La perception de l’environnement extérieur est importante pour des interactions efficaces entre plantes et champignons. Chez les champignons filamenteux, l’information associée au pH extracellulaire est transmise via une voie de signalisation conservée et impliquant sept protéines. Parmi ces protéines, la protéine transmembranaire PalH est un récepteur présumé initier la réponse aux pH neutre ou alcalin. Le facteur de transcription PacC, présent sous forme inactive dans le cytoplasme de la cellule fongique, est clivé en réponse à l’activation de la voie, et migre dans le noyau où il active la transcription des « gènes alcalins » et réprime la transcription des « gènes acides ». Chez Magnaporthe grisea, un Ascomycète responsable de la principale maladie du riz, le rôle de cette voie dans la physiologie du champignon est encore inconnu. Les deux homologues des gènes PACC et PALH ont été identifiés. Dans le but d’analyser le rôle des deux protéines PacC et PalH chez M. grisea, la délétion de ces gènes a été réalisée. Plusieurs phénotypes ont été analysés chez les deux souches mutantes, notamment la croissance, la sporulation et le pouvoir infectieux. Ceci a permis d’étudier le rôle de la signalisation liée au pH extracellulaire dans le cycle de développement de M. grisea. De plus, une analyse du profil des gènes exprimés chez le mutant ΔpacC a été initiée. Les résultats obtenus indiquent que cette voie est importante pour l’adaptation du champignon à un environnement alcalin et qu’elle joue un rôle dans la pathogénicité du champignon / Perception of external environment is important for successful infection of plants by fungi. In these organisms, the information about extracellular pH is provided to the cell by a conserved signalling pathway that involves seven proteins. Among these proteins, the transmembrane protein PalH is the putative receptor which would initiate the pH response. The transcription factor PacC, existing in an inactive form in the fungus cell cytoplasm, is activated through proteolysis in response to the pathway activation, and migrates into the nucleus where it activates the « alkaline » genes transcription and represses that of the « acidic » genes. In Magnaporthe grisea , an ascomycete responsible for the main rice disease, the role of this pathway is still unknown. In this work, the PACC and PALH genes have been identified. In order to analyse the role of the two corresponding proteins PacC et PalH, the deletion of these two genes has then been performed. Several phenotypes were studied in the two mutant strains, including growth rate, conidiation and ability to infect host plants. This enabled the investigation of the involvement of the pH signalling pathway in the M. grisea development cycle. Furthermore, a gene expression profiling analysis of the ΔpacC mutant has been undertaken and revealed the multiple cellular responses to pH changes. Taken all together, the results collected in this work indicate that the pH signalling pathway is important for M. grisea's adaptation to an alkaline environment and that it plays a significant role in the fungus pathogenicity

L’ataxie de Friedreich (AF) est une maladie mitochondriale caractérisée par une ataxie sensitive et spinocérébelleuse, une cardiomyopathie et du diabète, pour laquelle il n’existe pas de traitement. L’AF résulte de niveaux réduits de frataxine (FXN), une protéine mitochondriale impliquée dans la biosynthèse des centres Fe-S. La neurophysiopathologie précise de la maladie n’est pas identifiée et malgré d’intenses progrès ces dernières années, il n’existait pas de bon modèle pour développer des approches thérapeutiques visant à stopper ou réverser l’atteinte sensitive de l’AF. Nous avons donc généré un nouveau modèle murin qui récapitule l’ataxie sensitive et la neuropathie associée au déficit en FXN. Plusieurs mécanismes moléculaires affectés en absence de FXN dans les neurones proprioceptifs, primairement affectés dans l’AF, ont été identifiés. Nous avons également démontré l’efficacité d’une approche de thérapie génique, basée sur l’utilisation de vecteur adéno-associés (AAV) exprimant la FXN humaine, pour réverser la neuropathie, établissant la preuve de concept du potentiel d’une telle approche pour l’atteinte sensitive de l’AF. / Friedreich ataxia (FA) is a rare mitochondrial disease characterized by sensory and spinocerebellar ataxia, hypertrophic cardiomyopathy, and diabetes, for which there is no treatment. FA is caused by reduced levels of frataxin (FXN), an essential mitochondrial protein involved in the biosynthesis of Fe-S clusters. To date, FA precise neuropathophysiology is not identified and despite significant progresses in recent the years, there was no good model to develop therapeutic approaches in order to stop or reverse the sensory ataxia associated to the FA. Thus, we have generated a new neuronal mouse model that recapitulates the sensory ataxia and the neuropathy associated to FXN deficiency. Several molecular mechanisms dysregulated in the absence of FXN in the proprioceptive neurons, primarily affected in FA, were identified. Furthermore, we have demonstrated the efficacy of a gene therapy (GT) approach, based on the delivery of adeno-associated vectors (AAV) expressing the human FXN, to reverse the sensitive neuropathy, thus establishing the preclinical proof of concept for the potential of GT in treating FA sensitive neuropathy.

Dans ce travail de thèse, nous avons étudié la variabilité (ou stochasticité) de l’expression des gènes en considérant que le signal stochastique que produit cette expression est porteur d’information quant au processus d’expression lui-même. Cette stochasticité de l’expression génique peut être caractérisée par la variation observée du nombre de protéines produites soit entre différentes cellules isogéniques (portant le même génome) à un instant donné, soit au sein d’une même cellule au cours du temps. Dans un premier temps, nous avons montré expérimentalement que le niveau de stochas- ticité de l’expression d’un gène change suivant son locus (sa position sur le génome). De plus, nous avons montré que, à locus constant, le niveau de stochasticité peut être influencé par des agents modificateurs globaux de l’état chromatinien. Ensuite, nous avons analysé comment la dynamique chromatinienne peut influencer la stochasticité de l’expression génique d’un gène. Pour ce faire, nous avons utilisé une ap- proche de modélisation et simulation que nous avons ensuite confrontée à des données biologiques. L’utilisation d’un modèle à deux états nous a permis de montrer que l’acti- vité du promoteur est caractérisée par de longues périodes durant lesquelles la chromatine empêche la transcription, entrecoupées par de brèves périodes où la transcription est à nouveau rendue possible sous forme de « bursts » de forte intensité. Pour finir, nous avons identifié, par des approches statistiques et par l’utilisation de bases de données génomiques, des éléments caractéristiques de la séquence génomique qui, lors- qu’ils sont présents dans le voisinage d’un gène, peuvent influer sur la stochasticité de celui-ci. Nous avons en particulier montré que, lorsque le gène rapporteur est inséré à proximité d’un autre gène, sa stochasticité augmente de manière significative. Ce travail nous a permis de mettre en évidence un lien entre la dynamique chromatinienne, l’environnement génomique et la stochasticité de l’expression génique. Ce lien offre à la cellule des perspectives évolutives en lui permettant de réguler cette stochasticité, ouvrant ainsi la porte à la sélection d’un niveau approprié de variabilité. / During my PhD, we have studied the variability (or stochasticity) of gene expression assuming that the stochastic signal it produces carries information about the process of gene expression itself. The stochasticity of gene expression can be characterized by the observed variation in the number of proteins produced either by different isogenic cells (cells that have the same genome) at a given time or within a single cell over time. First, we showed experimentally that the level of stochasticity of a gene changes according to its locus (its position on the genome). We have also shown that, for a given locus, the level of stochasticity could be influenced by global chromatin-state modifier agents. Then, we analyzed how the chromatin dynamics can influence the stochasticity of gene expression. This analysis was conducted by using a modeling and simulation approach, the results of which being in turn compared to biological data. Using a two-states model allowed me to show that the activity of a promoter is characterized by long periods during which the chromatin prevents transcription, interspersed by brief periods when transcription can occur in the form of intense bursts. Finally, we identified characteristic genomic elements that, when in the neighbourhood of a gene, may influence its level of stochasticity. In particular, we have shown that when the reporter gene is integrated close to a neighbour gene, its stochasticity is significantly increased. This work allowed me to unravel a link between the chromatin dynamics, the genomic environment and the stochasticity of gene expression. This link confers evolutionary pers- pectives to the cell by allowing it to regulate stochasticity, which allows for the selection of an appropriate level of stochasticity.

L'hypertrophie ventriculaire gauche (HVG) est un remodelage prédicteur du développement d'une insuffisance cardiaque et de la mortalité cardiovasculaire. L'hypertension artérielle est une cause majeure de l'HVG, puisque 30% des patients hypertendus développent une HVG. Un dépistage biologique précoce de l'HVG post hypertensive permettrait d'optimiser la prise en charge des patients et d'empêcher que l'HVG évolue vers l'insuffisance cardiaque. L'utilisation de biomarqueurs est un outil rapide, efficace et peu couteux pour le diagnostic de nombreuses pathologies. Dans la pratique clinique il n'existe pas de biomarqueurs pour identifier les patients hypertendus avec HVG de ceux sans ce remodelage. Le premier objectif de notre étude a été d'identifier des biomarqueurs plasmatiques de l'HVG post hypertensive. Une analyse métabolomique obtenue par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire du proton (H1) a été effectuée sur les échantillons de plasma de 48 patients hypertendus avec HVG, 48 hypertendus sans HVG et 24 témoins. A l'aide d'outils bio-informatiques et d'analyses statistiques adaptées, nous avons mis en évidence la présence d'un ratio des groupements chimiques méthylène/ méthyle (-CH2-/-CH3) des chaines aliphatiques des lipides plasmatiques augmenté chez les patients hypertendus avec HVG (p<0.001). Ce ratio détecte la présence d'une HVG chez les patients hypertendus avec une sensitivité de 52.08% et une spécificité de 85.42%. Nous proposons que le ratio -CH2-/-CH3 des chaines aliphatiques lipidiques présent dans plasma représente un biomarqueur diagnostique de l'HVG dans l'hypertension artérielle. L'incidence de l'HVG est aussi augmentée chez les patients qui souffrent du syndrome métabolique (MetS). Le MetS est défini par la présence d'une obésité abdominale plus deux facteurs parmi la dyslipidémie, l'insulino-résistance et l'hypertension artérielle. Ces facteurs synergisent et sont les responsables de l'instauration d'une HVG et d'une progression vers l'insuffisance cardiaque. Des données publiées montrent que les patients MetS ont un taux réduit de l'insulin-like growth factor binding protein 2 (IGFBP2). L'IGFBP2 a un rôle potentiel dans le diabète et dans le métabolisme, mais il n'existe pas d'étude sur son rôle dans les pathologies cardiaques causées par une dérégulation métabolique. Le premier objectif de notre étude sur l'IGFBP2 a été de mesurer le taux plasmatique d'IGFBP2 et le taux d'expression cardiaque de l'ARN messager d'IGFBP2 dans une cohorte de patients avec et sans MetS. Nous avons montré que le taux plasmatique ainsi que le taux d'ARN messager cardiaque d'IGFBP2 sont diminués chez les patients avec le Mets comparé à des témoins. Puis, nous avons mesuré le tôt cardiaque d'ARN messager de l'IGFBP2 dans un model murin de MetS. Pour générer ce modèle, nous avons nourri des souris C57BL/6J avec du régime gras à 60% pendant 15 semaines. Le taux d'expression cardiaque de l'ARN messager de l'IGFBP2 est réduit chez les souris avec Mets, en accord avec les résultats obtenu chez l'homme. Enfin, nous avons testé si la thérapie génique utilisant un virus adeno-associé qui exprime l'IGFBP2 humaine (AAV9-hIGFBP2) pouvait restaurer un niveau normal d'IGFBP2 et interférer avec l'HVG causé par le MetS chez ces souris. Nos résultats montrent que l'injection de l'AAV9-hIGFBP2 rétabli durablement le niveau cardiaque d'IGFBP2 chez la souris avec MetS et qu'IGFBP2 prévient l'épaississement des parois du ventricule gauche, l'hypertrophie et la dysfonction cardiaque. Nos résultats suggèrent qu'IGFBP2 est une nouvelle cible thérapeutique potentielle de l'HVG. / Left ventricular hypertrophy (LVH) is a strong predictor of future heart failure and cardiovascular mortality. Arterial hypertension is considered as the main causative agent for LVH as 30% of hypertensive patients develop LVH. These patients have an increased risk for cardiovascular complications and heart failure. Early diagnosis of LVH and prompt treatment are crucial to reduce LVH and stop its progression towards heart failure. Biomarkers could represent a rapid, effective and low-cost tool to discriminate hypertensive patients with LVH from those with normal LV size. Therefore, we aimed to identify plasma metabolomics biomarkers by 1H NMR to provide novel diagnostic tools for rapid detection of LVH in populations of hypertensive individuals. We realized a cross-sectional study including 48 hypertensive patients with LVH matched with 48 hypertensive patients with normal LV size, and 24 healthy controls. Two-dimensional targeted M-mode echocardiography was performed to measure left ventricular mass index. Partial least squares discriminant analysis was used for the multivariate analysis of the 1H NMR spectral data. From the 1H NMR analysis, we found that the methylene/methyl (-CH2-/-CH3) ratio of aliphatic chain from plasma lipids was significantly increased (p<0.001) in hypertensive patients with LVH compared to hypertensive patients without LVH and to control. Receiver operating characteristic curve showed that a cutoff value of 2.34 provided a 52.08% sensitivity and 85.42% specificity for discriminating LVH (AUC=0.703, p-value<0.001). We propose the -CH2/-CH3 ratio from plasma aliphatic lipid chains as a biomarker for the diagnosis of LVH in arterial hypertension. LVH incidence is also increased in patients with metabolic syndrome (MetS). MetS is defined by central obesity plus any two medical conditions such as dyslipidemia, insulin resistance, and hypertension. These factors synergize to cause LV dysfunction and HF. Published data have shown that MetS patients have low plasma insulin-like growth factor binding protein 2 (IGFBP2). IGFBP2 was shown to play a role in diabetes and metabolism, but studies investigating its role in cardiac diseases are lacking. We first aimed to investigate plasma IGFBP2 levels and cardiac IGFBP2 mRNA levels in MetS patients. Both plasma levels and heart expression levels of IGFBP2 were decreased in patients with MetS compared to control patients. Further, in a C57BL/6J mouse model of 60% high fat diet-induced MetS, we measured cardiac mRNA IGFBP2 levels. According to the observed data in human, mice with MetS showed a decreased cardiac IGFBP2 mRNA level. Finally, we investigated whether a gene therapy strategy using adeno-associated virus 9 carrying human IGFBP2 coding sequence (AAV9-hIGFBP2) could prevent from MetS associated left ventricular hypertrophy. Our data showed that AAV9-hIGFBP2 injection restored durably cardiac IGFBP2 levels in mouse heart and prevented from left ventricle wall thickening, hypertrophy and dysfunction. These clinical and animal data suggest that IGFBP2 is a potential new cardiac therapeutic target in MetS.

Outil d’évaluation des risques microbiologiques d’origine alimentaire, et d’optimisation des procédés de transformation, la microbiologie prévisionnelle ne considère pas l’influence de l’état physiologique des microorganismes sur leur comportement. L’objectif de ce travail est d’identifier des marqueurs permettant de rendre compte de l’impact de l’adaptation cellulaire face à un stress acide. Dans ce cadre, la résistance acide de Bacillus weihenstephanensis a été étudiée et des ARNm ont été identifiés en tant que biomarqueurs de résistance.(i) La résistance acide a été quantifiée via des méthodes culturales pour différents passés cellulaires. L’adaptation à un stress salin est défavorable à la résistance acide en comparaison à des conditions optimales de croissance ou à une adaptation spécifique au stress acide. Néanmoins,la résistance acide de B. weihenstephanensis est modulée de la même façon par l’acidité de l’environnement, indépendamment des conditions de culture préalablement rencontrées.(ii) Un outil basé sur la technologie Pall GeneDisc®a été développé pour permettre la quantification de l’expression génique par RT-qPCR.(iii) La corrélation des données Omic et de résistance acide a permis la sélection de biomarqueurs permettant de différencier les cellules les plus résistantes des cellules les plus sensibles présentent au sein d’une population bactérienne.(iv) Des corrélations linéaires et non linéaires ont également permis de définir des ‘direct biomarker’ qui correspondent aux gènes dont l’expression peut être linéairement corrélée à la résistance; et des ‘long-acting biomarker’ qui correspondent aux gènes dont l’expression transitoire est corrélée à une résistance acide stable.(v) Une analyse multivariée a été utilisée afin de prendre en compte les interactions entre l’expression des différents gènes impliqués dans la résistance acide et a permis la sélection de 9 gènes comme biomarqueurs de résistance acide. Enfin, des premières données prometteuses ont été obtenues. Il serait ainsi possible d’utiliser l’expression génique d’une population bactérienne à un instant donné pour prévoir sa survie dans un environnement létal. / Predictive microbiology is a tool to assess food microbiological risks and optimise food processes. However predictive microbiology which predicts the bacterial behaviour does not take bacterial physiological state into consideration. The aim ofthis work is to identify molecular biomarkers to assess the impact of bacterial adaptation on the subsequent acid resistance. In this study, the acid resistance of Bacillus weihenstephanensis wasinvestigated and mRNAs were identified as acid resistance biomarkers.(i) The bacterial acid resistance of different mildstress adapted cells was quantified using cultural methods. Mild salt-adapted cells were less resistant than cells grown in optimal conditions;and the latter less resistant than acid-adaptedcells. However, the bacterial resistance of B.weihenstephanensis followed the same patternwhen facing acidic changes of the environment and that, whatever the environmental condition previously encountered.(ii) For RT-qPCR gene expression quantifications a specific rotative PCR device based on the PallGeneDisc® Technology was developed.(iii) Omic data and bacterial acid resistances correlation allows the selection of biomarkers to track the more resistant and the more sensitive cells present within the bacterial population.(iv) Both linear and non linear correlations allowed to define two types of biomarkers: ‘Directbiomarker’ for which expression patterns uponmild stress treatment were linearly correlated to the subsequent acid resistance and ‘long-actingbiomarkers’ which were transiently up-regulatedduring mild stress exposure and correlated to increased acid resistance over time.(v) A multivariate analysis was performed to correlate the acid bacterial resistance and the gene expression of vegetative cells. This mathematical method provides the advantage to take gene expressions and their interactions into account and allowed the selection of 9 genes as acid resistance biomarkers of B. weihenstephanensis. Finally, some promising results were also obtained. There by, it would be feasible to use gene expression at a given time to predict the bacterialsurvival behaviour in lethal acid conditions.

Les altérations transcriptionnelles présentes dans le tissu cérébral et dans les leucocytes sanguins des patients souffrant de trouble dépressif majeur (TDM) ou de troubles schizophréniques (TSZ) pourraient être dues à des altérations de la machinerie épigénétique. Ce travail de thèse (i) a recherché des altérations transcriptionnelles des gènes codant pour la machinerie épigénétique dans le tissu cérébral et les leucocytes sanguins de patients souffrant de TDM ou de TSZ, (ii) a confronté les altérations transcriptionnelles périphériques aux altérations cérébrales afin d'évaluer leur significativité neurobiologique. Chez des patients avec TDM, une première étude utilisant la PCR en temps réel a identifié une surexpression des gènes codant pour des enzymes responsables de la mise en place de marques épigénétiques répressives vis-à-vis de l'expression génique dans le cortex préfrontal dorsolatéral (DLPFC), le cortex cingulaire et les leucocytes sanguins. Chez des patients avec TSZ, une deuxième étude de data-mining a identifié une surexpression des gènes codant pour la machinerie de biogénèse des microARNs dans le DLPFC et le cervelet, suggérant une augmentation de la production des microARNs dans ces deux régions cérébrales. Des altérations transcriptionnelles distinctes ont été observées dans les cellules sanguines mononucléées périphériques et l'épithélium olfactif. Une troisième étude utilisant la PCR en temps réel a identifié des réseaux de co-expression génique distincts dans les leucocytes et le tissu cérébral. Certains réseaux, exclusivement retrouvés chez les patients souffrant de TDM, pourraient participer à la constitution du phénotype pathologique. Dans le DLPFC et les leucocytes sanguins, le TDM est associé à une modification de la régulation transcriptionnelle des gènes intervenant dans les processus de stress et de sénescence cellulaires. Au total, ce travail retrouve une altération transcriptionnelle de la machinerie épigénétique dans le TDM et les TSZ. Dans le tissu cérébral, ces anomalies pourraient conduire à une répression de l'expression génique et participer aux altérations transcriptionnelles retrouvées dans le TDM et les TSZ. Dans les leucocytes périphériques, les altérations transcriptionnelles ne reflètent que partiellement les altérations centrales, suggérant que le TDM et les TSZ sont des affections systémiques. L'expression sanguine d'HDAC2 et celle de DICERl pourraient constituer de potentiels biomarqueurs périphériques, respectivement pour le TDM et les TSZ / Transcriptional abnormalities in brain tissue and blood leucocytes of patients with major depressive disorder (MDD) or schizophrenic disorders (SZ) may be due to alterations in the epigenetic machinery. This thesis work aimed to (i) identify altered expression of genes encoding the epigenetic machinery in brain and blood tissues of patients with MDD or SZ, (ii) and compare the peripheral transcriptional alterations to the cerebral ones in order to evaluate their neurobiological relevance.In MDD patients, a first study using real-time PCR identified overexpression of genes encoding enzymes which transfer repressive transcriptional marks in the dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC), the cingulate cortex and the blood leucocytes. In SZ patients, a second study using a data-mining software identified an overexpression of genes encoding the microRNA biogenesis machinery in the DLPFC and the cerebellum, suggesting an increase in microRNA production in these two brain regions. Distinct transcriptional alterations were observed in peripheral mononuclear blood cells and the olfactory epithelium. In MDD patients, a third study using real-time PCR identified MDD-specific, distinct co-expression networks of stress- and senescence-related genes in the DLPFC and blood leucocytes. This suggests that MDD is associated with a transcriptional regulatory shift in the DLPFC and blood leucocytes.Altogether, these studies report transcriptional alterations of the epigenetic machinery coding genes in the brain tissues and blood leucocytes of MDD and SZ patients. In the brain tissues, aberrant expression of the epigenetic machinery coding genes may lead to the repression of gene expression and participate in the transcriptional abnormalities associated with MDD and SZ. In peripheral leucocytes, transcriptional alterations only partially reflect central ones, emphasizing that MDD and SZ are systemic disorders. Finally, HDAC2 and DICER1 blood expression may represent clinically useful peripheral biomarkers for MDD and SZ, respectively

La protoporphyrie érythropoïétique (PPE) est une maladie héréditaire rare caractérisée par un déficit en activité FECH responsable d’une accumulation de PPIX. Elle se manifeste par une photosensibilité très invalidante. Il n’existe pas de traitement efficace pour la PPE. 95 % des malades présentent un allèle FECH hypomorphe (c.315-48C) en trans d'une mutation FECH délétère, ce qui entraine une diminution de l'activité FECH résiduelle dans les érythroblastes en dessous d'un seuil critique d'environ 35 % de l'activité normale. L’allèle hypomorphe (c.315-48C) favorise l'utilisation d'un site cryptique d'épissage situé en -63 de l’intron 3 générant un ARNm FECH incluant une partie de l’intron 3 et possédant un codon stop prématuré. L’ARN est alors dégradé par NMD pendant sa maturation. Nous avons déjà identifié un oligonucléotide antisens (ASO-V1) qui redirige l'épissage vers le site accepteur physiologique de l’intron 3 et augmente la production d’ARN FECH WT. Nous avons développé par ce travail une nouvelle stratégie d’adressage d’ASO-V1 en utilisant des peptides ciblant le récepteur de la transferrine (RTf1) qui est exprimé à un niveau très élevé dans les progéniteurs érythroïdes en différenciation concomitamment à la FECH. Nous avons développé des peptides bifonctionnels à partir des séquences peptidiques ciblant le RTf1 tout en les couplant à des séquences Cell Penetrating Peptide (CPP) qui facilitent la sortie de l’ASO-V1 de la vésicule endosomale. Après la transfection des lignées lymphoblastoïdes de malades PPE par différents nanocomplexes RTf1-CPP/ASO-V1, nous avons pu montrer que plusieurs des peptides bifonctionnels utilisés permettaient une redirection efficace et prolongée de l’épissage cryptique vers l’épissage physiologique exon3-exon4 et que cela permettait une correction des taux d’ARN FECH WT. Nous avons ensuite testé l’effet des nanocomplexes RTf1-CPP/ASO-V1, ex vivo, dans les progéniteurs érythroïdes en différenciation de différents sujets atteints de PPE et nous sommes arrivés à augmenter l’ARN FECH WT et diminuer significativement l’accumulation de la PPIX dans ces cellules par rapport à celles transfectées par des nanocomplexes RTf1-CPP/ASO-Mock. La prochaine étape de notre étude serait d’apporter la preuve de concept, in vivo, dans un modèle murin humanisé de PPE après l'administration de nanocomplexes RTf1-CPP/ASOV1 / Erythropoietic protoporphyria (EPP) is a rare hereditary disease characterized by a deficiency in FECH activity responsible for the accumulation of PPIX. EPP is manifested by a very disabling photosensitivity. There is no effective treatment for EPP. 95% of the patients present a hypomorphic FECH allele (c.315-48C) in trans of a deleterious FECH mutation, resulting in a decrease in residual FECH activity in erythroblasts below a critical threshold of about 35% of normal activity. The hypomorphic allele (c.315-48C) promotes the use of a cryptic splicing site located at -63 of the intron 3 generating a FECH mRNA including a part of the intron 3 and possessing a premature stop codon. The RNA is then degraded by NMD during its maturation. We have previously identified an antisense oligonucleotide (ASO-V1) that redirects splicing to the physiological acceptor site of intron 3 and increases the production of WT FECH mRNA. Here, we developed a new ASO-V1 addressing strategy using transferrin receptor (TRf1) targeted peptides. TfR1 is expressed at a very high level in differentiating erythroid progenitors concomitantly with FECH. We developed bifunctional peptides from peptide sequences targeting TfR1 while coupling them to Cell Penetrating Peptide (CPP) sequences that facilitate the release of ASO-V1 from the endosomal vesicle. We transfected the lymphoblastoid cell lines from EPP patients by different TfR1-CPP/ASO-V1 nanocomplexes and we demonstated that several of the bifunctional peptides allowed an efficient and prolonged redirection of the cryptic splicing towards the exon3-exon4 physiological splicing and the correction of the WT FECH mRNA levels. Then, we tested the effect of TfR1-CPP/ASO-V1 nanocomplexes, ex vivo, in differentiating erythroid progenitors of different EPP subjects and we were able to increase WT FECH mRNA and decrease significantly the accumulation of the PPIX in these cells compared to those transfected by TfR1-CPP/ASO-Scr nanocomplexes. The next step of our study would be to provide a proof of concept, in vivo, in a humanized murine model of EPP after the administration of TfR1-CPP/ASOV-1 nanocomplexes

La faculté d’adaptation aux conditions environnementales des bactéries provient de lacomplexité de leur réseau de régulation génique, impliquant de nombreux régulateursspécifiques et la machinerie d’expression génique. Nous avons montré que le gène crl, codantun régulateur global d’Escherichia coli, est exprimé de façon transitoire lors de laphase exponentielle. Notre étude a permis d’identifier deux régulateurs responsables dece profil parmi une centaine testés. Ainsi, le complexe CRP-AMPc, réprime de façon indirectel’expression de crl, tandis que la nucléoprotéine Fis se fixe sur le promoteur de crlet active sa transcription directement. Le profil d’expression de crl étant similaire à celuide nombreux régulateurs globaux, nous nous sommes intéressés au rôle de la machinerieglobale d’expression des gènes et à son impact sur la croissance. Dans ce but, nous avonsconstruit un système nous permettant de contrôler la croissance d’E. coli en modulantl’expression des sous-unités _ et _’ de l’ARN polymérase et donc le niveau de transcriptiondans la cellule. Lorsque l’ARN polymérase est en faible concentration, le taux decroissance devient quasiment nul et les cellules filamentent. Ce contrôle de la croissanceest dose dépendant et a été mis en évidence autant à l’échelle de la population qu’à cellede la cellule unique. Nous avons enfin étudié par RNA-seq l’impact du niveau d’ARNpolymérase sur la transcription de l’ensemble du génome de cette souche. Cette étudemontre que toutes les classes fonctionnelles de gènes sont affectées par notre système, àl’exception des gènes qui codent les protéines ribosomales. / Bacteria can adapt to many different environmental conditions. This capacity of adaptationis conferred to the organism by a complex regulatory network, composed of specificregulators and the global gene expression machinery. We have studied the expression dynamicsof Crl, a global regulator of Escherichia coli, and observed a peak of transcriptionduring the exponential phase of growth. In order to identify potential regulators of crlexpression, we have measured the expression profile of crl in about one hundred differentmutant strains. This screen has revealed that CRP-cAMP represses indirectly the transcriptionof crl and the nucleoprotein Fis activates transcription of the crl promoter bybinding to the crl promoter region. We noted that the expression of most global regulatorsof E. coli have an expression profile similar to the one of Crl. We have thereforestudied the relationship between global gene expression machinery and cellular growth.We constructed a bacterium where the transcription of the two large subunits of RNApolymerase, _ et _’, is under external control. A small concentration of RNA polymeraseleads to a small growth rate of this engineered bacterium and the cells start to filament,whereas a high concentration of RNA polymerase produces phenotypically wild-type cells.We have characterized the control of growth rate by our system at the population level andin single cells. An analysis of the global transcription pattern of this strain by RNA-seqshows that the transcription of genes in all functional classes, with the possible exceptionof genes coding for ribosomal proteins, are almost equally affected by the modificationsof the intracellular concentration of RNA polymerase.

Les réseaux hydrographiques sont caractérisés par leur structure hiérarchique de type dendritique (ramifié) et l'hétérogénéité spatio-temporelle du milieu. En effet, l'hétérogénéité de l'habitat sur les cours d'eau varie selon le temps (variations saisonnières), la dimension longitudinale (caractéristiques physico-chimiques et courant) et la dimension latérale (connectivité entre le cours principal et les annexes hydrauliques). Ces variations des paramètres environnementaux sont soit graduelles le long des branches du réseau hydrographique (gradient physico-chimique, courant), soit discrètes entre les branches du réseau (diversité de l'habitat). La structure du réseau hydrographique va, par conséquent, influencer la distribution, les déplacements et le flux génique des organismes inféodés aux cours d'eau. Les objectifs de cette thèse étaient de tester (i) l'effet de la topologie du réseau hydrographique sur la dispersion et le flux de gènes, et (ii) l'effet des variations environnementales sur la distribution et les traits phénotypiques des individus liés à la dispersion. Pour répondre à ces objectifs nous avons utilisé une approche empirique, en menant notre étude sur le bassin moyen de la Loire chez une espèce de demoiselle, le Calopteryx splendens (Odonates : Zygoptères). Parallèlement nous avons développé un modèle théorique permettant de simuler la dispersion et le flux de gènes sur des réseaux hydrographiques artificiels. Ainsi nous avons mis en évidence une distribution discontinue des individus sur le cours d'eau et un cline morphologique sur le bassin de la Loire entre l'amont et l'aval. Ce cline est lié aux caractéristiques physico-chimiques de l'eau. Ces variations morphologiques n'influencent pas les capacités de dispersion, mais affectent la survie des individus. La survie et la densité sont les facteurs déterminants de la dispersion chez C. splendens. Les analyses génétiques ont montré un isolement par la distance et une forte structuration génétique sur le bassin versant, mais l'absence d'entités génétiques clairement définies. Ceci peut être expliqué par la présence de flux de gènes entre les sous-bassins et une structure en métapopulation à l'échelle du réseau hydrographique. Ces résultats sont les premiers obtenus à l'échelle d'un bassin versant tel que la Loire sur des populations naturelles. L'étude a également permis de réaliser le logiciel Gene-Net testant l'effet de la géométrie des réseaux hydrographiques sur la structure génétique des populations d'organismes d'eau douce.

L'administration systémique de gènes représente une voie intéressante pour le traitement par thérapie génique de la mucoviscidose ou des cancers pulmonaires. Dans cette optique, les polyplexes (complexes ADN/polymère cationique) doivent atteindre le poumon et traverser les vaisseaux sanguins pour transfecter les cellules épithéliales mutées ou les cellules cancéreuses. Il existe peu de données sur le passage transendothélial de polyplexes. Afin d'en améliorer les connaissances, nous avons mis au point un modèle d'endothélium microvasculaire pulmonaire et étudié l'influence de la polarisation cellulaire sur les voies d'internalisation de polyplexes formés avec la polylysine histidylée (pLK-His) et la polyéthylènimine (PEI), leur efficacité de transfection, leur capacité à traverser la barrière endothéliale et leur adhésion sur la monocouche de cellules endothéliales en conditions de flux. Les travaux réalisés montrent que la polarisation des cellules endothéliales diminue l'internalisation et l'efficacité de transfection des polyplexes pLK-His mais pas celles des polyplexes PEI. Par contre, la polarisation des cellules épithéliales n'a pas d'influence sur l'efficacité des polyplexes pLK-His. Les polyplexes pLK-His et PEI sont capables de traverser la monocouche de cellules endothéliales et transfecter des cellules épithéliales à la fois par leur côté apical et basolatéral. L'incubation des cellules endothéliales avec des cytokines pro-inflammatoires permet d'augmenter ce passage. Enfin, l'adhésion des polyplexes sur les cellules endothéliales est plus importante dans les conditions de flux des microvaisseaux que dans les conditions de flux des veines. L'adhésion des polyplexes PEI est légèrement supérieure à celle des polyplexes pLK-His. Des polyplexes formés avec une PEI sur laquelle a été greffée des motifs de tétraglucose spécifiques des cellules endothéliales adhèrent trois fois plus que les polyplexes formés avec la PEI ce qui montre un ciblage des cellules endothéliales pulmonaires en conditions de flux. L'ensemble des résultats montre qu'il est indispensable de mieux considérer les effets des conditions physiologiques des cellules (polarisation, effets du flux sanguin, conditions d'inflammation) sur la transfection pour concevoir de nouveaux vecteurs synthétiques afin d'améliorer leur efficacité in vivo.