012g.L -1 and 0.36 h -1 for ammonium sulfate, 0.20 g.L -1 and 0.39h -1 for casaminoacids and 0.34 g.L -1 and 0.54 h -1 for casein. Lower ammonium sulfate concentrations induced higher specific proteolytic activity in batch cultures. Higher proteolytic activity was found during exponential growth of batch cultures when casaminoacids were the nitrogen source. Antagonistic results were observed for continuous cultures under casoaminoacid limiting conditions. Higher specific substrate flowrates (corresponding to high specific growth rates) resulted in lower proteolytic activity while low specific substrate flowrates (corresponding to lower growth rates) were associated with maximum proteolytic activities. Maximum proteolytic activity was observed in a pH range of 7,0 to 8.5 and at a temperature of 35 o C, although 50% of the maximum activity was detected at 45 and 70 o C. Proteolytic activity followed Michaelis-Menten kinetics when azocasein was used as substrate. Enzyme extract proteolytic activity was inhibited by EDTA, PMSF, pepstatin and the divalent metal ions Co 2+ , Mg 2+ and Zn 2+ , while it was activated by Mn 2+ . These results indicate the presence of aspartyl, serine and metalo proteases in the extracellular enzyme extract of yeast 5-BXII- 1 .

Made available in DSpace on 2015-11-11T12:13:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 flavia_cardoso_ioc_dout_2012.pdf: 4710105 bytes, checksum: dc3501a4d3afbbe60d475111f040507c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-05-21 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / No presente trabalho a imunopatologia da infecção por Leishmania amazonensisfoi estudada em quatro linhagens de camundongos singênicos. Diferentes parâmetros como análise da expressão/produção de citocinas em diferentes órgãos e no soro, quantificação da carga parasitária, caracterização das populações celulares presentes no infiltrado inflamatório, assim como alterações histopatológicas e na matriz extracelular foram avaliados a fim de verificar as diferenças existentes na resposta imunopatológica entre as linhagens de camundongos utilizadas. A partir destas análises observamos que na fase inicial da infecção, tanto na lesão primária como no linfonodo, as células predominantemente encontradas foram eosinófilos e mastócitos em todas as linhagens de camundongos. A maior presença de células como linfócitos T\03B3\03B4, células B, plasmócitos, assim como altos níveis de anticorpos foi verificada nos camundongos sensíveis a infecção por L. amazonensissugerindo o papel destes na suscetibilidade a doença. Quanto à carga parasitária, as linhagens mais sensíveis (C57BL/10 e CBA) apresentaram maior densidade de amastigotas e maior destruição tecidual com lesões grandes, além de metástase e visceralização do parasito, enquanto os camundongos resistentes (C3H.He) apresentaram poucos parasitos, sem formação de úlceras ou visceralização De acordo com nossas observações, a resposta imunológica à L. amazonensisdemonstra uma compartimentalização e consequente diferença na produção/expressão de citocinas nos diferentes órgãos estudados. As linhagens mais sensíveis apresentaram, na lesão primária, níveis mais elevados de expressão de citocinas próinflamatórias como IL-12, TNF-\03B1e IFN-\03B3, assim como a indução de iNOS, estando tais níveis associados a maior destruição tecidual observada, enquanto níveis elevados de TGF-\03B2 estariam associados a desativação do macrófago e consequente estabelecimento do parasito no início da infecção. A expressão de IL-4 foi mais evidente nos linfonodos dos camundongos sensíveis. Já no baço de camundongos C57BL/10 uma expressão concomitante de TNF-\03B1e IL-10, assim como IL-12, IFN-\03B3e iNOS estavam associadas a presença de parasitos.A expressão de citocinas proinflamatórias (INF-\03B3, TNF-\03B1e IL-12) no fígado de camundongos C57BL/10 foi observada na fase inicial da infecção,enquanto citocinas regulatórias (TGF-\03B2e IL-10) na fase tardia. Os camundongos resistentes àinfecção por L. amazonensis apresentaram baixos níveis de expressão de citocinas em todos os órgãos analisados Apesar de não haver uma correlação direta na produção/expressão destas citocinas nestes órgãos, a infecção induz uma produção mista de citocinas que é independente da constituição genética do hospedeiro. Na análise da expressão de proteínasda matriz observamos uma associação entre o aumento na expressão fibronectina, colágenoI e III com a expressão de TGF-\03B2no fígado e linfonodo de C57BL/10 e C3H.He. Tal associação não foi observada na pata e no baço destes animais. A expressão de colágeno III napata, na fase tardia da infecção, estava relacionada à presença maciça de histiócitos parasitados. Altos níveis de expressão de laminina foram observados na pata de camundongos C57BL/10, 30 dias após a infecção, assim como o aumento de colágeno IV e fibronectina / In the present work L. amazonensis infection immunopathology was studied in four inbred mouse strains. With the aim of evaluate the differences in immunopathologic response between all strains, different parameters such as: cytokines analysis expression/production, in different organs and serum, parasite quantification , inflammatory infiltrate description, as well as histopathological and extracellular matrix alter ations were evaluated. The association of these analyzes showed that in the early phase of in fection, in both primary lesion and lymph nodes, the cells predominantly found in all mouse s trains were eosinophils and mast cells. A highest presence of T γδ lymphocytes, B cells, plasma cells, as well as hig h levels of antibodies were observed in L. amazonensis susceptible mice, suggesting a role of this parameters in disease susceptibility. In regard the parasite load, the more susceptible strains (C57BL/10 and CBA) showed a heavy parasite load, ma ssive tissue destruction with large lesions and metastasis, and parasite visceralizatio n. The resistant mice (C3H.He) showed few parasites and no scars or visceralization were obse rved. According to our observations, L. amazonensis immune response showed cytokines production/expres sion compartmentalization in different studied organs. T he more susceptible strains showed an increase of proinflammatory (IL-12, TNF- α and IFN- γ ) cytokines expression, as well as the iNOS induction, in the primary lesion. This enhance ment of expression was associated with tissue destruction, while high levels of TGF- β were associated with macrophages deactivation and subsequent parasite establishment in the early infection. The expression of IL-4 was more evident in susceptible mice lymph nodes. In C57BL/1 0 mice spleen a concomitant expression of TNF- α and IL-10, as well as IL-12, IFN- γ and iNOS, were associated with parasites presence. Proinflammatory cytokines (IFN- γ , TNF- α and IL-12) expression in C57BL/10 mice liver was observed in the initial phase of inf ection, whereas regulatory (TGF- β and IL- 10) cytokines were seen in the late phase. The resi stant to L. amazonensis mice showed low levels of cytokine expression in all examined organ s. Although there is not a direct association between cytokines production/expression in these organs, the L. amazonensis infection induces a mixed cytokines production that is independent of the host genetic background. The analysis of extracellular matrix pr oteins expression showed an association between FN, collagen I and III expression increase with the expression of TGF- β in the liver and lymph nodes of C57BL/10 and C3H.He mice. This a ssociation was not observed in the footpad and spleen of these animals. The footpad ex pression of collagen III in the late phase of infection was associated with the massive presen ce of parasitized histiocytes. A highest level of laminin, as well as the increase of collag en IV and fibronectin expression was observed in C57BL/10 mice footpad, 30 days after in fection.

Made available in DSpace on 2016-04-07T13:20:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 desio_oliveira_ioc_dout_2011.pdf: 1175865 bytes, checksum: f838717ed871f60759465b1b71ebee3c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A infecção pelo Trypanosoma cruzi promove alterações em órgãos linfóides. O timo apresenta-se atrofiado com depleção de células CD4+CD8+ (DP) na fase aguda. Em órgãos linfóides periféricos, os linfonodos subcutâneos (LSC) e o baço apresentam-se hipertrofiados com aumento de células T e B, enquanto os linfonodos mesentéricos (LM) apresentam-se atrofiados devido à morte dessas células. Nesse trabalho estudamos os efeitos da infecção pelo T. cruzi sobre células epiteliais tímicas (TEC) e timócitos, bem como o papel do timo no comportamento de órgãos linfóides periféricos. Em experimentos de infecção in vitro, avaliamos TEC, abordando a expressão de ligantes e receptores da matriz extracelular (ECM), e ainda, as possíveis conseqüências desse aumento de ECM sobre a interação de TEC/timócitos ou TEC/parasita. Nossos resultados demonstram que a infecção promove diminuição do número de TEC, alterações morfológicas e aumento de ECM em culturas infectadas. Observamos também que componentes da ECM são requeridos na interação entre TEC/parasita. Curiosamente, o menor crescimento de TEC em culturas infectadas está associada com a inibição do ciclo celular e não com apoptose No que se refere à interação TEC/timócitos, observamos que a adesão foi maior nas culturas infectadas, especialmente sobre TEC parasitadas. Esse aumento de adesão entre TEC/timócitos corrobora a hipótese descrita anteriormente pelo nosso grupo que a infecção favorece a migração de timócitos para periferia. Estendendo nossa análise ao compartimento linfóide do timo, investigamos a apoptose de timócitos na infecção. Observamos que a celularidade do timo diminui viii durante a infecção, juntamente com aumento de apoptose de timócitos CD4-CD8- (DN), DP, CD4 e CD8. Procurando entender a via envolvida na apoptose desses timócitos, demonstramos que a atividade de caspases total, caspase 8, caspase 9 e caspase 3 estão aumentadas na infecção. Observamos que ambas caspases iniciadoras caspase 8 (via extrínseca, Fas, TNF, TRAIL) e caspase 9 (via intrínseca, privação de fatores) parecem estar envolvidas na depleção desses timócitos Esse dado foi confirmado nos experimentos de bloqueio de morte com inibidores de caspases, onde observamos que o tratamento in vivo (injeção intratímica) e in vitro com zVAD (inibidor geral de caspases) em timócitos de animais infectados foi mais eficaz no bloqueio da morte do que os inibidores de caspase-8 (zIETD) ou caspase-9 (zLEHD). Além disso, animais infectados e tratados com zVAD apresentaram a celularidade do timo parcialmente recuperada, mais especificamente em timócitos DN e DP. Finalmente, procurando entender o papel do timo na resposta imune regional de órgãos linfóides periféricos na infecção, camundongos foram timectomizados antes da infecção para avaliação da celularidade dos LSC, LM e baço. Nossos dados demonstram que, mesmo com a ausência do timo, a hipertrofia dos LSC e a atrofia dos LM permaneciam inalterados, entretanto, encontramos significativo acúmulo de linfócitos T e B no baço de animais infectados. Em conjunto, nossos resultados demonstram que as alterações observadas no componente epitelial do microambiente tímico, assim como em timócitos de animais infectados favorecem a migração e morte destes timócitos e a atrofia desse tecido. Além disso, demonstramos que células do timo possuem papel imunoregulatório no baço durante a infecção / Trypanosoma cruzi infection promotes lymphoid organ alterations. The thymus is atroph ied with CD4 + CD8 + (DP) thymocyte depletion in the acute phase of infection. In p eripheral lymphoid organs, subcuta neous lymph nodes (LSC) and spleen present hypertrophy, with increase of T and B cells, whereas mesenteric lymph nodes (LM) are atrophied due to the death of these cells . In this work, we studied the effects of T. cruzi infec tion in thymic epithelial cells (TEC) and thymocytes , as well as the role of thymus in the behavior of peripheral lymphoid organs . In experiments of in vitro infection, we evaluated TEC, concerning the expression of extracellular matrix (ECM) ligands and receptor s , and also the possible conseq uences of ECM increase in TEC /thymocyte or TEC/parasit e intera ctions . Our data demonstrate that T. cruzi infection promotes a decrease of TEC number , morphological alterations and ECM increase in infected cultures . We observed that ECM components ar e required in the interaction between TEC and parasit es . Curiously, the decrease in TE C number in infected cultures is associated to cell cycle inhibition but not to apoptos is . Concerning TEC/thymocyte interactions, we observed that adhesion was greater in infected cultures, especially on parasitized TEC . This increase in TEC/thymocyte adhesion corroborates the hypothesis previously described by our group that the infection favors migration of thymocyte s to the periphery . Extending our analysis to th ymic ly mphoid compartment, we investigated thymocyte apoptosis following infection . We observed that thymus cellulari ty decreases during infection, together with the increase of apopt osis in CD4 - CD8 - (DN), DP, CD4 and CD8 thymocyte s. Searching to understand what death pathway is involved in thymocyte apoptosis, we demonstrated that the activity of total cas pases, caspase - 8, caspase - 9 and caspase-3 (ef f e c tor caspase ) are increased in infection . We observ ed that both initiator ca spase - 8 (extrinsic pathway, Fas, TNF , TRAIL) and caspase - 9 (intrinsic pathway, factor deprivation) seem to be involved in thymocyte deple tion. These data were confirmed in death blocking experiments with caspase inhibitors , in which w e showed that in vivo (intrat hy mic inje ction ) and in vitro treatment s with zVAD ( general caspase in hibitor ) were more effective in blocking thymocyte death than the in hibitors of caspase - 8 (zIETD) or caspase - 9 (zLEHD) separately . Moreover , infected animals treated with zVAD showed a partial recovery of thymus cellularity , more specifica lly in DN and DP thymocytes . Finally, searching to understand the role of the thymus in the regional immune response of peripheral lymphoid organs in infection , mice were t hy mectomiz e d prior to infection to evaluation of LSC, LM and spleen cellularity. Our data demonstrate d that, even in the absence of the thymus, LSC hypertrophy and LM atrophy were not altered ; however , we found a significant accumulation of T and B lymphocytes in the spleen of infected animals. Conjointl y , our results show that the alterations observed in the epithelial component of the thymus microenvironment, as well as in thymocyte s of infected animals favor the migration and death of thymocyte s and the atrophy of this tissue . Besides that , we demonstr at ed that thymic cells have an immunoregulatory role in the spleen during infection .

Made available in DSpace on 2015-10-06T13:03:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-07-24. Added 1 bitstream(s) on 2015-10-06T13:18:12Z : No. of bitstreams: 1 000848379.pdf: 743130 bytes, checksum: d77bb064fd18e5841495951287d9ff0f (MD5) / Por objetivos, estudaram-se procedimentos em cultivo celular e se eles alteram a supraorganização da matriz extracelular (MEC) amniótica e da límbica, considerando-se propriedades anisotrópicas dos biopolímeros em comum, isto é, colágenos fibrilares e proteoglicanos. Explantes límbicos de coelhos foram cultivados sobre fragmentos de membrana amniótica (MA) desepitelizada humana, por dois, sete e 15 dias. Fragmentos não cultivados de MA e de limbo foram usados como controles. Avaliaram-se parâmetros de birrefringência em fibras colágenas e de absorção e de dicroísmo linear (LD) em proteoglicanos, da MEC amniótica e da límbica. Todas as análises foram conduzidas em microscópio óptico munido de luz polarizada, filtros monocromadores com diferentes comprimentos de onda e vídeo-câmera. Empregaram-se procedimentos em análise digital de imagens (software Image J®, NIH, USA). Parâmetros de birrefringência revelaram que os graus de paralelismo das fibras colágenas amnióticas foram de 1,02 nos controles, 1,17 nas amostras cultivadas por dois dias, 1,26 nas amostras cultivadas por sete dias e de 1,17 nas amostras cultivadas por 15 dias. Relativamente às fibras límbicas, foram de 1,33, 1,17, 1,25 e 1,44. Os contrastes dos brilhos das birrefringências das fibras amnióticas foram de 2,0 nos controles, 13,25 nas amostras cultivadas por dois dias, 19,26 nas amostras cultivadas por sete dias e de 13,23 nas amostras cultivadas por 15 dias. Relativamente às fibras límbicas, foram de 23,01, 13,39, 19,90 e 30,31. Cores de interferência causadas por dispersão anômala de birrefringência foram detectadas. Procedimentos em cultivo celular alteraram parâmetros absorciométricos relacionados à supraorganização dos proteoglicanos da MEC amniótica e da límbica. As MAs de todas as amostras, exceto as cultivadas por 15 dias, apresentaram-se com valores negativos de DL. Os valores de DL dos limbos de todas as amostras, exceto... / The goal of this study was to evaluate whether procedures on cell culture alter the supraorganization of amniotic and limbal extracellular matrix (ECM). Anisotropic properties of fibrillar collagen and proteoglycans were studied, since they correspond to major extracellular biopolymers. Rabbit limbal explants were cultured on denuded human amniotic membrane (AM) for two, seven, and 15 days. Uncultured AM and limbus were used as controls. Birefringence parameters related to the supraorganization of collagen fibers, and spectral absorption and linear dichroism (LD) related to the supraorganization of proteoglycans were evaluated. All samples were evaluated on microscope equipped with polarized light, monochromatic filters with varying wavelengths, and digital video camera. Birefringence, absorbances and LD were quantified by using image analyses software (Image J®, NIH, USA). Studies on birefringence showed that parallelism degrees of amniotic collagen fibers were of 1.02 for the control group, 1.17 for the two days culture, 1.26 for the seven days culture, and 1.17 for the 15 days culture. In relation to limbal collagen fibers, parallelism degrees were of 1.33, 1.17, 1.25, and 1.44. Birefringence brightness contrasts of amniotic collagen fibers were of 2.0 for the control group, 13.25 for the two days culture, 19.26 for the seven days culture, and 13.23 for the 15 days culture. In relation to limbal collagen fibers, birefringence brightnesses were of 23.01, 13.39, 19.90, and 30.31. Interference colors due to anomalous birefringence dispersion were observed. Procedures on cell culture induced alterations in absorbance values related to proteoglycans from amniotic and limbal ECM. In all samples, except on those cultured for 15 days, the amniotic ECM showed negative DL values. The DL of limbal ECM varied between negative and positive values for all, except on two days culture

Resumo não disponível

As purinas extracelulares ATP e adenosina têm sido extensivamente estudadas em diferentes modelos e tipos celulares na modulação de várias respostas fisiológicas e patológicas. No entanto, a inosina extracelular, produto da degradação da adenosina pela Adenosina Deaminase (ADA), foi considerada por muito tempo um simples metabólito inativo. Recentemente, diversos trabalho têm demonstrado que este nucleosídeo possui importante papel na regulação de inúmeros processos. As células de Sertóli são as células somáticas dos túbulos seminíferos, e possuem fundamental importância na espermatogênese. Estas células, expressam diferentes purinoreceptores, estando estes envolvidos na regulação de diversas funções destas células relacionadas ao controle do desenvolvimento das células germinativas. No testículo, o TNF-α é produzido pelas espermátides redondas e pelos macrófagos ativados presentes no espaço intersticial. As células de Sertóli expressam os dois receptores descritos para TNF-α, TNF-RI (p55) e TNF-RII (p75), e diversos trabalhos tem descrito a modulação de diferentes funções destas células por esta citocina, incluindo a modulação da produção de NO e da fosforilação das MAPKs. Recentemente, foi descrita a modulação purinérgica da sinalização por TNF-α, bem como, a atividade ATPásica do receptor TNF-R1. Assim, nesta dissertação, foi estudado o efeito do TNF-α nos níveis das purinas extracelulares, além da possível participação purinérgica na sinalização desta citocina, em células de Sertóli em cultura. O tratamento destas células com TNF-α leva a um rápido aumento (5minutos) da concentração extracelular da inosina, que se prolonga até seis horas de incubação, sem alterar a concentração dos demais nucleotídeos e seus metabólitos. A inosina modula a produção de NO e a fosforilação das MAPKs ERK½ e p38 em células de Sertóli em cultura, aparentemente, através de diferentes mecanismos, sendo o primeiro efeito independente do receptor para adenosina A1 e o segundo efeito dependente da ativação deste receptor. Além disso, a inosina extracelular está envolvida na modulação da produção de NO e da fosforilação da MAPK ERK½ em células de Sertóli em cultura pelo TNF-α. A inibição do acúmulo de inosina estimulado pelo TNF-α através da incubação com um inibidor da adenosina deaminase cancela o aumento da produção de NO estimulada por esta citocina. Além disso, o bloqueio do receptor para adenosina A1 por antagonistas específicos impede o aumento na fosforilação da ERK½ estimulada por esta citocina. Assim, nesta dissertação, é descrito um papel intermediário da inosina extracelular na sinalização do TNF-α em células de Sertóli em cultura.