Os Fungos Micorrízicos Arbusculares (FMAs) desempenham um papel importante na sustentabilidade dos ecossistemas, devido a importância da simbiose que formam com a maioria das plantas. A associação destes fungos com as raízes possibilita uma melhor nutrição das plantas, além de promover o crescimento e a resistência a fatores causadores de estresse. Desta forma, auxiliam no aumento da produtividade das mesmas, e na redução do uso de insumos químicos, como fertilizantes e agrotóxicos, na agricultura. Em função ao caráter de simbiontes obrigatórios, é de grande interesse o desenvolvimento de processos que permitam o isolamento, caracterização, manutenção de isolados e produção de inóculo desses fungos. Assim, com o objetivo de produzir um método de cultivo axênico, e que também possa auxiliar o estudo destes em áreas como a biologia molecular, testou-se protocolos de micropropagação para a produção in vitro de Glomus etunicatum W. N. Becker & Gerd., utilizando-se como hospedeiro raízes de tomateiro, videira e menta. Além destas culturas, que foram propagadas vegetativamente para a manutenção das culturas estoques e enraizadas in vitro com a aplicação exógena do regulador de crescimento ácido indolbutírico (AIB), trabalhou-se também com a cultura da menta, mas devido a problemas que ocorreram durante a etapa de enraizamento, não foi possível efetivar a associação do inóculo Na inoculação de esporos em raízes da videira cultivadas in vitro, não se obteve êxito. Com o cultivo in vitro de raízes de tomateiro foi possível conduzir os trabalhos até a etapa de colonização do FMA. No enraizamento in vitro das três culturas trabalhadas foi avaliado o número e o comprimento médio das raízes cultivadas nos meios de enraizamento nas doses de 0, 1,0 e 2,0 mg.L-1 de AIB. Para o tomateiro e a menta, o número e o comprimento médio de raízes por explante foram significativamente maiores com a dose de 1,0 mg.L-1 de AIB. Entretanto, para a cultura da videira, embora o uso de AIB, em ambas as doses de 1,0 e 2,0 mg.L-1 induziram um maior número de raízes, o comprimento médio de raízes foi maior quando AIB não foi adicionado no meio de enraizamento.

O filoplano do Hibiscus rosa-sinensis abriga uma enorme biodiversidade de leveduras e fungos semelhantes a leveduras cujo potencial biotecnológico ainda é desconhecido. Foram isoladas 84 cepas de leveduras de filoplano desta planta, sendo identificadas pela metodologia clássica. Do total de isolados 37% são de afinidade ascomicética, 36% de afinidade basidiomicética e 27% de fungos semelhantes a leveduras.

Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-03-16T13:30:02Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇAO Jadson Diogo Bezerra.pdf: 1447785 bytes, checksum: 5ce7a69d178857885f214678553f14dd (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-16T13:30:02Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇAO Jadson Diogo Bezerra.pdf: 1447785 bytes, checksum: 5ce7a69d178857885f214678553f14dd (MD5) Previous issue date: 2013-02-20 / CNPq, FINEP, FAPEMIG, FACEPE e SISBIOTA / Fungos endofíticos vivem dentro dos tecidos sadios de plantas e podem promover tolerância das espécies hospedeiras para diferentes estresses ambientais. No entanto, a maioria dos estudos tem sido de plantas em ambientes úmidos e são poucos os relatos dos benefícios de tais associações com plantas de ambientes extremos. O objetivo deste trabalho foi analisar a diversidade de fungos endofíticos de Cereus jamacaru em três diferentes áreas de sucessão ecológica da floresta tropical seca brasileira (Caatinga), Paraíba, Brasil. O material vegetal foi coletado e 1215 fragmentos foram estudados em condições assépticas dos quais foram isolados 560 fungos endofíticos distribuídos nas áreas de sucessão ecológica Inicial (206 isolados), Intermediária (206 isolados) e Tardia (149 isolados) e identificados como pertencentes a 59 táxons. Cladosporium cladosporioides e Fusarium oxysporum foram as espécies mais comumente isoladas, seguidas por Acremonium terricola, Aureobasidium pullulans, Trichoderma viride, Chrysonilia sitophila, e Aspergillus flavus. As espécies dos gêneros Boeremia, Candida, Cochliobolus, Guignardia, Pestalotiopsis, Phomopsis, Purpureocillium, Redaellia (= Aspergillus), Sporobolomyces, e Syncephalastrum foram encontradas apenas uma ou duas vezes. O isolamento de Redaellia inicia discussão sobre o gênero e sua sinonímia com Aspergillus. Quarenta e sete espécies são registradas pela primeira vez como fungos endofíticos de cactos, e 18 outras como endófitos para o Brasil. Os valores dos índices de diversidade de Shannon-Wiener e Simpson indicaram a área de sucessão ecológica Tardia como a mais diversa e a mais abundante por uma ou poucas espécies, sendo esta área, segundo a equitabilidade de Pielou, a que possui a maior uniformidade de indivíduos entre as espécies de fungos endofíticos. A maior similaridade, segundo o coeficiente de Sorensen, foi entre as áreas Inicial e Intermediária. Claramente existe uma riqueza de fungos endofíticos associados C. jamacaru na Caatinga. Esta subestimada diversidade microbiana suporta a ideia de que endófitos podem estar envolvidos na proteção de plantas em ambientes extremos, e a maior frequência de fungos endofíticos em áreas de preservação recente (Inicial e Intermediária) sugere que esses microorganismos podem participar ativamente da regeneração de florestas tropicais secas. Este é o primeiro estudo de fungos endofíticos associados com o cacto C. jamacaru na floresta tropical seca brasileira conhecida como Caatinga.

Neste estudo, 144 amostras de sementes de arroz oriundas de áreas de produção de sementes dos estados do Rio Grande do Sul, Santa Catarina e Goiás, cultivadas em três safras, foram analisadas quanto a presença de Fusarium. Colônias de espécies do complexo Fusarium graminearum (FGSC) foram identificadas em 43% das 110 amostras da safra 2011/12 com incidência média de 0,7% e colônias de outras espécies do gênero em 77% das amostras com incidência média de 3,6%. Quinze amostras com variada incidência de Fusarium, apresentaram concentração média da micotoxina deoxinivalenol (DON) de 5.750 μg/kg. Em uma coleção de 144 isolados purificados de Fusarium obtidos das sementes de arroz infectadas, foram identificadas, por métodos moleculares (genotipagem multilocus e similaridade com sequencias do gene TEF1-alfa), quatro complexos de espécies: F. fujikuroi (FFSC) F. chlamydosporum (FCSC), F. graminearum (FGSC) e F. incarnatum-equiseti (FIESC). Dentre os 96 isolados do FGSC, a espécie-genótipo tricoteceno predominante foi F. asiaticum-NIV (68/96), seguido de F. graminearum-15-ADON (14/96), F. cortaderiae-NIV (13/96) e um F. meridionale-NIV. Isolados de F. asiaticum oriundos do arroz e F. graminearum oriundos do trigo, quando cultivados em grãos de arroz, produziram a micotoxina predita pela genotipagem, NIV e 15-ADON, respectivamente No entanto os isolados de F. asiaticum do trigo produziram DON e seus acetilados, discordando da genotipagem (NIV). Nos ensaios de patogenicidade em plantas de arroz, o isolados de F. asiaticum do arroz mostraram-se mais agressivos do que F. asiaticum e F. graminearum do trigo. Já no trigo, os isolados F. asiaticum do arroz foram os menos agressivos. Esses resultados suportam a hipótese que adaptação ao hospedeiro pode influenciar na distribuição das espécies do complexo. Na análise de tricotecenos nas sementes dos ensaios de patogenicidade no arroz, somente os isolados de F. chlamydosporum produziram DON (800 a 900 μg/kg). Nas inoculações em trigo, somente os isolados F. asiaticum oriundo do trigo produziram a micotoxina nivalenol. Os resultados deste estudo contribuem para o aumento do conhecimento sobre a diversidade de espécies de Fusarium em arroz e alertam sobre a alta contaminação com tricotecenos por um complexo de espécies toxigênicas. / In this study, 144 samples of rice seeds obtained from seed-growing areas of the states of Rio Grande do Sul, Santa Catarina and Goiás, during three seasons, were assessed for the presence of Fusarium. Fungal colonies resembling species of the Fusarium graminearum species complex (FGSC) were identified in 43% of 110 samples from the 2011/12 season with mean incidence of 0,7%. Also, colonies of other species of the genus were found in 77% of the samples with mean incidence of 3,6%. Fifteen seed samples that showed various Fusarium incidence levels had high levels of deoxynivalenol (DON) mycotoxin (mean = 5.750 μg/kg) and its acetylates. In a collection of 144 purified isolates obtained from the infected seeds, 19 species grouped in four species complexes were identified using molecular analysis (multilocus genotyping targeting FGSC and sequences of TEF1-alfa): F. fujikuroi species complex (FFSC), F. chlamydosporum species complex (FCSC), F. graminearum species complex (FGSC) and F. incarnatum-equiseti species complex (FIESC). Among the four phylogenetic species-trichothecene genotype within the FGSC, F. asiaticum-NIV was the most prevalent (68/96), followed by F. graminearum-15-ADON (14/96), F. cortaderiae-NIV (13/96) and one F. meridionale-NIV. F. asiaticum isolates from rice and F. graminearum from wheat produced the same trichothecene predicted by the PCR assay, NIV and 15-ADON, respectively Nevertheless, F. asiaticum isolates from wheat did not produce NIV as predicted by the genotyping. In the pathogenicity assay in rice, F. asiaticum isolates from rice were more aggressive than F. asiaticum and F. graminearum isolates from wheat. In wheat, F. asiaticum from rice were the least aggressive isolates. The trichothecene analysis in seeds from the pathogenicity assays showed that only isolates of the FCSC produced DON (800 a 900 μg/kg). In wheat, only F. asiaticum from wheat produced NIV. Results of this study contributes to expand the knowledge on the diversity of Fusarium affecting rice seeds and raise concern about the high contamination of rice with trichothecenes possibly produced by a complex of toxigenic species. Also, it corroborates with the hypothesis that host preference possibly regulates distribution of species within the FGSC complex.

Os pesticidas organofosforados são amplamente utilizados na agricultura, pois são muito eficazes no controle de pragas, promovendo um aumento na produtividade dos alimentos. Contudo, sua utilização indiscriminada provoca graves problemas ambientais e para a saúde humana, uma vez que são tóxicos também para as espécies que não são alvos e acumulam grandes quantidades de metabólitos tóxicos, como por exemplo, fenois. Os compostos fenólicos enquadram-se nos resíduos resultantes da degradação de compostos naturais e xenobióticos da atividade antrópica. Este trabalho teve por objetivo estudar as reações de conjugação de fase II em compostos fenólicos derivados da hidrólise de pesticidas organosfosforados (clorpirifós, metil paration e profenofós) e a biotransformação de outros fenois por enzimas provenientes de fungos de ambiente marinho. Primeiramente foi realizado um screening com os fungos de ambiente marinho Aspergillus sydowii CBMAI 934, A. sydowii CBMAI 935, A. sydowii CBMAI 1241, Penicillium decaturense CBMAI 1234, P. raistrickii CBMAI 931, P. raistrickii CBMAI 1235 e Trichoderma sp. CBMAI 932 para avaliar a resistência destes microrganismos frente à toxicidade dos pesticidas organofosforados para posterior escolha da cepa mais resistente e melhor adaptada aos pesticidas testados nesse trabalho. O fungo selecionado para as reações em meio líquido de malte 2%, que melhor adaptou-se na presença dos pesticidas testados foi a cepa do fungo A. sydowii CBMAI 935. Foram realizadas curvas analíticas com o objetivo de estimar a extensão da biodegradação dos pesticidas clorpirifós, metil paration, profenofós e seus respectivos produtos de hidrólise, os fenois 3,5,6-tricloro-2-piridinol, 4-nitrofenol e 4-bromo-2-clorofenol, respectivamente. As reações de biotransformação em meio líquido de malte 2% foram avaliadas com 10, 20, 30 d de reação com concentração inicial dos pesticidas organofosforados de 50 mg.L-1. Todos os metabólitos encontrados nas reações de biotransformação dos pesticidas organofosforados com o fungo A. sydowii CBMAI 935 foram comparados com os seus padrões analíticos e sintéticos (metilação) com o objetivo de corroborar as reações de bioconjugação. Através deste estudo foi possível sugerir a presença de enzimas fosfotriesterases e enzimas metiltransferases provenientes do fungo A. sydowii CBMAI 935. Enzimas que promoveram a hidrólise e metilação dos pesticidas e compostos fenólicos testados nesse trabalho. Segundo a literatura, as reações de biotransforrmação e bioconjugação dos pesticidas orgafosforados, diminuem consideravelmente a toxicidade desses compostos recalcitrantes. / Organophosphate pesticides are widely used in agriculture, as they are very effective in pest control, promoting an increase in productivity of food. However, indiscriminate use causes serious problems environmental and for human health, since they are also toxic to non-target species and accumulate large amounts of toxic metabolites, such as phenols. Phenolic compounds are part of the waste resulting from the degradation of natural compounds and xenobiotics of human activity. This work aimed to study the phase II conjugation reactions in phenolic compounds derived from hydrolysis of pesticides organophosphates (chlorpyrifos, methyl parathion and profenofos) and the biotransformation of other phenols for enzymes from marine environment fungi. First was conducted a screening with the marine environment fungi. Aspergillus sydowii CBMAI 934, A. sydowii CBMAI 935, A. sydowii CBMAI 1241, Penicillium decaturense CBMAI 1234, P. raistrickii CBMAI 931, P. raistrickii CBMAI 1235 and Trichoderma sp. CBMAI 932 to evaluate the resistance of these microorganisms front the toxicity of organophosphate pesticides to later choose the most resistant strain and better adapted to pesticides tested in this work. The fungus selected to the reactions in liquid medium 2% malt, which best adapted in the presence of the pesticide tested was the fungal strain of A. sydowii CBMAI 935. Standard curves were performed in order to estimate the extent of biodegradation of pesticides chlorpyrifos, methyl parathion, profenofos and their hydrolysis products, phenols 3,5,6-trichloro-2-pyridinol, 4-nitrophenol and 4-bromo- 2-chlorophenol, respectively. The biotransformation reactions in liquid medium 2% malt were evaluated in 10, 20, 30 days reaction of with initial concentration of organophosphate pesticides of 50 mg.L-1. All metabolites found in the biotransformation reactions of organophosphate pesticides with the fungus A. sydowii CBMAI 935 were compared with their synthetic and analytical standards (methylation) in order to corroborate the bioconjugation reactions. Through this study was possible suggest the presence of enzymes phosphotriestesterases and methyltransferases from fungus A. sydowii CBMAI 935. Enzymes that promote hydrolysis and methylation of pesticides and phenolic compounds tested in this work. According to the literature, the reactions of biotransformation and biodegradation of organophosphate pesticides, greatly reduce the toxicity of recalcitrant compounds.

O papel do milho na alimentação humana e animal é importante por causa da composição química e do valor nutritivo; por isso, é um dos cereais mais cultivados e consumidos no mundo. Uma das principais causas de danos à qualidade dos grãos é a infecção fúngica e a conseqüente contaminação por micotoxinas. Neste trabalho, foi identificado os efeitos do retardamento da colheita, do grau de umidade e do período de armazenamento dos grãos na ocorrência de fungos patogênicos e de grãos ardidos e a possível contaminação por micotoxinas na lavoura e durante o armazenamento, com o objetivo de caracterizar a influência dos fungos de pré e pós colheita na qualidade dos grãos de milho nas safras 98/99 e 99/00. A incidência de fungos patogênicos foi quantificada em 400 grãos e de grãos ardidos (GA), a percentagem de grãos com injúria mecânica visível (IMV) e de grãos normais (GN) em quatro repetições de 250 g de grãos. A contaminação por micotoxinas foi analisada por cromatografia de camada delgada e as características nutricionais foram analisadas por espectrometria de reflectância no infravermelho proximal. O retardamento da colheita gerou condições favoráveis para a elevação da incidência dos fungos das espécies Aspergillus spp., Cephalosporium spp., Fusarium graminearum e Penicillium spp. A incidência de GA se elevou enquanto os grãos apresentavam umidade acima de 20%. A incidência de Fusarium moniliforme foi reduzindo à medida que os grãos perdiam água. O percentual de grãos com IMV somados a incidência GA foi de 15,90% no silo de Lodi e de 15,78% na Cotrel. O retardamento de colheita influenciou na ocorrência de fungos, de GA e de micotoxinas na lavoura. As práticas de manejo das lavouras e a operação de colheita afetaram qualidade comercial dos grãos de milho e o armazenamento conservou as características nutricionais.

O cultivo de feijão no Brasil tem sido limitado por diversos patógenos. Entre os problemas da cultura estão os nematóides do gênero Meloidogyne, os quais constituem uma das principais razões da baixa produtividade das lavouras. Além dos danos diretos causados pelos nematóides às plantas, estes causam danos indiretos devido aos ferimentos que servem como porta de entrada a patógenos, como o Fusarium sp. Atualmente, um dos métodos mais usados no controle de nematóides é o controle químico, o qual é caro e extremamente prejudical ao meio ambiente. Portanto, tem por objetivo este trabalho estudar o potencial dos fungos Trichoderma spp. e Paecilomyces lilacinus no controle de M. incognita, assim como os mecanismos utilizados por estes em biotestes realizados in vivo associados a plantas de feijão. Testes realizados in vitro evidenciaram a produção de enzimas líticas como quitinases, glucanases e proteases, metabólitos voláteis dos fungos e hifas modificadas pelos isolados dos referidos fungos. Os filtrados fúngicos ocasionaram mortalidade de 100% dos J2 (juvenis de 2° estágio) de M. incognita. A análise microscópica demonstrou a adesão de conídios de Trichoderma spp. em ovos de M. incognita. Em testes in vivo com plantas de feijão cv. Engopa Ouro, obteve-se menor número de galhas e do fator de reprodução nos tramentos onde foram aplicados isolados T. harzianum (6T), T. pseudokonigii (2T) e o fungo nematófago P. lilacinus. Os resultados evidenciam que os isolados de Trichoderma spp. apresentam potencial no controle de M. incognita; os mecanismos utilizados consistem na produção de metabólitos voláteis, difusíveis e inibitórios aos nematóides, na produção de enzimas líticas que degradam a quitina dos ovos e capturam formas ativas do nematóide, além da formação de hifas modificadas denominadas “armadilhas”. / The bean cultive in Brazil has been limited by several pathogens. One of the most important problems in the culture are Melodogyne nematodes, which constitute one of the main reasons behind the low productivity in the agriculture. Besides the direct damages caused by nematodes to plants, they also bring indirect damages due to the wounds acting as entrance points to pathogens, like Fusarium sp. Chemical control is currently one of the most used methods to control nematodes, which is expensive and extremely harmful to the environment. Thus, this work objective is studying the possible action of Trichoderma spp. and Paecilomyces lilacinus to control M. incognita, as well as the mechanisms used by them through in vivo tests associated to bean plants. In vitro performed tests evidenced the production of lytic enzymes as chitinases, glucanases, and proteases, volatile metabolic and hyphae modified by those fungus’ isolates. The fungal filtrate caused 100% mortality to M. incognita J2 (second-stage juveniles). The microscopical analysis demonstrated the attachment of Trichoderma spp. conidia in M. incognita eggs. In vivo tests with Engopa Ouro bean plants achieved lower numbers of root-knot and reproduction factor when applying isolates of T. harzianum (6T), T. pseudokonigii (2T), and P. lilacinus nematophagous fungus. The results point out that Trichoderma spp. isolates are promising controllers of M. incognita, and the used mechanisms consist on producing volatile metabolics, which are diffusive and therefore inhibitory to nematodes, producing lytic enzymes that damage the egg chitina and capture active nematodes, and developing modified hyphae named “traps”.

Metarhzium anisopliae é um fungo entomopatogênico que infecta uma variedade de artrópodes. É o entomopatógeno melhor caracterizado, tendo a capacidade de penetrar ativamente através da cutícula de seus hospedeiros. Durante a infecção, Metarhizium produz hidrolases, como proteases, lípases e quitinases que auxiliam na penetração da cutícula de seus hospedeiros e também estão relacionadas ao processo de colonização. Nosso grupo de pesquisa tem se dedicado ao estudo de genes que atuam na etapa de penetração dos hospedeiros, em especial, caracterizando o sistema de degradação da quitina em M. anisopliae. Três genes que codificam quitinases já foram caracterizados em M. anisopliae: o gene chit1, que codifica uma endoquitinase de 42 kDa (BOGO, 1998), o gene chi2 que codifica uma quitinase de 42 kDa e o gene chi3 que codifica uma endo/exo quitinase de 30 kDa (SILVA et al., 2005). Entretanto, apenas a quitinase de 30 kDa foi demonstrada ser produzida durante o processo de penetração. A função dos outros dois genes não foi ainda determinada. O objetivo deste trabalho foi estudar a função do gene chit1 em M. anisopliae por meio da superexpressão da endoquitinase de 42 KDa. Neste, e em trabalhos anteriores do grupo, o gene chit1 foi clonado e caracterizado e sua ORF foi clonada em um vetor de expressão baseado no promotor homólogo do gene tef1-α (ptef1-α, NAKAZATO et al., 2006). Em outra construção a ORF chit1 foi clonada na orientação anti-senso no mesmo vetor de expressão. Neste trabalho, a superexpressão, bem como a supressão da expressão pelo anti-senso, foram analisadas em relação à produção da endoquitinase de 42 KDa e as linhagens construídas foram testadas em bioensaios utilizando o carrapato B. microplus, para se verificar sua participação no processo de infecção de carrapatos. Possíveis alterações morfológicas no ciclo normal de desenvolvimento também foram analisadas. Os resultados mostram um aumento na expressão da endoquitinase na construção de superexpressão em relação à linhagem selvagem de M. anisopliae. Em experimentos de bioensaio com carrapatos (Boophilus microplus) não foram observadas diferenças na eficiência de infecção da linhagemdo fungo que superexpressa o gene chit1 nem daquela contendo a construção antisenso, havendo 100% de mortalidade no terceiro dia após a infecção, comparável com a linhagem selvagem. Também não foram detectadas alterações no desenvolvimento, na morfologia e na produção de esporos nas linhagens transformantes em relação à linhagem selvagem do fungo. / M. anisopliae is an entomopathogenic fungi that infects a variety of arthropods. It is the best characterized entomopathogen having the capacity to penetrate actively through host-cuticle. During the infection, Metarhizium produces hidrolases, as proteases, lipases and chitinases that assist the penetration of cuticle of its hosts and also is related to the host-colonization process. Our group has focused the study of genes that act on the penetration stage, in special, characterizing the system of chitin degradation in M. anisopliae. Three genes that codify for chitinases have already been characterized in M. anisopliae: the gene chit1, that codifies an endochitinase of 42 kDa (BOGO, 1998), the gene chi2 that codifies for a chitinase of 42 kDa and the gene chi3 that codifies an endo/exo acting chitinase (SILVA et al., 2005). However, only chitinase 30 kDa was demonstrated to be produced during the penetration process. The function of the other two genes is still not determined. In this work we studied the function of the gene chit1 in Metarhizium by means of overexpression of the chitinase. Here, and in previous work of the group, the gene chit1 was cloned and characterized and its ORF was cloned in a expression vector based on the homologous promoter of the gene tef1-α (ptef1-α, NAKAZATO et al., 2006) . In other construction the chit1 ORF was cloned in the anti-sense orientation in the same vector. The overexpression, as well as the suppression of the expression in the anti-sense, was analyzed in relation to the production of 42 KDa endochitinase and the infectivity of the overexpressing transformants tested in bioassay using tick B. microplus to verify its participation in the process of infection. Possible morphologic alterations in the normal cycle of development had been also analyzed. The results shown an increase in the expression of 42 KDa endochitinase in the transformants in relation to the wild-type M. anisopliae. In bioassay experiments using ticks differences in the efficiency of infection were not observed neither in the overexpressing transformants nor in the anti-sense construct as compared to the wild-type. Also alterations in development, morphology and production of conidia in the transformants were not detected.

Leandria momordic 3 é um importante patógeno de cucurbitáceas. No entanto, além da baixa eficiência dos agroquímicos usados no seu controle, pouco se sabe sobre a sobrevivência, hospedeiros, variabilidade genética, fontes de resistência, virulência e comportamento in vitro deste fungo, além das desencontradas informações sobre a epidemiologia e o desenvolvimento da infecção em plantas no campo e em estufa. Pesquisou-se, então, em áreas de produção de pepinos no litoral de Santa Catarina e nos laboratórios da Epagri, em Itajaí, SC e da Faculdade de Agronomia da UFRGS, Porto Alegre, RS, controle químico; sobrevivência em hospedeiros, no solo e in vitro; preservação de restos culturais no campo; esporulação e infecção; gama de hospedeiros e de resistência; epidemiologia em campo e em estufa; variabilidade, através de polimorfismo de DNA, via AFLP e plasticidade morfológica. O fungo pode sobreviver no solo, em seus hospedeiros e in vitro, congelado ou em água destilada; apresenta anastomose e variabilidade genética entre isolados de hospedeiros distintos. A doença, cuja sintomatologia varia com a temperatura e umidade, é mais severa sob chuva e temperatura entre 18 a 25 °C. O micélio pode infectar, mesmo sob condições impróprias ao conídio. Cayaponia tayuya, Melothria pendula e Cucurbita maxima foram imunes ao fungo, e Cucurbita pepo, Bryonia cretica, Sicana odorifera, Cucumis metuliferus e Cucurbita pepo var. melopepo também são seus hospedeiros. A esporulação depende de luz, temperatura e meio de cultura e a luminosidade não interfere no crescimento. Colônias, após imersão em água, produzem mais esporos. A doença pode ser controlada pelo efeito guarda-chuva das estufas e por certos agroquímicos e o efeito biocida de Citrobio in vitro não se reproduz, necessariamente, no campo. / Leandria momordicE is an important pathogen of cucurbitaceee plants. However, the efficiency of pesticides used for its control — is poor and the existing knowledge on its survival, hosts, genetic variability, resistance sources, infection potential and in vitro behavior — is very reduced. Besides, the information available on the conditions that favor the development of infection and disease under field and greenhouse situations — is quite contradictory. Therefore, the following research studies were carried out in the main Santa Catarina cucumberproducing areas, Brazil, over latitude 28° S and longitude 48° W, at EPAGRI laboratories, and at Faculdade de Agronomia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul: chemical control, survival in hosts, soil an in vitro, maintenance of crop residues en field, sporulation and infection, scope of hosts and resistance, epidemiology in field and greenhouse, anastomosis, variability through DNA polymorphism and morphological plasticity. The fungus may survive in the soil, in hosts and in vitro (frozen or distilled water) and presents anastomosis and genetic variability between different host isolates. The disease, whose symptomatology varies according to temperature and moisture, gets more severe under temperature from18-25 °C and rainy conditions. The mycelium can infect even under unfavorable conditions to conidium. Cayaponia tayuya, Melothria pendula and Cucurbita maxima proved immune to the fungus, and Cucurbita pepo, Bryonia cretica, Sícana odorífera, Cucumis metuliferus and Cucurbita pepo var. melopepo also represent hosts. Sporulation depends on sunlight, temperature and culture mean; the sunlight does not interfere with the fungai growth. lmmersion the colonies in water may increased sporulation. The disease can be controlled by using greenhouse and certain pesticides; the effect of Citrobio, in vitro and under field conditions, is not necessarily alike.

Para infectar seus hospedeiros artrópodes, Metarhizium anisopliae produz uma série de enzimas hidrolíticas e diversas alterações morfológicas como a formação de estruturas denominadas de apressórios e blastosporos. Estas estruturas de infecção representam estágios cruciais de penetração e disseminação no inseto hospedeiro, respectivamente. Além disso, o apressório é uma estrutura conservada entre fungos entomopatogênicos e fitopatogênicos. O gene emp1 (codifica uma proteína de matriz extracelular de Magnaporthe grisea) parece ter um papel importante na diferenciação do apressório, bem como na patogenicidade e virulência. Um dos nossos objetivos foi avaliar a possível função de um ortólogo do gene emp1 em M. anisopliae pela análise do perfil transcricional e construção de mutantes funcionais por mutagênese insercional utilizando agrotransformação. Foram geradas linhagens transformantes contendo o cassete de inativação do gene emp1 (pPZP::bar::emp1), sendo este construído pela subclonagem das regiões flanqueadoras 5’ (1.515pb) e 3’ (1.513pb), fusionadas a um cassete de expressão do gene bar (3.500pb) que confere resistência a glifosinato de amônia. A freqüência de transformação observada nesta etapa de transformação foi superior a 60%, porém em apenas 1,5% dos transformantes há indícios de recombinação homóloga. Também foi analisado o perfil transcricional de emp1, sob três condições anteriormente padronizadas: células diferenciadas em apressório, hifas (crescimento vegetativo), e blastosporos, sendo observada a presença de transcritos deste gene em todas as condições testadas. Em uma segunda etapa deste trabalho, foi avaliado o perfil transcricional de quitinases putativas de M. anisopliae nos estágios de diferenciação celular de apressório, hifas e blastosporos. Esta classe de proteínas está diretamente envolvida no remodelamento da parede celular fúngica durante a diferenciação celular, como também na degradação da quitina da cutícula do hospedeiro durante a etapa de penetração. Originalmente foram caracterizados três genes para quitinases (chit1, chi2 e chi3), e a análise in silico do genoma revelou outras 20 quitinases putativas de Metarhizium. Essa diversidade pode ser responsável pelas diferentes funções que o conjunto de enzimas quitinolíticas tem na degradação de quitina durante o ciclo de vida e de infecção do fungo. É, portanto importante: (i) validar transcricionalmente as quitinases putativas e (ii) tentar atribuir função a cada uma delas. Para isso, procedemos a análise dos transcritos de cada uma das 23 quitinases putativas sendo sintetizados cDNAs a partir das três condições de diferenciação celular (apressório, hifas e blastosporos). Na condição de diferenciação a apressório dez espécies de transcritos foram detectadas sendo seis do subgrupo A, três do subgrupo B, uma do subgrupo D. Nenhum transcrito de quitinases do subgrupo C foi detectado nas condições testadas. Tanto em crescimento vegetativo quanto em blastosporos foram detectadas sete espécies de transcritos de quitinases do subgrupo A, e uma do subgrupo D. As quitinases do subgrupo B diferiram quanto a sua distribuição nas condições testadas: três espécies de transcritos foram detectadas durante o crescimento vegetativo e seis em blastosporos. O estudo envolvendo os diferentes genes putativos (emp1 e de quitinases) de M. anisopliae, sob as diversas abordagens, representa um importante precursor para nos fornecer indicativos sobre as funções destes genes no ciclo de vida e de infecção de Metarhizium. / To infect their arthropod hosts, Metarhizium anisopliae produces a series of hydrolytic enzymes and several morphological changes, including the formation of structures called appressoria and blastospores. These infective structures represent crucial stages of penetration and dissemination in the insect host, repectively. In addition, the appressorium is a structure conserved among phytopathogenic and entomopathogenic fungi. The emp1 gene (encodes an extracellular matrix protein) from Magnaporthe grisea showed an important role in appressorium differentiation, as well as pathogenicity and virulence. Our goal was evaluate the possible role of an ortholog gene emp1 in M. anisopliae by transcriptional analysis and construction of functional mutants by insertional mutagenesis mediated by agrotransformation. We generated transformants strains containing the gene inactivation cassette of emp1 (pPZP::bar::emp1), which was constructed by subcloning of flanking portions 5’ (1.515bp) and 3’ (1.513bp) fused in a expression cassette of bar gene (resistance to glufosinate ammonium). The frequency of transformation observed in this round was higher than 60%, but only 1,5% of the transformants there is evidence of homologous recombination. We also analysed the transcriptional profile of emp1 under three conditions previously standardized, such as differentiated cells in appressorium, hyphae (vegetative growth) and blastospores. Accordingly, we observed the presence of transcripts of this gene in all growth condition tested. In a second step of this work, we evaluated the transcriptional profile of putative chitinases of the M. anisopliae in those different stages of cellular diferentiation. This class of proteins is directly involved in fungal cell wall remodeling during cellular diferentiation, as well as degradation of chitin in the host cuticle during the penetration stage. Originally we characterized three genes of chitinases (chit1, chi2 and chi3), but apart from these, the in silico analysis of the genome revealed 20 putative chitinases. This diversity may be reponsible for differents functions that the set of chitinases enzymes have in the chitin degradation during the life and infection cycle of the fungus. It is therefore important: (i) validate transcriptionally the putative chitinases and (ii) attemping to assign function to each one of them. Chitinases transcript survey was performed using cDNAs from three cell types: appressorium, vegetative growth and blastospores. In the appressorium condition ten species of transcripts were detected being six from the subgroup A chitinases, three from group B and one from group D. No transcripts of subgroup C chitinases were detected. Both in vegetative growth and blastospores seven species of transcripts of the subgroup A, and one from group D were detected. Chitinases from subgroup B differed - three species of transcripts were detected during vegetative growth and six were detected in blastospores. This study of several putative genes (as emp1 and chitinases) of M. anisopliae, under different approaches, may represent an important preliminary outcome to shed a light in the functions of these genes during life cycle and infection of Metarhizium.