O objetivo deste estudo foi analisar as concentrações do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 (IGF1) e insulina (INS) no fluido folicular durante foliculogênese em éguas, e localizar o receptor tipo 1 de IGF (IGF1R) nas paredes foliculares. Durante a estação reprodutiva, 40 éguas mestiças enviadas para abate em matadouro, com idades variando entre 6 e 16 anos foram utilizadas. As éguas foram abatidas de forma humanitária. Os tratos reprodutivos internos foram recuperados dentro de 10 min após o abate, ovários de éguas cíclicas foram separados do resto do aparelho. As éguas foram classificadas em quatro grupos: G1 – Folículo ≤ 13,5 mm e CL identificável; G2 – Folículo de 13,6 - 22,5 mm e CL identificável; G3 – Folículo de 22,6 - 31,5 mm e CL identificável; G4 – Folículo ≥ 31,6 mm e CL difícil de identificar. O fluido folicular (FF) foi aspirado e armazenado a -80 ° C até a sua utilização. Após a punção do FF, um fragmento da porção ventral da parede folicular foi removido para realizar a imunohistoquímica para localização de receptores IGF1R. O IGF1 livre foi determinado por ensaio imunoradiométrico. A INS foi determinada por um radioimunoensaio de fase líquida. A concentração de IGF1 livre e INS no FF aumentou com o crescimento folicular (P < 0,05). O escore imunohistoquímico de IGF1R nas células da granulosa e da teca interna da parede folicular equina em diferentes grupos aumentou (P < 0,05) com aumento folicular. Concluímos que as concentrações de IGF1 livre e INS no FF e de IGF1R em paredes foliculares de éguas aumentam com o crescimento folicular durante a foliculogênese, dando evidência do papel importante do IGF1 e INS no desenvolvimento folicular, e uma interação entre ambos hormônios na fisiologia reprodutiva ovariana. Sendo a égua um modelo de pesquisa para estudos comparativos na dinâmica folicular para consideração em mulheres, a conclusão deste estudo pode ser aplicada, também, a humanos. / The aim of this study was to analyze free type 1 insulin-like growth factor (IGF1) and insulin (INS) concentrations in follicular fluid during folliculogenesis in mares, and to localize type 1 IGF receptor (IGF1R) on follicular walls. During the breeding season, 40 mixed-breed mares sent to slaughter at an abattoir, with ages ranging between 6 to 16 years were used. Mares were humanely slaughtered. Internal reproductive tracts were recovered within 10 min after slaughter; ovaries of cyclic mares were separated from the rest of the tract. Mares were categorized into four groups: G1 – Follicle ≤ 13.5 mm and CL identifiable; G2 – Follicle of 13.6 to 22.5 mm and CL identifiable; G3 – Follicle of 22.6 to 31.5 mm and CL identifiable; G4 – Follicle ≥ 31.6 mm and CL difficult to identify. The follicular fluid (FF) was aspirated and stored at -80°C until use. After puncture of the FF, a fragment of the ventral portion of the follicular wall was removed to perform immunohistochemistry to localize IGF1R receptors. Free IGF1 was determined by immunoradiometric assay. INS was determined by a liquid phase radioimmunoassay. The concentration of free IGF1 and INS in FF increased with follicle growth (P < 0.05). Immunohistochemical score of IGF1R on granulosa and internal theca cells from equine follicular wall on different groups increase (P < 0.05) with follicular raise. We conclude that free IGF1 and INS concentrations in FF and IGF1R in follicular walls of mares increase with follicular growth during folliculogenesis, giving evidence of important role of IGF1 and INS in follicular development, and an interaction between both hormones in ovarian reproductive physiology. As the mare is a model research for comparative studies in follicular dynamics for consideration in women, the conclusion of this study can be applied to humans also.

Intraovarian growth factors play a vital role in influencing the fate of ovarian follicles. They affect proliferation versus apoptosis of granulosa cells (GCs), and can influence whether small antral follicles continue their growth or undergo atresia. Transforming Growth Factor-alpha (TGFα), an oocyte-derived growth factor, is thought to regulate granulosa cell function, yet has been largely overshadowed by current interest in TGF-beta superfamily members, such as bone morphogenetic proteins (BMPs) and anti-Mullerian hormone (AMH). In the current study, effects of TGFα on bovine GC proliferation, intracellular signaling and cytokine-induced apoptosis were evaluated. Briefly, all small antral follicles (3-5mm) from bovine ovaries were aspirated and the cells were initially plated in T25 flasks containing DMEM/F12 medium, 10% FBS, and antibiotic-antimycotic, and incubated at 37 degrees Celsius in 5% CO2 for 3-4 days. Once confluent, the cells were sub-cultured to 96-, 12- or 6-well plates in serum-free conditions (insulin 100 ng/mL; transferrin 55 ng/mL; sodium selenite 6.7 pg/mL). 24-hour treatment of bovine GCs with TGFα (10 and 100ng/mL) stimulated cell proliferation compared to control (p<0.05; n = 7 ovary pairs). Cell proliferation was accompanied by a concomitant increase in mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling within 2 hours of treatment, as measured by phosphorylated ERK1/2 expression (p<0.05, n = 3 ovary pairs). These effects were entirely negated, however, by the MAPK inhibitor, U0126 (10uM, p<0.05). Additionally, pre-exposure of the bovine GCs to TGFα (100ng/mL) failed to prevent Fas Ligand (100ng/mL)-induced apoptosis, as determined by caspase 3/7 activity (P<0.05, n = 7 ovary pairs). Collectively, the results indicate TGFα stimulates proliferation of bovine GCs from small antral follicles via a MAPK/ERK-mediated mechanism, but this action alone fails to prevent apoptosis, suggesting TGFα may be incapable of promoting the persistence of follicles during the process of follicular selection and deviation.

Chez la vache le développement des techniques d’induction d’ovulations multiples et de production d’embryons est limité par la variabilité inter-individuelle de la réponse ovarienne au traitement de superovulation. Chez la femme, l’Hormone anti-Müllérienne (AMH) est le meilleur marqueur endocrinien de la réponse folliculaire au traitement de stimulation ovarienne. Les objectifs de mon travail étaient d’étudier l’AMH comme marqueur endocrinien de la réponse ovarienne à un traitement gonadotrope chez la vache et d’étudier la régulation de la production d’AMH par les cellules de granulosa. Nos résultats montrent que les concentrations plasmatiques d’AMH sont prédictives de la réponse ovulatoire à un traitement gonadotrope. Au cours du cycle, les concentrations d’AMH ont un profil en 2 temps : elles diminuent entre les chaleurs et J5 à J8, puis augmentent jusqu’aux chaleurs suivantes. Pour prédire efficacement la réponse ovulatoire, les concentrations d’AMH doivent être mesurées aux chaleurs ou après J12 du cycle. L’étude de la régulation de la production in vitro d’AMH par les cellules de granulosa montre que BMP stimule tandis que FSH inhibe la production d’AMH. / In the cow, the development of multiple ovulation and embryo transfer technologies is limited by the variability between animals in ovarian responses to superovulatory treatments. In the women, the anti-Mullerian Hormone (AMH) is the best marker of follicular response to a stimulatory treatment. The objectives of my work were to study AMH as an endocrine marker of the ovulatory response to a stimulatory treatment in the cow and to study the regulation of AMH production by granulosa cells. Our results show that plasma AMH concentrations can predict the ovulatory responses to a stimulatory treatment. During the estrous cycle, AMH concentrations have a dynamic profile in 2 steps: AMH concentrations decrease between estrus and D5 to D8 and then they increase until the next estrus. To predict in optimal conditions, AMH has to be measured at the estrus time or after D12 of the estrous cycle. In vitro, the study about regulation of AMH production by granulosa cells indicates that BMP enhances whereas FSH decreases AMH production.

Submitted by Socorro Pontes (socorrop@ufersa.edu.br) on 2017-08-21T14:18:25Z No. of bitstreams: 1 KatiaRFL_TESE.pdf: 11131110 bytes, checksum: 4a75d7853dd30ba6006c604e3f17426d (MD5) / Approved for entry into archive by Vanessa Christiane (referencia@ufersa.edu.br) on 2017-08-21T16:39:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 KatiaRFL_TESE.pdf: 11131110 bytes, checksum: 4a75d7853dd30ba6006c604e3f17426d (MD5) / Approved for entry into archive by Vanessa Christiane (referencia@ufersa.edu.br) on 2017-08-21T16:39:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 KatiaRFL_TESE.pdf: 11131110 bytes, checksum: 4a75d7853dd30ba6006c604e3f17426d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-21T16:39:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 KatiaRFL_TESE.pdf: 11131110 bytes, checksum: 4a75d7853dd30ba6006c604e3f17426d (MD5) Previous issue date: 2017-06-30 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The donkeys (Equus asinus) are individuals historically relevant for the occupation of inhospitable areas around the world, but they have been losing importance due to the modernization of urban centers and the creation of traction and cultivation technologies. Due to this fact, many donkey breeds are already extinct or passing through a rapid process of population decrease. Among these breeds, the Northeast donkey, an endemic breed in Brazil, is highlighted. One of the strategies for conservation is the use of biotechnologies that facilitate reproduction, such as the manipulation of oocytes enclosed in preantral follicles (MOEPF) that maximize the availability of oocytes for in vitro fertilization. The starting point for the use of this and other techniques are known reproductive physiology details of this breed as the characteristics of their gametes. The objective of this study was to estimate and to characterize the population of ovarian PFs derived from Northeast breed donkeys. Twenty females aging 5.1 ± 3.2 years and weighing 105.2 ± 18.6 kg were used. Animals were subjected to an ovariectomy procedure guided by laparoscopy for ovary collection. As the equines, donkey ovaries presented a kidney form and their parenchymal zone were extracted, taking the ovulation fossa as basis. Fragments of ovary were fixed in Carnoy, dehydrated in increasing Ethanol concentrations (70 to 99%), clarified using xylene and finally included in histological paraffin wax blocks. These blocks were serially sectioned on 7 μm slices at using a microtome. Every 120th slice was mounted on glass slides, stained with hematoxylin–eosin and read in inverted optical microscope. PFs presenting visible oocyte nuclei were measured at using an ocular micrometer and classified as primordial, primary or secondary. PFs were also classified and counted as morphologically normal, when containing an oocyte with regular shape and uniform cytoplasm, and organized layers of granulosa cells; or as degenerated, when the oocyte exhibited pycnotic nucleus and/or ooplasm shrinkage, and occasionally, granulosa cell layers became disorganized, detached from the basement membrane and/or included enlarged cells. The PF population was estimated by using the formula: (number of follicles × number of sections × thickness of sections)/(number of sections observed × range of oocyte nuclei diameter). The results allowed us to estimate a total population of 21,135.3 ± 10,646.1 PFs per animal. From this population, 91.3% PFs were classified as primordial, 8.2% PFs as primary, and 0.3% as secondary. multioocyte PFs were observed in all animals, and they were more frequently present in primordial follicles, representing 0.99% of total PFs counted. The estimated population was distributed between the right and left ovaries, at 54.6% and 45.4%, respectively. Most PFs were considered morphologically normal (90.2%) and the smallest, degenerate (9.8%). An inversely proportional relationship between age and follicular population was identified, similarly to the relation between weight and follicular population. In the second experiment, the ovarian tissue of animals from the same group was subjected to a vitrification procedure using dimethylsulfoxide (DMSO) and ethylene glycol (EG) as cryoprotectants in separate and associated. When comparing treatments, the use of DMSO 3M (81.7 ± 37.5%), EG 3M (83.7 ± 27.4%) and the combination of both DMSO 3M + EG 3M (81.8 ± 46.8%) allowed a greater percentage of follicular survival. When vitrified using the DMSO + EG combination, a higher percentage (62.5 ± 29.1%) of viable follicles was observed in relation to the other vitrification treatments (P <0.05). The TUNEL technique identified that all treatments tested showed DNA fragmentation in the follicular cells, except in the case of the DMSO 3M plus EG 3M treatment. When evaluating the presence of NORs, no significant differences were observed in the amount of NORs between the fresh and vitrified groups using DMSO 3M plus EG 3M (P >0.05). Thus, we concluded that the combination DMSO 3M plus EG was more efficient for the vitrification of ovarian tissue taken from Equus asinus, allowing adequate preservation of PAFS morphology, viability, DNA integrity and cell proliferative capacity. This work presented for the first time the estimate of ovarian preantral follicles in donkeys of the Northeastern breed and successful vitrification / Os jumentos (Equus asinus) são animais historicamente relevantes para a ocupação de áreas inóspitas em todo o mundo, mas tem perdido espaço devido à modernização dos centros urbanos e a mecanização agrícola e transporte motorizado. Assim, muitas raças de jumentos já foram extintas ou encontram-se em rápido processo de queda populacional, e dentre elas está a raça Nordestina, endêmica do Brasil. Uma das estratégias de conservação é o uso de biotecnologias que favoreçam a reprodução assistida, como a manipulação de oócitos inclusos em folículos pré-antrais (MOIFOPA) que maximiza a disponibilidade de oócitos para outras biotécnicas. O ponto de partida para o uso desta e outras biotécnicas é conhecer detalhes da fisiologia reprodutiva e dos gametas da espécie ou raça que se deseja manipular. O objetivo desta tese é caracterizar e conservar por meio da vitrificação a população de folículos ovarinos pré-antrais (FP) em fêmeas asininas da raça Nordestina. No primeiro experimento, dez fêmeas com idade média de 5,1 ± 3,2 anos e peso médio de 105,2 ± 18,6 kg, constituíram o grupo de estudo. As mesmas foram submetidas a procedimento de ovariectomia guiada por laparoscopia para coleta dos ovários. Assim como nos demais equídeos, os ovários das jumentas apresentam formato reniforme e suas zonas parenquimatosa, incluindo a fossa ovariana, foram extraídas. Fragmentos do ovário foram fixados com carnoy, desidratados com etanol em concentrações crescentes (70 a 99%), clarificados usando xilol e finalmente inclusos em blocos de parafina histológica. Estes blocos foram sequencialmente seccionados em micrótomo em frações de 7μm. Uma a cada 120 frações foi montada em lâminas de vidro e corada com hematoxilina-eosina e lida em microscópio ótico. Os FPs que apresentaram núcleo visível foram fotografados, mensurados com uso de software e classificados como primordiais, primários e secundários. Os FPs classificados e contados foram identificados como normais ou degenerados. A população de FPs foi estimada usando a fórmula: (número de PF observados × número total de secções × espessura das secções) dividido pelo (número de secções observadas × diâmetro médio do núcleo dos oócitos). A população média estimada foi de 21.135,3 ± 10.646,1 FPs por animal. Destes, 91,3% foram identificados como primordiais, 8,2% como folículos primários e 0,4% como secundários. Folículos com múltiplos oócitos foram observados em todos os animais, todos classificados como primordiais, representando 0,99% do total de folículos. A população de PF estimada estava distribuída entre os ovários direito e esquerdo, em 54,6% e 45,4% respectivamente. A maior parte dos PFs foi considerada morfologicamente normal (90,2%) e a menor parcela, degenerados (9,8%). Foi identificada uma relação inversamente proporcional entre a idade e a população folicular, semelhante à relação entre peso e população folicular. No segundo experimento, o tecido ovariano de jumentas foram submetidos a procedimento de vitrificação em superfície sólida usando dimetil sulfóxido (DMSO) e etileno glicol (EG), isoladamente em diferentes concentrações (3M e 6M) e associados, como agentes crioprotetores. Quando comparados aos tratamentos o uso do DMSO 3M (81,7 ± 37,5%), EG 3M (83,7 ± 27,4%) e a combinação de DMSO 3M + EG 3M (81,8 ± 46,8%) apresentaram um grande percentual de folículos morfologicamente normais. O uso do DMSO 3M + EG 3M, apresentou o maior percentual (62,5 ± 29,1%) de folículos viáveis em relação aos demais tratamentos (P <0,05). Pela técnica TUNEL, todos os tratamentos apresentaram fragmentação de DNA nas células foliculares, exceto no caso do DMSO 3M + EG 3M. Quando avaliada a presença de NORs, não foi verificada diferenças significativas entre o número de NORs no grupo controle e no tratamento DMSO 3M + EG 3M (P < 0,05). A combinação DMSO 3M e EG 3M mostrou-se mais eficiente para a vitrificação de tecido ovariano de jumentas, apresentando-se de forma adequada para a preservação da morfologia e viabilidade de folículos pré antrais, bem como a integridade do DNA e a capacidade de proliferação celular. Este trabalho apresentou de forma inédita a estimativa de folículos pré-antrais ovarianos em jumentas da raça nordestina bem como uma estratégia de criopreservação com resultados positivos / 2017-08-21

O objetivo deste estudo foi analisar as concentrações do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 (IGF1) e insulina (INS) no fluido folicular durante foliculogênese em éguas, e localizar o receptor tipo 1 de IGF (IGF1R) nas paredes foliculares. Durante a estação reprodutiva, 40 éguas mestiças enviadas para abate em matadouro, com idades variando entre 6 e 16 anos foram utilizadas. As éguas foram abatidas de forma humanitária. Os tratos reprodutivos internos foram recuperados dentro de 10 min após o abate, ovários de éguas cíclicas foram separados do resto do aparelho. As éguas foram classificadas em quatro grupos: G1 – Folículo ≤ 13,5 mm e CL identificável; G2 – Folículo de 13,6 - 22,5 mm e CL identificável; G3 – Folículo de 22,6 - 31,5 mm e CL identificável; G4 – Folículo ≥ 31,6 mm e CL difícil de identificar. O fluido folicular (FF) foi aspirado e armazenado a -80 ° C até a sua utilização. Após a punção do FF, um fragmento da porção ventral da parede folicular foi removido para realizar a imunohistoquímica para localização de receptores IGF1R. O IGF1 livre foi determinado por ensaio imunoradiométrico. A INS foi determinada por um radioimunoensaio de fase líquida. A concentração de IGF1 livre e INS no FF aumentou com o crescimento folicular (P < 0,05). O escore imunohistoquímico de IGF1R nas células da granulosa e da teca interna da parede folicular equina em diferentes grupos aumentou (P < 0,05) com aumento folicular. Concluímos que as concentrações de IGF1 livre e INS no FF e de IGF1R em paredes foliculares de éguas aumentam com o crescimento folicular durante a foliculogênese, dando evidência do papel importante do IGF1 e INS no desenvolvimento folicular, e uma interação entre ambos hormônios na fisiologia reprodutiva ovariana. Sendo a égua um modelo de pesquisa para estudos comparativos na dinâmica folicular para consideração em mulheres, a conclusão deste estudo pode ser aplicada, também, a humanos. / The aim of this study was to analyze free type 1 insulin-like growth factor (IGF1) and insulin (INS) concentrations in follicular fluid during folliculogenesis in mares, and to localize type 1 IGF receptor (IGF1R) on follicular walls. During the breeding season, 40 mixed-breed mares sent to slaughter at an abattoir, with ages ranging between 6 to 16 years were used. Mares were humanely slaughtered. Internal reproductive tracts were recovered within 10 min after slaughter; ovaries of cyclic mares were separated from the rest of the tract. Mares were categorized into four groups: G1 – Follicle ≤ 13.5 mm and CL identifiable; G2 – Follicle of 13.6 to 22.5 mm and CL identifiable; G3 – Follicle of 22.6 to 31.5 mm and CL identifiable; G4 – Follicle ≥ 31.6 mm and CL difficult to identify. The follicular fluid (FF) was aspirated and stored at -80°C until use. After puncture of the FF, a fragment of the ventral portion of the follicular wall was removed to perform immunohistochemistry to localize IGF1R receptors. Free IGF1 was determined by immunoradiometric assay. INS was determined by a liquid phase radioimmunoassay. The concentration of free IGF1 and INS in FF increased with follicle growth (P < 0.05). Immunohistochemical score of IGF1R on granulosa and internal theca cells from equine follicular wall on different groups increase (P < 0.05) with follicular raise. We conclude that free IGF1 and INS concentrations in FF and IGF1R in follicular walls of mares increase with follicular growth during folliculogenesis, giving evidence of important role of IGF1 and INS in follicular development, and an interaction between both hormones in ovarian reproductive physiology. As the mare is a model research for comparative studies in follicular dynamics for consideration in women, the conclusion of this study can be applied to humans also.

O nascimento de gêmeos na espécie humana é rodeado por muitos mistérios e, há bastante tempo, desperta a curiosidade tanto leiga quanto científica. Os estudos com gêmeos vêm contribuindo para o entendimento de diversas áreas da biologia humana; porém, aspectos epidemiológicos e etiológicos relacionados aos nascimentos gemelares em si permanecem pouco elucidados. Para além de mera curiosidade, pesquisas nessa área podem ajudar a compreender mecanismos relacionados à reprodução em geral, além de serem importantes em um contexto de saúde pública, já que a gestação gemelar representa riscos adicionais à mãe e à prole. Em países industrializados observa-se um aumento acentuado nas taxas gemelares (TGs) que parece estar relacionado ao aumento da idade materna na primeira gravidez e tecnologias de Reprodução Medicamente Assistida (RMA). No Brasil, os aspectos geográficos e sociodemográficos dos nascimentos gemelares ainda não foram profundamente estudados. Assim, este estudo objetivou responder a três questões principais relacionadas aos nascimentos de gêmeos: “Quantos?” “Onde? e “Como?”, isto é, considerando aspectos epidemiológicos e etiológicos. Para o estudo epidemiológico, desenhamos um estudo de base de dados populacional e investigamos as TGs em duas dimensões: espacial e temporal. Para isso, utilizamos dados provenientes do Sistema de Informações sobre Nascidos Vivos (SINASC) e analisamos mais de 41 milhões de nascimentos que ocorreram em todos os 5.565 municípios brasileiros entre 2001 e 2014. Encontramos uma TG nacional média de 9,41 por 1.000 nascimentos e o modelo de análise de séries temporais revelou tendência de aumento global ao longo do período estudo, mas com notáveis diferenças regionais. De fato, resultados da “Análise de Cluster e Outlier” (Anselin Local Moran’s I) revelaram concentração de municípios com altas TGs em uma área que vai do sul do Nordeste brasileiro até o Rio Grande do Sul (Global Moran Index = 0.062, P < 0.001). Além disso, encontramos correlação positiva entre o Índice de Desenvolvimento Humano (IDH) local e as TGs em diferentes cenários, sugerindo que o IDH pode ser um importante indicador de RMA no Brasil. Nossas análises também revelaram aumento de 26.42% na TG entre as mulheres com mais de 44 anos durante o período estudado. A tendência de aumento temporal encontrada para algumas regiões do país está de acordo com o que é observado em outros países industrializados, enquanto que a análise geográfica revelou duas situações bem distintas dentro do Brasil. Por sua vez, os 9 estudos acerca da etiologia dos nascimentos de gêmeos foram concentrados em investigar polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em mães de Cândido Godói (CG), uma pequena cidade do Sul do Brasil conhecida como a “Cidade dos Gêmeos”. Este título é devido à alta TG observada no município e à recorrência do traço nas famílias locais, com forte descendência europeia. Nós desenhamos um estudo caso-controle e genotipamos sete SNPs relacionados à foliculogênese (rs6166:C>T em FSHR, rs11031006:G>A próximo a FSHB, e rs17293443:T>C in SMAD3) ou a gestações de sucesso (rs1801131:T>G e rs1801133:G>A em MTHFR, rs2010963:C>G em VEGFA, e rs1800629:G>A em TNF) em 44 mães de gêmeos (casos) e 102 mães de filhos únicos (controles), todas residentes de CG. Para todos os SNPs, a distribuição das frequências alélicas e genotípicas foi similar entre casos e controles. Diferentes combinações de alelos de risco e análises haplotípicas também foram homogeneamente distribuídas entre ambos os grupos. Assim, estes resultados sugerem uma ausência de associação entre os nascimentos gemelares em CG e sete SNPs relacionados à foliculogênese ou a gestações de sucesso, mas é possível que outras variantes genéticas ligadas a ambos os processos possam estar envolvidas neste fenômeno que possui uma base genética subjacente. / The birth of twins in human species is surrounded by many mysteries and it has long aroused both lay and scientific curiosity. Studies with twins have contributed to the understanding of several areas of human biology; however, the epidemiological and etiological aspects related to twin births by themselves remain unclear. Beyond mere curiosity, research in this field may help us to understand the mechanisms related to reproduction in general, and it is important in a public health context since a twin pregnancy represents additional risks to the mother and offspring. Some countries have reported a striking increase in twinning rates (TRs), which seems to be related mainly to delayed childbearing and to Medically-Assisted Reproduction (MAR) technologies. In Brazil, the epidemiological scenario of twin births has not been studied while considering its territorial and sociodemographic magnitude. Therefore, this study aimed to answer three main questions related to twin births: "How many?", “Where” and "How?", that is, we investigated twinning in light of epidemiology and etiology. For the epidemiological study, we carried out a population-based study, investigating twin births in two dimensions: spatial and temporal. For that, we used data from Brazil’s Live Birth Information System (SINASC), and we analyzed over 41 million births that occurred in all 5,565 Brazilian municipalities between 2001 and 2014. We found an average TR of 9.41 per 1,000, and a first-order autoregressive model of time-series analysis revealed a global upward trend over time, but with important regional differences. In fact, a Cluster and Outlier Analysis (Anselin Local Moran’s I) was performed and identified clusters of high TR in an area stretching from the south of Brazil’s Northeast Region to the South Region (Global Moran Index = 0.062, P < 0.001). Furthermore, we found a positive correlation between the local Human Development Index (HDI) and TRs in different scenarios, suggesting that the HDI may be an important proxy indicator of MAR in Brazil. We also found a sharp increase (26.42%) in TR in women aged over 44 years. The upward temporal trend in TRs is in line with recent observations from other countries, whereas the spatial analysis revealed two very different realities within our country. In turn, studies on the etiology of twin births were focused on single nucleotide polymorphisms (SNPs) in mothers from Cândido Godói (CG), a small southern Brazilian city known as the "Twin’s Town”. This title is due to the high TR attributed to the municipality and to the recurrence of the twin trait through the 11 local families, who have a strong European descent. We performed a case-control study and genotyped seven SNPs related to folliculogenesis (rs6166:C>T in FSHR, rs11031006:G>A near FSHB, and rs17293443:T>C in SMAD3) and to a successful pregnancy (rs1801131:T>G and rs1801133:G>A in MTHFR, rs2010963:C>G in VEGFA, and rs1800629:G>A in TNF) in 44 mothers of twins (cases) and 102 mothers of singletons (controls), all of them from CG. For all SNPs, the distributions of the genotypic and allelic frequencies were similar between the cases and controls. Different combinations of risk alleles and haplotypic analyses were also homogeneously distributed between both groups. Thus, these results suggest a lack of association between twin births in CG and seven SNPs related to folliculogenesis or successful pregnancies, but it is possible that other genetic variants linked to both processes may be involved in this phenomenon, which has an underlying genetic basis.

Submitted by Dianelli Lisboa Caun null (dianellicaun@gmail.com) on 2016-03-31T03:58:32Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Mestrado _ Dianelli Lisboa Caun!.pdf: 3828104 bytes, checksum: 90229c28752bb69884ad8a4a0b1595eb (MD5) / Rejected by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: No campo “Versão a ser disponibilizada online imediatamente” foi informado que seria disponibilizado o texto completo porém no campo “Data para a disponibilização do texto completo” foi informado que o texto completo deverá ser disponibilizado apenas 6 meses após a defesa. Caso opte pela disponibilização do texto completo apenas 6 meses após a defesa selecione no campo “Versão a ser disponibilizada online imediatamente” a opção “Texto parcial”. Esta opção é utilizada caso você tenha planos de publicar seu trabalho em periódicos científicos ou em formato de livro, por exemplo e fará com que apenas as páginas pré-textuais, introdução, considerações e referências sejam disponibilizadas. Se optar por disponibilizar o texto completo de seu trabalho imediatamente selecione no campo “Data para a disponibilização do texto completo” a opção “Não se aplica (texto completo)”. Isso fará com que seu trabalho seja disponibilizado na íntegra no Repositório Institucional UNESP. Por favor, corrija esta informação realizando uma nova submissão. Agradecemos a compreensão. on 2016-04-01T12:25:24Z (GMT) / Submitted by Dianelli Lisboa Caun null (dianellicaun@gmail.com) on 2016-04-01T13:56:46Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Mestrado _ Dianelli Lisboa Caun!.pdf: 3828104 bytes, checksum: 90229c28752bb69884ad8a4a0b1595eb (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-04-05T14:39:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 caun_dl_me_sjrp.pdf: 3828104 bytes, checksum: 90229c28752bb69884ad8a4a0b1595eb (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-05T14:39:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 caun_dl_me_sjrp.pdf: 3828104 bytes, checksum: 90229c28752bb69884ad8a4a0b1595eb (MD5) Previous issue date: 2016-02-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Apesar das diferentes estratégias reprodutivas apresentadas pelos morcegos, relativamente pouca atenção tem sido dada aos estudos morfológicos das estruturas reprodutivas nesses animais. Com o intuito de gerar informações que propiciem uma descrição mais detalhada dos aspectos reprodutivos em Chiroptera, o objetivo do presente estudo foi descrever a morfologia dos órgãos reprodutivos (útero e ovários) das fêmeas de Artibeus planirostris (Phyllostomidae) durante quatro fases do ciclo reprodutivo e analisar o processo de foliculogênese. As fêmeas de A. planirostris possuem um útero simples de histologia semelhante ao padrão geral dos mamíferos, com a parede uterina sendo composta por três camadas, na qual a mais interna, o endométrio, demonstrou um processo de descamação e necrose, que ao ser associada com sangramento, caracteriza a menstruação. Artibeus planirostris produz apenas um filhote por gestação e exibe um padrão poliéstrico, evidenciado pela captura de fêmeas concomitantemente grávidas e lactantes, demonstrando a existência de um estro pós-parto. Os ovários de A. planirostris, apresentaram uma polaridade aparente, com os folículos primordiais restritos a uma zona localizada em apenas um lado do ovário, a partir da qual os folículos são recrutados para posterior crescimento e desenvolvimento. Ambos os ovários são funcionais, confirmados pela presença do corpo lúteo, mas constatamos que eles não podem ser considerados bilateralmente simétricos, uma vez que o corpo lúteo foi encontrado preferencialmente no ovário esquerdo (76,2%). Os ovários durante a gravidez apresentam diferenças significativas entre si, evidenciando um processo de regressão por parte do ovário sem corpo lúteo, que apresenta grandes quantidades de folículos atrésicos, e valores de diâmetro, área e volume significativamente menores do que o ovário que ovulou (com corpo lúteo). Quanto ao processo de foliculogênese, A. planirostris segue o padrão básico dos mamíferos e outros morcegos, tendo início com o recrutamento de folículos primordiais, visando seu crescimento e desenvolvimento, podendo se tornar um folículo maduro (de Graaf) ou morrer por um processo de atresia. Com esses resultados, fornecemos detalhes sobre o ciclo reprodutivo de A. planirostris, evidenciando características reprodutivas típicas dessa espécie. / Despite the many reproductive strategies employed by bats, there is not enough attention being given to the morphological studies of reproductive structures of the Chiroptera. Aiming to generate informations that enable a more detailed explanation of the reproductive aspects of Chiroptera, the purpose of this study is to describe the morphology of the reproductive organs (uterus and ovaries) of female Artibeus planirostris (Phyllostomidae) during four phases of the reproductive cycle and analyse the folliculogenesis. The A. planirostis female has a simple uterus, histologically similar to the mammalian general pattern, uterine wall formed by three layers, of which, the inner layer, the endometrium, has showed process of necrosis and scaling that, when combined with bleeding, typifies menstruation. Artibeus planirostis produces only one offspring per gestation and presents a poliestric pattern, corroborated by the capture of females concomitantly pregnant and lactating, desmonstrating the existence of a postpartum estrus. The ovaries of A. planirostis showed an apparent polarity, with the primary follicles restricted to an area located in only one side of the ovary, from which the follicles are recruited to the consequent growth and development. Both ovaries are functional, confirmed by the presence of the corpus luteum and it was found, however, that they can not be considered bilaterally simetrical, for the corpus luteum was predominantly found in the left ovary (76,2%). The ovaries, during pregnancy, showed significant differences among each other, evincing a regression process of the ovary that did not present corpus luteum and showing great quantity of atretic follicles, and with diameter, area and volume significantly smaller than the ovary which presented corpus luteum, i.e., which has ovulated. As for the folliculogenesis process, A. planirostis follows the basic mammalian pattern as well as other bats, starting with primary follicle recruiting, growing and developing it, and enabling it to become a mature follicle (graafian foliclle) or dying of a process of atresia. With such results, we provide details on the reproductive cycle of A. planirostis, evincing typical reproductive characteristics for this species.

O objetivo deste estudo foi analisar as concentrações do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 (IGF1) e insulina (INS) no fluido folicular durante foliculogênese em éguas, e localizar o receptor tipo 1 de IGF (IGF1R) nas paredes foliculares. Durante a estação reprodutiva, 40 éguas mestiças enviadas para abate em matadouro, com idades variando entre 6 e 16 anos foram utilizadas. As éguas foram abatidas de forma humanitária. Os tratos reprodutivos internos foram recuperados dentro de 10 min após o abate, ovários de éguas cíclicas foram separados do resto do aparelho. As éguas foram classificadas em quatro grupos: G1 – Folículo ≤ 13,5 mm e CL identificável; G2 – Folículo de 13,6 - 22,5 mm e CL identificável; G3 – Folículo de 22,6 - 31,5 mm e CL identificável; G4 – Folículo ≥ 31,6 mm e CL difícil de identificar. O fluido folicular (FF) foi aspirado e armazenado a -80 ° C até a sua utilização. Após a punção do FF, um fragmento da porção ventral da parede folicular foi removido para realizar a imunohistoquímica para localização de receptores IGF1R. O IGF1 livre foi determinado por ensaio imunoradiométrico. A INS foi determinada por um radioimunoensaio de fase líquida. A concentração de IGF1 livre e INS no FF aumentou com o crescimento folicular (P < 0,05). O escore imunohistoquímico de IGF1R nas células da granulosa e da teca interna da parede folicular equina em diferentes grupos aumentou (P < 0,05) com aumento folicular. Concluímos que as concentrações de IGF1 livre e INS no FF e de IGF1R em paredes foliculares de éguas aumentam com o crescimento folicular durante a foliculogênese, dando evidência do papel importante do IGF1 e INS no desenvolvimento folicular, e uma interação entre ambos hormônios na fisiologia reprodutiva ovariana. Sendo a égua um modelo de pesquisa para estudos comparativos na dinâmica folicular para consideração em mulheres, a conclusão deste estudo pode ser aplicada, também, a humanos. / The aim of this study was to analyze free type 1 insulin-like growth factor (IGF1) and insulin (INS) concentrations in follicular fluid during folliculogenesis in mares, and to localize type 1 IGF receptor (IGF1R) on follicular walls. During the breeding season, 40 mixed-breed mares sent to slaughter at an abattoir, with ages ranging between 6 to 16 years were used. Mares were humanely slaughtered. Internal reproductive tracts were recovered within 10 min after slaughter; ovaries of cyclic mares were separated from the rest of the tract. Mares were categorized into four groups: G1 – Follicle ≤ 13.5 mm and CL identifiable; G2 – Follicle of 13.6 to 22.5 mm and CL identifiable; G3 – Follicle of 22.6 to 31.5 mm and CL identifiable; G4 – Follicle ≥ 31.6 mm and CL difficult to identify. The follicular fluid (FF) was aspirated and stored at -80°C until use. After puncture of the FF, a fragment of the ventral portion of the follicular wall was removed to perform immunohistochemistry to localize IGF1R receptors. Free IGF1 was determined by immunoradiometric assay. INS was determined by a liquid phase radioimmunoassay. The concentration of free IGF1 and INS in FF increased with follicle growth (P < 0.05). Immunohistochemical score of IGF1R on granulosa and internal theca cells from equine follicular wall on different groups increase (P < 0.05) with follicular raise. We conclude that free IGF1 and INS concentrations in FF and IGF1R in follicular walls of mares increase with follicular growth during folliculogenesis, giving evidence of important role of IGF1 and INS in follicular development, and an interaction between both hormones in ovarian reproductive physiology. As the mare is a model research for comparative studies in follicular dynamics for consideration in women, the conclusion of this study can be applied to humans also.

O nascimento de gêmeos na espécie humana é rodeado por muitos mistérios e, há bastante tempo, desperta a curiosidade tanto leiga quanto científica. Os estudos com gêmeos vêm contribuindo para o entendimento de diversas áreas da biologia humana; porém, aspectos epidemiológicos e etiológicos relacionados aos nascimentos gemelares em si permanecem pouco elucidados. Para além de mera curiosidade, pesquisas nessa área podem ajudar a compreender mecanismos relacionados à reprodução em geral, além de serem importantes em um contexto de saúde pública, já que a gestação gemelar representa riscos adicionais à mãe e à prole. Em países industrializados observa-se um aumento acentuado nas taxas gemelares (TGs) que parece estar relacionado ao aumento da idade materna na primeira gravidez e tecnologias de Reprodução Medicamente Assistida (RMA). No Brasil, os aspectos geográficos e sociodemográficos dos nascimentos gemelares ainda não foram profundamente estudados. Assim, este estudo objetivou responder a três questões principais relacionadas aos nascimentos de gêmeos: “Quantos?” “Onde? e “Como?”, isto é, considerando aspectos epidemiológicos e etiológicos. Para o estudo epidemiológico, desenhamos um estudo de base de dados populacional e investigamos as TGs em duas dimensões: espacial e temporal. Para isso, utilizamos dados provenientes do Sistema de Informações sobre Nascidos Vivos (SINASC) e analisamos mais de 41 milhões de nascimentos que ocorreram em todos os 5.565 municípios brasileiros entre 2001 e 2014. Encontramos uma TG nacional média de 9,41 por 1.000 nascimentos e o modelo de análise de séries temporais revelou tendência de aumento global ao longo do período estudo, mas com notáveis diferenças regionais. De fato, resultados da “Análise de Cluster e Outlier” (Anselin Local Moran’s I) revelaram concentração de municípios com altas TGs em uma área que vai do sul do Nordeste brasileiro até o Rio Grande do Sul (Global Moran Index = 0.062, P < 0.001). Além disso, encontramos correlação positiva entre o Índice de Desenvolvimento Humano (IDH) local e as TGs em diferentes cenários, sugerindo que o IDH pode ser um importante indicador de RMA no Brasil. Nossas análises também revelaram aumento de 26.42% na TG entre as mulheres com mais de 44 anos durante o período estudado. A tendência de aumento temporal encontrada para algumas regiões do país está de acordo com o que é observado em outros países industrializados, enquanto que a análise geográfica revelou duas situações bem distintas dentro do Brasil. Por sua vez, os 9 estudos acerca da etiologia dos nascimentos de gêmeos foram concentrados em investigar polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em mães de Cândido Godói (CG), uma pequena cidade do Sul do Brasil conhecida como a “Cidade dos Gêmeos”. Este título é devido à alta TG observada no município e à recorrência do traço nas famílias locais, com forte descendência europeia. Nós desenhamos um estudo caso-controle e genotipamos sete SNPs relacionados à foliculogênese (rs6166:C>T em FSHR, rs11031006:G>A próximo a FSHB, e rs17293443:T>C in SMAD3) ou a gestações de sucesso (rs1801131:T>G e rs1801133:G>A em MTHFR, rs2010963:C>G em VEGFA, e rs1800629:G>A em TNF) em 44 mães de gêmeos (casos) e 102 mães de filhos únicos (controles), todas residentes de CG. Para todos os SNPs, a distribuição das frequências alélicas e genotípicas foi similar entre casos e controles. Diferentes combinações de alelos de risco e análises haplotípicas também foram homogeneamente distribuídas entre ambos os grupos. Assim, estes resultados sugerem uma ausência de associação entre os nascimentos gemelares em CG e sete SNPs relacionados à foliculogênese ou a gestações de sucesso, mas é possível que outras variantes genéticas ligadas a ambos os processos possam estar envolvidas neste fenômeno que possui uma base genética subjacente. / The birth of twins in human species is surrounded by many mysteries and it has long aroused both lay and scientific curiosity. Studies with twins have contributed to the understanding of several areas of human biology; however, the epidemiological and etiological aspects related to twin births by themselves remain unclear. Beyond mere curiosity, research in this field may help us to understand the mechanisms related to reproduction in general, and it is important in a public health context since a twin pregnancy represents additional risks to the mother and offspring. Some countries have reported a striking increase in twinning rates (TRs), which seems to be related mainly to delayed childbearing and to Medically-Assisted Reproduction (MAR) technologies. In Brazil, the epidemiological scenario of twin births has not been studied while considering its territorial and sociodemographic magnitude. Therefore, this study aimed to answer three main questions related to twin births: "How many?", “Where” and "How?", that is, we investigated twinning in light of epidemiology and etiology. For the epidemiological study, we carried out a population-based study, investigating twin births in two dimensions: spatial and temporal. For that, we used data from Brazil’s Live Birth Information System (SINASC), and we analyzed over 41 million births that occurred in all 5,565 Brazilian municipalities between 2001 and 2014. We found an average TR of 9.41 per 1,000, and a first-order autoregressive model of time-series analysis revealed a global upward trend over time, but with important regional differences. In fact, a Cluster and Outlier Analysis (Anselin Local Moran’s I) was performed and identified clusters of high TR in an area stretching from the south of Brazil’s Northeast Region to the South Region (Global Moran Index = 0.062, P < 0.001). Furthermore, we found a positive correlation between the local Human Development Index (HDI) and TRs in different scenarios, suggesting that the HDI may be an important proxy indicator of MAR in Brazil. We also found a sharp increase (26.42%) in TR in women aged over 44 years. The upward temporal trend in TRs is in line with recent observations from other countries, whereas the spatial analysis revealed two very different realities within our country. In turn, studies on the etiology of twin births were focused on single nucleotide polymorphisms (SNPs) in mothers from Cândido Godói (CG), a small southern Brazilian city known as the "Twin’s Town”. This title is due to the high TR attributed to the municipality and to the recurrence of the twin trait through the 11 local families, who have a strong European descent. We performed a case-control study and genotyped seven SNPs related to folliculogenesis (rs6166:C>T in FSHR, rs11031006:G>A near FSHB, and rs17293443:T>C in SMAD3) and to a successful pregnancy (rs1801131:T>G and rs1801133:G>A in MTHFR, rs2010963:C>G in VEGFA, and rs1800629:G>A in TNF) in 44 mothers of twins (cases) and 102 mothers of singletons (controls), all of them from CG. For all SNPs, the distributions of the genotypic and allelic frequencies were similar between the cases and controls. Different combinations of risk alleles and haplotypic analyses were also homogeneously distributed between both groups. Thus, these results suggest a lack of association between twin births in CG and seven SNPs related to folliculogenesis or successful pregnancies, but it is possible that other genetic variants linked to both processes may be involved in this phenomenon, which has an underlying genetic basis.

Some plasticizers are endocrine-disrupting chemicals that cause reproductive toxicity in both males and females. Several chemicals already approved by the Food and Drug Administration have been proposed as substitutes for some of these plasticizers, one example is acetyl tributyl citrate (ATBC). However, no studies have tested whether ATBC causes direct toxicity to the ovary. Ovarian antral follicles are essential for female fertility because they are the major producers of ovarian steroids and are the only follicle type that can ovulate in response to gonadotropin stimulation. Previous studies have used in-vitro ovarian follicle culture as a screening tool to demonstrate that EDCs can cause direct ovarian toxicity. Therefore, we designed this study to test whether exposure to in vitro treatment with ATBC causes ovarian toxicity in CD-1 mice. We mechanically isolated antral follicles from the ovaries of adult CD-1 mice (35-39 days old) and individually exposed them (n=5 cultures with n≥8 follicles per treatment) to supplemented media alone (NT), dimethyl sulfoxide (DMSO, vehicle for ATBC), and ATBC (0.001-100 µg/mL) for 24-72 h. Follicle growth and survival were monitored by measuring follicle diameter and cytotoxicity (compromised membrane integrity; CellTox Green) every 24 h, and assessing number of metabolically active cells (ATP concentration; Promega CellTiterGlo) at the end time point. The DNA synthesis inhibitor hydroxyurea (HU, 100 mM) was used as a positive control for the viability assays. Exposure to ATBC did not affect the ability of antral follicles to increase their diameter over time at all concentrations tested. When stratified by growth pattern, there was not a significant difference in the proportion of follicles growing normally, growing slowly, or not growing following ATBC exposure at all concentrations tested. ATBC treatment did not cause compromised membrane integrity and did not inhibit ATP production at any of the concentrations tested. The positive control, HU, inhibited follicle growth (24-72 h), decreased follicle cell membrane integrity (72 h), and inhibited ATP production (24-72 h). The purpose of this experiment is to evaluate the effects of oral exposure to ATBC in female CD-1 mice. For the in vivo experiments, the female mice (n=22; PND 81) were randomly divided into treatment groups and dosed according to daily body weight with one of the following treatments: corn oil (vehicle, n=7), 5 mg/kg/day ATBC (n=8), or 10 mg/kg/day (n=7) ATBC for 15 consecutive days. Vaginal smears were performed and analyzed daily to measure any change in estrous cyclicity. After the 15th day of dosing the female mice were introduced into an individually housed proven breeder male’s cage. Daily body weight measurements continued and plug checks were performed every morning. Pregnancy and time to conception data did not statistically differ from the vehicle (oil) for all ATBC treatments (days to conception: vehicle 2.43 ± 0.65, 5 mg/kg/day ATBC 2 ± 0.33, 10 mg/kg/day ATBC 2.5 ± 0.22; gestation length: vehicle 19.71 ± 0.18, 5 mg/kg/day ATBC 20 ± 0.19, 10 mg/kg/day ATBC 20 ± 0.00). On the day of parturition the dams and pups were sacrificed; organ weight and gross morphology data was collected for: uterus, kidneys, adrenals, spleen, liver, and ovaries. The data analyzed includes: estrous cyclicity, pre-dosing body weight % gain, dosing body weight % gain, pregnant body weight % gain, organ weight, gestation length, litter size (live vs. dead), litter weight, implantation sites, time to conception, and pup sex ratio. Interestingly, there was an increase in spleen weight at the 5 mg/kg/day treatment when compared to vehicle control-treated spleen weights (spleen weight, Oil: n=7; 5 mg/kg ATBC: n= 8). Treatment with 5 mg/kg/day ATBC caused a significant decrease in average estrous cycle length in days compared to the pre-dosing average estrous cycle length. Animals exposed orally to 10 mg/kg/day ATBC showed a significant decrease in total follicle number (10 mg/kg/day ATBC, 313 ± 20.37) when compared to vehicle (oil) treated mice (vehicle, 433.71 ± 34.85). Also treatment with 10 mg/kg/day ATBC resulted in significant reduction in secondary (101.67 ± 5.7) and late antral (4.17 ± 1.45) follicle numbers when compared to the vehicle-treated mice (secondary follicles: 141.14 ± 14.79, late antral follicles: 7.00 ± 1.54). ATBC treatment with 10 mg/kg/day showed a significantly decreased mean body weight percent gain during pregnancy on days 3, 5, and 14 when compared to animals treated with vehicle (oil), while animals treated with 5 mg/kg/day ATBC showed a significant decrease in weight gained on only day 13 when compared to the vehicle (oil). These novel findings show that ATBC could disrupt ovarian function in mice when exposed to low-dose ATBC.