Sickle cell disease is an inherited blood cell disorder that affects about 100,000 people in the US and results in high cost of medical care exceeding $1.1 billion annually. Sickle cell patients suffer from unpredictable, painful vaso-occlusive crises. Portable, costeffective approaches for diagnosis and monitoring sickle blood activities are important for a better management of the disease and reducing the medical cost. In this research, a mobile application controlled, impedance-based flow cytometer is developed for the diagnosis of sickle cell disease. Calibration of the portable device is performed using a component of known impedance value. The preliminary test results are then compared to those obtained by a commercial benchtop impedance analyzer for further validation. With the developed portable flow cytometer, experiments are performed on two sickle cell samples and a healthy cell sample. The acquired results are subsequently analyzed with MATLAB scripts to extract single-cell level impedance information as well as statistics of different cell conditions. Significant differences in cell impedance signals are observed between sickle cells and normal cells, as well as between sickle cells under hypoxia and normoxia conditions. / Includes bibliography. / Thesis (M.S.)--Florida Atlantic University, 2018. / FAU Electronic Theses and Dissertations Collection

Micoplasmas estão difundidos pela natureza e são caracterizados por um genoma relativamente pequeno, baixo conteúdo GC e ausência de parede celular e de algumas rotas biossintéticas. Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína, capaz de colonizar o trato respiratório e seu crescimento in vitro, comparado com o de outros micoplasmas, é mais lento. Mycoplasma hyorhinis também é encontrado no trato respiratório de suínos. Devido à falta de algumas vias biossintéticas, micoplasmas são incapazes de sintetizar alguns nutrientes e componentes essenciais, sendo forçados a obtê-los do ambiente. Assim, um dos maiores empecilhos enfrentados na pesquisa e diagnóstico de micoplasma tem sido a dificuldade do cultivo in vitro. Portanto, o desenvolvimento de um meio de composição definida que sustente o crescimento celular serviria como uma ferramenta controladamente manipulável, permitindo a definição de suas vias metabólicas assim como análises genéticas. O objetivo do presente estudo foi analisar a viabilidade, taxa de crescimento e regulação gênica de M. hyopneumoniae e M. hyorhinis em diferentes meios de cultivo, assim como em diferentes condições de cultura. Neste trabalho, foi utilizado o meio Friis (1975) como meio complexo, e quatro meios definidos: (i) meio descrito para Mycoplasma pneumoniae por Yus et al. (2009); (ii) meio Yus sem adição de peptona; (iii) meio comercial CMRL e (iv) meio CMRL+ (complementado com lipídeos, aminoácidos e vitaminas). A viabilidade celular foi avaliada em todos os meios definidos e a taxa de crescimento de ambas as espécies nos cinco meios foi avaliada por citometria de fluxo. Os resultados demonstraram que a composição do meio influencia no crescimento da bactéria, uma vez que há diferença entre a concentração celular em cada meio testado. Entretanto, ambas as espécies apresentaram concentração celular semelhante em cada meio. Os resultados demonstram que, dentre os meios definidos testados, o meio CMRL+, desenvolvido no presente estudo, é o meio mais adequado, podendo ser considerado um meio de manutenção para estes microrganismos. Para a avaliação da regulação gênica através de qPCR, M. hyopneumoniae foi cultivado em meio Friis e CMRL+ sendo posteriormente submetido a condições de estresse (choque térmico e estresse oxidativo). Os resultados obtidos sugerem que M. hyopneumoniae altera seus níveis transcricionais mais rapidamente quando cultivado em meio CMRL+, provavelmente devido ao estresse duplo causado pela privação nutricional e estresse oxidativo ou choque térmico. Na condição de choque térmico, o tipo de regulação predominante diferiu entre os dois meios, enquanto que, quando submetido a estresse oxidativo, os genes apresentaram um padrão de regulação semelhante entre Friis e CMRL+. O meio de cultivo definido CMRL+ forneceu uma taxa de crescimento semelhante à do meio complexo Friis, e demonstrou presença de regulação gênica em M. hyopneumoniae em resposta à sua composição e às condições de estresse testadas. Portanto, este meio pode ser usado como uma ferramenta para o avanço da pesquisa com Mycoplasma. / Mycoplasmas are widespread in nature, and are characterized by a relative small genome, low GC content, absence of cell wall and lack of some biosynthetic pathways. Mycoplasma hyopneumoniae is the infective agent of enzootic pneumonia in swine, able to colonize the respiratory tract. Its growth is slower than other porcine mycoplasmas. Mycoplasma hyorhinis f y y . Ty y, ’ f mycoplasma that grows in culture, and its presence can frequently prevent the isolation of other Mycoplasma spp. Due to the lack of some biosynthetic pathways, mycoplasmas are incapable of synthesize some nutrients and essential compounds, being forced to obtain from the environment. Therefore, the major impediment to Mycoplasma research and laboratory diagnosis has been the difficulty of in vitro cultivation. Thus, the development of a defined medium that support mycoplasma growth would provide a tool that can be controllably manipulated to enable the definition of mycoplasmal metabolic pathways as well as genetic analysis. The aim of this work was to analyze viability, growth rate and gene regulation of M. hyopneumoniae and M. hyorhinis in different culture media, and cultivation conditions. In this work, we used Friss broth (1975) as a complex medium, and four different defined media: (i) a medium described for M. pneumoniae by Yus et al. (2009), (ii) defined Yus medium without peptone, (iii) commercial medium CMRL and (iv) CMRL+ medium (supplemented with lipids, amino acids and vitamins). All the defined media were tested towards cell viability and the growth rate of both species in the five media was assessed, through flow cytometry assay comparing between them. The results from flow cytometry assay showed that the composition of the media influences the bacterial growth, once cell concentration in each of the tested media was different. However, both species presented similar cell concentration in each media. The results demonstrate that, amongst the defined media tested, CMRL+ broth, developed in this study, b , g ’ y b . To gene regulation assessment, M. hyopneumoniae was cultivated in Friis and CMRL+ and underwent two stress conditions (heat shock and oxidative stress). Results suggest that M. hyopneumoniae alters the transcriptional levels of some genes more promptly when cultivated in CMRL+ broth, probably due to the dual stress caused by the combination of nutrients deprivation in CMRL+ broth plus heat shock or oxidative stress. In the heat shock condition, the prevailing kind of regulation differed between the two media, while when submitted to oxidative stress, genes presented similar pattern of regulation between Friis and CMRL+. CMRL+ medium provided a growth rate resembling the complex broth and M. hyopneumoniae showed to have gene expression regulation in response to its composition and to the culture conditions tested. Thus, it can be used as a tool that can be controllably manipulated enabling the definition of mycoplasmal nutritional requirements and metabolic pathways as well as genetic analysis, such as gene regulation.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:39:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Valeria Bernadete Leite Quixabeira.pdf: 764206 bytes, checksum: 26b6ac4121a88f1f850bb807362ccd51 (MD5) Previous issue date: 2009-03-12 / Flow cytometry evaluates cell properties, in so far as cells move in an isoelectrolitic solution, through a group of photomultiplying canals/philters (PMT s) of fluorescence. The applications of flow cytometry are wide, in both research laboratories and clinical laboratories. Therefore, it is important to approach, by means of quantitative analysis, the development of the applications and innovations of this technique, as well as evaluating its contribution in several fields of genetics. For this proposal, there are methodologies which permit to evaluate the scientific production in a particular field, as scientometric analyses. The objective of this work was to evaluate the trends and prospects of development in the field of genetics with the use of flow cytometry from 1991 to 2007, by means of scientometric analysis. For this proposal, a bibliographical survey was conducted in the site Thomson ISI , using the key-words flow* cytometr* and genetics* or genotype* , (the use of the asterisk permits the basis to search for words in the singular as well as in the plural) in the aforementioned years, due to the fact that they contain the summary of the articles. Different approaches of evaluation were conducted about the articles: type of research (experimental or review), countries which published about the issue, diversity and impact factor of journals, number of authors per articles, types of studied organisms and the temporal trend, study material chosen for the research through works and through organisms. As a result, it was noticed the growth in the number of publications in genetics with the use of flow cytometry, many of which developed in the USA, published in periodicals of international circulation and showing high rate of citation, diversity of journals and increase of partnerships between authors and research institutions. It was observed prominent interest in the study with humans, followed by rise in the number of works with plants, bacteria and viruses. Most of the research was conducted with the study of proteins, followed by desoxiribonucleic acid. However, in the articles published about humans, the majority was in the oncologic field, clearly showing the interest of researchers and research institutions in the development of new weapons against cancer and other diseases which devastate society. / A citometria de fluxo avalia as propriedades celulares, na medida em que as células se movem em uma solução isoeletrolítica, através de um conjunto de canais/filtros fotomultiplicadores (PMTs) de fluorescência. Devido as suas amplas aplicações, tanto em laboratórios de pesquisa quanto nos laboratórios clínicos, tornou-se importante avaliar, por meio de análise quantitativa, o desenvolvimento das aplicações e inovações desta técnica, bem como avaliar sua contribuição nas diversas áreas da genética. Desde a década de 90 foram introduzidas metodologias que permitem avaliar a produção científica em uma determinada área, como as análises cienciométricas. O objetivo deste trabalho foi o de avaliar as tendências e perspectivas do desenvolvimento no campo da genética com o uso da citometria de fluxo nos anos de 1991 a 2007 por meio de análise cienciométrica. Foi realizado um levantamento bibliográfico no sítio Thomson ISI, utilizando as palavras-chave flow* cytometr* and genetic* or genotyp*, (o uso do asterisco permite que a base busque tanto palavras no singular, quanto no plural) nos anos referidos acima, por conterem o resumo dos artigos. Foram realizadas diferentes abordagens de avaliação sobre os artigos: tipo de pesquisa (experimental ou revisão), países que publicaram sobre o tema, diversidade e fator de impacto das revistas, número de autores por artigos, tipos de organismos estudados e a tendência temporal, material de estudo escolhido para as pesquisas por trabalhos e por organismos. Como resultado, constatou-se um aumento no número de publicações em genética com o uso da citometria de fluxo, muitos dos quais desenvolvidos nos EUA, publicados em periódicos de circulação internacional e apresentando elevado índice de citação, diversidade de revistas e aumento de parcerias entre autores e instituições de pesquisa. Observou-se relevante interesse no estudo com humanos, seguido por aumento no número de trabalhos com plantas, bactérias e vírus. A maioria das pesquisas foi realizada com estudo de proteínas, seguidas por ácido desoxiribonucleico. Em humanos, a maioria dos artigos publicados foi na área de oncohematologia, evidenciando o interesse de pesquisadores e instituições de pesquisa no desenvolvimento de novas armas contra o câncer e outras doenças que assolam a sociedade.

A indoleamina - 2,3 dioxigenase (IDO) é uma enzima expressa por diversas células do organismo e, dentre suas muitas funções, atua principalmente na regulação do sistema imune. Esta se baseia no catabolismo do triptofano, cuja depleção induz uma interrupção do ciclo celular em linfócitos T, tornando-os mais sensíveis a apoptose aliado à ação de metabólitos provenientes desta reação os derivados da quinurenina que potencializariam a atividade da IDO. A presença e ativação de IDO em alguns tipos tumorais representam um dos mecanismos pelo qual as células tumorais podem se evadir do sistema imune, facilitando a indução, crescimento e progressão tumoral. O objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil epidemiológico e anatomopatológico de 21 animais portadores de neoplasias mamárias, além de verificar, pelas técnicas de imuno-histoquímica e citometria de fluxo, o número de células neoplásicas e inflamatórias que expressam IDO em cultivo celular na presença de fatores como seu substrato L- triptofano e seu inibidor competitivo 1-metil-DL-triptofano (1MT). As neoplasias malignas corresponderam a 86% dos casos e o principal diagnóstico histopatológico encontrado foi o carcinoma simples. No que concerne à idade, todos os animais apresentaram idade média igual a 10,3 ± 3,3 anos. Na análise imuno-histoquímica os resultados mostraram que todas as amostras apresentaram imunomarcação citoplasmática para IDO confinado principalmente nas células localizadas nos ductos mamários. Os resultados in vitro indicam que, após 24 horas, o grupo suplementado com L - triptofano apresentou aumento significativo da expressão de IDO nas células de carcinoma simples (49,5 ± 2,5 ) ( p ≤ 0,01 ), enquanto o grupo tratado 1 metil DL- triptofano exibiu uma diminuição significativa na expressão de IDO ( 33,8 ± 4,0) ( p ≤ 0,01). Os macrófagos e células dendríticas na área tumoral também expressaram IDO e foram susceptíveis ao efeito de 1MT. Atualmente, na medicina veterinária procura de novas estratégias e compostos para a modulação da resposta antitumoral em pequenos animais e o 1 - metil - DL - triptofano representaria um candidato potencial para uma abordagem complementar no tratamento de neoplasias mamárias / The indoleamine - 2, 3 - dioxygenase (IDO) is an enzyme expressed on many cells and among its functions acts mainly in regulation of the immune system. It relies on the tryptophan catabolism, whose depletion induces cell cycle arrest of T lymphocytes turning these cells more sensitive to apoptosis, in addition to some down-stream tryptophan-derived metabolites that would increase IDO activity. The presence and activation of IDO in some tumor types represents a mechanism by which tumor cells can evade the immune system, thus facilitating the induction and progression of tumor growth. Our aim was to evaluate 21 animals with mammary tumors and to verify, by immunohistochemistry and flow cytometry, whether these cells express IDO, and to quantify its in vitro expression on neoplastic cells under influence of IDO substrate tryptophan and IDO competitive inhibitor 1-methyl-DL-tryptophan. Malignant neoplasms accounted for 86% of the cases and the most common diagnosis was carcinoma simple. All animals were adult females, with mean age of 10.3 ±.3 years. Immunohistochemistry results showed that all samples presented cytoplasmic immunostaining for IDO confined mainly in cells located in the mammary ducts. In vitro results indicate that, after 24 hours, the group supplemented with L - tryptophan showed significant increased expression of IDO in carcinoma cells (49.5 ± 2.5) (p ≤ 0.05), while the 1MT treated group displayed an significant decreased on IDO expression (33.8 ± 4.0) (p ≤ 0.05). Macrophages and dendritic cells at the tumour site also expressed IDO and were susceptible to the effect of 1MT. Currently, veterinary medicine seeks new strategies and compounds for modulating the antitumor response in small animals and 1-methyl DLtryptophan would represent a potential candidate as a complementary approach for the treatment of mammary neoplasms

A qualidade de uma reconstrução protética depende, primordialmente, de sua integração biológica e da sua adaptação. O afastamento gengival serve para se obter espaço para o material de moldagem e também para a visualização e acesso aos limites gengivais dos preparos, que são essenciais para a confecção de próteses com uma justeza de adaptação clínica. No entanto, a inserção de um material (fio retrator ou casquete) pode romper o sistema de fibras gengivais que conectam a margem gengival à superfície do cemento causando recessão gengival. Ocasionalmente, ocorre significativa inflamação ou perda de inserção. O objetivo deste trabalho foi quantificar a resposta inflamatória decorrente das diferentes técnicas de moldagem para prótese fixa, em termos da quantidade de IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF-α, IFN-γ, presentes no fluido gengival dos dentes com necessidade protética. A amostra foi composta por 10 dentes moldados pela técnica de afastamento gengival com fio retrator e um grupo de 10 dentes moldados pela técnica do casquete. Os pacientes foram selecionados considerando-se a necessidade de prótese parcial fixa, higiene bucal satisfatória e não possuírem sinais clínicos de doença periodontal. Previamente à moldagem, uma tira de periopaper foi inserida no sulco gengival do paciente e foi mantida por 30 segundos. A coleta foi repetida 4 vezes para as faces mesiovestibular, distovestibular, mesiolingual e distolingual. Terminado o procedimento da moldagem, após 2 horas, 4 horas e 24 horas, respectivamente, foi repetido o procedimento de inserção do periopaper nos 4 sítios dos dentes. A amostra foi preparada para a citometria de fluxo (CBA - cytometric beads array). Os resultados foram analisados pelo teste de Tukey. Na análise de variância a 3 critérios, por meio da comparação entre técnica de moldagem, paciente e tempo para os valores de TNF-α, a relação tempo e paciente versus tempo foi estatisticamente significante (p?0,05). Na comparação entre a técnica de moldagem com casquete e o fio retrator, não houve superioridade entre uma técnica e outra(p?0,05). O teste Tukey para a comparação intragrupo tempo (4 tempos), independente de técnica e paciente, mostrou relevância estatística entre os períodos antes da moldagem e após 24 horas (p=0,016) e, no período entre 2 horas e 24 horas após a moldagem (p=0,06). Portanto, foi possível concluir que não existe evidência científica que demonstre alguma superioridade das técnicas estudadas. Com isso, a escolha pelo método de afastamento gengival depende da situação clínica e habilidade do profissional. / The quality of a prosthetic reconstruction depends mostly on its integration and its biological adaptation. The gingival retraction serves to provide space for the impression material and also for visualize and give access to the gingival limit of tooth preparations, which are essential for making prostheses with a reliable clinical precision fit. However, the inclusion of a material (retractor cord or acrilic resin coping) can break the system of gingival fibers that connect the gingival margin to cementum´s surface, causing gingival recession. Occasionally, inflammation or significant insertion loss occurs. The aim of this study was to quantify the inflammatory response resulting from differents impression techniques for fixed prosthodontics in terms of the quantity of IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF-α, IFN-γ, found in gingival fluid of tooths needing prosthetic restorations. The sample consisted of 10 teeth impressed by gingival retraction cord technique and a group of 10 teeth using acrilic resin coping technique. Patients were selected considering the need for fixed partial denture, good oral hygiene and absence of periodontal disease´s clinical signs. Prior taking impressions, a Periopaper strip was inserted into the gingival sulcus of patients and was maintained for 30 seconds. The collect was repeated 4 times to the mesiobuccal, distovestibular, mesiolingual and distolingual sides: After the impression procedure, collecting was repeated after 2 hours, 4 hours and 24 hours respectively. the Periopaper strip was inserted on the teeth´s four sites. The sample was prepared for flow cytometry examination (CBA - cytometric beads array). The results were evalueted by Tukey test. The 3-way analysis of variance criteria,comparing impression technique, patient and time to values of TNF-α, the relationship between time and patient versus time was statistically significant (p ? 0.05). Comparing the acrilic resin coping and retraction cord impression techniques, there was no superiority between each other (p ? 0.05). The Tukey test for intragroup comparison time (4 times) irrespective of technique and patient showed statistical significance between periods before the impression and after 24 hours (p=0,016) and the period between 2 and 24 hours after impressions (p=0,06). Therefore, it was concluded that there is no scientific evidence that exists any superiority between the techniques studied. Thus, the choice of gingival retraction method depends on the clinical situation and professional´s skills.

O plasma seminal é o constituintes não celular do sêmen suíno e contém uma série de componentes orgânicos e inorgânico que desempenham ações variadas tanto no trato reprodutivo masculino como no feminino. No entanto, este fluido de constituição complexa, exerce ações ambiguas sobre os espermatozoides suínos, pois pode atuar ao mesmo tempo de forma benéfica ou deletéria sobre a viabilidade destas células. Nesse sentido, alguns estudos sugerem que este não é o melhor meio para a conservação de espermatozoides. Desta forma o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos do plasma seminal sobre a integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial do espermatozoide suíno armazenado sob refrigeração a 17°C por 72 horas. Para tanto, foram obtidos 4 ejaculados de 6 cachaços. Em seguida o sêmen in natura foi avaliado quanto às características da motilidade pelo sistema computadorizado de análise do sêmen, morfologia espermática por contraste de interferência diferencial e concentração espermática. Após essa primeira avaliação, os ejaculados foram acondicionados em tubos cônicos de 50 mL para serem divididos em três tratamentos, a saber: não centrifugado (NC), centrifugado e com o plasma seminal retirado pós-centrifugação (CS) e centrifugado resuspendido (CR). A força de centrifugação utilizada foi de 500xg por 10 minutos. Todos os tratamentos foram submetidos à diluição em meio BTS para que se obtenha uma concentração de 30 x 106 espermatozoides por mililitro (mL). Em seguida, as amostras permaneceram por 90 minutos em temperatura ambiente e protegidas da luz antes de serem armazenadas. As doses com os diferentes tratamentos foram acondicionadas à temperatura de 17°C e foram avaliadas nos intervalos 0 (90 min pós-diluição), 24, 48 e 72 horas para os seguintes parâmetros: características da motilidade (CASA), integridade das membranas plasmática e acrossomal, estabilidade da membrana plasmática e peroxidação das membranas espermáticas (citometria de fluxo). Os tratamentos foram submetidos à análise de variância (PROC GLM), empregando-se o programa SAS (1998). Quando o principal efeito foi significativo, as médias foram comparadas pelo teste de Tukey-kramer ao nível de 5% de significância. Os resultados do presente estudo mostram que a ausência do plasma seminal foi deletéria para algumas características de motilidade, o mesmo ocorreu para a integridade das membranas plasmática e acrossomal uma vez que houve diminuição na percentagem de celulás espermáticas com membrana plasmatica integra e acrossomo integro no tratamento sem plasma seminal. A peroxidação lipídica das membranas e a manutenção da estabilidade da membrana plasmática não foram influenciadas pelo tratamento. Assim, conclui-se que a presença do plasma seminal em doses inseminantes refrigeradas por 72 h é importante para a manutenção das características de motilidade e para a integridade das membranas plasmáticas e acrossomal / The present study aimed to evaluate the effects of seminal plasma, from the rich fraction of the ejaculate, on kinetics, plasma and acrosome membrane integrity, lipid peroxidation and capacitation of extended liquid boar semen stored under refrigeration at 17° C for 72 hours. For this purpose, four ejaculates from each of six boars were used. Shortly after collection and raw semen evaluation, ejaculates were extended in BTS medium and then assigned to one of three treatments, as follows: non-washed seminal plasma (NWSP), washed-seminal plasma (WSP) centrifuged with own seminal plasma suspended (CWSSP). All treatments were evaluated for sperm motility parameters by the sperm class analyzer (SCA). Plasma and acrosome membrane integrity, lipid peroxidation and sperm capacitation were evaluated by flow cytometry at 0, 24, 48 and 72 hours post dilution. The mean percentage of sperm motility (total and progressive) were lower (p<0.05) in the WSP treatment. There was an increase (p<0.05) in the percentage of sperm with damaged acrosome and damage plasma membrane in the WSP treatment. Membrane lipid peroxidation did not differ (p>0.05) irrespective of treatment nor did sperm capacitation, which was similar (p>0.05) among treatments. Our results show that seminal plasma from the sperm rich fraction is important to maintain adequate structural and functional characteristics of extended liquid boar and should be present in seminal doses throughout the period of store

Os bovinos são considerados a maior fonte de proteína animal para o homem, razão pela qual se fazem imprescindíveis pesquisas em diversas áreas de produção desses animais com o intuito de minimizar problemas que possam interferir no desenvolvimento e produtividade dos rebanhos. Nesse cenário, o estudo da placenta e placentação tem por objetivo conhecer o desenvolvimento embrionário e suas interações fisiológicas entre o feto e o organismo materno, caracterizado pela íntima união entre eles. O estudo da placenta e placentação tem por objetivo conhecer o desenvolvimento embrionário e suas interações fisiológicas entre o feto e o organismo materno, caracterizado pela íntima união entre eles. Além disso, a falta de marcadores específicos para células placentárias bovinas e as alterações que essas células sofrem durante o progresso da gestação são as principais barreiras para a determinação do perfil morfológico celular presente na interface materno-fetal, razão pela qual seu monitoramento torna-se importante. Buscando melhor compreender essas mudanças, o presente trabalho estudou a dinâmica populacional de células de placenta bovina a fresco e em cultivo. Foram utilizadas 30 amostras de placentônios, divididos em três grupos, de acordo com o desenvolvimento da gestação, quais sejam: primeiro, segundo e terceiro trimestres (n:10 para cada terço). Células oriundas de placentônios foram examinadas a fresco e pós-cultivo durante dez dias, pela microscopia óptica, microscopia eletrônica de transmissão e citometria de fluxo. Os resultados deste trabalho demonstraram a presença de tipos morfológicos celulares distintos na dependência do progresso da gestação: células gigantes trofoblásticas binucleadas, células gigantes trofoblásticas trinucleadas, células gigantes trofoblásticas mononucleadas, células mononucleadas maiores, células mononucleadas menores e células que apresentam citoplasma amplo, contendo inúmeras vesículas em seu interior. Com a utilização da citometria de fluxo, foi possível identificar nas amostras a fresco três populações distintas em tamanho (FSC) e complexidade (SSC) no primeiro terço, cinco populações no segundo terço e duas populações no terceiro terço gestacional. As células placentárias bovinas apresentaram freqüências variáveis de acordo com o trimestre gestacional e seu tempo de cultivo. / There is a great diversity of cell types in the bovine placenta like mononucleate trophoblast giant cells, binucleate trophoblast giant cells, specialized leucocytes (uterine natural killer, uterine macrophages, etc.) and part of their characterization and function remains unknown or controversial. Besides that, some of these cells change as pregnancy progresses; thus their monitoring is very important. The lack of specific markers to bovine placental cells is a main barrier for the development of an efficient cell tracing. Alternative techniques are being used to study these cells, as well as morphologic observation by optical and electron microscopy methods. The study was carried out to establish a populational kinetics of fresh and cultured bovine placental cells by optical microscopy, by electron microscopy and flow cytometry. Bovine placentomas were sampled at the slaughterhouse from cows with different trimesters of pregnancy (n:10 each). Fragments from the cotiledonary/caruncular interface were collected and cells were mechanically dissociated and their viability was estimated by Trypan Blue exclusion. After that they were incubated (2,5x107 cells per 2 mL) in Dulbecco´s Modified Eagle Medium with 10% FBS. First of all, fresh bovine placental cells analyzed by flow cytometry in order to identity the profiles of populational cells. At the same time, smear of fresh cells was made, fixed by methanol, stained with Giemsa for optical microscopy morphologic analisys and differential counting. After this, cells were analised by flow cytometry and optical microscopy .This process was repeated on the first, fifth and tenth days of the culture. We found seven types of cell: mononucleate trophoblast giant cells, binucleate trophoblast giant cells, trinucleate trophoblast giant cells, large mononucleate cells and small mononucleate cells. The placental cells displayed different frequencies according to the gestation period and culture time length.

O projeto tem como objetivo a detecção e caracterização das células epiteliais circulantes de pacientes com carcinoma de mama no estádio III. Analisou-se a presença ou ausência destas células antes da realização de quimioterapia neoadjuvante. Para tanto, utilizou-se o sistema de enriquecimento de amostras de sangue periférico por meio da marcação intracelular imunomagnética direta, empregando-se microbeads conjugados com citoqueratina e posterior separação imunomagnética. A amostra final, com as células alvo detectadas, foi então quantificada por imunocitoquímica ou citometria de fluxo. Resultados: A reação de imunocitoquímica no sangue periférico foi negativa em todos os casos enquanto que na citometria de fluxo foi positiva em 22/23 casos analisados. Conclusão: A detecção e caracterização de células tumorais circulantes em pacientes com câncer de mama podem vir a se constituir em um novo fator prognóstico, porém, são ainda necessárias novas estratégias para melhor detectá-las. / The aim of this study was to detect and characterize carcinoma cells of patients with breast cancer with clinical stage III analyzing the presence or absence before chemotherapy by enrichment of peripheral blood with super paramagnetic microbeads, using direct Immunomagnetic labeling of intracellular 7/8 cytokeratin. For enrichment, magnetically labeled tumor cells are passed over a high-gradient magnetic positive selection column. Cytospin preparations are made after immunomagnetic enrichment and are examined immunocytochemically (ICC) using an anti-cytokeratin and quantified by flow cytometry (CMF). Results: No cytokeratin positive cells were detected in the 32 peripheral blood of patients of breast carcinoma by ICC and cytokeratin positive cells were detected in the 22 of 23 patients by CMF. Conclusion: These methods of detection and characterization breast carcinoma cells will become useful in the diagnosis and prognosis but is necessary optimization of existing methods.

O objetivo deste trabalho foi avaliar mediante testes in vitro as características espermáticas de partidas de sêmen bovino e o impacto sobre a fertilidade quando utilizadas em um programas de IATF. Foram realizados 4 experimentos que serão descritos em forma de artigos científicos. No artigo 1 comparam-se a qualidade do sêmen determinada por métodos subjetivos e objetivos para a análise espermática in vitro de partidas de sêmen bovino. Foram analisadas 80 partidas de sêmen de dois touros, através de análises convencionais (motilidade subjetiva, vigor e morfologia espermática), de acordo com os resultados foram estabelecidos 3 grupos: Alta qualidade (A), Boa qualidade (B) e Qualidade questionável (Q). Posteriormente foram analisados os resultados das análises objetivas usando sondas fluorescentes por microscopia de epifluorescência para determinar a integridade de membranas plasmática, acrossomal e potencial de membrana mitocondrial (%PIAIA); e usando o sistema computadorizado de avaliação da motilidade espermática (CASA), o efeito foi avaliado mediante ANOVA e Tukey 5%. Posteriormente, foram utilizadas 67 partidas para determinar a concordância em determinar a qualidade seminal de acordo com três métodos de avaliação seminal: (1) Análise subjetiva considerando a Motilidade subjetiva, vigor e morfologia espermática (2) Análise pelo CASA levando em consideração a MT, VCL, VSL e VAP e (3) Análise por sondas fluorescentes considerando a %PIAIA. Foram realizadas análises de correlação de Pearson e análise de concordância (significância do Kappa). No artigo 2 foram utilizadas 18 partidas de sêmen classificadas de acordo com o índice de fertilidade de cada touro em dois grupos: de Alta (n=9) e Baixa fertilidade (n=9). A classificação do escore foi proporcionada pela central com base em dados provenientes de 33.198 serviços por IATF. As partidas foram submetidas às análises convencionais, CASA, análise por sondas fluorescentes para avaliar a porcentagem de PIAIA em microscopia de epifluorescência e produção de marcadores mitocondriais por sondas fluorescentes na citometria de fluxo. Foram realizadas análises de correlação de Pearson todas as características espermáticas e os efeitos entre grupos de fertilidade foram avaliados mediante ANOVA e Tukey 5%. No artigo 3 o objetivo determinar a relação entre qualidade espermática medida pela produção de marcadores mitocondriais e integridade das estruturas espermáticas com a taxa de prenhez (TP%) resultante de um programa de inseminação artificial e tempo fixo (IATF). Neste estudo, 29 partidas de sêmen convencional usadas para inseminar 4.795 vacas da raça Nelore submetidas ao mesmo protocolo de IATF, e após o diagnóstico de prenhez foram classificadas em três grupos: Alta fertilidade (A) com TP ≥60%, Média fertilidade (M) TP entre 53,0 e 59,9% e de Baixa fertilidade (B) TP <52,2%. Doses de sêmen das mesmas partidas foram descongeladas a 37°C durante 30 segundos e submetidas às análises convencionais, CASA, análise por sondas fluorescentes para avaliar a porcentagem de PIAIA em microscopia de epifluorescência e produção de marcadores mitocondriais por sondas fluorescentes na citometria de fluxo. Foram realizadas análises de correlação de Spearman para todas as características espermáticas e os efeitos entre grupos de fertilidade foram avaliados mediante ANOVA e Tukey 5%. No artigo 4 o objetivo foi determinar as subpopulações pela morfometria espermática em partidas de sêmen com diferente escore de fertilidade. Foram utilizadas 13 partidas de sêmen de 6 touros, sendo três touros de alto escore de fertilidade (n=9) e três de baixo escore de fertilidade (n=9). Duas palhetas de cada partida foram descongeladas e uma alíquota foi depositada em formol salino (4%) e posteriormente foi feito a análise por gota húmida para aquisição de 200 imagens da cabeça espermática que foram processadas pelo programa Imagem J para determinação da morfometria, os dados foram submetidos a análise multivariada de agrupamento para formação de subpopulações pelo método de Wards e posteriormente o efeito do grupo de fertilidade foi avaliado por ANOVA e Tukey 5%. Os resultados mostraram que os marcadores da função mitocondrial são bons indicadores da função e qualidade espermática; no entanto a heterogeneidade do sêmen bovino, com subpopulações espermáticas com boa e má qualidade, varia entre touros e entre partidas do mesmo touro e gera confusão na resposta de algumas análises. Determinou-se também, que a presença de subpopulações espermáticas (SBP) com variação na morfometria da cabeça (SBP1, SBP2, SBP3 e SBP4), sendo que a SBP4 foi associada com baixo escore de fertilidade. A conclusão geral é que a qualidade seminal impacta na fertilidade in vivo em bovinos. Sendo que a morfometria da cabeça espermática e funcionalidade das mitocôndrias teve maior impacto. No entanto, todas as características de qualidade espermática devem ser avaliadas em conjunto para determinar o potencial de fertilidade de uma amostra seminal. / The objective of this study was to evaluate the sperm characteristics of bovine semen and the impact on fertility when used in an IATF program. Four experiments were carried out and described in the form of scientific articles. In article 1. We compared the semen quality determined by subjective and objective methods for the in vitro sperm analysis of bovine semen. According to the results, three groups were analyzed: high quality (A), good quality (B) and high quality (A), Questionable quality (Q). Subsequently, the results of objective analyzes using fluorescence probes by epifluorescence microscopy were analyzed to determine the integrity of plasma, acrosomal membrane and mitochondrial membrane potential (% PIAIA); And using the computerized sperm motility evaluation system (CASA), the effect was evaluated using ANOVA and Tukey 5%. Afterwards, 67 matches were used to determine the agreement to determine seminal quality according to three methods of seminal evaluation: (1) Subjective analysis considering subjective motility, vigor and sperm morphology (2) Analysis by CASA taking into consideration the TM, VCL, VSL and VAP and (3) Analysis by fluorescent probes considering % PIAIA. Pearson correlation analysis and concordance analysis (Kappa significance) were performed. In article 2, 18 sets of semen were classified according to the fertility index of each bull in two groups: High fertility (n = 9) and Low fertility (n = 9). The classification of the score was provided by the central office based on data from 33,198 services by IATF. The semen were subjected to conventional analyzes, CASA, fluorescent probe analysis to evaluate the percentage of PIAIA in epifluorescence microscopy and production of mitochondrial markers by fluorescent probes in flow cytometry. Pearson correlation analyzes were performed on all sperm characteristics and effects between fertility groups were evaluated using ANOVA and Tukey 5%. In article 3 the objective was to determine the relationship between sperm quality measured by the production of mitochondrial markers and the integrity of the spermatic structures with the pregnancy rate (TP%) resulting from an artificial insemination and fixed time (IATF) program. In this study, 29 departures of conventional semen used to inseminate 4,795 Nelore cows submitted to the same IATF protocol, and after diagnosis of pregnancy were classified into three groups: High fertility (A) with TP ≥ 60%, Average fertility ( M) TP between 53.0 and 59.9% and Low fertility (B) TP <52.2%. Semen doses of the same departures were thawed at 37 ° C for 30 seconds and subjected to conventional, CASA, fluorescent probe analysis to evaluate the percentage of PIAIA in epifluorescence microscopy and production of mitochondrial markers by fluorescent probes in flow cytometry. Spearman correlation analyzes were performed on all sperm characteristics and effects between fertility groups were evaluated using ANOVA and Tukey 5%. In article 3, 18 sets of semen were classified according to the fertility index of each bull in two groups: High (n = 9) and Low fertility (n = 9). The classification of the score was provided by the central office based on data from 33,198 services by IATF. The matches were subjected to conventional analyzes, CASA, fluorescent probe analysis to evaluate the percentage of PIAIA in epifluorescence microscopy and production of mitochondrial markers by fluorescent probes in flow cytometry. Pearson correlation analyzes were performed on all sperm characteristics and effects between fertility groups were evaluated using ANOVA and Tukey 5%. In article 4 the objective was to determine subpopulations by sperm morphometry in semen matches with different fertility scores. Seventeen sets of six bulls were used, three bulls with a high fertility score (n = 9) and three with a low fertility score (n = 9). Two straws of each set were thawed and an aliquot was deposited in saline formaldehyde (4%) and then the wet analysis was performed to acquire 200 images of the spermatic head that were processed by the Image J program to determine morphometry, the data were submitted to a multivariate cluster analysis for clusters by the Ward\'s method and later the effect of the fertility group was evaluated by ANOVA and Tukey 5%. The results showed that markers of mitochondrial function are good indicators of sperm function and quality; However, the heterogeneity of bovine semen, with good and poor quality sperm subpopulations, varies between bulls and between straws and creates confusion in the response of some analyzes. It was also determined that the presence of sperm subpopulations (SBP) with variation in head morphometry (SBP1, SBP2, SBP3 and SBP4), and SBP4 was associated with a low fertility score. The overall conclusion is that seminal quality influences in vivo fertility in cattle. Being that the morphometry of the spermatic head and functionality of the mitochondria had greater impact. However, all sperm quality characteristics should be evaluated together to determine the fertility potential of a seminal sample.

Os trabalhos na área de neuroimunomodulação vêm contribuindo de forma marcante para o entendimento da regulação/modulação das respostas adaptativas dos organismos frente ao estresse ou às doenças. A integração de modelos biológicos e psicológicos surge e torna-se cada vez mais importante para a neuroimunologia. Cada animal comunica-se com outros de sua ou de outra espécie através de mecanismos que são característicos dentro de seus respectivos grupos; sabe-se que a comunicação entre os animais pode ser visual, táctil, química e sonora. Procuramos neste trabalho identificar o(s) tipo(s) de comunicação mais relevante(s) entre camundongas saudáveis e conspecíficas doentes. Mais especificamente, avaliamos efeitos neuroimunes decorrentes da convivência por 14 dias com companheiras inoculadas com tumor ascítico de Ehrlich e buscamos caracterizar o tipo de comunicação envolvida com este processo. Os resultados obtidos mostraram que a simples convivência com um portador do tumor de Ehrlich produziu em camundongas: 1) redução do peso e celulariedade do baço; 2) redução na contagem diferencial de blastos, eritrócitos jovens e linfócitos no esplenograma; 3) redução da porcentagem de linfócitos B e T helper e na proporção CD4/CD8 no baço; 4) aumento da atividade citotóxica de células NK; 5) aumento da celulariedade total da medula; 6) aumento na contagem absoluta de blastos e redução de eritrócitos jovens e de linfócitos no mielograma; na contagem relativa observamos um aumento dos blastos; 7) aumento de células na fase G1 e redução na fase G2 do ciclo celular da medula; 8) aumento de células tumorais de Ehrlich na fase G1 e redução destas na fase G2, 9) aumento de permanência na zona animal estranho e redução de tempo na zona companheiro doente em um labirinto em T, 10) aumento de interação social; 11) redução do burst oxidativo basal de neutrófilos provenientes de animais que conviveram com dois doentes, e reversão destas alterações quanto da convivência com dois sadios. Observamos, ainda que: 12) a convivência não modificou os níveis de corticosterona dos animais desafiados ou não por contenção; 13) a ausência de contato físico não foi relevante para reverter as alterações induzidas pela convivência; 14) a falta de contato visual também não foi relevante para reverter as alterações observadas; 15) os estímulos olfativos foram relevantes para as alterações induzidas pela convivência sobre o burst oxidativo e fagocitose de neutrófilos, crescimento tumoral, alterações comportamentais, dosagem plasmática de noradrenalina e de adrenalina e níveis hipotalâmicos de noradrenalina. Em seu conjunto observamos que a convivência por 14 dias com um animal portador de um tumor de Ehrlich produziu relevantes alterações no comportamento, em parâmetros neuroquímicos e de atividade imune inata de camundongas. Nossos resultados sugerem que a percepção do odor da doente esteja diretamente relacionada com as alterações relatadas. / Several papers are showing relevant neuroimmune regulation and/or modulation during stress or diseases. The incorporation of biological and psychological models of humans conditions are of high relevance in neuroscience. Animals exhibit a variety of adaptative behaviors for communicating with conspecifics; communication between animals can be visual, tactile, chemical and sound induced. The present experiment was designed to analyze the effects induced by cohabitation with a sick cage mate and some aspects of communication between sick mice and their companions. Specifically, we analyzed some neuroimmune effects induced by cohabitation with a sick cage-mate for 14 days (mice bearing an ascitic Ehrlich tumor), looking also for the type of communication related to this process. Our results showed that cohabitation with a sick cage-mate induced, in female mice 1) decreased spleen weight and total cellullarity; 2) decreased the number of blast, young erythrocytes and lymphocytes in spleen 3) decreased percentage of B and T helper cells, and decreased proportion of CD4/CD8 cells in the spleen; 4) increased NK cells cytotoxicity; 5) increased bone marrow total celullarity; 6) increased absolute number of blasts, and decreased the number of young erythrocytes and lymphocytes; in the relative count, an increase of blast cells in bone marrow was observed; 7) increased amount of cells on G1 cellular cycle phase, and a decreased population of cells on G2 cellular cycle phase in the bone marrow; 8) increased amount of Ehrlich tumor cells in G0-G1 cellular cycle phases, and decreased population of tumor cells in S/G2/M phases; 9) increased time spent with an strange animal and decreased time spent will sick companion in a T maze and increased locomotion in this apparatus; 10) increased social interaction; 11) decreased neutrophil basal oxidative burst in animals that lived with two sick companions. We also observed that: 12) cohabitation with a sick partner was unable to modify serum corticosterone levels with or without an immobilization stress challenge; 13) physical contact was not relevant for the neuroimune changes induced by cohabitation; 14) visual cues were not relevant for the present contextual immune changes; 15) odor cues were effective mechanisms of communication used by the mice in the present experiment; because it removal abrogated or reversed the neuroimmune changes reported above for cohabitation. The present findings showed that cohabitation with an ascitic Ehrlich tumor bearing mice produced behavioral, neurochemical, and immunological changes. The present results strongly suggest that volatile compounds released by the sick companion are directly relationed to the neuroimmune changes now reported in mice for cohabitation with a sick companion.