Objetivo: Avaliar o consumo de farináceos e de alimentos ricos em ácido fólico em uma amostra de mulheres em idade fértil da cidade de Porto Alegre-Brasil. Métodos: Foi realizado um estudo de prevalência com base populacional, com uma amostra de conveniência. Foi aplicado um questionário de freqüência quantitativa contendo questões relativas à classificação sócio-econômica e ao consumo de farináceos e alimentos-fonte em folato. Foram incluídas no estudo 400 mulheres entre 15 e 45 anos. Todas as participantes assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. Resultados: O consumo diário de folatos nesta população foi em média de 220,1 g. A quantidade consumida de farináceos foi de 176 g por mulher. A ingestão conjunta de alimentos-fonte de folato e de farináceos fortificados (farinha de trigo e/ou milho) foi de 404,7 g por pessoa. Conclusões: Como o consumo de ácido fólico preconizado pela RDA é de 400g/dia, incluindo tanto o folato proveniente de alimentos-fonte quanto os suplementados, a adição do ácido fólico na farinha de trigo está permitindo que o limite inferior recomendado seja atingido, não havendo, no entanto, uma garantia que esse valor se mantenha se forem computadas as perdas decorrentes do cozimento e da ação da luz UV, não consideradas neste trabalho.

A hipóxia-isquemia (HI) encefálica neonatal causa diversas seqüelas motoras e cognitivas permanentes devido à grande degeneração celular que ocorre no encéfalo dos neonatos. Esse dano é progressivo e gera atrofias visíveis em diversas estruturas encefálicas, principalmente hipocampo, estriado e córtex cerebral. Um estudo recente do nosso grupo de pesquisa mostrou que o tratamento com ácido fólico (AF) reverteu o déficit cognitivo e a diminuição da atividade da enzima Na+, K+-ATPase, em ratos submetidos à HI neonatal. Assim, buscando compreender melhor a possível eficácia do ácido fólico em tratar e/ou prevenir o dano causado pela HI neonatal, o objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos do tratamento com ácido fólico na degeneração celular na região CA1 do hipocampo dorsal 24 horas após o evento lesivo e em diferentes marcos do desenvolvimento de animais submetidos à hipóxia-isquemia neonatal. Foram utilizados ratos Wistar de ambos os sexos que foram submetidos ao modelo de Levine-Rice no 7º dia de vida pós-natal, sendo divididos em quatro grupos experimentais: 1) controle tratado com salina (CTS); 2) controle tratado com ácido fólico (CTAF); 3) HI tratado com salina (HIS); 4) HI tratado com ácido fólico (HIAF). Os animais receberam uma dose intraperitoneal de AF (0,011 μmol/g de peso corporal) 24 horas antes, imediatamente antes e 24 horas após a HI ou, diariamente, até o 14° DPN. Não foram encontradas diferenças na quantificação de células imunomarcadas para caspase-3 clivada pela técnica de imunoistoquímica, porém na avaliação da densidade celular observou-se uma diminuição de células no grupo HIS 13 quando comparado com os grupos CTAF e HIAF no hipocampo direito. Tanto na análise qualitativa quanto quantitativa da ultraestrutura dos neurônios piramidais da região CA1 hipocampal também foi possível encontrar uma importante degeneração celular nos grupos submetidos à HI neonatal, predominantemente caracterizada pelo padrão necrótico, porém no grupo tratado com AF essa degeneração foi menos expressiva. Quanto aos marcos do desenvolvimento, não verificou-se diferença nem pela lesão nem pelo tratamento. A partir desse estudo, portanto, podemos concluir que 24h após a HI ocorre diminuição da densidade celular e evidente processo lesivo ao tecido hipocampal, mais expressivamente por necrose. Ainda, a suplementação com ácido fólico foi capaz de reduzir e/ou prevenir o dano celular na região CA1 do hipocampo ipsilateral à oclusão arterial. / Neonatal hypoxia-ischemia (HI) causes diverse permanent motor and cognitive sequelae due to extensive cellular degeneration that occurs in the brain of neonates. This damage is progressive and generates visible atrophy in several brain structures, particularly the hippocampus, cerebral cortex and striatum. A recent study from our research group demonstrated that treatment with folic acid (FA) reversed cognitive deficits and decreased activity of the enzyme Na+, K+-ATPase in rats submitted to neonatal HI. Thus, in order to better understand the possible effectiveness of folic acid in recovering and / or preventing the damage caused by neonatal HI, the aim of this study was to evaluate the effects of treatment with folic acid on cell degeneration in the CA1 region of the dorsal hippocampus 24 hours after neonatal hypoxia-ischemia and at different developmental milestones of animals submitted to neonatal hypoxia-ischemia. Wistar rats of both sexes were submitted to the Levine - Rice model on the 7th postnatal day, being divided into four experimental groups: 1) control treated with saline (CTS); 2) control treated with folic acid (CTAF); 3) HI treated with saline (HIS) 4) HI treated with folic acid (HIAF). Animals received an intraperitoneal dose of FA (0.011μmol/g of body weight) 24 hours before, immediately before and 24 hours after the HI. No differences were found in the quantification of positive cells for cleaved caspase-3 by immunohistochemistry, but in the assessment of cell density was observed a decrease of cells in the HIS group when compared with the CTFA and HIFA groups in the right hippocampus. In the analysis of the ultrastructure of pyramidal neurons of the 15 hippocampal CA1 region was also possible to find an important cellular degeneration in the groups subjected to neonatal HI, predominantly characterized by necrotic pattern, but in the group treated with FA this degeneration was less expressive. As for developmental milestones, no significant difference was observed either by injury or by treatment. Concluding, 24 hours after HI occurs decreased cell density and evident degeneration process to hippocampal tissue, most significantly with death by necrosis. Yet, supplementation with folic acid was able to reduce and / or prevent cell damage in the CA1 region of the hippocampus ipsilateral to the arterial occlusion.

A Fissura Oral (FO) é uma malformação craniofacial comum na espécie humana e sua etiologia é complexa com aspectos genéticos e ambientais envolvidos na sua formação. Por ser uma malformação de prevalência variável, estudos de associação em populações distintas são necessários, principalmente em populações heterogêneas como no Brasil. A suplementação com ácido fólico está envolvida na redução do risco de recorrência para algumas malformações, mas a natureza da reação entre a ingestão do ácido fólico, a interação entre os genes da rota metabólica e o seu efeito nas concentrações de folato é pouco caracterizada. Além disso, existem poucos estudos envolvendo um grande número de genes e a suplementação com ácido fólico a longo prazo. O objetivo desse trabalho foi estudar o papel dos genes MSX1 e IRF6 e região 8q24 em indivíduos com fissuras orais não sindrômicas de diferentes regiões do Brasil e analisar o efeito da suplementação com ácido fólico e dos polimorfismos nos genes da rota metabólica do folato nos níveis de folato séricos e eritrocitários. Nossos resultados mostram associação positiva entre o alelo 4 do polimorfismo de repetição CA (MSX1) e FO, alelo A da variante rs987525 (8q24) foi associado com FL/P e o haplótipo G/A (rs2235371/rs642961) do gene IRF6 associado com o aumento do risco para FL/P. Dos 23 genes da rota metabólica do ácido fólico estudados, 5 (FPGS, FOLR1, FOLR2, SHMTI e MTHFR) foram relacionados com os níveis de folato sérico e eritrocitário. As variantes rs7033913 (FPGS), rs11235462 (FOLR1) e rs2276048 (FOLR2) foram associadas com os níveis de folato sérico após suplementação. Os polimorfismos rs2168781 e rs2461837 (SHMT1) foram relacionados com os níveis de folato eritrocitário basal e o rs1801131(MTHFR) com os níveis de folato eritrocitário durante a suplementação. Conhecer a etiologia das fissuras orais e entender os efeitos da suplementação e de variantes dos genes da rota do folato nos níveis basais de folato é essencial tanto para auxiliar no manejo clínico através de uma medicina personalizada quanto para aconselhamento genético. / Oral cleft (OC) is a common craniofacial malformation. The etiology is complex and involves genetic and environmental factors. OC have a variable prevalence and association studies are needed in different populations, especially in heterogeneous populations as the Brazilian. Folic acid supplementation reduce the recurrence risk for some malformation, but the reaction between folic acid intake, the interaction between genes of metabolic pathway and effect on folate concentrations is poorly characterized. Furthermore, there are few studies with a large number of genes and long-term folic acid supplementation. The aim was to analyze the role of MSX1 and IRF6 gene and 8q24 region in individuals with non-syndromic oral clefts in different regions of Brazil and to analyze the effect of folic acid supplementation in folate pathway genes and correlate to levels of serum and red blood cell (RBC) folate. Our results have shown a positive association between the CA repeat polymorphism 4 allele (MSX1) and OC, between rs987525 A allele (8q24) and CL/P and the G/A haplotype (rs2235371 / rs642961) of IRF6 associated with increased risk of CL/P. The 23 folate pathway genes studied, 5 (FPGS, FOLR1, FOLR2, SHMTI and MTHFR) were correlated to serum and red blood cell (RBC) folate levels. The variants rs7033913 (FPGS), rs11235462 (FOLR1) and rs2276048 (FOLR2) were associated to serum folate levels after supplementation. Polymorphisms in SHMT1 (rs2168781 and rs2461837) were associated with basal RBC folate while MTHFR (rs1801131) were associated with RBC folate levels during supplementation. Understanding of oral cleft etiology and folate gene pathway will assist clinic management and genetic counseling since folate is involved in important biologic processes.

O aborto espontâneo recorrente (AER) é definido pela ocorrência de três ou mais abortos espontâneos consecutivos com idade gestacional de até 20 semanas. O AER é um evento multifatorial, tem um índice de elucidação da causa na ordem de 50% e, mesmo com os avanços da medicina diagnóstica ainda assim 40% dos casos permanecem com sua causa desconhecida. O crescimento fetal é totalmente dependente do aporte de nutrientes oirundos da mãe, dentre esses nutrientes a cobalamina e o ácido fólico desempenham um papel fundamental para a viabilidade fetal. O objetivo geral deste estudo foi investigar se existe associação entre polimorfismos em genes relacionados ao metabolismo da cobalamina (MTHFR c.677C>T, TCN2 c. 776C>G e TCN2 c. 67A>G), e o aborto espontâneo recorrente. Os objetivos específicos deste estudo foram: 1 determinar se os polimorfismos MTHFR c. 677C>T, TCN2 c. 776C>G e TCN2 c. 67A>G estão associados ao aborto primário e secundário. 2 - Avaliar se os genótipos dos polimorfismos estudados estão relacionados com as concentrações séricas de cobalamina, folato e homocisteína total em mulheres com aborto espontâneo recorrente. Foram incluídas 256 mulheres com história de abortos espontâneos recorrentes, provenientes do Ambulatório de Obstetrícia da Clínica Obstétrica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP e 264 mulheres saudáveis, sem história de aborto espontâneo e que tenham tido pelo menos duas gestações normais (grupo controle), pareadas segundo as idades. Foram colhidas amostras de sangue para a realização das dosagens bioquímicas, hormonais e das vitaminas e também para a realização das genotipagens dos polimorfismos por meio de PCR-RPFL (MTHFR c.677C>T , TCN c.776C>G e c. 67A>G). As dosagens bioquímicas e hormonais apresentaram resultados dentro dos limites de variação do normal. Quanto as concentrações de folato e cobalamina, houve diferença estatística significante entre os grupos p<0,05. As frequências dos genótipos e alelos para os polimorfismos estudados comparadas entre os grupos abortos primário, aborto secundário e grupo controle não apresentaram diferença estatística significante. Optamos a seguir por dividir o grupo de estudo entre abortos primários, onde não existe história de feto viável, e secundário neste caso onde há história de feto viável. Desta forma foram refeitas as análises estatísticas entre os grupos e encontramos diferença estatísticamente significante p<0,05 quando confrontamos os genótipos do polimorfismo TCN c.776C>G entre o grupo primário e o grupo controle. Em conclusão, quando comparamos as frequência dos genótipos e alelos em conjunto não apresentaram associação com o AER. Quando comparado separadamente o grupo de aborto primário e grupo controle houve diferença estatística significante associando o polimorfismo TCN2 c.776C>G ao AER primário. / The recurrent spontaneous abortion (RSA) is defined by the occurrence of three or more consecutive miscarriages with gestational age up to 20 weeks. The AER is a multifactorial event, has an index of elucidating the cause of around 50% and, even with advances in diagnostic medicine still remain 40% of cases with a known cause. Fetal growth is totally dependent on the supply of nutrients from the mother oirundos among these nutrients cobalamin and folic acid play a key role in fetal viability. The aim of this study was to investigate whether there is an association between polymorphisms in genes related to metabolism of cobalamin (MTHFR c.677C> T, c TCN2. 776c> G and c TCN2. 67A> G), and recurrent miscarriage. The specific objectives of this study were: 1 determine whether MTHFR c. 677C> T, TCN2 c. 776c> G and c TCN2. 67A> G are associated with abortion primary and secondary. 2 - Assess whether the genotypes studied polymorphisms are associated with serum concentrations of cobalamin, folate and total homocysteine in women with recurrent spontaneous abortion. We included 256 women with a history of recurrent miscarriages, from the Clinic of Gynecology, Obstetrics, Hospital das Clinicas, Faculty of Medicine, USP and 264 healthy women with no history of miscarriage and have had at least two normal pregnancies (group control), matched according to age. Blood samples were collected to perform the biochemical, hormonal and vitamins and also to perform the genotyping of polymorphisms by PCR-RPFL (MTHFR c.677C> T, TCN c.776C> G and c. 67A> G). The biochemical and hormonal results presented within the limits of normal variation. As the concentrations of folate and cobalamin, statistically significant difference between groups p <0.05. The frequencies of genotypes and alleles for the polymorphisms studied compared between groups abortions primary, secondary and abortion control group showed no statistically significant difference. We chose then to divide the study group between primary abortions where there is a history of viable fetus, and secondary in this case where there is a history of viable fetus. Thus were repeated statistical analyzes between groups and found statistically significant difference p <0.05 when confronted TCN genotypes of polymorphism c.776C> G between the primary group and the control group. In conclusion, when comparing the frequency of genotypes and alleles together apresntaram no association with AER. When compared separately the group of abortion primary and control group was statistically significant associated polymorphism TCN2 c.776C> G the primary AER.

O carcinoma hepatocelular (HCC) é a 3&#170; causa de morte por neoplasias no mundo, sendo também o 5º tipo de neoplasia mais frequente. Seu tratamento limitado juntamente com o mau prognóstico tornam importante a adoção de medidas preventivas. A prevenção das etapas iniciais da hepatocarcinogênese pela administração de compostos bioativos de alimentos (CBAs) atualmente vem sendo observada em diversos estudos. Sugere-se que o processo de carcinogênese envolva alterações genéticas e epigenéticas, como a hipometilação do DNA e a desacetilação de histonas. Nesse sentido, o tratamento com ácido fólico (AF), precursor indireto de grupamento metil, e tributirina (TB), inibidora de enzimas desacetilases de histonas, quando em associação, poderia agir em adição potencializando os efeitos quimiopreventivos dos mesmos comparados às suas ações isoladas. A eventual atividade quimiopreventiva da TB (100mg/100g de peso corpóreo), do AF (0,08mg/100g de peso corpóreo), ambos com a metade da dose utilizada na literatura, e da associação entre os mesmos (AS) foi analisada durante a etapa de promoção da hepatocarcinogênese em ratos Wistar submetidos ao modelo do hepatócito resistente (HR). Para avaliação de GST-P, da proliferação celular, da apoptose, bem como a localização da histona H3K9 foi utilizada a técnica de imunohistoquímica; para a quantificação de H3K9, western blot. Em relação à análise macroscópica, os grupos tratados apresentaram menor número de nódulos em relação a MD (sem significância estatística), além de menor porcentagem de LPN menores do que 1mm nos grupos TB e AS. Na análise microscópica foi observado que os grupos TB, AF e AS apresentaram menor número de lesões pré neoplásicas persistentes (pLPN) em relação ao grupo controle isocalórico (MD, maltodextrina), assim como menor porcentagem de área ocupada por pLPN e por lesões em remodelação (rLPN). Quanto a proliferação celular, os grupos AF e AS apresentaram menor número de núcleos em fase S/mm2 quando comparados aos grupos MD e TB. Em relação à apoptose, os grupos TB e AS apresentaram maior número de hepatócitos em apoptose e corpúsculos apoptóticos/mm2 quando comparados aos grupos MD e AF. No resultado da metilação global do DNA não houve diferença entre os grupos. Em adição, os grupos AF e AS apresentaram maiores concentrações séricas de folato; o mesmo não ocorrendo para B12. No que diz respeito à acetilação de H3K9, os grupos TB e AS apresentaram maior porcentagem de acetilação quando comparados aos grupos N, MD e AF. Em conclusão, os grupos tratados com TB, AF e a associação entre eles apresentaram quimioprevenção pronunciada, sendo que o grupo AS apresentou mecanismos aditivos dos tratamentos isolados. / The hepatocellular carcinoma (HCC) is the third leading cause of death by cancer in the world, and the fifth most frequent type of neoplasm. Its limited treatment along with poor prognosis make it important to adopt preventive measures. The prevention of the initial stages of hepatocarcinogenesis by the administration of bioactive food compounds (BFCs) is currently being observed in several studies. It is suggested that the process of carcinogenesis involves genetic and epigenetic modifications, such as DNA hypomethylation and deacetylation of histones. Accordingly, treatment with folic acid (FA), indirect precursor of methyl grouping, and tributyrin (TB), a histone deacetylases inhibiting enzyme, when associated could act in addition to enhance the chemopreventive effects compared to their isolated actions. The possible chemopreventive activity of TB (100mg/100g body weight), FA (0.08 mg/100 g body weight) and the association between them (AS) were studied during the promotion stage of hepatocarcinogenesis in Wistar rats submitted to resistant hepatocyte model (RH).For evaluation of GST-P, cell proliferation, apoptosis, and the location of histone H3K9 was used immunohistochemistry, to quantify H3K9, western blot. Regarding the macroscopic analysis, the treated groups showed a lower number of nodules compared to MD (not statistically significant), and a lower percentage smaller than 1mm in groups TB and AS. Under microscopic examination the groups TB, FA and AS showed a lower number of persistent pre-neoplastic lesions (pLPN) compared to the isocaloric control group (MD, maltodextrin), as well as a lower percentage of the area occupied by pLPN and remodeling lesions (rLPN). As cell proliferation, FA and AS groups had fewer S phase nuclei/mm2 compared to MD and TB groups. Regarding apoptosis, TB and AS groups showed higher numbers of hepatocytes in apoptosis and apoptotic corpuscles/mm2 compared to MD and FA groups. Global DNA methylation did not differ between groups. In addition, AF and AS groups had higher serum concentrations of folate, which did not occur for B12.Concerning the H3K9 acetylation, the groups TB and AS showed higher percentage of acetylation when compared with the groups N, MD and FA. In conclusion, the groups treated with TB, FA and the association of both showed pronounced chemoprevention, and the AS group showed additive mechanisms compared with isolated treatments.

El desarrollo neural ocurre mediante el proceso de neurulación originando el sistema nervioso central y la médula espinal. Durante este proceso las células de la cresta neural (CCN) son especificadas en la región más dorsal del tubo neural; posteriormente, las CCN delaminan del epitelio neural, migran a diferentes regiones del embrión y se diferencian en diversos tipos celulares. Defectos en el desarrollo del tubo neural y de las CCN generan desórdenes congénitos como espina bífida, encefalocelia, y neurocristopatías (paladar-labio hendido, albinismo, entre otras). Una vitamina importante durante el desarrollo embrionario temprano es el folato, el cual se encuentra en el sistema circulatorio en forma de 5-metiltetrahidrofolato (5-MTHF) e ingresa a la célula por medio del receptor de membrana FOLR1 y el transportador RFC1. El 5-MTHF participa en la síntesis de nucleótidos y en la generación de Sadenosilmetionina (SAM) para la metilación de ácidos nucleicos y proteínas. La metilación de ácidos nucleicos y proteínas son importantes mecanismos de regulación epigenética durante el normal desarrollo embrionario de los vertebrados. Considerando lo dicho se plantea determinar el efecto epigenético de la deficiencia del folato en el desarrollo del tubo neural y de las CCN. Para esto realizamos la pérdida de función del receptor FOLR1 y transportador RFC1 mediante el uso de los morfolinos FolR1spMO y RFC1spMO en embriones de pollo. Posteriormente se evalúan los niveles de 5mC en el ADN y 6mA en el ARN mediante dot blots, observando una clara disminución en ambas marcas epigenéticas. El análisis de expresión del marcador de CCN Sox10 en embriones inyectados evidenció una disminución en el número de CCN. Adicionalmente, el marcador neural Sox2 presentó una expresión ectópica en el territorio de las CCN. Estos resultados muestran que la deficiencia de folato afecta la metilación global del ADN y ARN generando un cambio en el destino celular de los progenitores de las CCN hacia un destino neural. Los resultados obtenidos pueden sentar las bases para un mejor entendimiento y desarrollo de tratamientos capaces de prevenir o disminuir las anomalías ocasionadas por la deficiencia de folato en mujeres embarazadas. / Tesis

Throughout evolution, plants have developed a sophisticated network of signaling pathways allowing the activation and regulation of immune responses. The identification of metabolic pathways which are involved in modulating the intensity of that immune responses is an important challenge in the field of plant-pathogen interaction. With this aim, we performed two genetic approaches in Arabidopsis thaliana against the disease caused by the hemibiotroph bacterial pathogen Pseudomonas syringae DC3000. We demonstrate that the regulation of two pathways, related between them, is crucial to activate an effective immune response. By means of a genetic screening of regulators components of plant immunity, we identified the mutant scs9 (suppressor of csb3) which shows an affected resistance that triggers a enhanced susceptibility to P.s. DC3000 through an independent pathway of salicylic acid (SA)-mediated immune response. The cloning and characterization of SCS9 reveals that it codes for 2'-O-ribose tRNA methyltransferase. Our results indicate that the SCS9-mediated methylation of nucleosides N32 and N34, located in the tRNAs anticodon loop, is crucial for the plant immunity effectiveness. On the other hand, with a chemical genetic screening of agonist molecules of the immune response, we identified the sulfonamides as priming inducer molecules that exhibit a faster and/or stronger activation of SA-related defense responses and enhanced resistance to P.s. DC3000. Analysis of the mechanism of action of these molecules reveals that synthesis and accumulation of folates exert a SA-independent negative control on the immune response to P.s. DC3000. Through comparative proteomic analysis we identified the 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate homocysteine methyltransferase 1 (methione synthase, here named as METS1), enzyme responsible of the methionine synthesis in the folate-dependent 1C metabolism and overaccumulated in scs9 mutants, as modulator component in the immune response to P.s. DC3000. We observed that the overexpression of METS1 in transgenic plants of Arabidopsis suppresses plant immune responses and promotes enhanced susceptibility to P.s. DC3000. This repressor effect is due to a genome-wide increase in DNA methylation level, which is mediated by the overaccumulation of METS1 and the consequent increase of folate-dependent methionine synthesis. Therefore, the findings of this work provide a deeper knowledge about the mechanisms by which the DNA methylation and epigenetic regulation exert an influence on plant immunity through folate metabolism, particularly by METS1, whose synthesis is regulated through specific tRNA modifications mediated by SCS9. / Las plantas, a lo largo de la evolución, han desarrollado un sofisticado entramado de rutas de señalización que permiten la activación y el control de la respuesta inmune. Identificar qué procesos metabólicos participan en modular la amplitud de dicha respuesta inmune es un reto en el campo de la interacción planta-patógeno. Con este propósito, se han utilizado dos aproximaciones genéticas llevadas a cabo en Arabidopsis thaliana contra la infección por la bacteria hemibiotrofa Pseudomonas syringae DC3000. Los resultados ponen de manifiesto la importancia de la regulación de dos mecanismos, a su vez relacionados, para la activación de una respuesta inmune efectiva. Mediante un rastreo genético en busca de componentes reguladores de la inmunidad, identificamos el mutante que denominamos scs9 (supresor de csb3). scs9 muestra una resistencia afectada que conlleva un incremento en la susceptibilidad a P.s. DC3000 a través de un mecanismo independiente a la respuesta inmune mediada por ácido salicílico (SA). La clonación y caracterización de SCS9 revela que codifica una 2'-O-ribosa metiltransferasa de tRNA. Nuestros resultados indican que la modificación por metilación mediada por SCS9 de los nucleósidos N32 y N34 de la región anticodón de los tRNAs, es clave para la inmunidad de la planta. Por otro lado, mediante un rastreo de genética química en busca de moléculas agonistas de la respuesta inmune, identificamos un grupo de sulfonamidas como moléculas activadoras de un mecanismo de priming. Este conlleva una más rápida y/o más intensa activación de la respuesta defensiva dependiente de SA y de un incremento de la resistencia frente a P.s. DC3000. El análisis del mecanismo de acción de dichas moléculas revela que la síntesis y acumulación de folatos ejerce un control negativo sobre la respuesta inmune frente a P.s. DC3000; y ese control es ejercido de manera independiente a la ruta de señalización mediada por SA. A través de un análisis proteómico comparativo identificamos la proteína 5-metiltetrahidropteroiltriglutamato homocisteína metiltransferasa 1 (metionina sintasa, denominada aquí METS1), responsable de la síntesis de metionina en el metabolismo C1 dependiente de folatos y sobreacumulada en los mutantes scs9. Esta proteína participa entonces como componente modulador de la respuesta inmune a P.s. DC3000. La sobreexpresión de METS1 en plantas transgénicas observamos que suprime la respuesta inmune y conlleva a un incremento en la susceptibilidad frente a P.s. DC3000. Dicho efecto represor de la resistencia acontece a raíz de un incremento del nivel de metilación de DNA en todo el genoma mediado por la sobreacumulación de METS1 y del consiguiente posible aumento en la síntesis de metionina dependiente de folatos. Por tanto, estos resultados ahondan en el conocimiento de cómo la metilación de DNA y el control epigenético ejercen una influencia sobre la respuesta inmune. Esta influencia puede ser controlada a través del metabolismo de folatos, y en particular a través de METS1, enzima cuya síntesis está a su vez controlada por determinadas modificaciones de tRNA mediadas por SCS9. / Les plantes, al llarg de l'evolució, han desenvolupat un sofisticat entramat de rutes de senyalització que permeten l'activació i el control de la resposta immune. Identificar quins procesos metabòlics participen en la modulació de l'amplitud d'aquesta resposta immune és un repte en el camp de la interacció planta-patogen. Amb aquest propòsit, s'han utilitzat dues aproximacions genètiques en Arabidopsis thaliana en resposta a la infecció pel bacteri hemibiotrofo Pseudomonas syringae DC3000. Els resultats posen de manifest la importància de la regulació de dos mecanismes, al seu torn relacionats, per a l'activació d'una resposta immune efectiva. Mitjançant un rastreig genètic per a la recerca de components reguladors de la immunitat, es va identificar el mutant que denominem scs9 (supresor de csb3). scs9 mostra una resistència afectada que comporta un increment en la susceptibilitat a P.s. DC3000 fent ús d'un mecanisme independent a la resposta immune mediada per l'àcid salicílic (SA). La clonació i caracterització de SCS9 revela que codifica una 2'-O-ribosa metiltransferasa de tRNA. Els nostres resultats indiquen que la modificació per metilació mediada per SCS9 dels nucleòsids N32 i N34 de la regió anticodó dels tRNAs, és clau per a la immunitat de la planta. D'altra banda, per mitjà d'un rastreig de genètica química per a la recerca de molècules agonistes de la resposta immune, es va identificar un grup de sulfonamidas com a molècules activadores d'un mecanisme de priming. Aquest, comporta una més rápida i/o més intensa activació de la resposta defensiva dependent de SA i d'un increment de la resistència enfront de P.s. DC3000. L'anàlisi del mecanisme d'acció d'aquestes molècules revela que la síntesis i acumulació de folats exerceix un control negatiu sobre la resposta immune davant el bacteri P.s. DC3000; i eixe control és exercit de manera independent a la ruta de senyalització mediada per SA. Amb un anàlisi proteòmic comparatiu es va identificar la proteïna 5-metiltetrahidropteroiltriglutamato homocisteína metiltransferasa 1 (metionina sintasa, denominada ací METS1), responsable de la síntesi de metionina al metabolisme C1 dependent de folats i sobreacumulada en els mutants scs9. Aquesta, així doncs, es troba participant com a component modulador de la resposta immune a P.s. DC3000. La sobreexpressió de METS1 en plantes transgèniques suprimeix la resposta immune i comporta a un increment en la susceptibilitat per P.s. DC3000. L'efecte repressor de la resistència succeïx arran d'un increment del nivell de metilació de DNA en tot el genoma, mediat per la sobreacumulació de METS1 i del consegüent posible augment en la síntesi de metionina dependent de folats. Per tant, aquests resultats aprofundixen en el coneixement de com la metilació de DNA i el control epigenètic exerceixen una influència sobre la resposta immune. Aquesta influència pot ser controlada mitjançant el metabolisme de folats, i en particular a través de l'enzim METS1, la síntesi de la qual està al seu torn controlada per determinades modificacions de tRNA mediades per SCS9. / González García, B. (2017). Implicación de las modificaciones de tRNA y del metabolismo de los folatos en la respuesta inmune de Arabidopsis [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/86162 / TESIS

El desarrollo neural ocurre mediante el proceso de neurulación originando el sistema nervioso central y la médula espinal. Durante este proceso las células de la cresta neural (CCN) son especificadas en la región más dorsal del tubo neural; posteriormente, las CCN delaminan del epitelio neural, migran a diferentes regiones del embrión y se diferencian en diversos tipos celulares. Defectos en el desarrollo del tubo neural y de las CCN generan desórdenes congénitos como espina bífida, encefalocelia, y neurocristopatías (paladar-labio hendido, albinismo, entre otras). Una vitamina importante durante el desarrollo embrionario temprano es el folato, el cual se encuentra en el sistema circulatorio en forma de 5-metiltetrahidrofolato (5-MTHF) e ingresa a la célula por medio del receptor de membrana FOLR1 y el transportador RFC1. El 5-MTHF participa en la síntesis de nucleótidos y en la generación de Sadenosilmetionina (SAM) para la metilación de ácidos nucleicos y proteínas. La metilación de ácidos nucleicos y proteínas son importantes mecanismos de regulación epigenética durante el normal desarrollo embrionario de los vertebrados. Considerando lo dicho se plantea determinar el efecto epigenético de la deficiencia del folato en el desarrollo del tubo neural y de las CCN. Para esto realizamos la pérdida de función del receptor FOLR1 y transportador RFC1 mediante el uso de los morfolinos FolR1spMO y RFC1spMO en embriones de pollo. Posteriormente se evalúan los niveles de 5mC en el ADN y 6mA en el ARN mediante dot blots, observando una clara disminución en ambas marcas epigenéticas. El análisis de expresión del marcador de CCN Sox10 en embriones inyectados evidenció una disminución en el número de CCN. Adicionalmente, el marcador neural Sox2 presentó una expresión ectópica en el territorio de las CCN. Estos resultados muestran que la deficiencia de folato afecta la metilación global del ADN y ARN generando un cambio en el destino celular de los progenitores de las CCN hacia un destino neural. Los resultados obtenidos pueden sentar las bases para un mejor entendimiento y desarrollo de tratamientos capaces de prevenir o disminuir las anomalías ocasionadas por la deficiencia de folato en mujeres embarazadas. / Tesis

El objetivo de esta Tesis es diseñar sistemas multifuncionales que combinen funciones de diagnóstico y terapia, o teranósticos, a base de nanopartículas magnéticas (NPMs) de óxido de hierro (magnetita/maghemita) para su potencial aplicación en patologías oncológicas. Para ello se realizó un trabajo experimental que involucró la optimización de las metodologías de síntesis de las NPMs y la posterior incorporación secuencial de los distintos componentes, en conjunto con las caracterizaciones y ensayos tendientes a evaluar su funcionalidad en cada etapa. En primer término, se estudiaron las vías de síntesis de NPMs de manera de conseguir un control sobre las propiedades fisicoquímicas, y de la estabilidad de NPMs en suspensión acuosa. Se modificó la superficie de las NPMs con ácido fólico (AF) de manera de proporcionar a las NPMs selectividad para acumularse en células tumorales debido a que el receptor de folatos se encuentra sobreexpresado en células de varios tipos de cáncer. En una etapa posterior, se cargaron las NPMs modificadas con AF con fármacos oncológicos para impartir la función terapéutica. La Doxorubicina (Doxo) es uno de los agentes quimioterapéuticos más efectivos usados en el tratamiento de varios tipos de cáncer. A pesar de su gran uso, varios efectos secundarios se encuentran asociados a la distribución sistémica de este fármaco una vez administrado. Estos efectos secundarios están relacionados con la necesidad de administrar dosis elevadas del fármaco debido a la escasa selectividad y eficacia asociada con su distribución no específica en el cuerpo. Las siguientes instancias del desarrollo de este trabajo de tesis se dedicaron a evaluar las potencialidades de los agentes teranósticos para: (i) direccionamiento mediado por un campo magnético; (ii) actuar como medio de contraste en diagnóstico por imagen mediante resonancia magnética (RMI), (iii) ejercer su acción terapéutica. En el Capítulo I se introducen los conceptos básicos sobre nanotecnología, nanociencia y nanomateriales. Se describen en mayor detalle las razones por las cuales se seleccionaron las NPMs para el desarrollo de este trabajo de tesis. Dentro del conjunto de NPMs se puntualiza en las de óxido de hierro, en particular, magnetita (MAG, Fe3O4). Los métodos de síntesis de este óxido de hierro son brevemente reseñados, profundizando en la técnica de co-precipitación. Además se describen las diferentes estrategias de estabilización y funcionalización del núcleo magnético. Se resumen las aplicaciones de las NPMs en biomedicina. En este sentido, se describen las ventajas de las mismas como herramientas de diagnóstico, al actuar como agentes de contraste en RMI. También se muestran las formas de vectorización de fármacos mediante el empleo de NPMs y se enuncian las habilidades de las nanoformulaciones descriptas para actuar como agentes teranósticos. Finalmente se enumeran el objetivo general y los objetivos específicos, así como la hipótesis planteada en esta tesis. En el Capítulo II se describen los reactivos empleados y las técnicas de caracterización aplicadas a las diferentes nanoformulaciones junto con el tratamiento necesario de las muestras en cada caso. El Capítulo III se dedicó al estudio de las metodologías de síntesis, estabilización y control de la estabilidad de las NPMs de MAG. Se describen los resultados obtenidos al emplear dos métodos de síntesis: co-precipitación y su variante reducción-precipitación, con el fin de seleccionar una metodología adecuada para la obtención de NPMs de MAG en función de las aplicaciones propuestas. En base a los resultados, se seleccionó la técnica de co-precipitación como la más adecuada, y se incluyó un estudio exhaustivo de las variables experimentales asociadas a dicha técnica con el propósito de conseguir un control de las propiedades fisicoquímicas. Este análisis involucró el estudio de los mecanismos que conducen a la formación de las NPMs de MAG así como una completa caracterización y los ensayos necesarios para evaluar la estabilidad, en términos de la evolución del diámetro hidrodinámico (DH) en función del tiempo de almacenamiento en suspensión acuosa. En el Anexo I se informan los resultados que complementan a este capítulo. En el Capítulo IV se estudió la incorporación de un ligando selectivo, la vitamina B9 ó AF, a la superficie de MAG, previamente funcionalizada con 3-aminopropiltrietoxisilano (APTS). Para ello se evaluaron dos metodologías: la adsorción simple del AF y el anclaje covalente mediado por carbodiimida. Se combinaron los datos experimentales obtenidos con estudios teóricos. Esto permitió adquirir conocimientos acerca del mecanismo de interacción AF-MAG@APTS y corroborar la disponibilidad del grupo selectivo del AF posterior a su incorporación a la superficie de MAG@APTS. En una segunda instancia, se estudió la estabilidad de las nanoformulaciones obtenidas de acuerdo a dos criterios: (i) evolución del DH en función del tiempo de almacenamiento en dispersión acuosa y (ii) estudio de la capacidad de retención del AF incorporado. Finalmente, se incluye un estudio tendiente a predecir el comportamiento de las nanoformulaciones en un medio que simula el plasma sanguíneo en términos de osmolaridad, pH y contenido de proteína. En el Capítulo V se presentan y discuten los ensayos realizados para proveer a las nanoformulaciones de la acción terapéutica necesaria para constituir un agente teranóstico. La carga de la droga se realizó mediante adsorción superficial, explorando la influencia de diferentes parámetros asociados a dicho procedimiento. Se evaluó la liberación de Doxo in vitro mediante la implementación de una metodología que intenta simular la ruta que debería atravesar la nanoformulación una vez inyectada, vía intravenosa, en el torrente sanguíneo hasta su acumulación en el tumor. En el Capítulo VI se investigó la habilidad de las NPMs, presentadas en los Capítulos IV y V, para ser guiadas magnéticamente al exponerlas a un campo magnético externo mediante ensayos in vitro. Se propuso el empleo de un sistema de flujo continuo acoplado a un espectrofotómetro Uv-Visible, con el objetivo de monitorear la disminución del contenido de NPMs de la dispersión estudiada como consecuencia de la retención de las mismas por acción de un imán de NdFeB colocado en el sitio blanco. En este capítulo, se analizó además, la capacidad de las nanoformulaciones como agentes de contraste. Se determinó la eficiencia de contraste de cada formulación, comparando los valores obtenidos con los correspondientes a agentes de contrastes comerciales. En el Capítulo VII se incluyen ensayos in vitro, empleando una línea celular de cáncer colorrectal (CCR), con el fin de evaluar la capacidad del nanoteranóstico preparado de inhibir el crecimiento celular, a través de la internalización y la posterior liberación de droga en forma intracelular. En este mismo capítulo, se presentan, como complemento, los resultados correspondientes al estudio de la biocompatibilidad de las mismas nanoformulaciones utilizando un modelo animal de zebrafish. En el Anexo II se informan los resultados que complementan a este capítulo. Finalmente, en el Capítulo VIII, se puntualizan las conclusiones generales abordadas a partir de los resultados obtenidos y analizados en cada uno de los capítulos. Se definen además, los lineamientos de la proyección de futuros trabajos. / The aim of this thesis is to design multifunctional nanosystems combining the diagnostic and therapy or theranostics, based on magnetic nanoparticles (MNPs) of iron oxide (magnetite/maghemite) for their potential application in the treatment of oncological pathologies. To this end, an experimental work involving the optimization of MNPs synthetic procedures followed by a sequential incorporation of different components was performed. The synthesis of MNPs was carefully studied in order to achieve a control on their physicochemical properties and stability in aqueous suspension. The folate receptor is overexpressed in several types of tumor cells. Therefore, MNPs surface was modified with folic acid (FA) to provide them selectivity and affinity towards tumor cells. At a later stage, MNPs modified with FA were loaded with an oncological drug aiming to impart them therapeutic function. Doxorubicin (Doxo) is one of the most effective and used chemotherapeutic agents for the treatment of many types of cancer. In spite of this, several side effects are associated with the systemic distribution of this drug once administrated. These unwanted effects are related to large drug dosage, poor selectivity and low efficiency associated to the non specific distribution of drugs in the body. The following instances comprising this work were devoted to evaluate the capabilities of the theranostic agents concerning: (i) in vitro magnetic targeting, (ii) diagnostic as contrast agent for imaging magnetic resonance (MRI); (iii) therapeutic functions. In Chapter I, the fundamental concepts regarding the nanotechnology, nanoscience and nanomaterials are introduced. The abilities of MNPs to these kinds of applications are emphasized, justifying their selection for the development of this thesis. Magnetite (MAG, Fe3O4) was employed to formulate the MNPs. The methods of synthesis are briefly reviewed, highlighting the co-precipitation technique. Besides, different stabilization and functionalization strategies of the magnetic core are described. The applications of MNPs in biomedicine are summarized. Their capabilities as contrast agents in RMI, and target drug delivery are presented, as well as their potential as theranostic agents. Finally, the hypothesis followed by the general and specific objectives is defined. Chapter II describes all reagents and solvents employed in this work. Besides, the techniques used for the nanoparticles characterizations are described together with preparative treatment of the samples for each one. In Chapter III, the study of the synthesis methodologies, and stabilization of MAG are presented. Two methods of obtention are described; co-precipitation and its reduction-precipitation, both were evaluated in order to select a suitable methodology for achieving MAG. The co-precipitation technique was chosen based on the reached results. An exhaustive study of the experimental conditions associated to this methodology was included. This analysis involved the study of MAG formation mechanisms as well as a complete structural and surface characterization. The necessary tests to evaluate the stability, in terms of the evolution of the hydrodynamic diameter (HD) as a function of the storage time in aqueous suspension were performed. Complementary results are reported in Annex I. In Chapter IV the incorporation of FA to MAG surface, previously modified with APTS, was studied aiming to provide selectivity towards folate receptors. To do this, two methodologies were evaluated: simple adsorption and covalent linkage. The obtained experimental data were combined with theoretical studies to gain knowledge about the possible mechanisms to FA-MAG@APTS linkage. These data also provided evidence regarding the availability of the selective FA group after its incorporation into the MAG@APTS surface. The stability of the obtained nanoformulations was studied based on two criteria: (i) the evolution of the HD as a function of the storage time in aqueous dispersion and (ii) the study of the FA retention. Finally, a study tending to predict the behavior of nanoformulations in a medium simulating blood plasma in terms of osmolarity, pH and albumin content was developed. In this sense, the aggregation trend and the nanosystems stability were the analyzed parameters. In Chapter V, the assays devoted to provide the nanoformulations with therapeutic action are presented and discussed. The loading of the drug (Doxo) was carried out by simple adsorption. The influence of different parameters associated with the reaction was explored. The release of Doxo was analyzed by implementing an original procedure to simulate the pathways followed by MNPs once intravenously administered. In Chapter VI, the magnetic target ability of MNPs presented in Chapters IV and V, was in vitro investigated. To achieve this, a novel continuous flow system was fabricated to quantify the amount of MNPs retained in the magnet site in an environment mimicking the bloodstream. On the other hand, the efficiency of the nanosystems as selective contrast agents in MRI was analyzed using a clinical equipment. Chapter VII includes in vitro tests, using a human colorectal cancer cell line (CCR). The evaluated parameters were the MNPs internalization, cellular viability and the therapeutic action of the MNPs loaded Doxo. On the other hand, the results corresponding to biocompatibility studies of the same nanoformulations in vivo are presented. To this end an animal model, zebrafish (Danio rerio), was implemented. Complementary results are reported in Annex II. Finally, Chapter VIII lists the overall conclusions of this investigation work and establishes the guidelines for the future works.

Os folatos, vitaminas hidrossolúveis do grupo B estão envolvidos em importantes processos bioquímicos como a síntese e reparação de DNA. O metabolismo humano não é capaz de sintetizar folatos e necessita obtê-los da dieta. O ácido fólico (AF), vitâmero sintético e estável dos folatos, é usado para a fortificação de alimentos como farinha de trigo em função do baixo custo e grande biodisponibilidade. O AF compreende uma pterina, um ácido p-aminobenzóico e um ácido glutâmico. É um composto sensível, facilmente degradado em solução aquosa por luz ultravioleta e visível. O tratamento por ionização de alimentos elimina ou reduz patógenos e insetos, aumenta o tempo de estocagem e a vida de prateleira dos alimentos. A irradiação de alimentos utiliza elétrons acelerados, raios gama ou raios X. Os objetivos deste estudo foram avaliar os efeitos dos tratamentos com feixe de elétrons, térmico em estufa e em forno micro-ondas na degradação do AF em solução, suspensão e pó. Também foi desenvolvido um método de extração por solvente pressurizado do AF de farinha de trigo fortificada e de pães. Os diferentes processamentos degradaram o AF e os principais produtos de degradação foram identificados por LC/MS/MS como sendo: 6- carboxipterina (PCA), ácido p-aminobenzóico (PABA), p-aminobenzoil-L-ácido glutâmico (pABGA) e ácido pteroico (PA). Em soluções de AF irradiadas foram identificados novos radioprodutos: n-(4-nitrobenzoil)-L-ácido glutâmico (pNBGA), xantopterina (XA) e 2-amino-6-(hidroximetil)pteridina-4(1H)-one (AHMP). Uma extração completa do AF por solvente pressurizado foi realizada com sucesso em amostras de farinha de trigo fortificada e pães em apenas 15 minutos. A panificação reduziu em até 57% o teor de AF no produto final. Por outro lado, a irradiação de farinha de trigo fortificada com doses de radiação até 10 kGy não alterou o conteúdo de AF. Esta tecnologia mostrou-se eficaz para tratamento de farinha de trigo e poderia ser utilizada como medida fitossanitária. / Folates, water soluble vitamins of B group, are involved in important biochemical processes such as DNA synthesis and repair. The human metabolism is not able to synthesize folate and needs to get them from the diet. Folic acid, a synthetic and stable folate vitamer, is used in food fortification such as wheat flour due to the low cost and high bioavailability. Folic acid is composed of a pterin, the p-aminobenzoic acid and glutamate. This sensitive compound is easily degraded in aqueous solution by ultraviolet and visible light yielding various by-products. Ionizing radiation treatment of food reduces or eliminates pathogens and insects, increases food shelf life and storage. Irradiation is a food preserving process which uses accelerated electrons, gamma rays or X-rays. The objectives of this study were to evaluate the effects of electron beam treatment, heat treatment in oven and microwave in folic acid degradation in solution, in suspension and in powder. A pressurized solvent extraction method was also developed to folic acid fortified wheat flour and bread. The different processing degraded folic acid and the main degradation products were identified by LC/MS/MS as 6-carboxipterin (PCA), p-aminobenzoic acid (PABA), p-aminobenzoyl-L-glutamic acid (pABGA) and pteroic acid (PA). In irradiated folic acid solutions were identified new radioproducts: n-(4-nitrobenzoyl)-L-glutamic acid (pNBGA), xanthopterin (XA) and 2-amino-6-(hydroxymethyl)-pteridine-4(1H)-one (AHMP). A complete extraction of folic acid by pressurized solvent extraction was successfully performed on samples of fortified wheat flour and bread in just 15 minutes. Bread manufacturing reduced up to 57% folic acid content in the final product. Irradiation up to 10 kGy did not alter folic acid content of fortified wheat flour. Irradiation technology proved to be effective for the treatment of fortified wheat flour and could be used as a phytosanitary measure.