Orientador : Prof. Dr. Diogo R. Bazan Ducatti / Coorientadores : Prof. Dr. Miguel Daniel Noseda, Prof. Dr. Alan Guilherme Gonçalves / Sem cópia digital / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 20/03/2015 / Inclui referências : f. 120-134 / Resumo: As carragenanas são polissacarideos extraídos da matriz extracelular de algas vermelhas, pertencentes a família das galactanas sulfatadas, muito utilizadas na indústria alimentícia como espessante, gelificante, estabilizadora de viscosidade e textura. A odificação química de polissacarideos pode alterar caracteristicas fisico-químicas agregando-lhes valor economico. Dentre essas modificações, a oxidação seletiva e de grande interesse porque gera acidos poliuronicos com ampla aplicação na indústria como, por exemplo, na geleificação, complexação, antifloculação, adesão, bem como uma serie de atividades biológicas, como a atividade anticoagulante. Dessa forma, este trabalho teve como objetivo principal oxidar seletivamente as carragenanas kappa-, iota-, theta-, lambda- e o hibrido iota/nu em diferentes proporcoes utilizando o catalisador N-oxil-2,2,6,6-tetrametilpiperidina (TEMPO) e o co-oxidante acido tricloroisocianurico (TCCA) em solução aquosa tamponada em pH 9,6 para produzir uma carboxila no carbono C6 da unidade monossacaridica (¨3)-ƒÀ-D-alactopiranose. Inicialmente, foi realizado um estudo da reacao de oxidacao seletiva utilizando a kappa-carragenana como substrato e variando os equivalentes de TCCA (0,2; 0,5; 1; 2 e 3). As reacoes foram analisadas atraves de Ressonancia Magnética Nuclear (RMN) 1H indicando a entrada do grupo carboxila de acordo com o aumento do número de equivalentes. Assim, foram realizadas oxidações com 3 equivalentes de TCCA, por 15 horas ou por 2 horas. Foram obtidas oito frações a partir das carragenanas com diferentes graus de oxidação: ƒÈOT, ƒÇ/ƒËOT, ƒÇOP, ƒÇOT, ƒÆOP, ƒÆOT, ƒÉOP e ƒÉOT. Estas fracoes foram caracterizadas utilizando espectroscopia de infravermelho (FTIR) e RMN (1H, 13C e HSQC). Com os dados de literatura e mapas de correlação heteronucleares HSQC foi possivel realizar o assinalamento de RMN das diades produzidas apos a oxidação seletiva C6. A massa molecular relativa das carragenanas nativas e oxidadas foram determinadas utilizando tres curvas padrões de calibração. Análises cromatograficas em HPSEC-MALLS/IR foram utilizadas para a determinação de Mw. As análises revelaram diminuições em Mw após as oxidações e um aumento de solubilidade para a iota- e theta-carragenanas oxidadas, porem com maiores graus de oxidação observa-se diminuicao das taxas de recuperacao para as fracoes ƒÈOT, ƒÇ/ƒËOT, ƒÇOT, ƒÉOP e ƒÉOT sugerindo formação de agregados. As amostras nativas e oxidadas da theta-carragenana (ƒÆN, ƒÆOP e ƒÆOT) foram testadas por aPTT in vitro e apresentaram atividade anticoagulante dose-dependente em potencias diferentes. Os oxidados apresentaram uma potencia maior em relação ao biopolimero nativo, sendo a fracao com oxidação parcial (ƒÆOP) (80% de oxidaço) a que apresentou maior efeito anticoagulante. Palavras-chave: Polissacarideos, galactanas sulfatadas, carragenanas, oxidação seletiva. / Abstract: Carrageenans are polysaccharides extracted from extracellular matrix of red seaweeds that belong to the family of sulfated galactans. They are widely used in food industry as thickening, gelling and stabilizing agents. Chemical modifications of polysaccharides have been reported in order to improve physicochemical properties. The selective oxidation of sulfated polysaccharides can produce polyuronic acids derivatives with defined sulfation pattern and potential biological and technological application. Thus, the aim of this work is the selective oxidation of the kappa-, iota-, iota/nu, theta-, and lambda-carrageenan using 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl (TEMPO) and trichloroisocyanuric acid (TCCA) in a carbonate buffer (pH 9.6). Initially, we performed a study of selective oxidation reaction using the kappacarrageenan as substrate and increased amounts of TCCA (0.2, 0.5, 1, 2 and 3 equivalents). The carboxyl group in the polysaccharide backbone was detected using 1H NMR. It was observed that the increase of TCCA amount gave higher oxidation rate in the carrageenan backbone. The preparative reactions were performed using 3 equivalents of TCCA for 2 or 15 hours to give the following fractions with different degree of oxidation: êOT (87%) (from kappa); é/íOT (>95%) (from iota/nu-), éOP (42%) and éOT (>95%) (from iota-); èOP (80%) and èOT (>95%) (from theta-) and ëOP (83%) and ëOT (>95%) (from lambda-). All the fractions were characterized by infrared spectroscopy (FTIR), 1H,13C and HSQC NMR. The anticoagulant activity of native and oxidized fractions of theta-carrageenan (èN, èOP and èOT) were determined by aPTT. The oxidized fractions showed better activity than native polysaccharide, indicating that selective oxidation increased the anticoagulant property. Keywords: Polysaccharides, sulfated galactans, carrageenans, selective oxidation, TEMPO, TCCA.

GUIMARÃES, Cybele Pinheiro. Polissacarídeos sulfatados de rodofícea Hypnea musciformis como aditivos em apresuntados de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) e análise de estocagem sob refrigeração. Dissertação (Mestrado em Engenharia de Pesca)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by ROGÉRIA MARIA OLIVEIRA (rsetubaloliveira@yahoo.com.br) on 2017-10-25T17:23:51Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_CYBELE PINHEIRO GUIMARÃES.pdf: 1042026 bytes, checksum: 0a4cf31589478f4884edb4406b0dc15c (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-10-26T19:32:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_CYBELE PINHEIRO GUIMARÃES.pdf: 1042026 bytes, checksum: 0a4cf31589478f4884edb4406b0dc15c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-26T19:32:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_CYBELE PINHEIRO GUIMARÃES.pdf: 1042026 bytes, checksum: 0a4cf31589478f4884edb4406b0dc15c (MD5) Previous issue date: 2017 / The objective of the study was to evaluate the application of k-carrageenan of the red seaweed Hypnea musciformis in avocado-type by-products made from Nile tilapia fillets (Oreochoromis niloticus) during 90 days of refrigerated storage. The sulfate polysaccharides (PST) were obtained by refining aqueous extraction (25 and 80° C) and characterized by yield, carbohydrate (CT), free sulfate (SL), contaminating proteins (PCs), infrared spectroscopy , antioxidant activity in vitro, and in vivo toxicity. The PST yield was 36.82 ± 6.56%, CT (77.39 ± 0.012%) and SL (15.66 ± 0.33%). FT-IR showed strong bands for galactose-4-sulfate at 845 to 846 cm -1; 3,6-anhydro-d-galactose at 929 to 930 cm -1 and sulfate ester (S) at 1.230 to 1.260, a possible characteristic of k-carrageenan. The antioxidant action was verified by the methods of DPPH, ferrous ion chelation and total antioxidant capacity, whose results presented, respectively, 57.87%; 67.67% and 59.36% for dilution of 4mg.mL-1 in relation to the BHT and EDTA standards. The toxicological assay was performed in groups (n = 8) of male rats that received PST (100mg.kg-1) and saline (NaCl; 0.15M) for 14 consecutive days. The animals were tolerant to PST, without significant alterations in the parameters evaluated of PST, orally. The starch formulations were divided into groups: CONT (2% starch), APR1 (1% PST), APR2 (3% PST) and APR3 (1% starch and 1% PST). In the evaluation of the presented physicochemical and microbiological analyzes during 90 days of storage. The centesimal composition of the groups showed variation for proteins from 5.29 to 11.94%; humidity 69.02 to 82.77%; lipids 1.27 to 2.98% and carbohydrates 1.62 to 5.35%. pH was stable up to 30 days of storage and TBARS values were favorable up to 60 days of storage CONT (1.72mg MDA.kg-1), APR1 (1.87mg MDA.kg-1), APR3 (1.50mg MDA.kg-1). The water activity (Aw) was high, in the range of 0.96 to 0.98 and the color of the samples did not present p <0.05 significance between the groups. The results of thermotolerant coliforms, Staphylococcus sp and Salmonella presented values within the limits established in the current legislation. And the psychrotrophs were on the limit until the 60th day of storage, except APR2 that presented a value above the acceptable limit (2.13 x 105 CFU.g-1). / O objetivo do estudo foi avaliar a aplicação de k-carragenana da alga marinha vermelha Hypnea musciformis em subprodutos do tipo apresuntados, elaborados a partir de filés de tilápia do Nilo (Oreochoromis niloticus) durante 90 dias de estocagem sob refrigeração. Os polissacarídeos sulfatados (PST) foram obtidos por extração aquosa refinada (25 e 80°C) e caracterizados quanto ao rendimento, carboidratos (CT), sulfato livre (SL), proteínas contaminantes (PCs), espectroscopia no infravermelho (FT-IR), atividade antioxidante in vitro e toxicidade in vivo. Sendo o rendimento do PST (36,82 ± 6,56%), CT (77,39 ± 0,012%) e SL (15,66 ± 0,33%). A FT-IR apresentou bandas fortes para galactose-4-sulfato a 845 a 846 cm -1; 3,6-anidro-d-galactose a 929 a 930 cm -1e éster de sulfato (S) a 1,230 a 1,260, possível característica de k-carragenana. A ação antioxidante foi verificada pelos métodos de DPPH, quelação do íon ferroso e capacidade antioxidante total cujos resultados apresentaram respectivamente 57,87%; 67,67% e 59,36% para diluição de 4mg.mL-1 em relação aos padrões BHT e EDTA. O ensaio toxicológico foi realizado em grupos (n=8) de ratos machos que receberam PST (100mg.kg-1) e salina (NaCl; 0,15M), durante 14 dias consecutivos. Os animais mostraram-se tolerantes aos PST, sem alterações significativas nos parâmetros avaliados dos PST, por via oral. As formulações dos apresuntados foram divididas em grupos: CONT (2% de amido), APR1 (1% PST), APR2 (3% PST) e APR3 (1% de amido e 1% PST). Na avaliação dos apresuntados foram realizadas analises físicoquímicas e microbiológicas durante 90 dias de estocagem. A composição centesimal dos grupos apresentou variação para proteínas de 5,29 a 11,94%; umidade 69,02 a 82,77%; lipídios 1,27 a 2,98% e carboidratos 1,62 a 5,35%. O pH se manteve estável até 30 dias de estocagem e valores de TBARS foram favoráveis até 60 dias de estocagem CONT (1,72mg MDA.kg-1), APR1 (1,87mg MDA.kg-1), APR3 (1,50mg MDA.kg-1). A atividade de água (Aw) foi elevada, na faixa 0,96 a 0,98 e a cor das amostras não apresentou significância p<0,05, entre os grupos. Os resultados de Coliformes ermotolerantes, Staphylococcus sp e Salmonella apresentaram valores dentro dos limites estabelecidos na legislação vigente. E as psicrotróficas ficaram no limite até o 60º dia de estocagem, exceto APR2 que apresentou valor acima do limite aceitável (2,13 x 105 UFC.g-1).

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 EduardoHCF.pdf: 473372 bytes, checksum: 2fca55fdea3773bfb6942b7901966772 (MD5) Previous issue date: 2006-07-07 / Since the first description of sulfated polysaccharides from seaweeds, the biological activities of these compounds have been evaluated under different aspects and experimental procedures. Among the broad biological activities presented by seaweed polysaccharides, anticoagulant action appears as a promising function. In this present study we have obtained sulfated polysaccharides from the green seaweed Codium isthmocladium by proteolytic digestion, followed by separation into five fractions (0.3, 0.5, 0.7, 0.9 and 1.2) by sequential acetone precipitation. The chemical analyses have demonstrated that all fractions are composed mainly by sulfated polysaccharides. The anticoagulant activity of these fractions was determined by activated partial thromboplastin time (aPTT) and prothrombin time test (PT) using citrate normal human plasma. None fraction has shown anticoagulant activity by PT test. Furthermore, all of them have shown anticoagulant activity by aPTT test. These results indicated that the molecular targets of these sulfated polysaccharides are mainly in the intrinsic via of the coagulation cascade. Agarose gel electrophoresis in 1,3-diaminopropane acetate buffer, pH 9.0, stained with 0.1% toluidine blue showed the presence of two or three bands in several fractions while the fraction 0.9 showed a single spot. By anion exchange chromatography, the acid polysaccharides from the 0.9 acetone fraction were separated into two new fractions eluted respectively with 2.0 and 3.0 M NaCl. These compounds showed a molecular weight of 6.4 and 7.4 kDa respectively. Chemical analyses and infrared spectroscopy showed that Gal 1 and Gal 2 are sulfated homogalactans and differ one from the other in degree and localization of sulfate groups. aPPT test demonstrated that fractions 2,0 and 3,0M (Gal1 and Gal 2, respectively) have anticoagulant activity. This is the first time that anticoagulant sulfated homogalatans have been isolated from green algae. To prolong the coagulation time to double the baseline value in the aPTT, the required amount of sulfated galactan 1 (6,3mg) was similar to low molecular heparin Clexane?, whereas only 0,7mg of sulfated galactan 2 was needed to obtain the same effect. Sulfated galactan 2 in high doses (250mg) induces platelet aggregation. These results suggest that these galactans from C. isthmocladum have a potential application as an anticoagulant drug / Desde a primeira descri??o de polissacar?deos sulfatados em algas marinhas, as atividades biol?gicas destes compostos foram avaliadas sob diferentes aspectos e procedimentos experimentais. Dentre as diversas atividades biol?gicas apresentadas pelos polissacar?deos de algas marinhas, a a??o do anticoagulante aparece como sendo uma fun??o promissora. Neste presente estudo foram obtidas cinco fra??es de polissacar?deos sulfatados da alga Codium isthmocladium (F0.3, F0.5, F0.7, F0.9 e F1.2) , atrav?s de prote?lise seguida de fracionamento com volumes crescentes de acetona. An?lises qu?micas demonstraram que todas as fra??es s?o compostas por polissacar?deos sulfatados. A atividade anticoagulante destas fra??es cet?nicas foram determinadas por testes de tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT) e tempo de protrombina (PT), utilizando plasma humano normal citratado. Nenhuma fra??o apresentou atividade via teste de PT. No entanto todas as fra??es demonstraram atividade anticoagulante para teste de aPPT. Estes resultados indicam que o(s) seus alvo(s) molecular(es) esta(?o) localizado(s) principalmente na via intr?nseca da cascata de coagula??o. Eletroforese em gel de agarose demonstrou a presen?a de 2 ou 3 bandas em varias fra??es cet?nicas, enquanto a F0.9, somente uma banda. Os polissacar?deos da F 0.9, quando submetidos a cromatografia da troca i?nica, foram separados em duas novas fra??es elu?das com 2,0 e 3,0 M de NaCl. Estes compostos apresentaram um peso molecular de 6.4 e 7.4 kDa respectivamente. Analises qu?micas e espectroscopia de infravermelho das Gal 1 e Gal 2 demonstraram que essas s?o homogalactanas sulfatadas e que diferenciavam uma da outra apenas no grau e localiza??o dos grupamentos sulfato. Teste de aPTT mostrou que as fra??es 2,0 e 3,0 M (Gal 1 e Gal 2, respectivamente) possuem atividade anticoagulante. Esta ? a primeira vez que homogalactanas sulfatadas anticoagulantes s?o extra?das de macroalgas verdes. A massa necess?ria de Gal 1 (6,3mg) para prolongar o tempo normal de coagula??o em duas vezes, via teste de aPTT, foi semelhante a Clexane?, no entanto somente 0,7mg da Gal 2 s?o necess?rios para se obter o mesmo efeito. A Gal 2 em altas doses (250mg) induziu a agrega??o plaquet?ria. Estes resultados sugerem que as galactanas da alga C. isthmocladum tem potencial aplica??o como f?rmacos anticoagulantes

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MoniqueGCFA_DISSERT_PARCIAL.pdf: 1765775 bytes, checksum: 3815c2c3560cb6ce59df27ea29b474ca (MD5) Previous issue date: 2011-07-18 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Marine algae are one of the major sources of biologic compounds. In extracellular matrix of these organisms there are sulfated polysaccharides that functions as structural components and provides protection against dehydration. The fraction 1.0 (F1.0) rich in sulfated galactans obtained from red seaweed Hypnea musciformis was physicochemical characterized and evaluated for pharmacologic activity through antioxidant activity, cytotoxic action on erythrocytes, anticoagulant, stimulatory action under antithrombotic heparan sulfate synthesis and their effects on cell proliferation and cycle cell progression. The main components of F1.0 were carbohydrates (49.70 ? 0.10%) and sulfate (44.59 ? 0.015%), presenting phenolic compounds (4.79 ? 0.016%) and low protein contamination (0.92 ? 0.001%). Fraction 1.0 showed polidisperse profile and signs in infrared analysis in 1262, 1074 and 930, 900 and 850 attributed to sulfate esters S=O bond, presence of a 3,6- anidrogalactose C-O bond, non-sulfated ?-D-galactose and a C-O-SO4 bond in galactose C4, respectively. The fraction rich in sulfated galactans exhibited strong antioxidant action under lipid peroxidation assay with IC50 of 0.003 mg/mL. Besides the inhibition of hemolysis induced by H2O2 in erythrocytes treated with F1.0, this fraction did not promote significant cytotoxity under erythrocytes membranes. F1.0 exhibited low anticoagulant activity causing moderate direct inhibition of enzimatic activity of thrombin. This fraction promoted stimulation around of 4.6 times on this synthesis of heparan sulfate (HS) by rabbit aortic endothelial cells (RAEC) in culture when was compared with non treated cells. The fraction of this algae displayed antiproliferative action under RAEC cells causing incresing on cell number on S fase, blocking the cycle cell progression. Thus F1.0 presented cytostatic and no cytotoxic action under this cell lineage. These results suggest that F1.0 from H. musciformis have antioxidant potential which is a great effect for a compound used as food and in food industry which could be an alternative to food industry to prevent quality decay of lipid containing food due to lipid peroxidation. These polysaccharides prevent the lipid peroxidation once the fraction in study exhibited strong inhibitory action of this process. Furthermore that F1.0 present strong antithrombotic action promoting the stimulation of antithrombotic HS synthesis by endothelial cells, being important for thrombosis preventing, by its inhibitory action under reactive oxygen species (ROS) in some in vitro methods, being involved in promotion of hypercoagulability state. / Algas marinhas s?o uma das principais fontes de compostos biologicamente ativos. Na matriz extracelular desses organismos existem os polissacar?deos sulfatados que funcionam como componente estrutural prevenindo-a contra desidrata??o. A fra??o 1,0 (F1,0) rica em galactanas sulfatadas obtida da alga vermelha Hypnea musciformis foi caracterizada fisicoquimicamente e avaliada quanto a atividade farmacol?gica por meio de ensaios de atividade antioxidante, a??o citot?xica sobre hem?cias, atividade anticoagulante, a??o estimulat?ria sobre a s?ntese de heparam sulfato antitromb?tico e seus efeitos na prolifera??o e progress?o do ciclo celular. Os principais componentes da F1,0 foram carboidratos (49,70 ? 0,10%) e sulfato (44,59 ? 0,015%), apresentando compostos fen?licos (4,79 ? 0,016%) e baixa contamina??o prot?ica (0,92 ? 0,001%). F1,0 mostrou perfil polidisperso e sinais na an?lise de infravermelho em 1262, 1074 e 930, 900 e 850 cm-1 atribu?dos a liga??es S=O de ?steres de sulfato, presen?a de liga??o C-O de 3,6-anidrogalactose, ?-D-galactose n?o sulfatada e liga??o C-O-SO4 no C4 da galactose, respectivamente. A fra??o rica em galactanas sulfatadas exibiu forte a??o antioxidante sobre o ensaio de peroxida??o lip?dica com IC50 de 0,003 mg/mL. Al?m da alta inibi??o da hem?lise induzida por H2O2 em hem?cias humanas tratadas com F1,0, esta fra??o n?o promoveu citotoxicidade significativa sobre a membrana de hem?cias. F1,0 exibiu baixa atividade anticoagulante, causando moderada inibi??o direta da atividade enzim?tica da trombina. Esta fra??o promoveu estimula??o de cerca de 4,6 vezes na s?ntese de heparam sulfato (HS) pelas c?lulas endoteliais da aorta de coelho (RAEC), em cultura, quando comparadas com as c?lulas n?o tratadas com F1,0. A fra??o dessa alga mostrou atividade antiproliferativa sobre as c?lulas RAEC, causando aumento no n?mero de c?lulas na fase S, impedindo a progress?o do ciclo celular. Assim, F1,0 apresentou a??o citost?tica e n?o citot?xica sobre esta linhagem celular. Esses resultados sugerem que F1,0 de H. musciformis tem potencial antioxidante, efeito importante para um composto utilizado como alimento e na ind?stria aliment?cia, podendo ser uma alternativa na ind?stria aliment?cia para a preven??o do decaimento da qualidade dos alimentos contendo lip?dio devido a peroxida??o lip?dica, uma vez que a fra??o em estudo exibiu forte a??o inibit?ria sobre a peroxida??o lip?dica. Al?m disso F1,0 apresenta forte a??o antitromb?tica promovendo a estimula??o da s?ntese de HS antitromb?tico pelas c?lulas endoteliais, sendo ?til na preven??o da trombose, devido tamb?m a sua a??o inibit?ria sobre as esp?cies reativas do oxig?nio (ROS) em alguns sistemas in vitro, estando envolvidos na promo??o de estado de hipercoagulabilidade.