La mucoviscidose (CF, Cystic Fibrosis), maladie autosomique récessive la plus fréquente dans la population caucasienne, se manifeste par l’atteinte de plusieurs organes due à l’absence ou au dysfonctionnement du canal CFTR. Au niveau des poumons, la perte de l’activité du canal se traduit par une déshydration du mucus, des cycles d’infections et d’inflammation aboutissant à terme à la destruction du parenchyme pulmonaire. Les thérapeutiques proposées à l’heure actuelle, sont principalement symptomatiques et l’exploration de nouvelles pistes reste nécessaire. De récents travaux émanant de notre équipe ont révélé qu’une intervention au niveau de la stabilisation des transcrits pourrait être bénéfique pour améliorer la quantité de protéines nécessaires pour restaurer une activité suffisante du canal CFTR. Une autre piste qui pourrait être explorée serait de cibler, en plus de l’expression du gène CFTR, des régulateurs clés qui participent aux processus de réparation cellulaire ou à la réponse inflammatoire. Dans cet objectif, nous nous sommes focalisés sur des régulateurs clés comme les miARN et les ARE-BP (protéines de liaison à l’ARN) qui sont dérégulés dans les tissus CF et qui peuvent agir ensemble dans le contrôle de l’expression de nombreux gènes.Les travaux que nous avons réalisés nous ont permis d’une part, de montrer la dérégulation de miARN dans des échantillons CF ainsi que des isoformes de certains miARN. Deux miARN ont retenu notre attention, le miR-101 dont la distribution de ses séquences isomiR varient dans des cultures CF et le miR-181a-5p qui présente une dérégulation de son expression dans trois modèles ex-vivo CF que nous avons utilisés. Ces miARN ont la particularité de moduler l’expression de gènes clés dans les voies de signalisation PI3K-Akt/MAPK-Erk et Wnt. D’autre part, nos travaux ont révélé la dérégulation de la protéine ARE-BP TTP (Tristétraproline ou ZFP36) en contexte CF. Cette protéine est d’autant plus intéressante qu’elle est connue pour être un régulateur clé de l’inflammation. La suite de ce travail a donc été d’étudier sa régulation et son impact sur ses ARNm cibles. L’activité de cette ARE-BP a été principalement décrite pour être contrôlée par la voie p38-MAPK. Nous montrons l’implication de la voie p42/p44-MAPK (Erk1/2) dans la régulation de la phosphorylation de TTP dans des cultures bronchiques. La recherche des interactions entre TTP et ses cibles a également révélé que cette protéine agissait sur ses propres régulateurs ainsi que sur l’ARNm CFTR. Nous montrons ainsi pour la première fois que TTP se fixe au niveau de la région 3’UTR du transcrit CFTR et joue un rôle de stabilisateur sur ce transcrit.Identifier de nouveaux acteurs de la régulation du gène CFTR mais également des régulateurs centraux des processus altérés en contexte CF offre de nouvelles opportunités pour concevoir des outils ciblés pour combattre cette maladie. / Cystic fibrosis (CF), the most common life-shortening genetic disorder in Caucasians, affects many organs but chronic lung disease is the main cause of morbidity and mortality. This disease, characterized by CFTR gene alterations, results in ions transport dysfunctions that contribute to impair mucociliary clearance, favoring bacterial colonization and inflammation, and ultimately leading to lung destruction. Nowadays, therapeutic drugs have limited benefit, so development of new alternatives or complementary molecules remains essential. Recently, our team demonstrated that the intervention on CFTR mRNA stability leads to an increase in CFTR protein level and an improvement of the CFTR channel activity. An alternative way would be to target key actors such as miRNA and ARE-BP (RNA binding protein), deregulated in CF tissues, that display a pleiotropic activity and act together to control expression of several genes.Our findings led to the identification of dysregulated miRNA in CF samples and revealed multiple isoforms relative to miRNA of reference (i.e. isomiRs). We focused on two miRNA, miR-101, that displays a modification in isomiR distribution and miR-181a-5p that is highly deregulated, in three CF airways models. These miRNA modulate expression of key genes or related genes in PI3K-Akt/MAPK-Erk and Wnt signaling pathways.Our work also revealed the deregulation of an ARE-BP protein, TTP (Tristetraprolin, ZFP36), in CF context. This protein is a master regulator in inflammatory resolution. We next investigated the mechanism whereby this ARE-BP is regulated in bronchial cells and showed that TTP phosphorylation is regulated by MK2 through ERK activation. We also determined for the first time that TTP binds to the 3’UTR of CFTR mRNA where TTP binding stabilizes CFTR mRNA level.These data bring new insights into CF physiopathology and open new research opportunities in CF.

Les intégrons sont des éléments génétiques bactériens. Découverts récemment dans le contexte clinique, ils sont présents dans le génome d’un certain nombre de bactéries provenant d’environnements très variés. Ils sont composés d’un gène codant une intégrase et d’une succession de cassettes de gènes. L’activité de l’intégrase permet l’acquisition, la perte ou le réarrangement des cassettes. Par ailleurs un promoteur permet l’expression des cadres de lecture contenus dans les cassettes de gène. Ainsi les intégrons sont à la fois des réservoirs de gènes et des systèmes d'expression de ces gènes. Dans le contexte clinique, ils sont connus pour être impliqués dans l'adaptation des bactéries pathogènes. Ils sont en effet capables d'acquérir et de diffuser des gènes conférant un avantage sélectif face à la pression exercée par l’usage des antibiotiques et des biocides, et par ailleurs d’être mobilisés afin d’être transférés horizontalement. Quelques études ont porté sur les intégrons en dehors des environnements cliniques. Elles ont permis de caractériser de nombreuses cassettes de gènes, sans toutefois en atteindre toute la diversité, à partir de bactéries ou de communautés bactériennes issues d’environnements soumis à différents niveaux de contaminations. Cependant, la diversité de l'intégrase a été peu étudiée, car le plus souvent les études se sont limitées aux séquences d’intégrons cliniques. Ainsi, les intégrons environnementaux sont encore mal connus et mal caractérisés. Les objectifs de ma thèse étaient de caractériser la diversité des intégrons environnementaux, avec un focus particulier sur les intégrases, à partir d’environnements soumis à des contaminations chimiques variables, dans le but d’évaluer le rôle possible des intégrons dans l'adaptation des bactéries face à des perturbations environnementales. Au cours de ces travaux, environ 800 séquences d’intégrases différentes, pour la plupart encore inconnues, ont été obtenues à partir de différents sédiments d’eau douce et côtiers. Des études in situ et en microcosmes, d’environnements d’eau douce ou de milieux côtiers, et avec différents types et niveaux de polluants, ont permis de mettre en évidence un impact des contaminations du milieu sur la diversité des intégrons, sur l’intégrase comme sur les cassettes de gène, de manière indépendante à la structure de la communauté bactérienne. Enfin, lors de cette thèse a été réalisée la caractérisation d’un intégron potentiellement adaptatif face à une pollution pétrolière, porteur de la séquence intIOPS mise en évidence et nommée par Lionel Huang lors de sa thèse. Finalement, les résultats obtenus lors de cette thèse ont apporté de nouveaux éléments qui viennent soutenir notre hypothèse principale que les intégrons environnementaux seraient impliqués dans l’adaptation des communautés bactériennes en réponse à la présence de contaminants dans les milieux non cliniques. / Integrons are bacterial genetic elements. Recently discovered in the clinical context, they are present in the genome of a number of bacteria from a variety of environments. They are composed of a gene encoding an integrase and a succession of gene cassettes. The activity of integrase allows the acquisition, loss or rearrangement of cassettes. Furthermore, a promoter allows expression reading frames contained in the gene cassettes. Thus, integrons are both reservoirs of genes and these gene expression systems. In the clinical context, they are known to be involved in the adaptation of pathogenic bacteria. They are able to acquire and disseminate genes conferring a selective advantage over the pressure exerted by the use of antibiotics and biocides, and also being mobilized to be transferred horizontally. Some studies have focused on integrons outside of clinical environments. They have characterized many gene cassettes, without however reaching the diversity, from bacteria or bacterial communities coming from environments with different levels of contamination. However, the diversity of integrase has been little studied, because the majority of studies are limited to clinical integron sequences. Thus, environmental integrons are still poorly characterized and their diversity are little understood. The objectives of my thesis were to characterize the diversity of environmental integrate with a particular focus on integrase, from environments with varying chemical contamination, to evaluate the possible role of integrating in adapting bacteria face environmental disturbances. In this work, approximately 800 different integrase sequences, mostly unknown, were obtained from various freshwater and coastal water sediments. Field studies and microcosms of freshwater or coastal environments, with different types and levels of pollutants allowed to demonstrate an impact of environmental contaminations on the integron diversity, whether on the integrase or the gene cassettes, independently to the bacterial community structure. Finally, in this thesis the characterization of a potentially adaptive integron facing an oil pollution were performed. This integron carrying the intIOPS sequence highlighted and named by Lionel Huang during his thesis. Finally, the results obtained in this thesis provide further elements which support our main hypothesis that environmental integrons would be involved in the adaptation of bacterial communities in response to the presence of contaminants in non- clinical settings.

La structuration des réseaux neuronaux est un processus fondamental qui assure le bon fonctionnement du cerveau. Afin de comprendre la formation et l’activité de ces réseaux, nous souhaitons développer une méthode qui permette de contrôler in vivo sous l’action de la lumière l'expression de gènes ciblés impliqués dans ce phénomène,à l’échelle d’une cellule neuronale individuelle. Pour ce faire, nous utilisons une réaction de photo-clivage permettant de libérer de façon contrôlée un inducteur d’expression de gène sous l’action de la lumière, à l’aide de groupements photo-labiles sensibles aux excitations bi-photoniques développés au laboratoire et favorables aux applications in vivo. Afin de photo-réguler l'expression des gènes in vivo et avec un contrôle spatiotemporel élevé, nous combinons le système d’expression de gène inductible par la tétracycline « Tet-on » à une variété de précurseurs photo-activables d’analogues de tétracycline que nous avons synthétisés. Ceci devrait nous permettre de disposer d’un système efficace pour l’expression in vivo d’un gène d’intérêt par excitation lumineuse,et plus précisément dans le but de photo-réguler le gène Kir2.1 impliqué dans la régulation de l’activité électrique des neurones. / The structural neural network’s is a fundamental process that ensures the proper functioning of the brain. To understand the formation and activity of these networks, we are developing a method which spatio-temporally controlled in vivo, the expression of targeted genes involved in this process at individual neuron cells scale by light. To achieve this in vivo tests, it is necessary to work with methods which are orthogonal to their cellular environment. Photochemical activation by photo-cleavage of an inert biological precursor offers a unique orthogonal way to attain this spatio-temporal control. Therefore, we have recently developed a new family of photoremovable group which are sensitive to two-photon (TP) excitation sensitive, in order to irradiate at favorable wave-lengths for in vivo applications. Moreover, to photo-regulate the expression of genes with high spatial and temporal resolution, we are combining the inducible gene expression system by tetracycline called « Tet-on » system to different photo-activable precursors of tetracycline analogs obtained by hemi-synthesis. All this, should allow us to get an effective system for the in vivo expression of a gene of interest by light excitation in order to photoactivate Kir2.1, a gene that cell autonomously silences the electrical activity of neurons in a subset of cells.

Ces dernières années des études ont montré le rôle de la méthylation dans la régulation transcriptionnelle. Au cours de cette thèse, nous avons exposé des cellules hépatiques à plusieurs stimuli pour en évaluer l'effet au niveau du méthylome. Nous avons précisément étudié des facteurs clés dans le carcinome hépatocellulaire que sont le virus de l'hépatite B, le TGFbeta et au cours de la différenciation des hépatocytes. Au cours de ces expositions, nous avons observé que la méthylation était remanié spécifiquement dans certaines régions. En effet nous n'avons pas observé de nombreux changements dans les régions promotrices mais dans les régions intragéniques. Nous avons ensuite identifié l'impact des changements de méthylation dans ces régions. Nous avons ainsi pu observer qu'au cours de la différenciation hépatique une déméthylation du corps du gène HNF4A au sein d'un promoteur alternatif était corrélé à l'expression d'un autre isoforme de ce gène sous le contrôle de ce promoteur alternatif. Enfin nous avons utilisé l'outil d'édition CRISPR pour modifier les régions intragéniques. Nous avons ainsi inséré des mutations au sein d'un enhancer intronique du gène TRRAP. Nous avons alors observé que cette région semblait être nécessaire à la surexpression du gène au cours du traitement mais également au niveau de la réponse au TGFbeta. En conclusion nous avons identifié les régions intragéniques comme des régions épigénétiquement dynamiques en réponse aux facteurs environnementaux tels que l'inflammation et l'infection par HBV. Nous avons également identifié pour ces régions un potentiel rôle dans la régulation transcriptionnelle ainsi que dans les événements d'épissage alternatif / Hepatitis B virus (HBV) and chronic inflammation are well known risk factors for several chronic liver pathologies and cancer. We firstly studied the ability of HBV to modify the host methylome, using naturally infected primary human hepatocytes, and bead array. As a result, we identified non- random changes in gene expression and DNA methylation occurring specifically upon HBV infection. Moreover, a set of differentially methylated sites appeared early and were stable. These HBV-induced DNA methylation changes were defined by a specific chromatin context characterized by CpG-poor regions outside of gene promoters. During liver inJury, hepatic progenitor cells (HPC) are essential for tissue regeneration. Because of its role in determining cellular fate, DNA methylation may have an important role during the process of HPC differentiation. We therefore assessed DNA methylation during HPC differentiation. We found a progressive demethylation of HNF4A alternative promoter strongly associated with higher expression of another isoforms of HNF4A. Finally, TGFbeta is linked to a change in DNA methylation profiles. Using genome-wide strategy we observed a specific pattern of DNA methylation changes in response to TGFbeta treatment. Indeed, the observed changes were, as for HBV-induced changes, enriched in intragenic regions. In order to study the role of these regions, we used CRISPR/Cas 9 strategy on the intragenic enhancer of the TRRAP gene. This disruption was likely to suppress TGFbeta response at TRRAP expression level as well as the complete response to this cytokine. These data support a higher dynamicity of intragenic regions in response to the different stimuli we used at methylation level in liver cells. Moreover, these results support a role of intragenic methylation in cellular

L'objectif principal de ma thèse a été la caractérisation de l'histoire évolutive des voies de signalisation au travers d'une double approche: (i) l'analyse phylogénétique de leurs composés; et (ii) l'identification et la caractérisation de leurs interactions par l'analyse des interactomes d'organismes modèles. Or, bien que de nombreux outils soient disponibles pour la reconstruction d'arbres de gènes individuels, peu de méthodes ont été développées pour l'étude d'un ensemble de protéines impliquées dans un même processus cellulaire. Pourtant, au sein de la cellule, la plupart des protéines agissent en interaction avec d'autres protéines. Dans un premier temps, j'ai étudié l'histoire évolutive de la famille des PI3K (Phosphatidylinositol 3-kinases). Cette première analyse phylogénétique détaillée m'a permis de mettre en place une méthodologie applicable aux voies de signalisation. Un problème important rencontré dans cette étude a consisté en la sélection de transcrits alternatifs et ceci m'a conduit à développer un logiciel dédié nommé BATfinder (\Best Aligned Transcript finder). Dans le but d'étudier la voie de signalisation AKT/mTOR, j'ai effectué l'implémentation de la méthodologie validée avec les PI3K. Cette implémentation a pris la forme d'un pipeline automatique nommé EPINe (Easy Phylogenetics for Interaction Networks). Ce pipeline est théoriquement utilisable pour l'analyse phylogénétique de tout réseau métabolique eucaryote / The main goal of my thesis was the characterization of the evolutionary history of signalling pathways through a twofold approach: (i) the phylogenetic analysis of their components; and (ii) the identification and characterization of their interactions by the analysis of model organisms interactomes. While many tools are available for single genes tree reconstruction, only a few methods have been developed for the study of a set of proteins involved in the same cellular process. However, inside the cell, most of proteins interact with others.Initially, I studied the evolutionary history of the PI3K family (Phosphati-dylinositol 3-kinases). This first detailed phylogenetic analysis allowed me to set up a methodology suitable for signalling pathways. One of the important problems encountered in this study was the selection of alternative transcripts and this led me to develop a software called BATfinder (Best Aligned Transcript finder ). In order to study the AKT/mTOR signalling pathway, I have implemented the methodology previously validated with PI3Ks. This implementation was carried out as an automated pipeline called EPINe (Easy Phylogenetics for Interaction Networks). This pipeline is theoretically usable for the phylogenetic analysis of any eukaryotic metabolic network

La graisse commune est la principale phytobactériose du haricot.Cette maladie est causée par Xanthomonas citri pv. fuscans(Xcf) et X. phaseoli pv. phaseoli (Xpp). Xcf et Xpp étantphylogénétiquement distantes, leur capacité à produire lesmêmes symptômes sur haricot serait le fruit d’une convergencepathologique. L’objectif de cette thèse était d’identifi erles gènes candidats pour la spécifi cité d’hôte et d’étudier le rôledes effecteurs Transcription Activator-Like (TAL) dans l’interactionXanthomonas - haricot. Par une approche de génomiquecomparative, nous avons identifi é 116 gènes spécifi ques desagents de la graisse commune, dont un grand nombre a ététransféré horizontalement entre Xcf et Xpp. Ces gènes codentdes protéines intervenant aux différentes étapes de l’interaction.L’obtention du génome de 17 souches par séquençageSingle-Molecule Real-Time a révélé l’existence de un à troisgènes codant des effecteurs TAL par souche, pour un total dequatre gènes tal différents dont deux (tal23A et tal18H) ontété également transférés horizontalement entre Xcf et Xpp.L’ensemble de ces gènes constitue un répertoire spécifi que deXcf et Xpp qui pourrait expliquer la convergence pathologiqueentre ces pathovars. Des tests de pouvoir pathogène couplés àdes analyses transcriptomiques après inoculation d’un mutantde délétion de tal18H sur haricot ont révélé que TAL18H étaitimpliqué dans l’aggravation des symptômes et avait un effetpléiotrope sur le transcriptome du haricot lors de l’interaction.Les résultats de cette thèse constituent une / Common bacterial blight is the main bacterial disease of commonbean. This disease is caused by Xanthomonas citri pv.fuscans (Xcf) and X. phaseoli pv. phaseoli (Xpp). Xcf and Xppare phylogenetically distant yet they share the ability to inducethe same symptoms on common bean, which is suggestive ofpathological convergence between these two pathovars. Thisthesis aimed at identifying candidate genes for host specifi -city and studying the role of Transcription Activator-Like (TAL)effectors in the Xanthomonas – common bean interaction.Using a comparative genomic approach, we identifi ed 116genes specifi c to common bacterial blight agents, a largenumber of which were horizontally transferred between Xcfand Xpp. These genes encoded proteins involved in the differentsteps of the interaction.Single-Molecule Real-Timesequencing of 17 Xcf and Xpp genomes unveiled one to threeTAL-encoding genes per strain for a total of four different talgenes, two of which (tal23A and tal18H) were also horizontallytransferred between Xcf and Xpp. All these genes forma repertoire specifi c to Xcf and Xpp that could be responsiblefor the pathological convergence observed between thesetwo pathovars. Combination of pathogenicity tests and transcriptomicsafter inoculation of a tal18H deletion mutant oncommon bean plants revealed that TAL18H was involved insymptom development and displayed a pleiotropic effect oncommon bean transcriptome during the interaction. The resultsof this thesis constitute a stepping stone towards optimizingthe monitoring of co

Le champignon filamenteux, Podospora anserina, possède deux types sexuels, mat+ et mat-, caractérisés chacun par une séquence spécifique. La séquence mat+ contient un seul gène FPR1; la séquence mat- contient trois gènes : FMR1, SMR1 et SMR2. La fonction moléculaire de SMR1 est inconnue, les autres gènes codent des facteurs de transcription qui contrôlent la fécondation (reconnaissance intercellulaire), et le passage d’un syncytium à un hyphe spécialisé binucléé contenant un noyau mat+ et un noyau mat- (reconnaissance internucléaire). Il n’y a pas eu d’analyse exhaustive des gènes impliqués dans la reconnaissance intercellulaire et le mécanisme de la reconnaissance internucléaire est encore inconnu. Afin de déterminer les cibles de FPR1 et FMR1, et les différents mécanismes impliqués, nous avons utilisé une approche microarray. Le profil transcriptomique des souches mat+ et mat- compétentes pour la fécondation a permis d’identifier 157 gènes cibles, et l’analyse transcriptomique des souches mutantes fpr1- et fmr1- a révélé que ces cibles peuvent être soit réprimées, soit activées par FMR1 ou FPR1, ou être sous le contrôle de ces deux facteurs. Ces expériences ont aussi détecté l’existence de 10 gènes activés ou réprimés au même niveau dans mat+ et mat-. La délétion de 32 gènes choisis parmi ces 167 gènes cibles n’a permis de mettre en évidence que deux gènes impliqués dans la fécondation. Les comparaisons des gènes cibles des facteurs de transcription MAT de Gibberella moniliformis et Sordaria macrospora avec ceux de P. anserina révèlent un nombre significatif de gènes cibles communs entre ces espèces, mais ces gènes ont des profils transcriptomiques différents, soulevant la question du rôle de ces gènes cibles. La recherche des gènes cibles de FPR1, FMR1 et SMR2 impliqués dans la reconnaissance internuléaire a été effectuée en comparant le transcriptome des périthèces issus de deux croisements, l’un n’exprimant que les gènes spécifiques mat+, l’autre que les gènes spécifiques mat-. Les résultats ont été interprétés selon le modèle d’identité nucléaire et le modèle de ségrégation aléatoire. Le premier modèle a conduit à l’identification de 27 gènes cibles, tandis que 154 gènes cibles ont été identifiés en appliquant le deuxième modèle. Au total 46 souches mutantes ont été construites. Cependant aucune délétion n’a affecté le développement sexué. En parallèle de ces expériences transcriptomiques, nous avons invalidé tous les gènes à HMG-box de P. anserina. Les résultats montrent que ces derniers ont un rôle très important dans le développement sexué, particulièrement Pa_1_13940 qui code un régulateur des gènes des types sexuels, le premier identifié chez les Pezizomycotina. / The filamentous fungus, Podospora anserina, has two mating-type idiomorphs, mat+ and mat-. The mat+ sequence contains one gene FPR1, while mat- contains three genes: FMR1, SMR1 and SMR2. The molecular function of SMR1 is unknown, FPR1, FMR1 and SMR2 encode transcriptional regulators which control the fertilization (intercellular recognition) and the transition from a syncytium to a specialized dikaryotic hypha which contains one mat+ and one mat- nucleus (internuclear recognition). No exhaustive analysis is available for the genes involved in the intercellular recognition, while the mechanism of the internuclear recognition is unknown. In order to understand the mechanism of these events and to identify the target genes of mating-type transcription factors, we used a microarray approach. The transcriptomic profiles of the mat+ and mat- strains that are competent for fertilization revealed 157 differentially transcribed genes, and transcriptomic analysis of fmr1- and fpr1- mutant strains was used to determine the regulatory actions exerted by FMR1 and FPR1 on these differentially transcribed genes. All possible combinations of transcription repression and/or activation by FMR1 and/or FPR1 were observed. Furthermore, 10 additional mating-type target genes were identified that were up- or down-regulated to the same level in mat+ and mat- strains. Of the 167 genes identified, 32 genes were selected for deletion, which resulted in the identification of two genes essential for the sexual cycle. A comparison with similar data set from the two ascomycetes, Gibberella moniliformis and Sordaria macrospora, reveals significant numbers of orthologous pairs, although transcriptional profiles were not conserved between species, questioning the function of these target genes. Internuclear recognition was investigated by the transcriptomic analysis of perithecia from two crosses expressing mat+ and mat- genes, respectively. The tow internuclear recognition models: nuclear identity and random segregation, were used to interpret our results. According to the former model, 27 target genes have been identified, while 154 target genes were identified with the latter model. A total of 46 mutant strains were constructed. However, these strains showed no defects in sexual development. Besides this microarray experiences, we have invalidated all HMG-box genes of P. anserina. The results show that the HMG-box genes have a very important role in sexual development, especially Pa_1_13940 which encodes the first identified regulator of Pezizomycotinan mating-type genes.

Comment la taille d'un organisme est-elle régulée au cours du développement embryonnaire ? Quels sont les mécanismes génétiques à l'origine de l'arrêt de la prolifération pendant la croissance d'un organisme pluricellulaire ? Afin d'identifier des acteurs de la sortie du cycle cellulaire au cours du développement, mon travail s’est orienté sur l’étude de gènes suppresseurs de tumeurs pendant la croissance du toit optique (TO) du médaka Oryzias latipes. Le TO, structure dorsale du cerveau moyen des Vertébrés, est un modèle particulièrement adapté à l’étude de la régulation de la prolifération. Trois zones de la marge vers le centre du TO sont discernables : une zone périphérique de prolifération, une zone intermédiaire de cellules sortant du cycle cellulaire et une zone centrale de cellules différenciées. Un crible d'expression par hybridation In Situ a été réalisé et a permis d'identifier 28 gènes exprimés dans le TO, suggérant leur implication dans le contrôle de la sortie du cycle cellulaire au cours du développement. Dans le but de caractériser in vivo la fonction de gènes issus de ce crible, le gène BTG1 (B-cell Translocation Gene 1) et les membres de sa famille, ont été étudiés au cours du développement du médaka. J’ai mené des expériences fonctionnelles sur BTG1, permettant de mettre en évidence son rôle central pour la morphogenèse du système nerveux central. De plus, une autre partie de mon travail s’est penchée sur l’étude de l’expression des membres de la voie de signalisation Hippo, bien connue et caractérisée chez la drosophile et les Mammifères pour son rôle dans le contrôle de la taille des organes via une régulation de l’arrêt de la prolifération. A l’issu de notre travail, une fonction de la voie de signalisation Hippo dans la formation du TO et des somites a pu être mise en évidence au cours du développement du médaka. / How is an organisms’ size regulated during embryonic development? What are the genetic mechanisms that control the proliferation arrest during multicellular organisms growth? In order to identify a cell cycle exit developmental actor genes, I have analysed the role of tumor suppressor genes (TSGs) in the optic tectum (OT) of the medaka Oryzias latipes. This structure is particularly suited for this kind of studies because, during its morphogenesis, there is a strict correlation between the position of a cell and its degree of differentiation. 3 zones can be easily distinguished from the border to the center: a marginal zone made of proliferative cells, an intermediate zone in which cells exit the cycle, and a central zone made of postmitotic cells. Using this criterium, I have performed an in situ hybridization expression screen on 150 TSGs on medaka embryos. The expression patterns of 28 TSGs in the OT suggest their implication in the OT proliferation arrest mechanisms. I focused my study on the BTG1 gene, implicated in many cancers, and for which few developmental data are available. A functional analysis on developing medaka embryos has been performed and permitted to highlight the essential role of BTG1 in central nervous system morphogenesis. Furthermore, I performed an expression study on Hippo signalling pathway components. Hippo pathway is well caracterised for its organ size control function in drosophila and Mammals. Our results show that this pathway could act in OT formation and somitogenesis in medaka fish.

The sujet de cette these portait sur la caractérisation de la machinerie originale utilisée par les Mimiviridae pour glycosyler les fibrilles entourant leurs capsides en travaillant sur les prototypes des 3 lignées connues, Mimivirus (A), Megavirus chilensis (B) et Moumouvirus australensis (C). Les fibrilles de Mimivirus sont décorées par 2 polysaccharides différents :l’un est caractérisé par la répétition d’un disaccaride linéaire fait de 3)-α-L-Rha-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→, avec un pyruvate branché en position 4,6 du GlcNAc ; l’autre présente une unité répétée branchée de séquence 2)-α-L-Rha-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ pour le squelette linéaire et du rhamnose branché en position 3 par de 2OMeVioNAc. Nous avons suggéré que les fibrilles de Megavirus sont décorées par plus d'une espèce de polysaccharides/oligosaccharides, donc l’un ayant présentant un trisaccharide de RhaNAc:α-L-4OMe-RhaNAc-(1→3)-α-L-RhaNAc-(1→3)-α-L-RhaNAc-(1→. Les fibrilles de Moumouvirus sont décorées de glucosamine, quinovosamine et bacillosamine. A partir de ces données expérimentales il devenait possible de rechercher de nouveaux gènes responsables de ces glycosylations spécifiques. Le cluster de 9 gènes déjà publié de Mimivirus a pu être étendu à 13 gènes. Un cluster de 14 gènes a été d’autre part identifié dans le génome de Moumouvirus, le premier cluster de gènes de la glycosylation identifié dans la lignée B. Parmi les gènes de glycosylation, l’analyse fonctionnelle in vitro de la protéine L142 a permis de démontrer qu’il s’agit d’une N-acétyltransferase. En conclusion, les fibrilles des Mimiviridae sont lourdement glycosylées and le type de sucres et leur organisation dépend de la lignée considérée. / The aim of this thesis is the study of the innovative glycosylation machinery used by the Mimiviridae family for the glycosylation of the fibrils sourrounding their capsid, using Mimivirus, Moumouvirus australensis and Megavirus chilensis as prototypes of lineages A, B and C, respectively. Mimivirus fibrils are decorated with two distinct polysaccharide: one is characterized by a linear disaccharide repeating unit made of 3)-α-L-Rha-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→, with a pyruvic acid branched at position 4,6 of GlcNAc.; the other has a branched repeating unit with the sequence 2)-α-L-Rha-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ in the linear backbone and rhamnose further branched at position 3 by viosamine methylated at position 2 and acetylated at position 4. We suggested that Megavirus chiliensis fibrils are decorated by more than one polysaccharides/oligosaccharide species, one having this trisaccharide: α-L-4OMe-RhaNAc-(1→3)-α-L-RhaNAc-(1→3)-α-L-RhaNAc-(1→. Moumouvirus australensis fibrils are decorated with glucosamine and quinovosamine in addition to the rare sugar, bacillosamine. Starting from this experimental data, it was possible to identify new genes involved in glycosylation. As a result, the published nine-gene cluster of Mimivirus was extended to thirteen genes. A different cluster of fourteen genes was identified in Moumouvirus australensis, representing the first glycosylation gene cluster identified for the B lineage.Among the glycosylation genes, the function of L142 was investigated in vitro, demonstrating that it is an N-acetyltransferase. To conclude, the fibrils of Mimiviridae are heavily glycosylated and the type of sugars and their organization depends on their lineage.

La recombinaison homologue est un mécanisme de réparation de l’ADN extrêmement contrôlé et particulièrement chez les eucaryotes supérieurs. Dans les cellules méiotiques de ces derniers, où les cassures doubles brin de l’ADN sont programmées, les voies de crossing-over de la recombinaison homologue, qui génèrent de nouvelles combinaisons de gènes, sont restreintes. Dans les cellules somatiques, la recombinaison illégitime, qui assure majoritairement la réparation des cassures double brin de l’ADN, limite l’intégration ciblée du transgène par recombinaison homologue. Les entreprises de biotechnologie convoitent de maitriser la recombinaison homologue afin de contrôler d’une part le brassage génomique qui a lieu pendant la méiose, et d’autre part l’intégration du transgène dans le génome. Cette étude a porté sur le développement d’outils afin d’atteindre ces deux objectifs. Afin d’augmenter le brassage du génome, ayant lieu pendant la méiose, une version du promoteur OsDmc1b, active dans les cellules méiotiques, a été caractérisée chez le maïs. Des plantes sur-exprimant le gène ZmSpo11.1, sous contrôle de ce promoteur, ont ainsi été développées afin d’obtenir des lignées potentiellement hyper-recombinantes. Si la surexpression de ZmSpo11.1 permet effectivement d’augmenter le taux de crossing-over, il pourra être utilisé par les sélectionneurs afin d’accélérer l’introgression d’allèles d’intérêt dans des variétés élites. Concernant la mise en place d’une technique de ciblage de gène, deux stratégies, reposant sur l’utilisation de la méganucléase I-SceI, ont été testées. La démarche a nécessité trois éléments : un locus cible contenant le site de coupure I-SceI, une matrice de réparation et la séquence codant I-SceI (ou I-SceI::GR). La première stratégie, consistant à retransformer les lignées présentant le locus cible avec la matrice de réparation et I-SceI, ne semble pas exploitable car aucun évènement de ciblage de gène n’a été mis en évidence. La seconde stratégie, reposant sur l’assemblage des trois éléments par croisement, est beaucoup plus prometteuse. Malgré la faible activité d’I-SceI::GR, des évènements de recombinaison homologue ont été observés dans les tissus foliaires de certaines plantes. Du cal embryogène, développé à partir de ces dernières, a permis de régénérer des plantes présentant des évènements de ciblage de gène. Ces travaux ouvrent de nouvelles perspectives dans l’élaboration contrôlée d’OGM. / Homologous recombination is a DNA repair mechanism highly regulated in higher eukaryotes. In their meiotic cells, where DNA double-stranded breaks are programmed, the crossing-over pathway of homologous recombination, which generates new gene combinations, is limited in activity and genomic distribution. In somatic cells, illegitimate recombination, which mainly ensures DNA double-strand repair, limits the targeted integration of transgenes by homologous recombination. Biotechnology companies aim to master homologous recombination to control on the one hand the genomic mixing that occurs during meiosis, and on other hand, the integration of transgenes into the genome. This study focuses on the development of tools to achieve these two objectives.To increase genome mixing occurring during meiosis, a version of the OsDmc1b promoter active in maize meiotic cells was isolated. Then, plants over-expressing the ZmSpo11.1 gene under control of this promoter have been developed to obtain potentially hyper-recombinant lines. If ZmSPO11.1 overexpression increases the crossing over rate, it can be used by breeders to accelerate the introgression of alleles of interest into elite varieties. For the establishment of a gene targeting technique, two strategies based on the use of the I-SceI meganuclease were tested. These approaches involved the use of three elements which are: a target locus containing the cleavage site of I-SceI, a repair template and the sequence encoding I-SceI (or ISceI::GR). The first strategy, consisting of the retransformation of target locus lines with the repair template and I-SceI, does not seem workable because no gene targeting events were isolated. The second strategy, based on the assembly of the three components by crossing, is more promising. Despite the low activity of I-SceI::GR, homologous recombination events were observed in leaf tissues of certain plants. Embryogenic callus, developed from these plants, permitted the regeneration of plants with gene targeting events. This work opens new perspectives in the development of controlled GMO production.