La cholestase (altération du flux biliaire altéré) est caractérisée par la rétention des acides biliaires (AB) toxiques dans les cellules du foie: hépatocytes. Comme cette accumulation d’AB peut conduire à la cirrhose, la fibrose et finalement à l'insuffisance hépatique, la réduction de leurs niveaux et de leur toxicité est une cible importante pour les thérapies anti-cholestatiques. Le but de notre projet était donc d'identifier de nouvelles approches pharmacologiques qui stimuleraient la détoxification des AB dans les maladies cholestatiques du foie telles que la cholangite biliaire primitive (CBP) et la cholangite sclérosante primitive (CSP), 2 maladies auto-immunes du foie avec une indication commune pour une transplantation hépatique. Les activités de recherche ont porté sur le rôle des acides gras polyinsaturés oméga-3 (AGPI n-3) tels que l’acide docosahexaénoïque (ADH) et l’acide eicosapentaénoïque (AEP) dans la détoxification des AB. Ces études ont été soutenues par des techniques in vitro et in vivo pour caractériser les signatures moléculaires, cellulaires et métaboliques pertinentes à l'état cholestatique. Dans les expériences in vitro, nous avons démontré que dans le foie, les AGPI n-3 mènent d’une part, à l’inhibition de l'expression des gènes impliqués dans la synthèse et d'absorption des AB, et d’autre part à l'activation de ceux codant pour le métabolisme et l'excrétion des AB dans le foie, l'intestin et les reins. Le prétraitement à l’AEP et/ou à l’ADH atténuait de façon significative l’apoptose induite par les AB dans le foie et pourrait donc être efficace dans la protection des cellules hépatiques contre les dommages du foie induits par les AB lors de la cholestase. De plus, l’administration d’une diète riche en ADH à des souris sauvages a mené à une diminution des niveaux circulants d’AB totaux, favorisant ainsi la formation d’un profil moins toxique d’AB. Le profil transcriptomique des gènes liés aux AB a été affecté par une intervention nutritionnelle chez la souris, puisque l'expression de gènes codant pour la synthèse et de l'absorption des AB ont été inhibée, tandis que l’expression de ceux codant pour l'export et le métabolisme a été augmentée dans le foie, l’intestin et les reins. La variation interindividuelle observée dans la réponse à ces traitments limite malheureusment la portée e ces observations, mais pris dans un contexte plus large, nos données suggèrent cependant que ces effets contribuent aux effets hépato-protecteurs de l’AEP et de l’ADH contre les dommages hépatiques induits par les AB comme observé lors de situations cholestatiques. Dans la deuxième partie du projet de recherche, nous avons développé une méthode de spectrométrie de masse en mode d’acquisition « multiple reaction monitoring » (MRM-MS) pour la détection sélective et sensible de l’enzyme CYP3A4 dans les microsomes et homogénats de foies humains (normal ou provenant de patients présentant une lésion hépatique, tels que chez la CBP et la CSP). Ces études proposent de nouvelles approches pharmacologiques, qui assurent la régulation de l'homéostasie des AB dans les pathologies et des traitements cholestatiques, en plus du développement de nouveaux outils pour la quantification protéomique impliquée dans le métabolisme xéno- et endobiotique comme un indicateur de maladies du foie. / Cholestasis (impaired bile flow) is characterized by the retention of toxic bile acids (BAs) in hepatocytes. Since the BA accumulation can lead to cirrhosis, fibrosis and further to liver failure, the reduction of BA levels and toxicity is an important target for anti-cholestatic therapies. The aim of the project was therefore to identify novel pharmacological approaches stimulating BA detoxification for cholestatic liver diseases such as primary biliary cholangitis (PBC) and primary sclerosing cholangitis (PSC), 2 autoimmune liver diseases with a common indication for liver transplantation. The research activities were focused on the role of omega 3 polyunsaturated fatty acids (n-3 PUFAs) such as docosahexaenoic (DHA) and eicosapentaenoic (EPA) acids in BA detoxification. Those studies were supported by the use of in vitro and in vivo techniques to characterize molecular and cellular signatures relevant to cholestatic condition. Using in vitro experiments, we demonstrated that in the liver n-3 PUFAs inhibit the expression of genes involved in BA synthesis and uptake, while activating those encoding the proteins for BA detoxification and excretion in the liver, intestine and kidneys. EPA and/or DHA pretreatment significantly attenuated BA-induced liver apoptosis and thus could be efficient in protecting liver cells from BA-induced liver damages in cholestasis. Moreover, in mice fed a DHA-enriched diet, circulating abundance of total BAs was reduced, favoring the formation of a less toxic BA profile. The transcriptomic profile of BA-related genes was affected by nutritional intervention in mice, since the expression of genes coding for the BA synthesis and absorption was inhibited, while of those encoding for the BA export and metabolism was increased in the liver, intestine and kidneys. While the interpretation of these results remains limited due to a large inter-individual variability in the response to DHA, we hypothesize that those effects may contribute to the hepatoprotective effects of EPA and DHA against BA-induced liver damages as observed in cholestatic situation. In the second part of the research project, we developed a novel multiple reaction monitoring mass spectrometry method (MRM-MS) for the selective and sensitive detection of CYP3A4 in human liver microsomes and homogenates for CYP3A4 quantification in normal liver samples or from the patients with hepatic injury, such as PBC and PSC specimens. Overall, these studies provide novel pharmacological approaches, which ensure the regulation of BA homeostasis for cholestatic pathologies and treatments, in addition to the development of new tools for the quantification of protein involved in the xeno- and endobiotic metabolism as an indicator of liver diseases.

L’objectif de ce projet était de comprendre comment l’expression du génome influence les caractères de qualité du foie gras, tels que le poids de foie, le taux de fonte et les teneurs, en lipides et protéines, et d’identifier les mécanismes moléculaires sous-jacents. Afin de répondre à ces objectifs, nous avons dans un premier temps étudié l’expression différentielle de protéines selon les phénotypes des foies des canards mulards puis dans un second temps, nous avons entrepris d’identifier des QTL phénotypiques et protéiques (pQTL) à l’aide d’une nouvelle carte génétique composée de marqueurs SNP et microsatellites. Tout d’abord, une optimisation du dispositif expérimental a été entreprise : 3 famille F1, composées de 98 canes backcross et de leurs 294 fils mulards ont été sélectionnés pour leur contribution à des QTL existants liés à la qualité du foie gras. La première approche nous a permis de montrer que les foies ont des profils protéiques et métaboliques différents selon leur phénotype. Ainsi, les foies légers qui fondent peu, avec une faible teneur en lipides mais une forte teneur en protéines présentent un processus anabolique par la surexpression de protéines impliquées dans les métabolismes lipidiques, glucidiques, de synthèse. Au contraire, les foies lourds, fondant beaucoup, avec une forte teneur en lipides mais une faible teneur en protéines présentent des mécanismes de cytoprotection et de réponse au stress. La seconde approche nous a permis de mettre en évidence 30 QTL relatifs à des phénotypes de qualité du foie gras et 50 pQTL relatifs à différentes protéines. Sept chromosomes se démarquent par la ségrégation de plusieurs QTL et pQTL permettant d’émettre des hypothèses quant aux fonctions des gènes sous-jacents à ces QTL. Entre autres, le locus d’APL15 semble lié à la glycolyse et celui d’APL18 à des processus de survie cellulaire. L’ensemble de ces résultats permet ainsi non seulement d’identifier les voies métaboliques impliquées dans la qualité du foie, mais également d’établir un lien entre les caractères, les protéines et les loci des QTL suggérant un déterminisme génétique de ces voies métaboliques impliquées. Ces relations nécessitent d’être approfondies afin de préciser les processus et les gènes impliqués dans la qualité du foie gras. / The aim of this project was to understand how the genome expression influences liver quality traits such as liver weight, melting rate, lipid and protein rates, and to identify the molecular mechanisms underlying it. First, we studied the differential expression of proteins according to liver quality traits of mule ducks. Then we carried out detections of uni-trait and multi-traits phenotypic QTL and protein QTL using a new genetic map containing SNP and microsatellite markers. In preamble to the study, the optimization of the experimental disposal was necessary: 98 backcross dams and their 294 mule sons, composing 3 F1 families were selected because of their contribution to the likelihood of existing QTL related to foie gras quality. The first study showed that livers presented different protein and metabolic profiles according to their phenotypes. Indeed, light livers, with low melting rate, low lipid rate and high protein rate show an over-expression of proteins involved in lipid, glucid or in synthesis metabolism, suggesting an anabolism process. On the contrary, heavy livers, with high melting rate, high lipid rate and low protein rate show cytoprotection and response to stress mechanisms. The second study highlighted 30 QTL related to liver quality traits and 50 pQTL related to different proteins. In particular, 7 chromosomes segregated several QTL and pQTL, permitting to assess hypothesis on the functions of the genes underlying these QTL regions. As an example, the APL15 locus seems linked to glycolysis and the APL18 one seems linked to cell survival ones. All these results helped in identifying metabolic pathways implicated in liver quality as well as establishing a link between traits, proteins and the QTL loci, suggesting a genetic determinism of these pathways. These relationships need to be further studied in order to bring precision to the process and to determine more precisely the genes implicated in the foie gras quality traits.

Les systèmes bioartificiels de suppléance hépatique doivent permettre au patient d'attendre, soit une greffe, soit la régénération de l'organe, une fois les agents toxiques éliminés. Ces dispositifs reposent sur l'utilisation de cellules fonctionnelles dans un environnement adapté et placées dans un circuit extracorporel.<br />Dans ce travail, l'objectif a été de caractériser différentes géométries de foie bioartificiel en comparant les fonctionnalités de mêmes cellules (C3A):<br />1) lit fluidisé classique (la référence) avec des billes d'alginate de 1000 µm de diamètre<br />2) nouveau type de fluidisation avec des billes de diamètre plus faible (600 µm)<br />3) dispositifs à fibres creuses utilisés classiquement par des équipes concurrentes<br />4) système Air Lift doté d'un apport d'air permettant la circulation du fluide<br />Dans chaque système, les écoulements et les transferts de matière des nutriments et des métabolites ont été caractérisés en absence et en présence de cellules de façon expérimentale et à l'aide de modèles mathématiques.<br />Dans les cas 1 et 2, il s'est avéré que les transferts de masse étaient quasiment identiques pour les diamètres de billes 600 et 1000 µm. La viabilité et les fonctionnalités des cellules ont été étudiées sur 48h de culture montrant des résultats très satisfaisants et prouvant ainsi l'innocuité du dispositif. Dans le cas 3, différents types de fibres creuses ont été caractérisées, permettant de déduire que la membrane de porosité intermédiaire est la plus prometteuse en vue de l'application clinique. Dans le cas 4, le système Air Lift a pour avantage d'avoir un coefficient de transfert de masse plus important que dans le cas du lit fluidisé, en absence de cellules

Thesis (doctoral)--Lund University, 1995.

Th.--Méd.--Nancy 1, 1984. N°: 73.

La maladie alcoolique du foie (MAF) et l’hépatite C chronique (HCC) sont les causes les plus fréquentes de cirrhose, carcinome hépatocellulaire (CHC) et transplantation hépatique dans les pays industrialisés. La fibrose hépatique est le stigmate lésionnel de la progression de la maladie vers la cirrhose comme dans toutes les hépatopathies chroniques. Certains facteurs de risque cliniques environnementaux ont été identifiés. Toutefois, ils n’expliquent pas l’extrême variabilité individuelle de la progression de la fibrose. L’influence ethnique à développer une maladie plus sévère ainsi que les études de concordance des jumeaux mono- et di-zygotiques sur la prévalence de la cirrhose alcoolique ont suggéré l’existence de facteurs génétiques associés. Les nombreuses études de gènes candidats réalisées n’ont identifié que très peu de variants associés de manière reproductible. Pour l’HCC par exemple, le score de risque de cirrhose ou « CRS » a montré sa capacité à prédire une fibrose avancée dans diverses cohortes caucasiennes. Récemment, une étude d’association pangénomique (GWAS) dans la stéatohépatopathie non-alcoolique (NAFLD) a mis en évidence un singleton (single nucleotide polymorphism [SNP]) particulier (rs738409 C>G) dans le gène PNPLA3. Ce dernier s’est révélé être, dans diverses études, le SNP ayant l’impact le plus robuste et le plus reproductible dans cette maladie. Par ailleurs, ce même variant a également été significativement associé à la cirrhose alcoolique chez les hispaniques.<p><p>Les travaux réalisés dans le cadre de cette thèse ont permis de montrer que :<p><p>1) Le CRS avait la capacité de prédire la progression de la fibrose chez des patients caucasiens ayant une HCC dans 2 cohortes européennes indépendantes.<p><p>2) Par ailleurs, dans la MAF, nous avons répliqué chez des patients caucasiens l’association entre le SNP rs738409 dans le gène PNPLA3 et la cirrhose. Nous avons également montré pour la première fois, que l’expression de PNPLA3 était significativement diminuée chez les patients avec une fibrose plus avancée. De plus, nous avons observé dans 2 cohortes européennes que rs738409 était également associé à la prévalence du CHC.<p><p>3) Enfin, nous avons également mis en évidence l’impact de ce même SNP sur la stéatose hépatique et la fibrose dans l’HCC sans toutefois qu’il influence la réponse à la thérapie antivirale dans 3 cohortes caucasiennes indépendantes.<p><p>Ainsi de manière remarquable, un même SNP (rs738409) apparait associé à des lésions hépatiques sévères dans les trois pathologies hépatiques chroniques les plus fréquentes (la MAF, l’HCC et la NAFLD). Ceci suggère des voies pathogéniques communes de la fibrogénèse hépatique. Par ailleurs, ces travaux soulignent indirectement que les GWAS ont la capacité d’ouvrir de nouvelles voies physiopathologiques et d’identifier de nouveaux variants, gènes ou région génétiques capables de constituer de nouveaux biomarqueurs et cibles thérapeutiques dans l’HCC et la MAF. / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La muqueuse intestinale puis le foie sont en contact récurrent avec la flore microbienne issue du tube digestif. L’activation des récepteurs reconnaissant des motifs moléculaires microbiens (PRR :Pattern Recognition Receptors) constitue l’élément initial de la réponse inflammatoire de l’immunité innée et oriente le type d’activation de l’immunité adaptative. La première étape entraînera l’expression de médiateurs inflammatoire (cytokines (IL-1, IL-6, TNFα), activation de la réponse de phase aiguë) et le recrutement des cellules effectrices de l’immunité innée (neutrophiles, puis monocytes). L’équilibre entre la tolérance microbienne et l’exacerbation inflammatoire afin d’éliminer l’agent microbien et menant à la destruction tissulaire permet d’atteindre la situation d’homéostasie.<p>Si l’inflammation se perpétue, par exemple en cas de défaut de clairance de l’agent microbien ou de trouble de l’intégrité de la barrière muqueuse, l’inflammation peut devenir chronique. L’IL-6 exerce alors un rôle central dans la transition de l’immunité innée à l’immunité adaptative, en modulant différentiellement l’expression de chimiokines et l’apoptose des cellules immunes menant au remplacement de l’infiltrat neutrophilique par un infiltrat lympho-monocytaire. Par ailleurs, ce climat cytokinique particulier est propice au développement de lignées spécifiques de lymphocytes tels que les lymphocytes T CD4+ sécrétant de l’IL-17 (Th17). Ceux-ci, surtout étudiés dans les défenses anti-bactériennes et fungiques, et dans les maladies autoimmunes, ont été incriminés dans les phénomènes de cytotoxicité et de renouvellement inflammatoire par l’induction d’expression de chimiokines.<p><p>Une fois la barrière intestinale franchie, le foie est le premier organe en contact avec la flore microbienne issue de l’intestin. Certains TLRs ont été démontrés impliqués dans la physiopathologie de la stéatohépatite et dans le processus de fibrose. Ce climat constant d’exposition antigénique est associé en cas de maladie chronique du foie à une exacerbation d’expression de médiateurs infammatoires (IL-1, IL-6, TNFα).<p>Nous avons étudié la modulation d’expression des différents TLRs au cours d’un modèle de maladie alcoolique du foie chez la souris. Cette étude démontrait qu’il existait une majoration d’expression des TLR1, 2, 4, 6, 7, 8 et 9 dépendante du stress oxydatif suite à l’exposition chronique du foie à l’alcool ;celle-ci entraînant davantage de lésions hépatiques lors de l’injection des ligands respectifs de ces différents TLRs.<p>Dans ce contexte, nous avons également étudié l’expression des différentes sous-unités du récepteur à l’IL-6 au cours de deux maladies chroniques du foie chez l’homme :les maladies alcooliques du foie et l’hépatite C chronique. Nous avons mis en évidence que les taux plasmatiques d’IL-6 et de la forme soluble de gp130 augmentaient au cours des maladies chroniques du foie, de manière corrélée à la sévérité. Nous avons également démontré l’effet inhibiteur de sgp130 sur la réponse de phase aiguë dépendante du trans-signaling de l’IL-6 in vitro. Ces données suggèrent que sgp130 contribue au déficit de réponse de phase aiguë observé chez les patients atteints de cirrhose. <p><p>Par ailleurs, vu le contexte « cytokinique » chronique des maladies alcooliques du foie (IL-1 et IL-6), nous avons étudié l’activation de la voie de l’interleukine-17 et des Th17 au cours des maladies alcooliques du foie chez l’homme. Nous avons mis en évidence qu’il existait une activation de cellules circulantes sécrétant de l’IL-17 (comprenant des Th17) au cours de la cirrhose alcoolique stable. Par contre, au sein du foie, l’activation de cellules sécrétant de l’IL-17 était davantage augmentée lors de l’hépatite alcoolique. Nous avons également mis en évidence que les cellules stellées (cellules responsables de la fibrose hépatique) stimulées à l’IL-17 recrutaient les neutrophiles suite à l’expression d’IL-8 et de GROα. Cette nouvelle voie inflammatoire démontrée lors d’une maladie du foie chez l’homme met en évidence l’activation de la voie de l’IL-17 au cours des maladies alcooliques du foie et sa contribution potentielle au recrutement hépatique de neutrophiles au cours de l’hépatite alcoolique aiguë. Cette voie sera explorée dans l’avenir en termes de fonctionnalité et de potentielle cible thérapeutique. <p> <p>En conclusion, tout comme le suggère la littérature pour les maladies autoimmunes (maladie de Crohn, arthrite, sclérose en plaque), il semble que les maladies alcooliques du foie partagent avec ces dernières diverses caractéristiques inflammatoires. La flore microbienne intestinale participe à la physiopathologie des lésions hépatiques, de même que l’activation de PRR (TLR). Par ailleurs, un climat inflammatoire chronique (IL-6,…), contre-régulé par certains mécanismes (sgp130), est associé à la présence périphérique et hépatique de lymphocytes Th17. Cette dernière découverte ouvre de nouvelles perspectives dans la compréhension de la physiopathologie des maladies alcooliques du foie, et peut-être de nouvelles cibles thérapeutiques concernant l’hépatite alcoolique aiguë.<p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les objectifs de ce travail sont d'identifier les mécanismes biologiques impliqués dans le déterminisme de la variabilité de la fonte lipidique à la cuisson du foie gras de canard, et de définir des marqueurs de la fonte. Pour répondre à ces objectifs, nous avons choisi de conduire une caractérisation du tissu hépatique, selon son comportement ultérieur à la cuisson, basée sur une approche intégrée combinant de la biochimie, de la protéomique et de l'histologie. D'une part, l'expression différentielle des protéines hépatiques à l'abattage des animaux et au cours de la réfrigération, semble indiquer que le niveau de fonte pourrait être relié à des stades de développement de stéatose différents. Les animaux du groupe ‘Fonte faible' se distinguent de ceux du groupe ‘Fonte élevée' par un ‘profil d'accrétion' avec la surexpression de protéines du métabolisme énergétique par exemple, indiquant des mécanismes de synthèse et d'accumulation de lipides. A l'inverse, les animaux du groupe ‘Fonte élevée' présentent la surexpression de protéines de réponse au stress, ce qui pourrait indiquer un stade de stéatose plus avancé. Au cours de la réfrigération, la diminution globale de l'expression des protéines semble plus marquée dans le groupe ‘Fonte faible'. Dans le groupe ‘Fonte élevée', la surexpression de protéines du cytosquelette après réfrigération suggère un niveau de protéolyse plus important. D'autre part, les observations histologiques montrent des modifications de la morphologie des gouttelettes lipidiques dans le foie gras cru et au cours de la cuisson. Il semble que la fonte soit d'autant plus importante quand des fusions de gouttelettes lipidiques surviennent dans le produit cru. De plus, lors de la cuisson, les observations sur foies gras du groupe ‘Fonte élevée' révèlent une densification de la matrice non lipidique plus importante. Ces changements morphologiques et structuraux pourraient correspondre à un tissu plus fragile et donc plus sensible à la fonte lipidique. L'ensemble des résultats acquis dans ce projet permet de formuler une hypothèse sur le déterminisme biologique de la fonte lipidique même si certains mécanismes identifiés restent à confirmer. De plus, la relation entre l'aptitude à la stéatose et la qualité technologique du foie gras est une piste à explorer afin de mieux comprendre la variabilité de la fonte lipidique à la cuisson observée lors de la cuisson du foie gras de canard. / This work aims to identify the biological mechanisms involved in the determinism of variability of fat loss during cooking of duck ‘foie gras'. To achieve this objective, we carried out a characterization of liver tissue, according to its later behaviour during cooking, and based on an integrated approach combining biochemistry, proteomic and histology. On the one hand, the differential expressions of proteins early post mortem and during chilling indicate a different state of steatosis between the low and high fat loss groups. Livers with low fat loss during cooking were still in anabolic processes with regards to energy metabolism and protein synthesis, whereas livers with high fat loss during cooking developed cell protection mechanisms. The overall expression of proteins in the low ionic strength fraction was lower after chilling which revealed a down regulating effect of chilling on biological processes. In the high ionic strength fraction, the results showed an over expression after chilling of proteins from cytoskeleton and their associated proteins. This suggests that the variability of technological yield observed in processing plants could be explained by different state of ageing of fatty livers during chilling, most likely associated to different proteolytic pattern. On the other hand, the histological observations showed that, in raw livers, the lipid droplets were nearly spherical while after cooking, they were larger and lost their spherical shape. We also observed a decrease in the number of droplets after cooking, probably due to droplet fusion caused by the heat treatment. Fat loss during cooking was higher when there was more fusion of lipid droplets before cooking. Furthermore, it seemed that the effect of cooking on liver tissue was different between the two fat loss groups. These morphological modifications could mark a fragility of the tissue associated with a higher fat loss during cooking. All the results acquired in this work allowed us to draw a hypothesis on the biological determinism of cooking losses eventhough some of the identified mechanisms still need to be confirmed. The relationship between the potential to develop steatosis and the technological quality of ‘foie gras' deserves further studies in order to better understand the variability in fat loss during cooking observed in processing plants.

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