O filoplano do Hibiscus rosa-sinensis abriga uma enorme biodiversidade de leveduras e fungos semelhantes a leveduras cujo potencial biotecnológico ainda é desconhecido. Foram isoladas 84 cepas de leveduras de filoplano desta planta, sendo identificadas pela metodologia clássica. Do total de isolados 37% são de afinidade ascomicética, 36% de afinidade basidiomicética e 27% de fungos semelhantes a leveduras.

A mancha parda do arroz irrigado (MP), causada pelo fungo Bipolaris oryzae, é uma doença importante e que pode ter a semente como fonte de inóculo inicial. Os objetivos deste estudo foram: (1) avaliar o efeito de níveis de incidência de B. oryzae em sementes de arroz no desenvolvimento da cultura e epidemias de MP; (2) avaliar o padrão espacial de lesões de MP nas folhas por meio de análise digital; (3) elaborar e validar escalas diagramáticas para auxiliar estimativas visuais de severidade. Onze ensaios de campo com tratamentos de níveis de incidência de B. oryzae nas sementes (0, 3, 6, 12, 24 e 48%) foram instalados em Bagé e Cachoeirinha, RS, durante as safras 2008/09, 2009/10 e 2010/11. As variáveis avaliadas foram: estande de plantas, incidência e severidade da MP, produtividade e incidência de B. oryzae nos grãos colhidos nos ensaios. Nas parcelas experimentais da safra 2009/10, em Cachoeirinha, 350 folhas-bandeira com sintomas de MP foram coletadas e digitalizadas, retocadas e analisadas quanto à severidade da MP, e número e tamanho de lesões. O padrão espacial de distribuição de lesões na folha também foi determinado por análises específicas. Quatro escalas diagramáticas com dois incrementos (linear ou exponencial) e duas de coloração (preto e branco e imagens reais) foram elaboradas. A validação foi realizada, onde avaliou-se a repetibilidade, a reprodutibilidade, a acurácia e a precisão das estimativas por análise de correlação, regressão e concordância. Houve efeito dos níveis de incidência de B. oryzae na semente no estande de plantas em 8 ensaios, com redução do número de plantas em função do inóculo na semente, bem como na incidência da MP em três ensaios da safra 2009/10, com aumento da incidência em função da incidência de B. oryzae nas sementes. Contudo, não se observou efeito na severidade, produtividade e infecção de sementes para as condições dos experimentos instalados. A severidade das folhas coletadas foi majoritariamente baixa, com 55% dos casos apresentando severidades menores de 2%. As lesões de mancha parda ocorrem de maneira predominantemente aleatória, com tendência de agregação em severidades mais altas. Houve tendência geral entre os avaliadores de superestimarem a severidade observada quando sem auxílio. No entanto, com o uso das escalas diagramáticas, seja linear ou exponencial, houve melhora da qualidade das estimativas feitas pelos avaliadores, com destaque para as escalas em cores que melhorou a reprodutibilidade e repetibilidade das estimativas. / Rice brown spot (BS), caused by Bipolaris oryzae, is a fungal disease in which epidemics may originate from seedborne inoculum. The objectives of this study were to: (1) evaluate the effect seed-borne B. oryzae inoculum on crop development and BS epidemics; (2) determine the spatial distribution of BS lesions on leaves using digital analysis; and (3) develop and validate diagrammatic scales to aid visual estimates of BS severity. Eleven field trials were carried out in two locations in RS State (Bagé and Cachoeirinha) and three growing seasons (2008/09, 2009/10 and 2010/11) using cv. IRGA424. Treatments consisted of incremental incidence levels of B. oryzae in a seed lot (0, 3, 6, 12, 24 and 48%). The variables evaluated were: crop stand (number of seedlings per area unit), BS incidence and severity, rice yield and B. oryzae incidence in mature grains. In the experimental plots of the 2009/10 growing season, in Cachoeirinha, 350 symptomatic flag leaves were collected, scanned, retouched and analyzed for the severity of the BS, and number and size of lesions. The pattern of the distribution of lesions in a rice flagleaf was also determined by spatial analysis. Four diagrammatic scales varying in severity scale (linear or exponential) and color (black and white or true color) were prepared. In the scale validation, repeatability, reproducibility, accuracy and precision of the estimates were assessed by correlation, linear regression and concordance analysis. A significant effect was observed for the incidence of B. oryzae on the crop stand in eight trials; the number of plants was reduced with the increase of fungal incidence on the seeds. Also, BS incidence at the vegetative stages (for three trials analyzed) increased linearly with the increase of fungal incidence levels. No significant effect was found in BR severity, rice yield and seed infection. The BS severity values in the sampled leaves were mostly low (55% of 350 leaves were <2% severity). The distribution pattern of brown spot lesions was predominantly random, with a tendency to aggregate with the increase in severity (>8%). In the validation of the diagrammatic scales, there was an overall tendency of raters to overestimate severity when estimates were made unaided. However, the use of the diagrammatic scales, either with an exponential or linear severity increase, improved accuracy and precision of the estimates made by the raters, especially when using the color scales as an aid which led to improved reliability of the estimates.

A ferrugem da folha, causada pelo fungo Puccinia triticina, é umas das principais doenças do trigo. As condições ambientais presentes na região do Cone Sul da América do Sul, associadas à grande variabilidade genética para virulência do patógeno, favorecem a ocorrência de epidemias anuais. Desta forma, é comum a superação da resistência em variedades com genes específicos à raças de ferrugem. Neste contexto, a identificação de mecanismos de resistência potencialmente duráveis é de extrema importância. O objetivo deste trabalho foi caracterizar os eventos histológicos responsáveis pela reação de resistência em interações de hospedeiros (trigo suscetível (BRS 194), com resistência específica (Lr9) e não-específica à raças (Toropi)) e não-hospedeiros (cevada (BRS 195), aveia (URS 22) e arroz (Irga 417 e Nippon Bare)) à Puccinia triticina. Para isso, as plantas foram inoculadas com a raça B56 de P. triticina e foram feitas coletas de segmentos foliares de 1,5 cm de cada espécie em diferentes horários após a inoculação, onde foram quantificadas as estruturas infectivas formadas, bem como, as reações de resistência apresentadas pelos genótipos, nas fases de plântula e planta adulta. Os genótipos testados apresentaram diferentes mecanismos de resistência, ativos em momentos distintos do processo infecioso. Em aveia a resistência foi pré-haustorial e envolveu a formação de papila. Em arroz a resistência foi pré-haustorial, com produção de compostos autofluorescentes e formação de H202. Em cevada houve a combinação de mecanismos de resistência pré e póshaustoriais, o que também foi verificado no genótipo de trigo com resistência parcial, não específica à raças, Toropi. A linhagem isogênica de trigo Lr9 apresentou resistência do tipo pós-haustorial, induzindo a morte celular por hipersensibilidade. Os resultados sugerem que a resistência parcial à P. triticina se assemelha à resistência de nãohospedeiros observada. Ambas são ativas e envolvem a combinação de diferentes mecanismos de defesa. O conhecimento a respeito dos mecanismos de resistência atuantes em espécies não-hospedeiras pode auxiliar no entendimento das relações patógeno-hospedeiro, visando à obtenção de variedades comerciais com formas mais duráveis de resistência. A combinação de diferentes mecanismos de resistência em Toropi pode ser responsável pela manutenção da resistência, bem como, pela baixa severidade da doença observada no campo. / Leaf rust, caused by the fungus Puccinia triticina, is one of the major diseases of wheat. The environmental conditions present in the Southern Cone of South America, associated with a high genetic variability for virulence of the pathogen, favoring the occurrence of annual epidemics. Thus, it is common the overcome of resistance in varieties with specific resistance genes. In this context, the identification of potentially durable resistance mechanisms is of utmost importance. The objective of this study was to characterize the histological events responsible for the resistance reaction in host interactions (susceptible wheat (BRS 194), with specific resistance (Lr9) and nonspecific resistance (Toropi)) and non-host (barley (BRS 195), oat (URS 22) and rice (IRGA 417 and Nippon Bare)) to Puccinia triticina. For this, plants were inoculated with race B56 of P. triticina and collections were made from 1.5 cm leaf segments of each species at different times after inoculation, which were quantified for infective structures formed, as well as the reactions of resistance displayed by genotypes at the stage of seedling and adult plant. The genotypes showed different resistance mechanisms, active at different times of the infectious process. In oat resistance has been pre-haustorial and involved the formation of papillae. Resistance in rice has been pre-haustorial, with production of autofluorescent compounds and the formation of H202. In barley there was a combination of pre and post-haustorial mechanisms. The same was found in wheat genotype with partial resistance, Toropi. The isogenic line Lr9 showed post-haustorial resistance, inducing hypersensitive cell death. The results suggest that partial resistance to P. triticina resembles the non-host resistance observed. Both are active and involve a combination of different defense mechanisms. Knowledge about the resistance mechanisms operating in non-host species may assist in understanding the pathogen-host relationships, towards to obtain commercial varieties with more durable forms of resistance. The combination of different mechanisms of resistance in Toropi may be responsible for maintaining the resistance, as well as by the low disease severity observed in the field.

Metarhizium anisopliae é considerado um organismo modelo para estudos relacionados com interações entre artrópodes e microrganismos. Durante estas interações ocorre a secreção de várias proteínas, incluindo enzimas hidrolíticas que degradam a cutícula do hospedeiro durante a etapa de penetração. As quitinases de Metarhizium vêm sendo alvo de muitos estudos, pois além de participar da degradação da cutícula, estas enzimas têm funções importantes na biologia do fungo, participando do remodelamento da parede celular. Este trabalho teve como objetivo identificar proteínas secretadas diferencialmente expressas durante o cultivo do fungo, em condições que mimetizam a interação com o hospedeiro e validar as quitinases propostas pela análise in silico do projeto genoma de M. anisopliae. Sobrenadantes de culturas do fungo na presença de glicose, quitina cristalina e N-acetilglicosamina foram analisados utilizando eletroforese uni e bidimensional seguida de análise por espectrometria de massas (MS). Através de comparação com bancos de dados (NCBI e proteínas preditas de M. anisopliae) identificamos 38 proteínas, das quais quatro são quitinases: a quitinase CHIT30 (chi3), a quitinase CHIT42 (chit1) e duas quitinases preditas pela análise in silico, as quitinases B4 e D1. Estas análises permitiram identificar algumas proteínas secretadas ainda não descritas para Metarhizium e validar duas novas quitinases. / Metarhizium anisopliae is considered a model organism for studies concerning interactions between arthropods and microorganisms. During these interactions the secretion of several proteins occurs, including hydrolytic enzymes that degrade the host cuticle during the penetration stage. Metarhizium chitinases have been the target of many studies, because, besides participating in the degradation of the cuticle, these enzymes have important functions in the biology of the fungus participating in the remodeling of the cell wall. This work aimed to identify secreted proteins differentially expressed during the growth of the fungus under conditions that mimic the interaction with the host, and to validate the chitinases proposed by in silico analysis of the M. anisopliae genome project. Supernantants from cultures of the fungus in the presence of glucose, crystalline chitin and N-acetylglucosamine were analyzed using one and twodimensional gel electrophoresis followed by analysis by mass spectrometry (MS). Trough comparison with databases (NCBI and predicted proteins of M. anisopliae) we identified 38 proteins, four of which are chitinases: chitinase CHIT30 (chi3), chitinase CHIT42 (chit1) and two chitinases predicted by in silico analysis, chitinases B4 and D1. This analysis allowed the identification of some undescribed proteins secreted by Metarhizium and validated two new chitinases.

O trigo é o principal cereal componente dos produtos amiláceos atualmente consumido pela população. Além das limitações econômicas e políticas, a produção brasileira de trigo encontra obstáculos como a incidência de doenças, muitas delas causadas por fungos. O fitopatógeno Bipolaris sorokiniana é o agente etiológico da helmintosporiose, cujo controle é baseado principalmente em antifúngicos sintéticos. O fungo não é o principal causador de patologias em trigo, mas é importante do ponto de vista fitossanitário nas plantações, pois se mantém no solo por longo período de tempo podendo atacar as plantações em climas úmidos e quentes. O presente estudo teve objetivos avaliar a maior atividade antifúngica de três isolados de Bacillus sp. contra 34 isolados B. sorokiniana, selecionar uma linhagem de Bacillus sp., elucidar sua atividade inibitória in vivo e avaliar as melhores condições de cultivo, propriedades físicoquímicas do cultivo filtrado obtido e a atividade antifúngica in vitro do mesmo. A bactéria com a melhor ação antagonista foi analisada quanto à produção das enzimas caseinase e lipase, produção e atividade do filtrado de cultivo em diferentes meios e após tratamento térmico e variação de pH. Também foi realizado um teste in vivo do antagonista conta o isolado 98031 do fungo. Os três isolados de Bacillus foram capazes de inibir in vitro os isolados de B. sorokiniana, mas destacaram-se os isolados E164 e C98017. Quando testado in vivo, o isolado Bacillus E164 causou efeitos sobre a morfologia da planta, como redução significativa no comprimento das raízes. No entanto, não foi possível observar um nível elevado de proteção visto que mesmo as plantas infectadas não apresentaram os sintomas da doença. A produção do filtrado foi baseada em caldo triptona de soja, uma vez que a inibição foi similar ao meio com palha de milho e maior que o meio com extrato de malte. O filtrado antifúngico apresentou resistência à fervura por até 90 minutos, mas a atividade foi significativamente diminuída nesse tratamento quando comparada aos tratamentos de 50 a 80ºC e temperatura ambiente. A refrigeração e o congelamento não causaram diminuição na atividade do filtrado. A influência do grau de ionização foi percebida nos pHs 5, 6, 8 e 10. O isolado de Bacillus E164 apresentou atividade proteolítica e lipolítica em meios específicos. O controle exercido pelo isolado Bacillus E164 sobre B. sorokininana foi relevante nos testes in vitro. Porém, a influência e a importância da ação do(s) metabólito(s) produzido(s) por esse microrganismo devem ser mais estudados para uma possível aplicabilidade in vivo. / Wheat is the main cereal component of starch products consumed by the population. Brazilian wheat production has many limitations such as government policies, economic problems, and apart from there is a large loss in production due to diseases caused by fungi. Bipolaris sorokiniana is a phytopathogen that causes helminthosporiosis in cereal crops, whose control is mainly rely on synthetical antifungal agents. It has phytossanitary importance, since it can live for a long period in the soil, and attack crops on wet and warm weather conditions. The objectives of this work were to evaluate the antifungal activity of three Bacillus sp. Strains against 34 B. sorokiniana isolates, to select the best inhibitor of them, to elucidate its action in vivo and evaluate the best cultive conditions, physic and chemical properties of the filtrated obtained and in vitro antifungal capacity. The best bacterial strain was chosen and analyzed for the proteolytic and lipolytic activities, productions and activity of the cultive filtrated after growing on different culture media and after thermal treatment or pH variation. In vivo test was made on wheat infected by 98031 isolate. All bacterial isolates were active against B. sorokiniana but E164 and C98017T were better than OR13. On in vivo test the isolate E164 caused morphological effects on the plant as significant root length reduction. Increase of plants protection was not observed, as even infected ones did not presented disease symptoms. Filtrated production was based in tryptic casein soy broth as the inhibition degree was similar to the corn straw culture and greater than malt extract broth culture. The antifungal filtrated resisted until 90 minutes at 100ºC, but significant decrease of activity was observed in this treatment when compared to 50ºC to 80ºC and environment temperature. Refrigeration and freezing did not cause loss on filtrated activity. Ionization degree influence was observed in pH 5, 6, 8 and 10. Bacillus E164 showed proteolytic and lipolytic activities in specific media. Control exerted by Bacillus E164 over B. sorokiniana isolates was relevant in vitro, nevertheless the influence and importance of the metabolites produced must be elucidated for the application in vivo.

A ferrugem da folha, causada pelo fungo Puccinia triticina, é umas das principais doenças do trigo. As condições ambientais presentes na região do Cone Sul da América do Sul, associadas à grande variabilidade genética para virulência do patógeno, favorecem a ocorrência de epidemias anuais. Desta forma, é comum a superação da resistência em variedades com genes específicos à raças de ferrugem. Neste contexto, a identificação de mecanismos de resistência potencialmente duráveis é de extrema importância. O objetivo deste trabalho foi caracterizar os eventos histológicos responsáveis pela reação de resistência em interações de hospedeiros (trigo suscetível (BRS 194), com resistência específica (Lr9) e não-específica à raças (Toropi)) e não-hospedeiros (cevada (BRS 195), aveia (URS 22) e arroz (Irga 417 e Nippon Bare)) à Puccinia triticina. Para isso, as plantas foram inoculadas com a raça B56 de P. triticina e foram feitas coletas de segmentos foliares de 1,5 cm de cada espécie em diferentes horários após a inoculação, onde foram quantificadas as estruturas infectivas formadas, bem como, as reações de resistência apresentadas pelos genótipos, nas fases de plântula e planta adulta. Os genótipos testados apresentaram diferentes mecanismos de resistência, ativos em momentos distintos do processo infecioso. Em aveia a resistência foi pré-haustorial e envolveu a formação de papila. Em arroz a resistência foi pré-haustorial, com produção de compostos autofluorescentes e formação de H202. Em cevada houve a combinação de mecanismos de resistência pré e póshaustoriais, o que também foi verificado no genótipo de trigo com resistência parcial, não específica à raças, Toropi. A linhagem isogênica de trigo Lr9 apresentou resistência do tipo pós-haustorial, induzindo a morte celular por hipersensibilidade. Os resultados sugerem que a resistência parcial à P. triticina se assemelha à resistência de nãohospedeiros observada. Ambas são ativas e envolvem a combinação de diferentes mecanismos de defesa. O conhecimento a respeito dos mecanismos de resistência atuantes em espécies não-hospedeiras pode auxiliar no entendimento das relações patógeno-hospedeiro, visando à obtenção de variedades comerciais com formas mais duráveis de resistência. A combinação de diferentes mecanismos de resistência em Toropi pode ser responsável pela manutenção da resistência, bem como, pela baixa severidade da doença observada no campo. / Leaf rust, caused by the fungus Puccinia triticina, is one of the major diseases of wheat. The environmental conditions present in the Southern Cone of South America, associated with a high genetic variability for virulence of the pathogen, favoring the occurrence of annual epidemics. Thus, it is common the overcome of resistance in varieties with specific resistance genes. In this context, the identification of potentially durable resistance mechanisms is of utmost importance. The objective of this study was to characterize the histological events responsible for the resistance reaction in host interactions (susceptible wheat (BRS 194), with specific resistance (Lr9) and nonspecific resistance (Toropi)) and non-host (barley (BRS 195), oat (URS 22) and rice (IRGA 417 and Nippon Bare)) to Puccinia triticina. For this, plants were inoculated with race B56 of P. triticina and collections were made from 1.5 cm leaf segments of each species at different times after inoculation, which were quantified for infective structures formed, as well as the reactions of resistance displayed by genotypes at the stage of seedling and adult plant. The genotypes showed different resistance mechanisms, active at different times of the infectious process. In oat resistance has been pre-haustorial and involved the formation of papillae. Resistance in rice has been pre-haustorial, with production of autofluorescent compounds and the formation of H202. In barley there was a combination of pre and post-haustorial mechanisms. The same was found in wheat genotype with partial resistance, Toropi. The isogenic line Lr9 showed post-haustorial resistance, inducing hypersensitive cell death. The results suggest that partial resistance to P. triticina resembles the non-host resistance observed. Both are active and involve a combination of different defense mechanisms. Knowledge about the resistance mechanisms operating in non-host species may assist in understanding the pathogen-host relationships, towards to obtain commercial varieties with more durable forms of resistance. The combination of different mechanisms of resistance in Toropi may be responsible for maintaining the resistance, as well as by the low disease severity observed in the field.

O trigo é o principal cereal componente dos produtos amiláceos atualmente consumido pela população. Além das limitações econômicas e políticas, a produção brasileira de trigo encontra obstáculos como a incidência de doenças, muitas delas causadas por fungos. O fitopatógeno Bipolaris sorokiniana é o agente etiológico da helmintosporiose, cujo controle é baseado principalmente em antifúngicos sintéticos. O fungo não é o principal causador de patologias em trigo, mas é importante do ponto de vista fitossanitário nas plantações, pois se mantém no solo por longo período de tempo podendo atacar as plantações em climas úmidos e quentes. O presente estudo teve objetivos avaliar a maior atividade antifúngica de três isolados de Bacillus sp. contra 34 isolados B. sorokiniana, selecionar uma linhagem de Bacillus sp., elucidar sua atividade inibitória in vivo e avaliar as melhores condições de cultivo, propriedades físicoquímicas do cultivo filtrado obtido e a atividade antifúngica in vitro do mesmo. A bactéria com a melhor ação antagonista foi analisada quanto à produção das enzimas caseinase e lipase, produção e atividade do filtrado de cultivo em diferentes meios e após tratamento térmico e variação de pH. Também foi realizado um teste in vivo do antagonista conta o isolado 98031 do fungo. Os três isolados de Bacillus foram capazes de inibir in vitro os isolados de B. sorokiniana, mas destacaram-se os isolados E164 e C98017. Quando testado in vivo, o isolado Bacillus E164 causou efeitos sobre a morfologia da planta, como redução significativa no comprimento das raízes. No entanto, não foi possível observar um nível elevado de proteção visto que mesmo as plantas infectadas não apresentaram os sintomas da doença. A produção do filtrado foi baseada em caldo triptona de soja, uma vez que a inibição foi similar ao meio com palha de milho e maior que o meio com extrato de malte. O filtrado antifúngico apresentou resistência à fervura por até 90 minutos, mas a atividade foi significativamente diminuída nesse tratamento quando comparada aos tratamentos de 50 a 80ºC e temperatura ambiente. A refrigeração e o congelamento não causaram diminuição na atividade do filtrado. A influência do grau de ionização foi percebida nos pHs 5, 6, 8 e 10. O isolado de Bacillus E164 apresentou atividade proteolítica e lipolítica em meios específicos. O controle exercido pelo isolado Bacillus E164 sobre B. sorokininana foi relevante nos testes in vitro. Porém, a influência e a importância da ação do(s) metabólito(s) produzido(s) por esse microrganismo devem ser mais estudados para uma possível aplicabilidade in vivo. / Wheat is the main cereal component of starch products consumed by the population. Brazilian wheat production has many limitations such as government policies, economic problems, and apart from there is a large loss in production due to diseases caused by fungi. Bipolaris sorokiniana is a phytopathogen that causes helminthosporiosis in cereal crops, whose control is mainly rely on synthetical antifungal agents. It has phytossanitary importance, since it can live for a long period in the soil, and attack crops on wet and warm weather conditions. The objectives of this work were to evaluate the antifungal activity of three Bacillus sp. Strains against 34 B. sorokiniana isolates, to select the best inhibitor of them, to elucidate its action in vivo and evaluate the best cultive conditions, physic and chemical properties of the filtrated obtained and in vitro antifungal capacity. The best bacterial strain was chosen and analyzed for the proteolytic and lipolytic activities, productions and activity of the cultive filtrated after growing on different culture media and after thermal treatment or pH variation. In vivo test was made on wheat infected by 98031 isolate. All bacterial isolates were active against B. sorokiniana but E164 and C98017T were better than OR13. On in vivo test the isolate E164 caused morphological effects on the plant as significant root length reduction. Increase of plants protection was not observed, as even infected ones did not presented disease symptoms. Filtrated production was based in tryptic casein soy broth as the inhibition degree was similar to the corn straw culture and greater than malt extract broth culture. The antifungal filtrated resisted until 90 minutes at 100ºC, but significant decrease of activity was observed in this treatment when compared to 50ºC to 80ºC and environment temperature. Refrigeration and freezing did not cause loss on filtrated activity. Ionization degree influence was observed in pH 5, 6, 8 and 10. Bacillus E164 showed proteolytic and lipolytic activities in specific media. Control exerted by Bacillus E164 over B. sorokiniana isolates was relevant in vitro, nevertheless the influence and importance of the metabolites produced must be elucidated for the application in vivo.

O fungo filamentoso Metarhizium anisopliae é o entomopatógeno melhor caracterizado em nível molecular, em especial em relação a sua patogênese, principalmente pelo isolamento de genes diferencialmente expressos durante a infecção de hospedeiros. A infecção é um processo multifatorial complexo e os genes candidatos devem ser analisados funcionalmente. Para tal, uma das estratégias mais bem sucedidas é o desenvolvimento de sistemas para a geração de mutantes nulos por inativação gênica, mediada por recombinação homóloga. Neste trabalho, esta estratégia foi aplicada ao fungo M. anisopliae por intermédio da Agro-transformação. Inicialmente, padronizamos este sistema utilizando como alvo o gene trp1 deste fungo, envolvido no anabolismo do aminoácido triptofano. Obtivemos uma freqüência de recombinação homóloga em torno de 20 % para este locus. Como a integração do DNA exógeno é majoritariamente ectópica, nos valemos desta característica para construir uma biblioteca de mutantes de inserção e procedemos a uma caracterização preliminar de conídeos de mutantes morfológicos em relação a sua sensibilidade à radiação UV-A. Mostramos assim que este sistema é aplicável para o estudo funcional de genes no fungo. Dentre os prováveis fatores envolvidos no processo de infecção de M. anisopliae estão algumas hidrolases e o nosso grupo tem se dedicado a caracterização das quitinases neste fungo. As quitinases em particular são atraentes do ponto de vista de sua função, pois estão presentes em todos os fungos para o remodelamento da sua parede celular, composta por quitina, nos processos de crescimento e diferenciação, mas também nos processos de nutrição e patogênese. No sentido de estudar a função de um gene específico caracterizamos o gene chi3, o qual codifica para a quitinase bifuncional CHIT30. Clonamos a região 5´ flanqueadora e a análise in silico revelou a presença de possíveis elementos canônicos de regulação, dentre eles um associado à resposta ao choque térmico. Análises por qRT-PCR revelaram aumento dos níveis de transcritos do gene chi3 em condições de estresse térmico. Mutantes inativados deste gene foram gerados por Agro-transformação e os mesmos apresentaram menor produção de quitinases após o choque térmico e maior TL50 em bioensaios utilizando como modelo o inseto Dysdercus peruvianus. Para determinar a localização subcelular da quitinase CHIT30 foram gerados transformantes com um cassete para a expressão da proteína de fusão CHIT30 marcada com a proteína repórter GFP. Análises por microscopia confocal revelaram que a proteína de fusão está associada à parede celular, provavelmente seguindo a via de secreção de proteínas. Nossos resultados mostram que o gene chi3 apresenta regulação complexa. A expressão da quitinase CHIT30 de forma constitutiva parece ser letal e os mutantes nulos não demonstraram fenótipos claramente detectáveis em experimentos convencionais. O mutante Δchi3 apresentou eficiência diminuída na infecção do inseto D. peruvianus e a sua função na biologia do fungo é também complexa e ainda requer melhor detalhamento. / Metarhizium anisopliae is the best characterized enthomopathogenic fungus at the molecular level. The cloning of differentially expressed genes during the infection process is the main approach to study the infection process. The search for pathogenicity determinants has revealed that the process is complex and multifactorial. The characterization of putative genes related to the infection process has been made by the generation of null mutants via homologous recombination at the wild–type loci by using inactivation cassettes. In this work, we have developed a strategy for the generation of null mutants of the tryptophan anabolic gene trp1. Using Agrobacterium tumefaciens mediated transformation (ATMT), 22% efficiency of homologous recombination at the trp1 locus was achieved. Due to the high frequency of ectopic integration of the trp1 gene inactivation cassette, we applied this as a tool to generate an insertional library to isolate functional mutants. Morphological mutants were tested for their susceptibility to UV-A radiation. Therefore, we demonstrated the feasibility of this methodology in forward genetics studies in M. anisopliae. During fungal penetration through the host cuticle, hydrolases are tough to be crucial for infection consolidation. Chitinases are some of these enzymes and could be involved in cell wall modification or nutrient acquisition and pathogenicity. In order to contribute to the understanding of the role of specific chitinase genes in Metarhizium, we further characterized the CHIT30 chitinase encoding gene chi3. The 5´ upstream cloning and in silico analysis showed that some putative regulatory sequences are present, in particular a stress response element. Quantitative RT-PCR analysis detected an increase in chi3 transcripts during heatshock. ATMT gene inactivation was conducted for the chi3 gene. Mutants produced a lower level of chitinases during heat shock and were less virulent to the insect Dysdercus peruvianus. To uncover the subcellular localization of the CHIT30 chitinase, we have generated transformants to produce a GFP labelled CHIT30. Confocal microscopy analysis showed that the fusion protein was located at the cell wall. The chi3 gene possesses a complex regulation and the constitutive expression of the CHIT30 chitinase appears to be lethal. Null chi3 gene mutants were less virulent to the insect Dysdercus peruvianus. The function of this gene in virulence to insects is not clear. More studies will be necessary to fully understand the role of chitinases in fungi.

O fungo Metarhizium anisopliae é amplamente estudado como modelo da interação parasita-hospedeiro em nível molecular. Este fungo tem a capacidade de infectar artrópodes suscetíveis de forma direta através de suas cutículas. Para tanto, o fungo, utiliza-se de um processo multifatorial envolvendo pressão mecânica e secreção de hidrolases. Dentre elas, destacam-se as quitinases, envolvidas tanto nos processos de morfogênese do próprio organismo quanto em processos de patogenia e nutrição. Estudos avaliando a expressão de genes possivelmente envolvidos no processo de infecção de hospedeiros ajudam a esclarecer o processo em si. Assim, quitinases são alvos de interesse para estudos de regulação e função. Neste sentido, estratégias para a geração de transformantes que não expressem ou que expressem genes em níveis aumentados são utilizados e aplicados em trabalhos deste e de outros grupos de pesquisa a fim de determinar-se o papel de genes em determinados processos. Este trabalho envolve o estudo do gene chi2, que codifica para uma quitinase (CHI2) de 42 kDa, cuja seqüência fora previamente caracterizada. Inicialmente, análises de regulação demonstraram que este gene é altamente regulado dependendo da fonte de carbono disponibilizada. Para estudar a função da quitinase CHI2, foram gerados mutantes nulos para o gene chi2 (chi2) utilizando-se transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (ATMT), com taxa de recombinação homóloga dentre os transformantes de 1,3%. Experimentos de Western blot demonstraram a ausência de expressão de CHI2 nos transformantes. Assim como para a deleção, a superexpressão de chi2 (T33) foi realizada por Agro-transformação e análises de Western blot demonstraram a expressão aumentada e não regulada de CHI2. Bioensaios utilizando o inseto Dysdercus peruvianus demonstram diferenças de tempo letal mediano e tempo letal 90% (TL50 e TL90) entre as linhagens transformantes e selvagem, sendo maiores para o mutante sem expressão de chi2 22 e menores para o transformante superexpressando chi2 T33. Para avaliar a localização celular de CHI2, antisoro foi produzido em coelhos. Análises de microscopia óptica de imunofluorescência demonstraram diferenças marcantes na distribuição da enzima entre as linhagens selvagem e transformadas. Na linhagem selvagem, em hifas diferenciadas em apressório, a proteína encontra-se associada à parede celular, nas regiões de germinação do esporo, na extremidade da hifa, exatamente no ponto de formação do apressório e em todo o apressório, mas ausente no citoplasma e nos esporos. Já em hifas não diferenciadas, CHI2 apresenta-se associada à parede, mas sem pontos específicos e, portanto, difusa no citoplasma. Este fato evidencia possível rota de secreção. As linhagens deletadas não apresentaram fluorescência, indicando a ausência da proteína, sem nenhuma alteração fenotípica aparente. Portanto, CHI2 não teria papel na morfogênese. Linhagens superexpressando CHI2 não demonstraram localização específica de CHI2, cuja fluorescência foi mais intensa e difusa pela célula. Nestas linhagens, a quitinase CHI2 também pode ser detectada na parede celular dos conídios. Nenhuma alteração morfológica aparente foi detectada nos mutantes de superexpressão. Além disso, o gene chi2 sofre processos diferenciais de splicing, gerando duas espécies de transcritos. Uma delas é totalmente processada e outra retém o segundo íntron, como demonstrado por ensaios de Northern blotting. Demonstramos por ensaios de Western blot em géis SDS-PAGE-2D e espectrometria de massas que as duas proteínas diferentes são traduzidas a partir destes transcritos. Em trabalhos posteriores, transformantes carregando deleção ou superexpressando as diferentes formas poderão auxiliar no entendimento da função das formas de chitinase geradas e contribuirão para o conhecimento mais aprofundado da função das endoquitinases nos processos celulares. / Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin (1883) is a filamentous fungi widely studied as a model for host-parasite interactions on its molecular basis. This fungus has the ability to infect susceptible arthropods in a direct manner through the host cuticle. The fungus uses a complex process involving mechanic pressure and secretion of hydrolases, among them chitinases, which act either in morphogenesis processes as in pathogenesis and nutrition. Studies that evaluate the expression of genes possibly involved in the pathogenesis process may aid to clarify the process itself. Thus, chitinases genes become the aim for regulation, deletion and overexpression studies. Strategies for generating transformants lacking or overexpressing genes in levels above wild strains are currently being used and already applied in researches of our and other groups. This work involves the study of the chi2 gene, of which sequence has been already characterisized and codes for a 42 kDa chitinase (CHI2). Initially, regulation analysis showed that this gene is tightly regulated depending on the carbon source. The null chi2 mutants (chi2) were constructed by Agrobacterium tumefaciens mediated transformation (ATMT) and the homologous recombination rate was 1.3%. Western blotting assays demonstrated no CHI2 expression by the null transformants. The overexpression of chi2 (T33) was performed using ATMT and Western blotting analysis demonstrated non regulated high levels of CHI2 expression. Bioassays using the cotton stainer bug Dysdercus peruvianus demonstrated distinct TL50 and TL90 values among the wild and modified strains, which were higher for chi2 and lower for T33. In order to evaluate the cellular localization of CHI2, antiserum was produced in rabbits. Optical imunomicroscopy assays demonstrated significantly differences in the enzyme distribution among the wild and transformed strains. In the wild strain, in apressorium differentiated hyphae, the protein is associated with the cell wall, at the germination spot of the conidia, at the distal extremity of the hyphae, exactly at the apressorium formation spot, all over the apressorium and absent at the cytoplasm and conidia. In non differentiated hyphae, CHI2 is also associated with the cell wall, without specific locations and diffused throughout the cytoplasm. Possibly, CHI2 is addressed to secretion. The null strains did not present fluorescence as expected, confirming the absence of the protein, but no morphological alterations were observed. The CHI2 overexpressing strains did not show specific location for CHI2 protein, and the fluorescence reached higher levels and diffused through the cell. Also, CHI2 was detected at the conidia cell wall. No apparent morphological changes were detected in both CHI2 null and overexpressing strains. Thus, CHI2 do not have a role in morphogenesis. It was also observed that this gene presents different patterns of splicing, generating two transcript species. One of them is completely processed, while a second one retains a 72 base pairs intron, as demonstrated by Northern blotting assays. Mass spectrometry demonstrated the synthesis of two different proteins from the transcripts. In future works, transformants carrying deletions or overexpressing the distinct forms of the protein will provide new insights about their function and will improve the knowledge about the overall function of endochitinases throughout the cell development.

A citricultura representa um importante segmento sócio-econômico para o Estado do Rio Grande do Sul, onde são desenvolvidos sistemas de cultivo de citros com manejo agroecológico, principalmente pela agricultura familiar. O Grupo de Citricultura Ecológica constitui um grupo de pesquisa participativa, que conta com a participação de agricultores, pesquisadores e extensionistas, e tem por objetivos o desenvolvimento da citricultura agroecológica da região dos Vales do Caí e Taquari. O presente trabalho teve por objetivo realizar bioprospecção de microrganismos epifíticos dos citros com potencial para o controle biológico da doença pinta preta dos citros (PPC), e também caracterizar os mecanismos de antagonismo potencialmente envolvidos na interação dos agentes biocontroladores com G. citricarpa. Este trabalho foi realizado no Município de Montenegro – RS, em pomares de bergamoteira cv. Montenegrina, conduzidos sob manejo orgânico. A partir de folhas e frutos foram isolados 24 fungos filamentosos e 17 leveduras, caracterizadas em oito tipos morfológicos. Destes, apenas dois isolados de leveduras e quatro de fungos filamentosos apresentaram, in vitro, potencial para o biocontrole de G. citricarpa, sendo que um dos isolados de fungos filamentosos foi identificado como Trichoderma koningii. Não foi possível observar diretamente o micoparasitismo dos isolados epifíticos testados sobre G. citricarpa. Todos os isolados antagonistas à G. citricarpa apresentaram atividades quitinásica, glucanásica e proteásica. O mecanismo de antibiose foi observado em todos os isolados, seja pela produção de compostos difusíveis ou voláteis inibitórios à G. citricarpa. No mecanismo de competição foi observada a produção de sideróforos por todos os isolados de fungos filamentosos. O isolado epifítico de T. koningii apresentou, em condições de campo, redução de 18,58 % na incidência e 63,82 % na severidade da PPC. / Citriculture represents an important socioeconomic segment for the state of Rio Grande do Sul where the agroecological farming of citrus is developed, mainly by family agriculture. The Ecological Citriculture Group is a participative research group in which farmers, researchers and extensionists take part in and it aims at the development of the agroecological citriculture of the Caí Valley and Taquari Valley region. The present work aimed at performing a bioprospection of epiphytic microorganisms of citrus with a potential for the biological control of the citrus black spot disease (PPC), as well as characterizing the mechanisms of antagonism involved in the interaction of the biocontrol agents with G. citricarpa. This work was carried out in the town of Montenegro, Rio Grande do Sul in cv. Montenegrina tangerine orchards, conducted under organic farming. 24 filamentous fungi and 17 yeasts isolates were isolated from leaves and fruits, characterized in eight morphological types. Of these, only two yeast and four filamentous fungi isolates presented, in vitro, potential for the biocontrol of G. citricarpa, one of the filamentous fungi isolates was identified as Trichoderma koningii. It was not possible to directly observe the mycoparasitism of the epiphyte isolates tested on G. citricarpa. All the isolates antagonists of G. citricarpa presented quitinase, glucanase and protease activities. The antibiosis mechanism was observed in all the isolates, whether by the production of diffusible compounds or volatile inhibitors in G. citricarpa. In the mechanism of competition the production of siderophores by all of the filamentous fungi isolates was observed. The epiphyte isolate of Trichoderma koningii presented, in field conditions, a reduction of 18,58% in the incidence and 63,82% in the severity of the citrus black spot.