Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-10T10:41:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Traina_Fabiola_D.pdf: 10463418 bytes, checksum: a1c92a0820404ccf5ce6623bff80018a (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Importante passo para a compreensão dos processos fisiopatológicos das neoplasias é a identificação de genes ativamente expressos e das funções biológicas de cada proteína codificada por estes genes. Ankyrin Repeat Single KH Domain containing 1 (ANKHD1) foi inicialmente identificada em células de adenocarcinoma de próstata humano (LNCaP), no ano de 2003. Entretanto, seu padrão de expressão e sua função ainda não haviam sido caracterizados. A ANKHD1 é uma proteína ortóloga à Multiple Ankyrin repeat and single KH domain (Mask) da Drosophila melanogaster. Mask foi identificada através de um rastreamento genético utilizado para detectar novas proteínas associadas à proteína tirosina fosfatase Corkscrew (CSW), homóloga à Src Homology-2 domain-containing protein tyrosine Phosphatase-2 (SHP2) humana. SHP2 é uma fosfatase de tirosina citoplasmática codificada pelo gene PTPN11 e exerce papel fundamental no desenvolvimento da hematopoese normal e leucêmica. Os objetivos gerais do presente estudo foram caracterizar o padrão de expressão gênica e protéica de ANKHD1 em células hematopoéticas normais e leucêmicas e sua participação nas vias de sinalização celular. Neste estudo, foi demonstrada a elevada expressão gênica e protéica de ANKHD1 em linhagens de leucemias agudas humanas (KG-1, HEL, K562, NB4, HL-60, Jurkat, MOLT4, Raji, Daudi e Namalwa) e em amostras de 38 pacientes com diagnóstico de leucemia aguda, quando comparadas às células hematopoéticas normais. A expressão protéica de ANKHD1 em diferentes tecidos humanos normais (rim, baço, estômago, intestino delgado, músculo esquelético, fígado, pulmão e linfonodo) foi detectada em intensidades variáveis. A associação da ANKHD1 com SHP2 foi identificada, através de Western Blotting, em células de leucemia mielóide crônica em fase blástica (K562) e células LNCaP. Entretanto, esta associação não foi detectada nas linhagens leucêmicas KG1, HL60, Daudi e Jurkat. A ANKHD1 foi localizada no citoplasma de células hematopoéticas normais e leucêmicas. Detectou-se a fosforilação de ANKHD1 em serina em células leucêmicas, mas não em células hematopoéticas normais. Através de ensaio de duplo híbrido em levedura, utilizando-se uma biblioteca de cDNA de medula óssea humana normal, detectou-se a interação de ANKHD1 com as proteínas SIVA1 e SIVA2, proteínas pró-apoptóticas altamente expressas em linhagens de leucemia linfóide aguda. Análises preliminares indicaram que a inibição da expressão protéica de ANKHD1, através de RNAi, induziu à apoptose celular em células leucêmicas, sugerindo uma função anti-apoptótica à ANKHD1. Em conclusão, o presente estudo identificou ANKHD1 como uma nova proteína altamente expressa em leucemias agudas, associada à SHP2 e SIVA em diferentes células, e, possivelmente, envolvida com o fenótipo anormal da célula leucêmica através de uma função anti-apoptótica. Os achados aqui descritos sugerem que ANKHD1 pode ser uma molécula alvo para a terapia da leucemia no futuro, e permitirão direcionar novos estudos com o objetivo de melhor elucidar as funções específicas de ANKHD1 em diferentes células hematopoéticas normais e leucêmicas / Abstract: One step in the path towards building a comprehensive molecular portrait of human cancer is the definition of actively expressed genes and the function of their coding proteins. The Ankyrin Repeat Single KH Domain containing 1 protein (ANKHD1) was first described in humans in a prostate carcinoma cell line LNCaP, in 2003; however, its expression pattern and its function have not yet been described. ANKHD1 is an orthologous protein of the Drosophila melanogaster, MASK (Multiple Ankyrin repeat and single KH domain), where it was first identified using a genetic screen designed to discover proteins that interact with the protein tyrosine phosphatase Corkscrew (CSW), which is a homolog to the SH2-containing protein tyrosine phosphatase (SHP2) in humans. SHP2 is a cytoplasmic protein-tyrosine phosphatase, coded by the PTPN11 gene and plays an important role in the development of normal hematopoiese and leukemogenesis. The aim of the present study was to characterize the gene and protein expression pattern of ANKHD1 in normal hematopoietic cells and in leukemia cells, and its role in signaling pathways. In the present study, the overexpression of ANKHD1 mRNA and its protein was demonstrated in human leukemia cell lines (KG-1, HEL, K562, NB4, HL-60, Jurkat, MOLT4, Raji, Daudi and Namalwa) and in 38 patients with a diagnosis of acute leukemia, compared to normal hematopoietic cells. The ANKHD1 protein was found to have a variable expression in different normal tissues (kidney, spleen, stomach, small intestine, skeletal muscle, liver, lung and lymph node). An association of ANKHD1 and SHP2 was found, through imunopreciptation and Western Blotting, in the chronic myeloid leukemia blastic phase cell line (K562) and in LNCaP cells. However, this association was not detected in the leukemia cell lines, KG1, HL60, Daudi and Jurkat. ANKHD1 was found located in the cytoplasm of normal hematopoietic cells and leukemia cells. ANKHD1 was found to be phosphorylated at serine in leukemic cells, but not in normal hematopoieitic cells. Through the yeast two-hybrid system, using a cDNA library from normal human bone marrow, the interaction of ANKHD1 with SIVA1 and SIVA2 was detected. SIVA isoforms are pro-apoptotic proteins, overexpressed in acute lymphoblastic leukemia cell lines. Preliminary studies showed that the inbition of ANKHD1 expression, through RNAi, resulted in increased apoptosis in leukemic cells, which suggests an anti-apoptotic function for ANKHD1. In conclusion, the present study identified ANKHD1 as a new protein that is overexpressed in leukemic cells. The protein interacts with SHP2 and SIVA in different cells and is probably associated with the abnormal phenotype of the leukemia cell through its anti-apoptotic function. These findings suggest that ANKHD1 may be a molecular target for a rational therapy for leukemia in the near future, and open a new field of investigation to better define the specific roles of ANKHD1 in different normal and leukemic hematopoietic cells / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

Orientador: Eulazio Mikio Taga / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-26T05:20:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Buzalaf_MariliaAfonsoRabelo_D.pdf: 5040554 bytes, checksum: 5d7774aeca4271c23aebb3bb510d14d7 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: A PTP de BMr do fígado de carneiro foi purificada 1350 vezes até a homogeneidade, com rendimento de 2,6%, através de um procedimento envolvendo fracionamento com sulfato de amônio, diálise, cromatografia de troca iônica em SP-Sephadex com eluição por íon afinidade e cromatografia de exclusão molecular. Os critérios de pureza utilizados foram a AE, P AGE, SDSPAGE e filtração em gel (Superdex HR 200). A enzima purificada (AE de 81,18 µmol min-1 mg-1) é composta por uma cadeia polipeptídica simples e possui Mr de 17,4 e 18,3 kDa, como determinado através de filtração em gel e SDS-PAGE, respectivamente. O estudo do efeito do pH na atividade enzimática revelou que o pH ótimo é em tomo de 5,5. A enzima apresentou uma atividade máxima a 50°C. A energia de ativação para a hidrólise do pNPP, determinada pelo gráfico de Arrhenius, foi de 49,674 kJ mol-1. A adição de BSA (0,1 a 0,75 mg/mL) ao meio de reação enzimática promoveu um incremento de até 40% na atividade enzimática, sendo que concentrações maiores tiveram pouco efeito. Já a adição de BSA ao meio de diluição enzimática elevou a velocidade em até 350%, tendo provocado um ligeiro aumento na Km, praticamente sem interferir com a Ea. A atividade da enzima foi pouco sensível a diversos compostos e íons metálicos, exceto pela ativação por guanosina e inibição por SDS, ácido úrico, Ag+, Hg+, CU2+ e Zn2+. O estudo de inibidores demonstrou insensibilidade ao tartarato e fluoreto e inibição por vanadato (Ki de 0,097µM), fosfato inorgânico (Ki de 0,94 mM), molibdato de amônio (Kic de 12,8 µM e Kia de 2,7 µM) e pCMB. Dos substratos testados, apenas pNPP, ß-Naftil-P, Tyr-P e FMN foram hidrolisados significativamente, com Km de 0,151, 0,726, 3,873e 0,12 mM, no pH 5,0 e 1,861, 4,447, 5,673 e 0,11 mM no pH 7,0, respectivamente. Também houve hidrólise sobre o acetil-P (Km de 0,18 mM) no pH 5,0, entretanto com uma velocidade 100 vezes menor em relação ao pNPP / Abstract: A low molecular weight sheep liver phosphotyrosine protein phosphatase was purified 1350-fold to homogeneity, with 2.6% recovery, by a procedure involving ammonium sulfate fractionation, dialysis, SP-Sephadex ion-exchange chromatography with ion-affinity elution and molecular exclusion chromatography. The following homogeneity criteria were used: specific activity, P AGE, SDS-P AGE and gel filtration (Superdex HR 200). The purified enzyme (specific activity 81,18 µmol min-1 mg-l) contained a single peptide chain and had a relative molecular mass of 17.4 and 18.3 kDa, as determined by gel filtration chromatography and SDS-PAGE, respectively. pNPP hydrolysis cata1yzed by this enzyme had a pH optimum of 5.5 and maximal activity at 50°C. An activation energy value of 49.674 kJ mol-1 for the reaction of pNPP hydrolysis was determined from Arrhenius plot. Addition of BSA (0.1 to 0.75 mg/mL) to enzyme reaction media increased unti140% enzyme activity, but higher concentrations of BSA had a small effect. Addition of BSA to enzyme dilution media increased velocity until 350%, causing a slight increase in Km, without interfering in activation energy. Different compounds and meta1lic ions did not significant1y affect enzyme activity, except for inhibition by SDS, uric acid, Ag+, Hg+,Cu2+ and Zn2+ and activation by guanosine. Enzyme was also inhibited by vanadate (Ki, 0.097 µM), inorganic phosphate (Ki 0.94 µM), ammonium molybdate (Kic, 12.8 µM and Kia, 2.7 µM) and pCMB. Both tartrate and fluoride were very weak inhibitors. Apparent Km values obtained, at 37°C were 0.151, 0.726, 3.873 and 0.12 mM at pH 5.0 and 1.861, 4.447, 5.673 and 0.11 mM, at pH 7.0, for pNPP, ßNaftil-P, Tyr-P and FMN, respectively. Acetyl-P was also hydrolyzed CKm, 0,18 mM) at pH 5.0, but the velocity was 100 times smaller in respect to pNPP / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador : Hiroshi Aoyama / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-28T05:29:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cavagis_AlexandreDonizetiMartins_M.pdf: 4418052 bytes, checksum: 75d7494a0289b525b36b334f41a92428 (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: O objetivo central do presente trabalho foi avaliar a estabilidade conformacional da fosfatase ácida de sementes quiescentes de soja. Através de estudos de desnaturação térmica, verificou-se uma temperatura de transição (TM) de 65 oC que mostra uma resistência incomum frente à temperatura. Observaram-se efeitos da concanavalina A (lectina) e de molibdato (inibidor) no perfil de desnaturação enzimática com alterações na TM. A desnaturação enzimática por dodecilsulfato de sódio (SDS) foi muito pouco significativa em presença do fosfoenolpiruvato (PEP) como substrato. Essa insensibilidade ao agente desnaturante pode ser explicada pela alta afinidade apresentada pela fosfatase em relação ao substrato em questão. A desnaturação térmica da enzima em presença do PEP revelou que este substrato produz uma mudança significativa no perfil de desnaturação, induzindo uma diminuição na temperatura de transição (TM) que representa um efeito antagônico àquele observado na desnaturação por SDS. A análise de aminoácidos revelou informações valiosas que explicam propriedades como o pI relativamente baixo (5,0), e o número expressivo de resíduos ácidos pode estar relacionado à estabilidade conformacional da enzima. Os estudos sistemáticos da desnaturação reversível por uréia e cloreto de guanidínio (GuaCl) foram realizados utilizando-se a fluorescência como técnica de monitoramento. O cálculo da Estabilidade Conformacional (deltaG H2O) foi feito tomando-se os deslocamento nos comprimentos de onda de máxima emissão de fluorescência como parâmetro e o valor obtido foi de 2,48 kcal/mol -1. Os cálculos de centro de massa foram tomados em função da concentração do agente desnaturante em ambos os casos. A análise de carboidratos, realizada por HPLC revelou a presença de manose, glicosamina e galactosamina e a remoção da fração de carboidratos não foi possível mesmo após tratamento com 300 mU das endoglicosidases endo-H, endo-F e endo-F1 / Abstract: The central aim of the present work was to evaluate the conformational stability of an isoform of soybean seeds acid phosphatase. Through thermal denaturation studies, the transition temperature (TM) value determined (65 oC), indicated an unusual resistance of the enzyme under high temperatures. Effects of strongly binding compounds such as concanavalin A (lectin) and molybdate (inhibitor) on the denaturation profile and transition temperature values were also observed. Enzymatic denaturation by sodium dodecyl sulfate (SDS) was insignificant in presence of phosphoenolpyruvate (PEP) which might be explained by the high affinity of the enzyme for this substrate. Thermal denaturation studies in presence of PEP showed both a significant change on the denaturation profile and a reduction on the transition temperature value. Aminoacid analysis contributed to important informations that are in accordance with some properties of the enzyme such as the relatively low isoelectric point (pI): 5.0. Furthermore, the expressive number of acid residues seems to be related to the conformational stability of the polypeptidic chain. Systematic studies of reversible denaturation by urea and guanidinium chloride (GuaCl) were carried out using fluorescence as a monitoring technique. Conformational Stability calculations were made based on the wavelengths corresponding to the maximum fluorescence emission as a parameter and the value obtained was 2.48 kcal.mol-1. Calculations of the centre of mass were made as a function of the denaturating agent concentration in both cases. Carbohydrate analysis was carried out by using High Performance Liquid Chromatography (HPLC) revealed mannose, glucosamine and galactosamine as main carbohydrates in the glycoconjugated structure. Carbohydrate removal was not possible even after treatment with 300 mU/mL of the endo-beta-N-acetylglucosaminidases-H, F and F1 / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Tese (livre-docencia) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-20T12:38:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vizioli_MarioRoberto_LD.pdf: 5360351 bytes, checksum: ef7729bcfa7cc434aac68a7fda20e79e (MD5) Previous issue date: 1975 / Resumo: O presente trabalho teve a finalidade de se pesquisar a presença e o possível papel do grupo enzimático das fosfomo noesterases no tecido de granulação induzido por implantação de esponjas de policlorovinil (PVC) no tecido subcutâneo do rato. 0 tecido de granulação foi estudado aos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 e 40 dias de evolução. Foram realizados, com este material, os seguintes estudos: coloração com hematoxilina-eosina, para a investigação da morfologia do tecido de granulação; -radioautografia, para a pesquisa da síntese de colageno, por meio da incorporação, pelos fibroblastos, de prolina- 3H; técnica histofotometrica para investigar-se a síntese de mucopolissacarídeos ácidos por meio da coloração metacromática com azul de toluidina , pH 4; e, finalmente, histoquimica das seguintes fosfomonoesterases: fosfatase alcalina, fosfatase ácida, adenosin-trifosfatase -(ATPase), 5 '-nucleotidase e glucose-6-fosfatase. Os resultados mostraram que a síntese de colageno e de mucopolissacarídeos ácidos no tecido de granulação inicia-se logo aos primeiros dias de desenvolvimento e atinge o ponto máximo entre 15 e 20 dias, decaindo visivelmente após esse tempo. A pesquisa histoquimica das fosfomonoesterases demonstrou que a fosfatase alcalina tem atividade progressivamente crescente a partir dos 10 dias de evolução do tecido, atingindo o máximo de atividade aos 15 dias, mantendo-se ate 20 dias, quando cai bruscamente. Essa atividade, coincidente com o período máximo de síntese de colageno e de mucopolissacarídeos ácidos, demonstra que a fosfatase alcalina tem um papel importante na agregação do complexo colágeno - mucopolissacarídeos ácidos, agindo em algum ponto da formação das cadeias de carboidratos e, consequentemente, da formação dos mucopolissacarídeos ácidos. A ATPase e a 51-nucleotidase também tem a sua atividade máxima no período entre 15 e 20 dias, sendo portanto -relacionadas com os processos energéticos de alta intensidade , exigidos pelo tecido cujo metabolismo é muito ativo. A fosfatase ácida foi detectada somente nos ma -crófagos do tecido, a partir de 15 dias de evolução, estando a sua atividade ligada aos 1-isossomas dessas células. A glucose-6-fosfatase também reage unicamente nos macrÓfagos, sendo que a sua atividade se deve provavelmente ao fato que uma atividade -relativamente ligeira da glucose-6-fosfatase pode acompanhar o processo de glicolise, com a finalidade de aliviar o acúmulo de glicose-6-fosfato, liberando glicose para a circulação / Abstract: Not informed / Tese (livre-docencia) - Univer / Patologia / Livre-Docente em Odontologia

Resumo: O álcool atua no organismo podendo trazer várias doenças, entretanto sua ação no tecido ósseo ainda apresenta resultados controversos. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do consumo crônico de álcool a 20% em osteoblastos obtidos da calvária de ratos recém-nascidos. Foram utilizadas 18 ratas prenhas, tratadas durante a gestação e divididas em grupos conforme a dieta: álcool a 20%, grupo isocalórico, e controle. Aos três dias de vida, os recém-nascidos foram eutanasiados para remoção da calvária e isolamento das células por meio de digestão enzimática sequencial, sendo estas cultivadas por períodos de até 14 dias. Foram realizados testes para avaliar o efeito do álcool na adesão, proliferação e viabilidade celular, no conteúdo de proteína total, na atividade da fosfatase alcalina e nas formações nodulares de matriz mineralizada. Os resultados mostraram que em geral, a adesão celular não foi influenciada pelo consumo crônico de álcool, já que não foi demonstrada diferença estatística entre os grupos. Contudo, o grupo álcool apresentou aumento significativo na proliferação, exceto no período de 1 dia, e nas formações nodulares. Com relação a viabilidade celular, apenas no período de 3 dias houve aumento significativo de células no grupo álcool. Os valores representativos de proteína total variaram dependendo do período estudado, sendo maior no grupo controle com 7 dias, porém aos 14 dias houve maior média nos grupos isocalórico e álcool. Quanto à fosfatase alcalina observamos aumento de sua atividade nos grupos álcool e isocalórico em todos os períodos. Concluímos que nesta metodologia, o álcool não apresentou efeito deletério para os osteoblastos, talvez pelo curto tempo de administração / Abstract: The alcohol affects the organism and may cause various diseases, even though its effects on bone metabolism are still controversial. The purpose of this paper was to evaluate the effects of alcohol 20% chronic consumption in osteoblasts obtained from the calvaria of newborn mice. The alcohol was administrated to pregnant mice throughout the entire pregnancy. For that purpose, 18 mice were used, divided in groups according to the diet: 6 receiving alcohol 20%, 6 belonging to the isocaloric group and 6 receiving water and ration at will. At three days of life, the newborns were euthanized so as to remove the calvaria and start the cell culture procedures. The osteoblastic lineage cells were isolated by sequential enzymatic digestion and the osteoblasts were cultivated for periods of 14 days or less. Tests were performed on the culture slides to evaluate the effect of alcohol based on adhesion, proliferation and cellular viability on total protein content, alkaline phosphatase activity and nodule formation of mineralized matrix. The results have shown that the alcohol group presented significant increase in proliferation, except for the period of one day, and in nodule formation. A significant increase in the alcohol group concerning cellular viability was only observed in the period of 3 days and there was no statistic difference in adhesion. The total protein content was higher in the control group in 7 days, and the average higher in the isocaloric and alcohol groups in 14 days, according to the periods of time studied. An increase in the activity of the alkaline phosphatase was observed in the isocaloric and alcohol groups in all periods of evaluation. By this methodology, we have concluded that the alcohol has not presented any deleterious effect on osteoblasts, possibly due to the short period of administration / Orientador: Rosilene Fernandes da Rocha / Coorientador: Luana Marotta Reis de Vasconcellos / Banca: Cristina Pacheco Soares / Banca: Luciane Dias de Oliveira / Mestre

Orientador: João Matins Pizauro Júnior / Coorientador: Cecília Maria Costa do Amaral / Banca: Jesus Aparecido Ferro / Banca: Luís Henrique Souza Guimarães / Resumo: Bactérias do gênero Enterobacter sp. são conhecidas por produzir ácidos orgânicos e solubilizar fosfato inorgânico presente no solo. O objetivo do trabalho foi caracterizar a enzima fosfatase ácida ligada à membrana de Enterobacter sp. isolada de raízes de orquídeas Cyrtopodium paludicolum. A enzima ligada à membrana foi purificada por centrifugação a 100.000 x g durante uma hora a 4ºC. A atividade da p-nitrofenilfosfatase (PNFFásica) foi determinada descontinuamente a 37°C. A bactéria foi inoculada em meio de cultura líquido e a enzima foi estritamente regulada pelo fósforo, atingindo expressão máxima a 5 mM, em pH ótimo aparente de 3,5. Em relação aos inibidores avaliados, verificouse que o cobre apresentou inibição não-competitiva. Já o arsenato, vanadato e fosfato inibiram competitivamente a enzima, demonstrando que são análogos estruturais. A enzima exibiu comportamento "michaeliano" para a hidrólise do PNFF (atividade específica de 30,67 U/mg, Km = 0,55 mM e n = 1). Interações sítio-sítio foram observadas para a hidrólise do ATP (atividade específica de 11,2 U/mg, Km = 0,62 mM e n = 1,8) e para a hidrólise do pirofosfato (atividade específica de 15,64 U/mg, Km = 0,89 mM e n = 2,8). Os valores obtidos pela inativação térmica demonstraram que a enzima manteve-se estável a 45°C e a atividade enzimática diminuiu com o aumento da temperatura. Os resultados sugerem que a produção da fosfatase ácida promove aumento na disponibilidade dos nutrientes para as plantas, solubilizando minerais insolúveis através da produção de enzimas, sendo um dos mecanismos que esses microrganismos utilizam para solubilização de fosfato mineral / Abstract: Bacteria of the genus Enterobacter sp. are known as organic acid producers and are able to solubilize inorganic phosphate which is present in soil. The aim of this work was to characterize the cell-wall associated acid phosphatase of Enterobacter sp. symbionts of plants and were isolated from roots of orchid Cyrtopodium paludicolum. The enzyme was obtained by centrifugation at 100.000 x g, for one hour at 4ºC and the activity from p-nitrophenilphosphatase (PNPPase) was determined at 37°C Culture medium was inoculate d with bacteria and supplemented with phosphorus. Under optimal conditions (5mM phosphorus, pH 3.5) the enzyme was expressed. The activity from p-nitrophenylphosphatase (PNPPase) was determined at 37°C. The enzyme presen ted Michaelis behavior for the hydrolysis of PNPP (specific activity of 30.67 U/mg, Km = 0.55 mM and n = 1). Besides site-site interactions were observed for ATP hydrolysis (specific activity of 11.2 U/mg, Km = 0.62 mM and n = 1.8) and pyrophosphate hydrolysis (specific activity of 15.64 U/mg, Km = 0.89 mM and n = 2.8). It was observed that enzyme activity decreased with increasing temperature. Inhibition studies revealed that copper inhibited the enzyme in a non-competitive manner. In contrast arsenate, and vanadate which are structural analogues of phosphate presented a competitive inhibition. The results suggest that plants expressing acid phosphatase are able to solubilize mineral phosphate and are able to hydrolyse insoluble minerals thereby increasing the availibilty of nutrients which can be used by the plant / Mestre

Orientadora: Ana Maria Pires Soubhia / Banca: Glauco Issamu Miyahara / Banca: Alan Roger dos Santos Silva / Resumo: O presente estudo teve como objetivo investigar em glândulas submandibulares de ratos tratados com aguardente de cana, a morfologia, atividade funcional das fosfatases e níveis de mucina. 24 ratos machos e adultos foram divididos em 4 grupos (n=6) de acordo com o tipo de bebida fornecida, aguardente de cana (39º GL) ou água, e ao tempo de tratamento de 75 ou 105 dias. Após os períodos de tratamento, os animais foram submetidos à cirurgia para remoção das glândulas submandibulares, seguido da eutanásia. As glândulas submandibulares do lado direito foram processadas para análise histomorfométrica (Image J) dos ductos estriados, ductos granulosos e ácinos. As glândulas do lado esquerdo foram pesadas e armazenadas a -80 °C, para avaliação da atividade funcional da fosfatase ácida total (FAT), fosfatase ácida resistente ao tartarato (FART), fosfatase alcalina (FAL) e determinação dos níveis de mucina. Para isso foram feitos ensaios bioquímicos por métodos espectrofotométricos. Os dados quantitativos foram submetidos à análise estatística (p<0,05). Os pesos absolutos e relativos das glândulas submandibulares apresentam-se reduzidos em relação aos controles (p<0,05). Na análise histomorfométrica, observamos que houve relevante redução da área dos ácinos (p<0,05) e redução não significativa dos ductos estriados (p>0,05). Nos ductos granulosos ocorreu aumento não significativo da área (p>0,05). As atividades de FAT e FART se apresentaram expressivamente diminuídas nos grupos experim... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The present study aimed to investigate submandibular glands of rats treated with cane brandy, morp hology, functional activity of phosphatases and levels of mucin. 24 male and adult rats were divided into 4 groups (n = 6) according to the type of beverage provided, cane brandy (39° GL) or water, and treatment time of 75 or 105 days. After the treatment periods, the animals were submitted to surgery to remove the submandibular glands, followed by euthanasia. The submandibular glands on the right side were processed for histomorphometric analysis (Image J) of the striated ducts, granular ducts and acini. T he left glands were weighed and stored at - 80 °C for evaluation of the functional activity of total acid phosphatase (TAP), tartrate - resistant acid phosphatase (TRAP), alkaline phosphatase (ALP), and determination of mucin levels. For this, biochemical tes ts were carried out by spectrophotometric methods. Quantitative data were submi tted to statistical analysis (p <0.05). The absolute and relative weights of the submandibular glands are reduced in relation to the controls (p <0.05). In the histomorphometric analysis, we observed that there was a significant reduction of the acini area (p <0.05) and a non - significant reduc tion of the striated ducts (p> 0.05). In the granular ducts a not significant in crease of the area occurred (p> 0.05). The TAP and TRAP activi ties were significantly decrease d in the experimental groups (p <0.05), while the ALP functional activity decrease d moderately (p> 0.05). There was a significant reduction of mucin levels by the effect of chronic alcoholism (p <0.05). From these data it was p ossible to conclude that chronic alcoholism due to the use of cane brandy affects the biochemical functionality and morphology of the submandibular gland / Mestre

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química. / Made available in DSpace on 2012-10-22T18:16:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 230074.pdf: 2278286 bytes, checksum: 566304e98f55e0e1a2b3ede6927d6cf0 (MD5) / A natureza aprendeu a utilizar propriedades especiais dos metais para realizar uma ampla variedade de funções associadas aos sistemas vivos. Metaloproteínas que realizam funções catalíticas são denominadas de metaloenzimas, constituindo então uma classe especial de compostos bioinorgânicos. Neste contexto, as fosfatases ácidas púrpuras (PAPs), metaloenzimas pertencentes à classe das hidrolases, catalisam a hidrólise de ésteres e anidridos do ácido fosfórico em uma faixa de pH de 4 a 7. A característica cor púrpura dessa subclasse de fosfatases ácidas é resultado de um de transferência de carga do tipo ligante metal (OTyr?FeIII) em torno de 560 nm. Os complexos modelos tiveram papel fundamental no entendimento das propriedades físicos-químicas das PAPs, antes da resolução das estruturas cristalinas das mesmas. Assim, através do estudo estrutural, espectroscópico e de testes de reatividade, busca-se esclarecer o mecanismo através do qual ocorre o processo catalítico em complexos modelos para que estes possam auxiliar na elucidação do mecanismo pelo qual a enzima nativa atua. Neste trabalho foram sintetizados e caracterizados por análise elementar de CHN; medidas de condutividade; espectroscopias no infravermelho, eletrônica e Mössbauer; eletroquímica e titulação potenciométrica dois novos complexos de ferro(III)cobalto(II) e gálio(III)cobalto(II) empregando-se o ligante H2BPBPMP76, já descrito na literatura. Os complexos 1 - [FeIIICoII(BPBPMP)(µ-OAc)2]ClO4 . 0,25 H2O e 2 - [GaIIICoII(BPBPMP)(µ-OAc)2]ClO4 . H2O tiveram suas estruturas cristalinas resolvidas apresentando-se isoestruturais entre si, sendo ainda apontados como modelos estruturais para as PAPs metalo-substituídas, pois mimetizam os resíduos de aminoácidos presentes no sítio ativo das PAPs e simulam a distância intermetálica presente nas mesmas. Os estudos realizados frente à hidrólise do substrato modelo 2,4-bisdinitrofenilfosfato (2,4-BDNPP) resultaram em fatores de aceleração de 19,2 e 21,2 mil vezes, espectivamente, em relação à reação não catalisada sendo o complexo 2 (GaIIICoII) o que se apresentou mais efetivo na conversão do substrato a produtos. Estudos inibitórios (por íons OAc- e HPO4 2-) para a reação do 2,4-BDNPP mostraram que os íons acetato à baixas concentrações não influenciam significativamente o processo catalítico, porém, íons fosfato devido a sua alta constante de associação podem comprometer a catálise mesmo em concentrações reduzidas. A partir dos dados estruturais, espectroscópicos, eletroquímicos, cinéticos e de titulação potenciométrica foi possível propor um ciclo catalítico para a hidrólise do 2,4-BDNPP, mediada pelos complexos 1 e 2 compatível com outros já descritos na literatura.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-11-01Bitstream added on 2014-06-13T18:31:26Z : No. of bitstreams: 1 sandrini_gb_me_jabo.pdf: 333023 bytes, checksum: 103aefb6c00d464c83f63b4a78d2cb4c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Bactérias do gênero Enterobacter sp. são conhecidas por produzir ácidos orgânicos e solubilizar fosfato inorgânico presente no solo. O objetivo do trabalho foi caracterizar a enzima fosfatase ácida ligada à membrana de Enterobacter sp. isolada de raízes de orquídeas Cyrtopodium paludicolum. A enzima ligada à membrana foi purificada por centrifugação a 100.000 x g durante uma hora a 4ºC. A atividade da p-nitrofenilfosfatase (PNFFásica) foi determinada descontinuamente a 37°C. A bactéria foi inoculada em meio de cultura líquido e a enzima foi estritamente regulada pelo fósforo, atingindo expressão máxima a 5 mM, em pH ótimo aparente de 3,5. Em relação aos inibidores avaliados, verificouse que o cobre apresentou inibição não-competitiva. Já o arsenato, vanadato e fosfato inibiram competitivamente a enzima, demonstrando que são análogos estruturais. A enzima exibiu comportamento “michaeliano” para a hidrólise do PNFF (atividade específica de 30,67 U/mg, Km = 0,55 mM e n = 1). Interações sítio-sítio foram observadas para a hidrólise do ATP (atividade específica de 11,2 U/mg, Km = 0,62 mM e n = 1,8) e para a hidrólise do pirofosfato (atividade específica de 15,64 U/mg, Km = 0,89 mM e n = 2,8). Os valores obtidos pela inativação térmica demonstraram que a enzima manteve-se estável a 45°C e a atividade enzimática diminuiu com o aumento da temperatura. Os resultados sugerem que a produção da fosfatase ácida promove aumento na disponibilidade dos nutrientes para as plantas, solubilizando minerais insolúveis através da produção de enzimas, sendo um dos mecanismos que esses microrganismos utilizam para solubilização de fosfato mineral / Bacteria of the genus Enterobacter sp. are known as organic acid producers and are able to solubilize inorganic phosphate which is present in soil. The aim of this work was to characterize the cell-wall associated acid phosphatase of Enterobacter sp. symbionts of plants and were isolated from roots of orchid Cyrtopodium paludicolum. The enzyme was obtained by centrifugation at 100.000 x g, for one hour at 4ºC and the activity from p-nitrophenilphosphatase (PNPPase) was determined at 37°C Culture medium was inoculate d with bacteria and supplemented with phosphorus. Under optimal conditions (5mM phosphorus, pH 3.5) the enzyme was expressed. The activity from p-nitrophenylphosphatase (PNPPase) was determined at 37°C. The enzyme presen ted Michaelis behavior for the hydrolysis of PNPP (specific activity of 30.67 U/mg, Km = 0.55 mM and n = 1). Besides site-site interactions were observed for ATP hydrolysis (specific activity of 11.2 U/mg, Km = 0.62 mM and n = 1.8) and pyrophosphate hydrolysis (specific activity of 15.64 U/mg, Km = 0.89 mM and n = 2.8). It was observed that enzyme activity decreased with increasing temperature. Inhibition studies revealed that copper inhibited the enzyme in a non-competitive manner. In contrast arsenate, and vanadate which are structural analogues of phosphate presented a competitive inhibition. The results suggest that plants expressing acid phosphatase are able to solubilize mineral phosphate and are able to hydrolyse insoluble minerals thereby increasing the availibilty of nutrients which can be used by the plant

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-03-27Bitstream added on 2014-06-13T19:55:55Z : No. of bitstreams: 1 nakagi_vs_me_jabo.pdf: 402591 bytes, checksum: bde6a86608bbb9a9d68eb164ee5cc8ca (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A produção de fosfatase ácida extracelular pelo fungo Penicillium implicatum foi estudada em diferentes concentrações de fosfato no meio de cultivo e na presença e ausência de agitação. A produção de fosfatase ácida extracelular repressível foi cerca de 15 vezes maior em meio agitado e na presença de 50 ìM de KH2PO4 quando comparada ao tratamento controle. A enzima foi purificada 19 vezes em Fenil Sepharose CL-4B, e apresenta uma atividade específica de 27,3U/mg. A enzima é um monômero de massa molecular (Mr) da ordem de 45KDa. O pH ótimo aparente das atividades p-NFFásica e de pirofosfatase é de 5,5. Os íons Zn, Mg, e Co; EDTA, tartarato e iodoacetamida exerceram pouca ou nenhuma influência sobre a atividade da fosfatase ácida de P. implicatum; enquanto que a enzima foi inibida por molibdato e arsenato. A enzima apresenta atividade pirofosfatásica de 297,78U/mg a 4mM de pirofosfato e pH 5,5. A cinética de hidrólise simultânea dos substratos PNFF e PPi mostrou que ambos os substratos ligaram-se ao mesmo sítio. A aplicação da fosfatase na hidrólise de fitato em ração animal sugere uma forma de disponibilizar fosfato para o organismo e também minimizar o impacto ambiental. / The extracellular production of acid phosphatase by Penicillium implicatum was studied at different concentrations of phosphate and in the presence and absence of agitation growth medium. The production of extracellular repressible acid phosphatase was about 15-fold highest in agitated medium with 50ì M of KH2PO4 when compared to the control treatment. The enzyme was purified 19-fold on Phenyl Sepharose CL-4B and showed specific activity of 27,3U/mg. The enzyme is a monomer with molecular weight (Mr) of ~ 45KDa. The optimum pH of the p-NPP and pyrophosphate activities was 5,5. The Zn, Mg, Ca, Mn and Co ions, EDTA and tartarate had no effects; but it was inhibitored by arsenate and molybdate. The pyrophosphate activity was 298U/mg at 4mM and pH 5,5. The kinetics data of simultaneous p-NPP and pyrophosphate hydrolysis, showed that both substrates had bound the same active site. The phosphatase application on fitate hydrolysis in animal food suggests a mean to dispose phosphate to the organism and also to minimize the environmental impact.