Dentre os diversos processos de formação de mineral em organismos vivos, a formação do tecido ósseo é um exemplo particular, uma vez que fosfatos de cálcio, na forma de hidroxiapatita, são produzidos em meio a fibrilas de colágeno na matriz extracelular de células osteogênicas; processo este regulado por um complexo enzimático. A fosfatase alcalina tecido não-específico (TNAP) desempenha um papel fundamental na histogênese óssea, responsável principalmente pela produção de fosfato inorgânico necessário para a formação dos minerais. Diversas abordagens experimentais permitem a reconstituição desta enzima em sistemas miméticos de membrana celular, dentre os quais, os filmes Langmuir-Blodgett (LB), que possibilitam a formação de materiais com propriedades osteoindutoras. No presente estudo, foi investigada a imobilização desta enzima em filmes LB sobre suportes de Ti. O ácido dimiristoil fosfatídico foi o fosfolipídeo utilizado na confecção dos filmes LB, obtendo um regime de deposição linear de massa em função do número de camadas depositadas em subfases de CaCl2. A TNAP foi imobilizada nos filmes através de duas metodologias: a partir da adsorção física da enzima aos filmes LB pré-transferidos a um suporte sólido, ou ainda por meio da construção do filme a partir de uma monocamada mista de DMPA/Ca2+/TNAP. Em ambas as metodologias adotadas, foi obtida uma diminuição drástica da atividade fosfohidrolítica da forma imobilizada da enzima, em relação à sua atividade obtida em meio homogêneo. Ao expor suportes de Ti modificados com os filmes LB em uma solução contendo íons Ca2+ e ATP como fonte de fosfato inorgânico, foi observada a formação de uma maior quantidade de mineral para as amostras contendo a TNAP imobilizada; atribuída a uma maior supersaturação local de íons fosfato devido a maior hidrólise de ATP na presença da enzima, demonstrando a capacidade desta em conferir à superfície modificada uma maior capacidade na indução de formação de mineral. Após este ensaio de mineralização in vitro, foi obtida uma maior hidrofilicidade das superfícies recobertas com os filmes LB na presença da TNAP, tornando estas superfícies modificadas mais bioativas. A presença dos filmes LB mistos de lipídeo/TNAP nas superfícies permitiram a adesão, proliferação e recobrimento homogêneo de células osteogênicas, que posteriormente promoveram o extravasamento de fibrilas proteicas e a formação de nódulos de mineralização. Estes resultados são importantes na confecção de materiais que acelerem o processo de osteoindução. / Among all the processes of mineral formation in living organisms, the osseous tissue formation is a particular example, since that calcium phosphates as hydroxyapatite are produced among collagen fibrils at the extracellular matrix of osteogenic cells, being this process regulated by an enzymatic complex. The tissue nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) plays a central role on the osseous histogenesis, responsible mainly for the inorganic phosphate production necessary for mineral formation. Various experimental approaches allows this enzyme reconstitution in cellular membrane mimetic systems, among which, the Langmuir-Blodgett films (LB), that allows the formation of materials with osteoinductive properties. With that in mind, the immobilization of that enzyme in titanium supports modified with LB films was investigated. The dimyristoyl phosphatidic acid was the phospholipid used in the LB film construction, obtaining a linear deposition-layer numbers relation in CaCl2 subphases. The TNAP was immobilized at the films through two main methodologies: from the physical adsorption of the enzyme to the LB film pre-constructed on a solid support, or through the film construction from the mixed DMPA/Ca2+/TNAP monolayer. At both the adopted methodologies, it was obtained a diminishment at the phosphohidrolytic activity of the immobilized enzyme, comparing to its activity at homogeneous media. Exposing the Ti supports with the LB films in a solution containing Ca2+ ions and ATP as a phosphate source, it was observed a higeher mineral formation to the samples containing the immobilized TNAP, possibly due to a higher phosphate ions supersaturation from the higher ATP hydrolysis at the presence of the enzyme, demonstrating the capacity of the TNAP in promoting a higher mineral formation induction to the modified surface. After this in vitro mineralization assay, it was obtained surfaces more hydrophilic at presence of the LB films containing TNAP, making those modified surfaces more bioactive. The mixed LB films presence at the surfaces allowed the adhesion, proliferation and homogeneous covering of osteogenic cells, that posteriorly promoted the production of proteic fibrils and mineralization nodules. Those results are important in order to construct materials more osteointegrative.

O fenômeno da bio- e quimiluminescência tem atraído o interesse da comunidade científica nas últimas décadas não só pelo seu inerente interesse acadêmico, mas também devido as incontáveis aplicações analíticas que dele têm surgido. A maior parte do trabalho acadêmico que tem sido desenvolvido está relacionado ao estudo do mecanismo de geração de estados excitados e a eficiência de desativação radiativa. Por outro lado, do ponto de vista das aplicações tecnológicas, as metodologias para análise de enzimas, drogas e metabólitos, aplicadas à imunologia, microbiologia, medicina forense, etc., que se baseiam em quimiluminescência, estão entre as mais utilizadas em procedimentos de rotina em laboratórios. O desenvolvimento de substratos e, conseqüentemente, novas técnicas quimiluminescentes tem se tornado cada vez mais importante devido a alta sensibilidade desses ensaios, tipicamente equivalente ou melhor do que aqueles que utilizam rótulos radioativos. Esta tese apresenta o desenvolvimento de novas metodologias quimiluminescentes para a determinação de atividade enzimática. O princípio químico é a geração de peróxidos cíclicos instáveis, conhecidos como 1,2-dioxetanos, após a hidrólise de substratos específicos, catalisada pela enzima objeto de estudo. Anéis dioxetânicos são conhecidos pela sua propriedade de gerar produtos em estados eletronicamente excitados quando decompostos. A emissão de luz pode ser relacionada à atividade enzimática. Foi desenvolvido o substrato (fosfato dissódico de 2-metil-1-propenila, NA-MPP) (I)), capaz de produzir o composto 2-metil-1-propen-1-ol quando hidrolisado via a ação catalítica das enzimas fosfatase alcalina (ALP) ou fosfatase ácida (ACP). Este enol é oxidado, sob ação catalítica da enzima peroxidase de raiz forte (HRP), gerando acetona em estado excitado triplete. A emissão de luz direta ou sensibilizada da acetona excitada pode ser correlacionada a atividade enzimatica da ALP ou ACP. A determinação da atividade dessas enzimas livres ou ligadas em anticorpos (conjugados ALP-IgG) tem grande aplicação em tecnologias de diagnóstico, seja como um marcador de diversas doenças, seja como uma sonda em ensaios imuno-enzimáticos (EIA). A sensibilidade alcançada com este substrato foi de 10-15 mols de ALP, 0,0027 unid. de ACP e diluições de até 300.000 de um conjugado (ALP-IgG) por ensaio. Também foi possível correlacionar a atividade de ALP à velocidade de consumo do oxigênio dissolvido no meio de reação, que é uma característica dessa oxidação. Partindo do mesmo princípio delineado no parágrafo anterior, desenvolveu-se um composto para determinação de proteases. Para isso, o composto N-etil-N-(2-metil-1-propenil)benzenamida (II) foi preparado, pois a clivagem de sua ligação amídica geraria uma enamina, que também pode ser oxidada pela ação catalítica da HRP. No entanto, nossos estudos mostraram que este composto não é reconhecido como substrato das proteases. Tomando como base a bem conhecida característica de gerar uma fraca emissão de luz quando derivados indólicos são oxidados por agentes oxidantes clássicos, como KMnO4, K2S2O4, etc., foi estudado o potencial quimiluminescente de alguns derivados indólicos quando submetidos ao sistema HRP/H2O2/O2. Como era esperado, detectou-se quimiluminescência de baixa intensidade para a maioria dos derivados indólicos. Também neste caso a clivagem do anel indólico, via um intermediário dioxetânico, parece ser a responsável pela emissão observada na maioria dos compostos testados. Além disso, a oxidação do composto 2-metilindol (III) mostrou uma eficiência de quimiluminescência com cerca de 3 ordens de grandeza maior que os demais derivados. Verificou-se que o comportamento diferenciado desse composto estava relacionado à exclusiva formação de um composto secundário. A estrutura desse composto foi parcialmente atribuída ao 2,2\'-dimetil-2,2\'-diindoxil. Então, utilizando o 2-metilindol como substrato, desenvolveu-se uma metodologia analítica para determinação de HRP livre ou ligada em anticorpos (conjugados HRP-IgG). Assim como no caso da enzima ALP, conjugados do tipo HRP-IgG são largamente utilizados em EIA. Também com base nas características quimiluminescentes de \'alfa\'-hidroperóxi-cetonas quando submetidas a um forte meio alcalino, desenvolveu-se um potencial substrato para análise de esterases. A hidrólise catalisada por esterase de 2-peracetoxiadamantano-2-carboxialdeído (IV) geraria um \'alfa\'-hidroperóxi-aldeído, que por um ataque nucleofílico intramolecular, levaria a um intermediário dioxetânico. Este composto mostrou-se instável, gerando quimiluminescência mesmo na ausência da enzima. Este fato inviabilizou o seu uso como planejado. / The bio- and chemiluminescent phenomena have attracted the scientists attention in the last decades not only because its inherent academic interests, but also due the uncounted analytical applications that it has originated. Most of the academic work was devoted to the study of the mechanism responsible for the generation of the excited states and the efficiency of radiative deactivation. On the other hand, the technological developments pointed to methodologies for enzyme, drug, and metabolite determination applied to immunological, microbiology, forensic science, etc., based on chemiluminescence, which are already among the most applied techniques in routine laboratory procedures. The development of chemiluminescent substrates has become increasingly important due to their high sensitivity, typically equivalent to or better than assays using radioactive labels. This thesis reports the development of new chemiluminescent methodologies for enzymatic activity determination. The chemical basis is the generation of unstable cyclic peroxides, called 1,2-dioxetanes, upon hydrolysis of specific substrates catalyzed by the target enzyme. Dioxetanes rings are known by their properties to generate electronically excited products upon decomposition. The light emission can be related to enzymatic activity. It was developed a substrate (dissodium 2-methyl-1-propenyl phosphate) (Na-MPP) (I) able to produce 2-methyl-1-propen-1-ol when catalytically hydrolyzed by alkaline (ALP) or acid (ACP) phosphatases enzymes. This enol is oxidized, upon horseradish peroxidase (HRP) action, yielding acetone in triplet excited state. The direct or sensitized light emission of the excited acetone can be correlated to enzymatic activity of ALP or ACP. The activity of this enzyme, free or bound to antibody (ALP conjugates), is widely used in diagnostic technologies, either as a direct marker of several diseases or as an enzymatic probe in enzyme immunoassays (EIA). The sensibility reached with this substrate was 10-15 mols to ALP, 0,0027 u/mL to ACP and dilutions up to 300.000 of ALP-IgG per assay. Since the HRP system consumes dissolved oxygen during the oxidation of the enol, ALP quantification may be performed by following the oxygen uptake rate. By applying the same principle above delineated, it was synthesized a compound for proteases activity determination. Thus, the compound N-ethyl-N-(2-methylpropen-1-yl)benzenamide (II) was prepared, since its hydrolysis would lead to an enamine , which is known to be oxidized via HRP with light emission. However, our studies showed that II is not recognized as a substrate by proteases. Owning to the well known weak emission elicited when indole derivatives are oxidized by classical oxidants like KMnO4, K2S2O4, etc., it was studied the chemiluminescent potential when indoles are submitted to the HRP/H2O2/O2 oxidant system. Indeed, weak chemiluminescence was detected for almost all derivatives. Likewise, the oxidation of 2,3-bond of indoles, through a dioxetane intermediate leading to an open-ring product, seems responsible for this emission. Furthermore, the oxidation of 2-methylindole (III) showed a chemiluminescence efficiency about 3 orders of magnitude higher. It was observed that the high chemiluminescent yield was related to exclusive formation of a secundary product. Its structure was partially attributed to 2,2\'-dimethyl-2,2\'-diindoxil. Thus, using 2-methylindole as substrate was possible to develop an analytical procedure to quantify HRP activity, free or bound to antibodies (conjugates HRP-IgG). In EIA the enzymes HRP and ALP are the most important labels. From the also known chemiluminescent characteristics of \'alpha\'-hidroperoxy-ketones, when submitted to strong alkaline medium, it was developed a potential substrate to esterases. The esterase catalyzed hydrolysis of 2-acetylperoxiadamantane-2-carboxaldeyde (IV) would generate an \'alpha\'-hidroperoxy-aldeyde which, by an intramolecular nucleofilic attack, would lead to a dioxetane intermediate. This compound showed to be unstable and it generated chemiluminescence in the absence of the enzyme. This fact impaired its use as planned.

Um dos bens mais preciosos da Humanidade é a água. Embora ela seja abundante no planeta, grande parte é imprópria para o consumo humano. E, devido ao crescimento populacional intenso, à concentração urbana e à poluição dos corpos d\'água superficiais e subterrâneos, a quantidade de água em condições para consumo vem se reduzindo em taxas alarmantes. Recentemente, um dos tipos mais comuns de contaminação dos corpos d´água tem sido a presença de cianotoxinas. Atualmente, não existe um estado brasileiro que não tenha problemas com florações excessivas de algas e os correspondentes transtornos causados às concessionárias que operam as estações de tratamento. Tem-se apontado que esse fato é devido principalmente ao aporte de nitrogênio e fósforo derivado do uso indiscriminado de detergentes e fertilizantes. O presente estudo tem como objetivo investigar a aplicação da fotocatálise heterogênea solar (TiO2 como fotocatalisador) na destruição da [D-Leu]-Microcistina-LR, potente toxina de ampla ocorrência nas florações de cianobactérias. A [D-Leu]-Microcistina-LR foi extraída de uma cultura de Microcystis æruginosa. Foi utilizado um reator de placa plana de vidro recoberta com TiO2 para os estudos de degradação. Além disso, a irradiância durante os experimentos solares foi medida com o uso de espectrorradiômetro. Após os ensaios de degradação, a concentração da toxina foi determinada por CLAE. A cinética de mineralização da solução tratada foi determinada através de análises de COT. A toxicidade aguda e crônica do efluente foi quantificada através de análises utilizando camundongos e ensaios in vitro de inibição da proteína fosfatase. A partir dos experimentos realizados, pôde-se observar que foi necessário um tempo de tratamento de 150 min para que a concentração da microcistina fosse reduzida aos valores exigidos por lei (de 10 para 1 μg L-1). Outra constatação muito importante que pôde ser feita é que a fotocatálise heterogênea solar foi eminente destrutiva, não só para a toxina, mas também para os demais componentes do extrato e dos compostos de degradação gerados. Obteve-se uma remoção de carbono de aproximadamente 90% com 90 min de exposição ao Sol. Além disso, os testes de toxicidade utilizando camundongos mostraram que o efeito agudo causado pela amostras iniciais foi eliminado; entretanto, os testes utilizando a enzima fosfatase indicaram que podem ter sido formados subprodutos que produzam um efeito crônico em mamíferos. Os experimentos realizados apontam para a viabilidade do uso da fotocatálise heterogênea solar para o tratamento de águas contaminadas pela [D-Leu]-Microcistina-LR, não só devido à sua destruição, mas também à grande remoção de matéria orgânica que pode ser alcançada. / One of the most precious assets of mankind is the water. Although it is abundant in the planet, the majority of it is not suited for human consumption. Due to the intense population growth, to the urban concentration, and to the pollution of surface water bodies and ground water, the amount of freshwater is decreasing at alarming rates. Recently, a common type of water bodies\' contamination is the presence of cyanotoxins. Presently, all over Brazil there are records of excessive algae blooms, with the corresponding nuisances caused to the companies that run water treatment stations. This fact is thought to be a result of nitrogen and phosphorus inputs due to the indiscriminate use of detergents and fertilizers. The purpose of the present study is to investigate the use of solar heterogeneous photocatalysis (TiO2 as the photocatalyst) for the destruction of [D-Leu]-Microcystin-LR, powerful toxin of widespread occurrence within cyanobacteria blooms. The [D-Leu]-Microcystin-LR was extracted from a culture of Microcystis æruginosa. It was used a flat plate glass reactor covered with TiO2 for the degradation studies. The irradiance was measured during the experiments with aid of a spectrum radiometer. After the degradation experiments, the toxin concentration was determined by HPLC. The mineralization kinetics was determined by TOC analyses. The acute and chronic toxicities were quantified using mice and phosphatase inhibition in vitro assays. From the performed experiments, it was determined that 150 min are necessary to reduce the toxin concentration to the value demanded by law (from 10 to 1 μg L-1). Another important finding is that the solar heterogeneous photocatalysis was really destructive process, not only for the toxin, but also for the other extract components and degradation products generated. A mineralization degree of 90% was achieved with 90 min of exposure to the sun. Moreover, toxicity tests using mice have shown that the acute effect caused by the initial sample was removed. However, tests using the phosphatase enzyme indicated that it may be formed products capable of inducing chronic effects on mammals. The performed experiments indicate the feasibility of using solar heterogeneous photocatalysis for treating contaminated with [D-Leu]-Microcystin-LR, not only due to its destruction, but also to the significant removal of organic matter that can be achieved.

As serina/treonina fosfatases (PPs) são enzimas responsáveis pela desfosforilação de resíduos de fosfoserina e/ou fosfotreonina e estão subdivididas em duas famílias gênicas designadas PPP e PPM. A família PPP está dividida em cinco subfamílias, que compreendem as PPs do tipo 1 (PP1), 2A (PP2A), 2B (PP2B), 5 (PP5) e 7 (PP7), de acordo com a similaridade entre as sequências de aminoácidos das subunidades ou domínios destas enzimas. Novas PPs estão sendo descobertas em diferentes organismos e classificadas nestas famílias ou subfamílias com base na análise comparada de suas sequências. Uma delas é a proteína fosfatase do tipo 4 (PP4), descoberta originalmente em coelhos e cujas funções biológicas vêm sendo progressivamente elucidadas. Neste estudo tivemos como objetivos a identificação e caracterização de uma nova serina/treonina fosfatase de Dictyostelium discoideum. Para isto, rastreamos uma biblioteca de cDNA e um cDNA completo que codifica a subunidade catalítica da fosfatase do tipo 4 (PP4c) foi isolado e seqüenciado. Verificamos que o gene da PP4c é essencial e está presente em cópia única localizada no cromossomo 2, originando um mRNA expresso ao longo de todo o ciclo de vida de D. discoideum. Imunodetecção da PP4c realizada com anticorpo específico indicou que os níveis desta proteína também são constitutivos. Observamos que a superexpressão da PP4c sob o controle de um promotor constitutivo não causa alterações fenotípicas detectáveis. A análise da localização celular da PP4c expressa em células de D. discoideum como proteína de fusão com GFP (Green Fluorescent Protein) revelou que a enzima está localizada no citossol, contrastando com outros organismos, onde ela se encontra enriquecida no centrossomo. Por fim, descrevemos neste trabalho, além da organização genômica da PP4, a estrutura dos genes de todas as serina/treonina fosfatases da família PPP encontradas no cromossomo 2 e apresentamos dados das relações entre estas enzimas de D. discoideum. / The serine/threonine protein phosphatases (PPs) are enzymes responsible for dephosphorylation of phosphoserine and/or phosphothreonine residues and are divided in two gene families designated as PPP and PPM. The PPP family is divided in five subfamilies, which comprise type 1 (PP1), 2A (PP2A), 2B (PP2B), 5 (PP5) and 7 (PP7) phosphatases. This subdivision is based on aminoacid sequence similarity or enzyme domains. Novel PPs have been discovered in different organisms and classified in these families or subfamilies based on comparative sequence analysis. One of these is type 4 protein phosphatase (PP4), originally discovered in rabbit, which functions have been progressively uncovered. In this study our goal is to identify and characterize a novel serine/threonine phosphatase in Dictyostelium discoideum. We first screened a cDNA library and isolated a complete cDNA encoding the catalytic subunit of protein phosphatase 4 (PP4c), confirmed by manual DNA sequencing. The PP4c is an essential, single-copy gene located in chromosome 2, which encondes a mRNA constitutively expressed throughout D. discoideum life cycle. Immunodetection of PP4c performed with specific antibodies indicated corresponding protein levels. Overexpression of PP4c under a strong promoter caused no detectable phenotype. Subcellular localization of PP4c expressed as a GFP-fusion protein revealed its cytosolic location, in contrast to other organisms, where it has been reported to be enriched in centrosomes. We also describe here the genetic organization of PP4c, the genetic structure of all serine/threonine protein phosphatases belonging to the PPP family found in chromosome 2, and a phylogenetic analysis indicating relationships among these enzymes in D. discoideum and other selected organisms.

A fosfatase alcalina é uma fosfomonohidrolase inespecífica, capaz de hidrolisar monoésteres de fosfato, pirofosfato, diésteres de fosfato, bem como catalisar reações de transfosforilação, e é denominada \"alcalina\" por sua habilidade de efetuar estas reações mais eficientemente em pH acima do neutro (pH 8-11). O objetivo deste trabalho foi padronizar uma metodologia para a obtenção de uma fração de membrana rica em fosfatase alcalina a partir de culturas de células osteoblásticas, provenientes de medula óssea de rato, sem a utilização de solventes orgânicos, colagenase ou outras proteases. O procedimento padronizado é simples e reprodutível, com a vantagem da considerável redução do tempo necessário para se obter esta fração de membrana, o que contribui para um menor efeito desnaturante sobre a enzima. A fosfatase alcalina é inserida à membrana plasmática por uma âncora GPI e foi solubilizada tanto com polidocanol (1%, p/v) quanto com PIPLC (0,2 U/mL), hidrolisando diversos substratos (PNFF, ATP, PPi, ADP, ?-glicerofosfato, glicose-1-fosfato, glicose-6-fosfato e frutose-6-fosfato) e sendo inibida por inibidores clássicos deste grupo de enzimas (levanisol, teofilina, ZnCl2, vanadato, fosfato e arsenato). Os efeitos de lipossomos constituídos por DPPC, DPPC:DPPS (9:1 e 8:2, razão molar) e DPPC:DODAB (9:1 e 8:2, razão molar) na habilidade tanto de inserção da enzima nos sistemas vesiculares, bem como de modulação da atividade da enzima reconstituída, também foram avaliados. A reconstituição da fosfatase alcalina nos lipossomos mistos constituídos de DPPC:DPPS (9:1), DPPC:DPPS (8:2) e DPPC:DODAB (8:2) proporcionou máxima incorporação da atividade PNFFase da enzima (cerca de 90%, 75% e 90%, respectivamente) após 4 horas, 5 horas e 40 minutos, respectivamente, de incubação dos diversos lipossomos com a proteína. No entanto, utilizando lipossomos de DPPC:DODAB (9:1), apenas cerca de 50% da atividade PNFFase da enzima foi incorporada aos sistemas mesmo após 5 horas de incubação. Para os lipossomos com carga positiva, uma maior proporção de DODAB nos sistemas de DPPC favoreceu a inserção da fosfatase alcalina aos sistemas após um curto período de incubação. Para os lipossomos com carga negativa, as diferentes proporções de DPPS utilizadas não exerceram grande influência tanto na velocidade de incorporação quanto na quantidade de enzima incorporada aos sistemas. Para todos os sistemas utilizados, o processo de incorporação é tempo dependente. A eletroforese dos proteolipossomos de DPPC revelou a presença de uma única banda protéica bem intensa, com massa molecular ao redor de 60 kDa (quando desnaturada), que apresentou atividade de fosfomonohidrolase em condição não-desnaturante, com massa molecular de 120 kDa. Assim, com esta estratégia, foi possível obter proteolipossomos ricos em fosfatase alcalina devido à inserção preferencial da âncora de GPI às bicamadas lipídicas, em detrimento das outras proteínas que não interagem favoravelmente com os sistemas vesiculares, comprovando que a metodologia de reconstituição padronizada pode ser usada eficientemente na obtenção de sistemas de proteolipossomos sem a necessidade de uma etapa de purificação prévia da enzima solubilizada, de modo a se obter um máximo de incorporação da enzima às vesículas com mínima perda em atividade. A reconstituição da enzima empregando-se células ghost resseladas foi obtida incubando-se volumes iguais de enzima (23 ?g/mL) e células ghost (0,22 mg/mL), por 2 horas, a 25ºC, com cerca de 40% da atividade PNFFase da fosfatase alcalina incorporada às vesículas. Para verificar o efeito do microambiente da membrana sobre a atividade da enzima reconstituída, foram determinados os parâmetros cinéticos de hidrólise para diferentes substratos (ATP, PPi e PNFF). Para todos os substratos, uma única classe de sítios de hidrólise foi observada, com valores de K0,5 que variaram de 0,14 a 2,7 mM. Excesso de PPi e ATP no meio reacional inibiu as atividades PPase e ATPase da enzima reconstituída, respectivamente, em todos os sistemas estudados. A hidrólise de PPi apresentou efeitos cooperativos positivos para todos os sistemas, enquanto que para a hidrólise de ATP, uma pequena cooperatividade positiva foi observada apenas para os sistemas constituídos de DPPC e contendo DPPS em sua composição. Assim, a enzima não perdeu a habilidade de hidrolisar nenhum dos substratos quando reconstituída nos diferentes sistemas vesiculares, e todos os dados obtidos reforçam a hipótese de que a composição lipídica do microambiente onde a fosfatase alcalina se encontra exerce grande influência na modulação tanto da atividade da enzima quanto da interação da mesma com os sistemas vesiculares. Assim, os resultados obtidos fornecem novas informações que poderão contribuir tanto para a compreensão dos mecanismos de interação da fosfatase alcalina com a membrana, quanto para estudos da função da enzima durante o processo de biomineralização. / Alkaline phosphatase is a multifunctional enzyme, capable of hydrolyzing phosphate monoesters, pyrophosphate, phosphodiesters, as well as catalyzing transphosphorylation reactions, and it is named \"alkaline\" due to its ability to perform these reactions more efficiently in pH above the neutral (pH 8-11). The aim of this work was to standardize a methodology to obtain a membrane fraction rich in alkaline phosphatase from osteoblastic cells cultures, originated from rat bone marrow, without the use of organic solvents, collagenase or others proteases. The standardized procedure is simple and easy to reproduce, with the advantage of considerable reduction in the time needed to obtain this membrane fraction, which contributes to a smaller denaturing effect on the enzyme. Alkaline phosphatase is a membrane-bound enzyme attached to the cell membrane via a GPI anchor and was solubilized with both polidocanol (1%, w/v) and PIPLC (0,2 U/mL), hydrolyzing several substrates (PNPP, ATP, PPi, ADP, beta-glycerophosphate, glucose-1-phosphate, glucose-6-phosphate and fructose-6-phosphate) and being inhibited by some classical inhibitors of this group of enzymes (levamisole, theophylline, ZnCl2, vanadate, phosphate and arsenate). The effect of liposomes constituted by DPPC, DPPC:DPPS (9:1 and 8:2, molar ratio) and DPPC:DODAB (9:1 and 8:2, molar ratio) on the enzyme insertion ability in the vesicular systems and activity modulation of the reconstituted enzyme were also evaluated. The alkaline phosphatase reconstitution in the mixed liposomes constituted by DPPC:DPPS (9:1), DPPC:DPPS (8:2) and DPPC:DODAB (8:2) presented maximum incorporation of the PNPPase enzyme activity (about 90%, 75% and 90%, respectively) after 4 hours, 5 hours and 40 minutes, respectively, of incubation of the several liposomes with the protein. However, using DPPC:DODAB (9:1) liposomes, only about 50% of the PNPPase enzyme activity was incorporated in the systems, even after 5 hours of incubation. For positive charged liposomes, a higher proportion of DODAB in the DPPC systems favored the alkaline phosphatase insertion into it after a short period of incubation. For negative charged liposomes, the different proportions of DPPS used did not have a big influence in both, incorporation velocity and quantity of incorporated enzyme into the systems. For all the systems used, the incorporation process is time dependent. SDS-PAGE of the DPPC proteoliposomes revealed only a single protein band, with molecular mass of about 60 kDa (when denaturated), which presented phosphomonohydrolase activity under non-denaturing conditions, with molecular mass of about 120 kDa. Thus, using this strategy, it was possible to obtain proteoliposomes rich in alkaline phosphatase due to the preferential insertion of the GPI anchor in the lipid bilayers, since the other proteins do not interact favorably with the vesicular systems. This proves that the standardized methodology for reconstitution can be used efficiently to obtain proteoliposomes systems without prior purification of the solubilized enzyme, with its maximum incorporation in the vesicles and a minimum loss of activity. The reconstitution of the enzyme using resealed ghost cells was obtained by incubating equal volumes of enzyme (23 microg/mL) and ghost cells (0,22 mg/mL), for 2 hours, at 25ºC, with about 40% of the alkaline phosphatase PNPPase activity being incorporated into the vesicles. To verify the effect of the membrane microenvironment on the activity of the reconstituted enzyme, the kinetic parameters for the hydrolysis of different substrates (ATP, PPi and PNPP) were determined. For all the substrates, only one class of hydrolysis sites was observed, with K0,5 values that varied from 0,14 to 2,7 mM. Excess of PPi and ATP in the reaction medium inhibited the PPase and ATPase activities of the reconstituted enzyme, respectively, in all systems studied. PPi hydrolysis presented positive cooperative effects for all systems, while for ATP hydrolysis a small positive cooperativity was observed only for the systems constituted by DPPC and containing DPPS in its composition. Thus, the enzyme did not lose the ability to hydrolyse any of the studied substrates when reconstituted in the different vesicular systems and all the data obtained strengthen the hypothesis that the lipid composition of the microenvironment where the alkaline phosphatase is located plays a great influence on the modulation of both enzyme activity and enzyme interaction with the vesicular systems. Thus, the results obtained provide new information that could contribute to the comprehension of the interaction mechanisms of the alkaline phosphatase with the membrane, as well as to studies of the enzyme function during the biomineralization process.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência das características química e de rugosidade da superfície de titânio sobre a adesão, proliferação e diferenciação de células semelhantes aos osteoblastos de rato (Osteo-1), cultivados em meio de cultura adicionado de BMP-7. MATERIAL E MÉTODO: Células Osteo-1 foram cultivadas sobre discos de titânio com superfícies:1) lisa, 2) jateada por areia de grânulos grandes e atacada por ácido (SLA) e 3) rugosa SLA e quimicamente modificada e hidrofílica (SLAactive) na presença ou ausência de 20ng/ml de rhBMP- 7 no meio de cultura. A adesão e viabilidade das células Osteo-1 foram analisadas após 24 horas de contato com as superfícies em estudo. A diferenciação celular foi avaliada através da análise do conteúdo de proteína total (PT), conteúdo de colágeno, atividade de fosfatase alcalina (ALPase), em 7, 14 e 21 dias, e da formação de matriz mineralizada, em 21 dias. Os resultados foram comparados pela análise de variância (ANOVA) e teste de Tukey. RESULTADOS: A adesão (p=0.3485) e a viabilidade (p=0.5516) celular, o conteúdo de colágeno (p=0.1165) e a formação de matriz mineralizada (p=0.5319) não foram afetados pelas diferentes superfícies ou pela adição de rhBMP-7 ao meio. Células Osteo-1 cultivadas sobre superfície SLA apresentaram um aumento significativo no conteúdo de proteína total aos 21 dias. A relação atividade de ALPase/PT (p=0.0000) foi afetada pelos tratamento e tempo. CONCLUSÃO: Os resultados sugerem que a adição de rhBMP- 7 ao meio de cultura não promoveu efeito sobre a adesão, proliferação e diferenciação de células semelhantes a osteoblastos nas diferentes superfícies testadas. Todas as superfícies de titânio testadas permitiram uma completa expressão do fenótipo de osteoblasto como a mineralização da matriz pela célula Osteo-1. / The aim of the present study was to assess the influence of the chemical characteristics and roughness of titanium surfaces on the attachment, proliferation and differentiation of osteoblast-like cells cultured in medium supplemented with bone morphogenetic protein-7 (BMP-7). METHODS: Osteo-1 cells were grown on titanium discs presenting the following surfaces: 1) machined surface, 2) coarse gritblasted and acid-etched (SLA), and 3) modified SLA (SLAactive) in the absence or presence of 20 ng/ml rhBMP-7 in culture medium. The attachment and viability of osteo-1 cells were evaluated after 24 h. Cell differentiation was evaluated by analysis of total protein content (TP), collagen content and alkaline phosphatase (ALPase) activity at 7, 14 and 21 days and of mineralized matrix formation at 21 days. The results were compared by analysis of variance (ANOVA) and Tukey\'s test. RESULTS: Cell attachment (p=0.3485), cell viability (p=0.5516), collagen content (p=0.1165) and mineralized matrix formation (p=0.5319) were not affected by the different surfaces or by the addition of rhBMP-7 to the medium. Osteo-1 cells cultured on SLA surface presented a significant increase in TP at 21 days. The ALPase/TP ratio (p=0.0000) was affected by treatment and time. CONCLUSION: The results suggest that the addition of rhBMP-7 to the culture medium did not promote any effect on the adhesion, proliferation or differentiation of osteoblast-like cells grown on the different surfaces tested. All titanium surfaces analyzed permitted the complete expression of the osteoblast phenotype such as matrix mineralization by osteo-1 cells.

A mineralização do esqueleto começa dentro de vesículas matriz derivadas de células (MVs); então, os minerais se propagam para a matriz de colágeno extracelular. A fosfatase alcalina não específica de tecido (TNAP) degrada o pirofosfato inorgânico (PPi), um potente inibidor da mineralização, quee contribui com Pi (Fosfato) de ATP para iniciar a mineralização. Em comparação com a membrana plasmática, as MVs são ricas em Colesterol (Chol) (32%) e TNAP, mas como o Chol influencia a atividade da TNAP ainda não está claro. Nós reconstituímos TNAP em lipossomos de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dimiristoilfosfocolina (DMPC) dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) combinada com Chol ou seus derivados Colestenona (Achol) e Ergosterol (Ergo). Comparamos as propriedades cinéticas: Velocidade máxima de hidrólise (Vmax), constante de afinidade (k0,5), cooperatividade (n) e eficiência catalítica (kcat / k0,5) da TNAP para os substratos fisiológicos ATP e PPi, quando o TNAP é incorporada nestes diferentes microambientes lípidicos. O DPPC mais 36% de esteróis em lipossomos aumentaram a atividade catalítica do TNAP em relação ao ATP. A presença de Chol também aumentou a propagação de minerais em 3,4 vezes. A eficiência catalítica da TNAP em relação ao ATP foi quatro vezes menor nos proteolipossomos de DOPC, em comparação aos proteolipossomos do DPPC. Os proteolipossomos DOPC também aumentaram a biomineralização 2,8 vezes em comparação com os proteolipossomos de DPPC. O TNAP catalisou a hidrólise do ATP mais eficientemente no caso do proteolipossomo consistindo em DOPC com 36% de Chol. O mesmo comportamento surgiu com Achol e Ergo. A organização do lipídio e a estrutura do esterol influenciaram a tensão superficial (), a atividade fosfohidrolítica do TNAP na monocamada e a eficiência catalítica do TNAP nas bicamadas. Membranas na fase L (Achol) proporcionaram melhores parâmetros cinéticos em relação às membranas na fase Lo (Chol e Ergo). a presença de SM ou Chol: SM 90:10 (mol%), proteolipossomos DPPC não alterou os valores de eficiência catalítica, para a hidrólise do ATP. No entanto, estes proteolipossomos aumentaram a propagação mineral em cerca de 4,5 e 8 vezes, respectivamente, em comparação com DPPC puro. O aumento na eficiência catalítica para proteolipossomos contendo DMPC: SM 90:10 e DMPC: Chol: SM 80:10:10 (% molar) foi observado. Em conclusão, as propriedades físicas e a organização lateral de lipídios em proteolipossomas são cruciais para o controle. propagação mineral mediada pela atividade da TNAP durante a mineralização / Mineralization of the skeleton starts within cell-derived matrix vesicles (MVs); then, minerals propagate to the extracellular collagenous matrix. Tissuenonspecific alkaline phosphatase (TNAP) degrades inorganic pyrophosphate (PPi), a potent inhibitor of mineralization, and contributes Pi (Phosphate) from ATP to initiate mineralization. Compared to the plasma membrane, MVs are rich in Cholesterol (Chol) (32%) and TNAP, but how Chol influences TNAP activity remains unclear. We have reconstituted TNAP in liposomes of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), dimyristoylphosphocholine (DMPC) dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) combined with Chol or its derivatives Cholestenone (Achol) and Ergosterol (Ergo). We compare the kinetic properties: maximum rate of hydrolysis (Vmax), affinity constant (k0,5), cooperativity (n) and catalytic efficiency (kcat / k0,5) of TNAP for the physiological substrates ATP and PPi, when TNAP is incorporated in these different microenvironments lipids. DPPC plus 36% sterols in liposome increased the catalytic activity of TNAP toward ATP. The presence of Chol also increased the propagation of minerals by 3.4-fold. The catalytic efficiency of TNAP toward ATP was fourfold lower in DOPC proteoliposomes as compared to DPPC proteoliposomes. DOPC proteoliposomes also increased biomineralization by 2.8-fold as compared to DPPC proteoliposomes. TNAP catalyzed the hydrolysis of ATP more efficiently in the case of the proteoliposome consisting of DOPC with 36% Chol. The same behavior emerged with Achol and Ergo. The organization of the lipid and the structure of the sterol influenced the surface tension (), the TNAP phosphohydrolytic activity in the monolayer, and the TNAP catalytic efficiency in the bilayers. Membranes in the L phase (Achol) provided better kinetic parameters as compared to membranes in the Lo phase (Chol and Ergo). The presence of SM or Chol:SM 90:10 (mol%), DPPC-proteoliposomes did not alter the catalytic efficiency values, for the ATP hydrolysis. However, these proteoliposomes increased the mineral propagation by about 4.5 and 8-fold, respectively, compared to neat DPPC. The increase in catalytic efficiency for proteoliposomes containing DMPC:SM 90:10 and DMPC:Chol:SM 80:10:10 (mol%) was observed. In conclusion, the physical properties and the lateral organization of lipids in proteoliposomes are crucial to control mineral propagation mediated by TNAP activity during mineralization

A observação de que os RNPMBPN alimentados com leite materno ou fórmula láctea não específica para prematuros estão em risco de desenvolvimento de deficiência osteomineral estimulou-nos ao desenvolvimento desse estudo. Nosso objetivo~ foi o de verificar se a adição de Cálcio e Fósforo a dieta oferecida aos RNPMBPN interfere na concentração da F A, levando em conta seu envolvimento no metabolismo ósseo. Foram selecionados 71 neonatos prematuros com PN inferior a 1500g de IO de inferior a 35 semanas divididos em 2 grupos. No OI os neonatos (n 37) receberam leite-matemo ou fórmula para lactentes a termo acrescido de sais de Ca e P; e no 02 (n 34)~ os neonatos receberam apenas leite matemo ou a mesma fórmula. Paralelamente~ selecionou-se um terceiro grupo de neonatos a termo AIO alimentados com LM ou fórmula. Ao ingressar no estudo não houve diferenças significativas entre os grupos G I e 02 com relação ao PN, PCN~ CN~ Sexo e IG. Os dois grupos receberam o mesmo volume de alimentação e taxas calóricoprotéicas semelhantes. Os RNPMBPN foram acompanhados com dosagens séricas quinzenais de Ca., P e FA ate atingirem 2000g. Não houve diferença significativa na média do Ca sérico nos G I e G2, mas em relação ao grupo 3 - a média do Ca sérico foi significativamente mmor do que nos outros 2 grupos. Encontrou-se resultados semelhantes com relação ao P sérico. A média da. concentração da. FA entre Gl e G2 diferiu significativamente a partir da. quarta semana de vida. A comparação das médias da concentração da. F~ nas diversas idades, entre Gl e G3 não mostra diferença significativa; no entanto, há significância. entre as médias de G2 e G3. Em sete neonatos de G2 - que alcançaram a concentração da F A 5 vezes o limite superior considerado como normal iniciou-se a. suplementação de Ca e P. Em todos houve a. diminuição da. concentração da. F A, com diferença estatisticamente significativa considerando-se o grupo. Concluímos que a medida da concentração da FA é um método útil e eficiente para a monitorização da. DOMP nos neonatos. Podemos concluir també~ que o leite humano eJou as fórmulas lácteas não especificas para RNPMBPN são inadequadas para. a sua alimentação, tendo em vista. o deficiente aporte de Ca e P, sendo necessária., a suplementação desses sais na. tentativa. de prevenir a DOMP. / The observation 1hat 1he VLBW infants fed wi1h breast-milk or with a not specified cow milk-based formula for prematures suffer any risk of developping osteomineral deficiency encouraged us to work on this subject Our aim was to prove whether the addition of Calcium and Phosphor to the diet offered,to VLBW infants interferes in the concentration o f AP (phosphatase Alkaline ), taking into accowtt its envolvement in 1he bone metabolism. Seventy one (71) premature newbom with BW ~ 1500 gr and GA ~ 35 weeks were selected and divided into two groups. In G 1 the fullterm newbom (n ± 37) received breast miik or a cow milk-based formula enriched by CA (calcium) and P (phosphorus) salts; and in G2 (n=34) the newbom received only breast milk or the same formula At 1he same time a third group of newborn was selected and fed, apropriate for the gesta:tional age, wi1h breast milk or formula In 1he begirming of this study there were no significant di:fferences between Gl and G2 with relation to PN, PCN, CN, sex and gestational age. The two groups received same volume of nourishment and with similar caloric-proteic rates. The VLBW infants were accompanied by weekly serial doses of CA, P and AP tmtil reaching 2. 000 gr. No significa.tive difference in the average of CA serial in G 1 and G2 appeared, but in rela.tion to G3 the seral CA average was considerably higher than in the other 2 groups. Similar results were found with relation to P (phosphorus) serial. The concentration average o f AP between G 1 and G2 differed considerably from the fourth week of life on. The comparison o f the AP concentration-average does not show significative difference; however, there is a sigficance between the average of G2 and 03. To seven newbom of G2, who reached a FA concentration 5 times higher than the superior Iimit considered normal, an addition of CA and P was given. In ali of them there was a descresse of the FA concentration with a significant statistically proved di.fference considering the group. W e concluded that the FA concentration rate is a useful and efficient method for the monitorization of the MBDP (Metabolic Bone Disease) of newbom. We may also conclude that human milk andlor non specific milk formula for VLBW infants are inadequate for their nourishment, due to the defficient amount of CA and P, a suplementation of these salts being therefore necessary in order to prevent Metabolic Bone Disease of Prematurity (MBDP).

Nesse trabalho, estudou-se a incorporação da fosfatase alcalina de placa óssea de ratos em dois tipos de sistemas modelo que mimetizassem uma membrana celular: as monocamadas de Langmuir e os filmes Langmuir-Blodgett (LB), ambos formados com fosfolipídios. No intuito de se investigar o papel da âncora de glicosilfosfatidilinositol (GFI), covalentemente ligada ao grupo carboxi-terminal da cadeia polipeptídica, duas formas da enzima foram estudadas: uma com a âncora GFI intacta, solubilizada por ação de um tensoativo não-iônico, e a outra sem a parte hidrofóbica dessa âncora, clivada por ação de uma fosfolipase específica. A primeira forma enzimática foi chamada de FAT (fosfatase alcalina solubilizada por tensoativo), e a segunda de FAC (fosfatase alcalina clivada). Diferenças marcantes na atividade superficial foram observadas entre as duas formas. Comparativamente, a forma FAT adsorve mais rapidamente à interface ar/água que a forma FAC, que mostra um tempo de indução significativo. A incorporação da forma FAT às monocamadas de ácido dimiristoilfosfatídico (DMPA) também ocorre mais rapidamente que a forma FAC. No entanto, o uso de alta força iônica acelerou a adsorção da forma FAC à interface ar/água (com ou sem DMPA). Uma pressão de superfície de exclusão de 20mN/m foi encontrado para a forma FAC, enquanto para a forma FAT, essa pressão representa uma mudança no perfil das curvas pressão x tempo. Isso revelou que, devido à presença da âncora GFI, essa forma enzimática é capaz de incorporar às monocamadas de DMPA, mesmo em altas pressões de superfície. Isotermas superficiais de monocamadas mistas de DMPA e fosfatase alcalina também mostraram diferentes perfis para duas formas enzimáticas estudadas. Enquanto a forma FAT provoca uma alteração na compressibilidade em pressões de até 20mN/m, a forma FAC desloca a curva pressão x área para áreas mais elevadas. Tal fato foi explicado pelo fato da forma FAT incorporar na monocamada preferencialmente com a âncora GFI posicionada entre as cadeias apolares do DMPA, enquanto a forma FAC deva incorporar a cadeia polipeptídica à interface lipídica . Microscopias de fluorescência e no ângulo de Brewster revelaram que a forma FAT provoca agregação espontânea do DMPA na interface ar/água, levando a uma microeterogeneidade, na qual três fases distintas podem ser observadas. A obtenção de espectros de infravermelho na interface ar/água, associada com medidas de atividade catalítica in situ, revelou que a atividade da fosfatase alcalina é modulada pela capacidade de empacotamento interfacial, medida pelo módulo de compressibilidade superficial. Em 20mN/m, há uma reorganização molecular na interface, o que vai restringir a flexibilização da cadeia polipeptídicia, que estará voltada para a interface ar/água. No entanto, ao menos até 30mN/m, nenhuma alteração conformacional foi detectada, como revelada pelos espectros de infravermelho. Filmes LB mistos de DMPA e as duas formas de fosfatase alcalina revelaram que o empacotamento máximo de proteína depende da presença da âncora GFI. Dados usando microgravimetria, atividade enzimática, infravermelho, elipsometria, e microscopia de força atômica mostraram que a adsorção da âncora na interface posiciona o eixo maior do elipsóide, formador da cadeia polipeptídica, paralelamente à matriz lipídica. Na ausência da âncora GFI, o posicionamento da cadeia polipeptídica na interface é aleatório, e para um alto grau de empacotamento, as interações entre os resíduos de aminoácidos intermoleculares favorecerão o posicionamento do eixo maior do elipsóide em uma posição mais perpendicular à interface lipídica / Não consta

A mineralização do esqueleto começa dentro de vesículas matriz derivadas de células (MVs); então, os minerais se propagam para a matriz de colágeno extracelular. A fosfatase alcalina não específica de tecido (TNAP) degrada o pirofosfato inorgânico (PPi), um potente inibidor da mineralização, quee contribui com Pi (Fosfato) de ATP para iniciar a mineralização. Em comparação com a membrana plasmática, as MVs são ricas em Colesterol (Chol) (32%) e TNAP, mas como o Chol influencia a atividade da TNAP ainda não está claro. Nós reconstituímos TNAP em lipossomos de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dimiristoilfosfocolina (DMPC) dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) combinada com Chol ou seus derivados Colestenona (Achol) e Ergosterol (Ergo). Comparamos as propriedades cinéticas: Velocidade máxima de hidrólise (Vmax), constante de afinidade (k0,5), cooperatividade (n) e eficiência catalítica (kcat / k0,5) da TNAP para os substratos fisiológicos ATP e PPi, quando o TNAP é incorporada nestes diferentes microambientes lípidicos. O DPPC mais 36% de esteróis em lipossomos aumentaram a atividade catalítica do TNAP em relação ao ATP. A presença de Chol também aumentou a propagação de minerais em 3,4 vezes. A eficiência catalítica da TNAP em relação ao ATP foi quatro vezes menor nos proteolipossomos de DOPC, em comparação aos proteolipossomos do DPPC. Os proteolipossomos DOPC também aumentaram a biomineralização 2,8 vezes em comparação com os proteolipossomos de DPPC. O TNAP catalisou a hidrólise do ATP mais eficientemente no caso do proteolipossomo consistindo em DOPC com 36% de Chol. O mesmo comportamento surgiu com Achol e Ergo. A organização do lipídio e a estrutura do esterol influenciaram a tensão superficial (), a atividade fosfohidrolítica do TNAP na monocamada e a eficiência catalítica do TNAP nas bicamadas. Membranas na fase L (Achol) proporcionaram melhores parâmetros cinéticos em relação às membranas na fase Lo (Chol e Ergo). a presença de SM ou Chol: SM 90:10 (mol%), proteolipossomos DPPC não alterou os valores de eficiência catalítica, para a hidrólise do ATP. No entanto, estes proteolipossomos aumentaram a propagação mineral em cerca de 4,5 e 8 vezes, respectivamente, em comparação com DPPC puro. O aumento na eficiência catalítica para proteolipossomos contendo DMPC: SM 90:10 e DMPC: Chol: SM 80:10:10 (% molar) foi observado. Em conclusão, as propriedades físicas e a organização lateral de lipídios em proteolipossomas são cruciais para o controle. propagação mineral mediada pela atividade da TNAP durante a mineralização / Mineralization of the skeleton starts within cell-derived matrix vesicles (MVs); then, minerals propagate to the extracellular collagenous matrix. Tissuenonspecific alkaline phosphatase (TNAP) degrades inorganic pyrophosphate (PPi), a potent inhibitor of mineralization, and contributes Pi (Phosphate) from ATP to initiate mineralization. Compared to the plasma membrane, MVs are rich in Cholesterol (Chol) (32%) and TNAP, but how Chol influences TNAP activity remains unclear. We have reconstituted TNAP in liposomes of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), dimyristoylphosphocholine (DMPC) dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) combined with Chol or its derivatives Cholestenone (Achol) and Ergosterol (Ergo). We compare the kinetic properties: maximum rate of hydrolysis (Vmax), affinity constant (k0,5), cooperativity (n) and catalytic efficiency (kcat / k0,5) of TNAP for the physiological substrates ATP and PPi, when TNAP is incorporated in these different microenvironments lipids. DPPC plus 36% sterols in liposome increased the catalytic activity of TNAP toward ATP. The presence of Chol also increased the propagation of minerals by 3.4-fold. The catalytic efficiency of TNAP toward ATP was fourfold lower in DOPC proteoliposomes as compared to DPPC proteoliposomes. DOPC proteoliposomes also increased biomineralization by 2.8-fold as compared to DPPC proteoliposomes. TNAP catalyzed the hydrolysis of ATP more efficiently in the case of the proteoliposome consisting of DOPC with 36% Chol. The same behavior emerged with Achol and Ergo. The organization of the lipid and the structure of the sterol influenced the surface tension (), the TNAP phosphohydrolytic activity in the monolayer, and the TNAP catalytic efficiency in the bilayers. Membranes in the L phase (Achol) provided better kinetic parameters as compared to membranes in the Lo phase (Chol and Ergo). The presence of SM or Chol:SM 90:10 (mol%), DPPC-proteoliposomes did not alter the catalytic efficiency values, for the ATP hydrolysis. However, these proteoliposomes increased the mineral propagation by about 4.5 and 8-fold, respectively, compared to neat DPPC. The increase in catalytic efficiency for proteoliposomes containing DMPC:SM 90:10 and DMPC:Chol:SM 80:10:10 (mol%) was observed. In conclusion, the physical properties and the lateral organization of lipids in proteoliposomes are crucial to control mineral propagation mediated by TNAP activity during mineralization