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Introdução: Dentre as neuropatias hereditárias, as neuropatias hereditárias motoras e sensitivas (HMSN), também conhecidas como Doença de Charcot-MarieTooth (CMT) são as mais comuns, podendo acometer 1:2500 pessoas. Elas podem ser classificadas com base nas características clínicas, eletrofisiológicas, padrão de herança e mutação em localização gênica/mutação. Atualmente, mais de 80 genes estão relacionados à CMT, dentre eles o GDAP1 que é responsável pelas formas CMT4A, AR-CMT2, CMTRIA e CMT2K. O gene codifica a proteína GDAP1 que é expressa pelos neurônios do sistema nervoso periférico e central e também pelas células de Schwann. Mutações no GDAP1 geralmente estão relacionados com CMT de herança recessiva, mas autossômica dominante também pode ocorrer. Geralmente, as neuropatias recessivas são de diagnóstico molecular mais difíceis, são mais graves e tem rápida progressão. É necessário que haja um maior número de casos de pacientes com CMT envolvendo mutações no GDAP1, juntamente com os dados clínicos, patológicos e de eletrofisiologia detalhados, para estabelecer uma relação de confiança entre o genótipo e o fenótipo das diferentes formas da doença. O objetivo do trabalho foi investigar mutações no gene GDAP1 em uma amostra da população brasileira com quadro clínico de CMT tanto axonal quanto desmielinizantes. Métodos: Screening mutacional do gene GDAP1 por sequenciamento direto em 100 pacientes com diagnóstico clínico sugestivo de CMT4, CMT2, CMTi e CMT esporádico, onde mutações nos genes MPZ, MFN2 e GJB1 foram previamente excluídos. Resultados: Foram encontradas alterações no GDAP1 em 6 pacientes índices não relacionados, sendo que 1 deles foi homozigoto para a alteração Q163*, 1 heterozigoto composto para as alterações N64S e R125*, dois pacientes não relacionados foram heterozigotos compostos para as alterações P119T e Q163*, 1 paciente em heterozigose para a alteração P119T e 1 paciente em heterozigose para alteração K207T. Dentre essas alterações, as variantes N64S, P119T, K207T ainda não foram descritas na literatura. Conclusão: Os resultados obtidos mostraram que mutações no gene GDAP1 estão presentes em pacientes da população brasileira com fenótipo de CMT2, AR-CMT2 e CMT esporádico. A frequência de ocorrência pode ser considerada alta (3,88%). Ademais, foram encontradas na população de estudo, duas mutações conhecidamente patogênicas (Gln163Ter e Arg125Ter) e três novas variantes (Asn64Ser, Pro119Thr, Lys207Thr) que ainda não haviam sido relacionadas ao fenótipo de CMT. / Introduction: Among the inherited neuropathies, the hereditary motor and sensory neuropathies (HMSN), also known as Charcot-Marie-Tooth disease, are the most common ones and may affect 1:2500 people. They can be classified based on their clinical features, electrophysiology, inheritance pattern and mutation on a gene location/mutation. Today, more than 80 genes have been related to the CMT disease and among them the GDAP1 gene, responsible for the CMT4A, AR-CMT2, CMTRIA and CMT2K forms. This gene codes the GDAP1 protein, which is expressed by neurons from the peripheral and central nervous system and also by Schwann cells. GDAP1 mutations are usually related to recessive inheritance, although autosomal dominant cases can also occur. Most of the times, recessive neuropathies tend to have a more difficult molecular diagnosis, besides being more severe and presenting fast progression. A larger number of patients with CMT related to GDAP1 mutations, along with detailed clinical, pathological and electrophysiological data, is necessary in order to establish a trustful relation between genotype and phenotype in the different forms of this disease. The objective of this research was to investigate mutations in the GDAP1 gene in a brazilian sample of patients with clinical picture of both axonal and demyelinating CMT. Methods: Mutational screening of the GDAP1 gene by direct sequencing of 100 patients presenting suggestive clinical diagnosis of CMT4, CMT2, CMTi and sporadic CMT, where mutations in the MPZ, MFN2 and GJB1 genes have been previously excluded. Results: Alterations in the GDAP1 were found in 6 unrelated index patients, including 1 homozygous for the Q163* alteration, 1 compound heterozygous for the N64S and R125* alterations, 2 compound heterozygous for the P119T and Q163* alterations, 1 heterozygous for the P119T alteration alone and 1 heterozygous for the K207T alteration. Among these alterations, the variants N64S, P119T, K207T haven\'t been described in the literature yet. Conclusion: The results obtained showed that mutations in GDAP1 gene are present in patients of brazilian population with phenotype of CMT2, AR-CMT2 and sporadic CMT. The occurrence frequency can be considered high (3,88%). Furthermore, were found in the studied population two mutations known as pathogenic (Gln163Ter and Arg125Ter) and three news variants (Asn64Ser, Pro119Thr, Lys207Thr), that had not been related to the CMT phenotype.

Introdução: Dentre as neuropatias hereditárias, as neuropatias hereditárias motoras e sensitivas (HMSN), também conhecidas como Doença de Charcot-MarieTooth (CMT) são as mais comuns, podendo acometer 1:2500 pessoas. Elas podem ser classificadas com base nas características clínicas, eletrofisiológicas, padrão de herança e mutação em localização gênica/mutação. Atualmente, mais de 80 genes estão relacionados à CMT, dentre eles o GDAP1 que é responsável pelas formas CMT4A, AR-CMT2, CMTRIA e CMT2K. O gene codifica a proteína GDAP1 que é expressa pelos neurônios do sistema nervoso periférico e central e também pelas células de Schwann. Mutações no GDAP1 geralmente estão relacionados com CMT de herança recessiva, mas autossômica dominante também pode ocorrer. Geralmente, as neuropatias recessivas são de diagnóstico molecular mais difíceis, são mais graves e tem rápida progressão. É necessário que haja um maior número de casos de pacientes com CMT envolvendo mutações no GDAP1, juntamente com os dados clínicos, patológicos e de eletrofisiologia detalhados, para estabelecer uma relação de confiança entre o genótipo e o fenótipo das diferentes formas da doença. O objetivo do trabalho foi investigar mutações no gene GDAP1 em uma amostra da população brasileira com quadro clínico de CMT tanto axonal quanto desmielinizantes. Métodos: Screening mutacional do gene GDAP1 por sequenciamento direto em 100 pacientes com diagnóstico clínico sugestivo de CMT4, CMT2, CMTi e CMT esporádico, onde mutações nos genes MPZ, MFN2 e GJB1 foram previamente excluídos. Resultados: Foram encontradas alterações no GDAP1 em 6 pacientes índices não relacionados, sendo que 1 deles foi homozigoto para a alteração Q163*, 1 heterozigoto composto para as alterações N64S e R125*, dois pacientes não relacionados foram heterozigotos compostos para as alterações P119T e Q163*, 1 paciente em heterozigose para a alteração P119T e 1 paciente em heterozigose para alteração K207T. Dentre essas alterações, as variantes N64S, P119T, K207T ainda não foram descritas na literatura. Conclusão: Os resultados obtidos mostraram que mutações no gene GDAP1 estão presentes em pacientes da população brasileira com fenótipo de CMT2, AR-CMT2 e CMT esporádico. A frequência de ocorrência pode ser considerada alta (3,88%). Ademais, foram encontradas na população de estudo, duas mutações conhecidamente patogênicas (Gln163Ter e Arg125Ter) e três novas variantes (Asn64Ser, Pro119Thr, Lys207Thr) que ainda não haviam sido relacionadas ao fenótipo de CMT. / Introduction: Among the inherited neuropathies, the hereditary motor and sensory neuropathies (HMSN), also known as Charcot-Marie-Tooth disease, are the most common ones and may affect 1:2500 people. They can be classified based on their clinical features, electrophysiology, inheritance pattern and mutation on a gene location/mutation. Today, more than 80 genes have been related to the CMT disease and among them the GDAP1 gene, responsible for the CMT4A, AR-CMT2, CMTRIA and CMT2K forms. This gene codes the GDAP1 protein, which is expressed by neurons from the peripheral and central nervous system and also by Schwann cells. GDAP1 mutations are usually related to recessive inheritance, although autosomal dominant cases can also occur. Most of the times, recessive neuropathies tend to have a more difficult molecular diagnosis, besides being more severe and presenting fast progression. A larger number of patients with CMT related to GDAP1 mutations, along with detailed clinical, pathological and electrophysiological data, is necessary in order to establish a trustful relation between genotype and phenotype in the different forms of this disease. The objective of this research was to investigate mutations in the GDAP1 gene in a brazilian sample of patients with clinical picture of both axonal and demyelinating CMT. Methods: Mutational screening of the GDAP1 gene by direct sequencing of 100 patients presenting suggestive clinical diagnosis of CMT4, CMT2, CMTi and sporadic CMT, where mutations in the MPZ, MFN2 and GJB1 genes have been previously excluded. Results: Alterations in the GDAP1 were found in 6 unrelated index patients, including 1 homozygous for the Q163* alteration, 1 compound heterozygous for the N64S and R125* alterations, 2 compound heterozygous for the P119T and Q163* alterations, 1 heterozygous for the P119T alteration alone and 1 heterozygous for the K207T alteration. Among these alterations, the variants N64S, P119T, K207T haven\'t been described in the literature yet. Conclusion: The results obtained showed that mutations in GDAP1 gene are present in patients of brazilian population with phenotype of CMT2, AR-CMT2 and sporadic CMT. The occurrence frequency can be considered high (3,88%). Furthermore, were found in the studied population two mutations known as pathogenic (Gln163Ter and Arg125Ter) and three news variants (Asn64Ser, Pro119Thr, Lys207Thr), that had not been related to the CMT phenotype.

Glycosphingolipide sind eine Gruppe von amphiphatischen Membran- und Strukturlipiden, welche aus einem Molekül des Aminoalkohols Sphingosin oder einem seiner Derivate, einer langkettigen Fettsäure und einem Kohlenhydratrest als polare Kopfgruppe zusammengesetzt sind. Eine Subgruppe dieser Substanzen stellen die Ganglioside dar, welche durch das Vorkommen von Sialinsäure als Bestandteil ihrer Glykankette charakterisiert sind. Das Gangliosid GD3 ist als tumorassoziiertes Antigen auf der Oberfläche neuroektodermaler Tumore sowie als proapoptotisch wirkender Lipidmediator beschrieben. Seine biologischen Funktionen und der genaue Wirkmechanismus im Rahmen der Apoptose sind bisher aber unbekannt. Es gibt jedoch Hinweise, dass nicht GD3 selbst, sondern sein oxidiertes Derivat das eigentliche Effektormolekül darstellt. Eine minimale Veränderung des GD3-Moleküls, die 9-O-Acetylierung der Seitenkette der terminalen Sialinsäure, hebt die proapoptotische Wirkung des Gangliosids auf. Tumorzellen, in denen das Enzym 9-O-Acetyltransferase aktiv ist, können der Apoptose auf diese Weise entgehen. Das Anliegen dieser Arbeit war es, Vorkommen und Funktion des bis dahin nur artifiziell generierten oxidierten GD3-Derivates zu untersuchen. Es war zu analysieren, welche Auswirkungen oxidiertes GD3 auf das Überleben von GD3-resistenten Tumorzellen hat. Es sollte geprüft werden, ob GD3-7-Aldehyd in Primärzellen und Geweben auftritt. Dabei war zu klären, ob das Molekül unter Bedingungen des oxidativen Stresses entstehen und auf der Zelloberfläche oder intrazellulär induziert werden kann. Daraus folgernd sollte betrachtet werden, welche neuen immunologischen Therapieansätze zur Behandlung resistenter Tumore unter Nutzung von GD3-7-Aldehyd möglich wären. Voraussetzungen für die Experimente dieser Arbeit und für nachfolgende Forschungsfragen sind zuverlässige Nachweismöglichkeiten der Metabolite GD3, 9 O-acetyl-GD3 und GD3-7-Aldehyd. Während für den Nachweis von GD3 und 9 O acetyl-GD3 bereits monoklonale Antikörper zur Verfügung standen, war für die Detektion von GD3-7-Aldehyd im Rahmen dieser Arbeit erstmals ein monoklonaler Antikörper gegen ein oxidiertes Gangliosid zu generieren und zu charakterisieren. Für die Selektion antikörperproduzierender Zellen musste dafür zunächst eine neue Screeningmethode etabliert werden. Für die Überprüfung des Bindungsverhaltens der gangliosidspezifischen Antikörper und für die Durchführung der Inkubationsversuche waren die Ganglioside GD3 und 9-O-acetyl-GD3 über mehrere Chromatographieschritte aus lyophilisierter Buttermilch zu isolieren und das oxidierte Derivat herzustellen. Dabei wurde erstmals die Reinigung von GD3-7-Aldehyd mit der HPLC durchgeführt. Der im Rahmen dieser Arbeit generierte monoklonale Antikörper 10C6 gehört der Immunglobulin-Subklasse IgG2a an und bindet an die oxidierte Form des Gangliosids GD3. Das von 10C6 erkannte Antigen ist eine Glycankette der Struktur Neu5Ac-8Neu5Ac-3Gal mit oxidierter terminaler Sialinsäure. Der Antikörper reagiert nicht mit reduzierten oder 9-O-acetylierten Gangliosidvarianten und weist eine höhere Sensitivität auf als die etablierten Antikörper zum Nachweis der beiden anderen GD3-Derivate. In der Arbeit wurde in vitro gezeigt, dass die oxidative Modifikation von GD3 zu GD3 7-Aldehyd unter Bedingungen des oxidativen Stresses entstehen kann. In der GD3-resistenten Zelllinie Molt-4 induziert die Substanz Apoptose. GD3-7-Aldehyd kommt daher als proapoptotisches Effektormolekül in Frage. Das von 10C6 erkannte Antigen kommt auf der Oberfläche von Monozyten einzelner Spender vor. Außerdem kann es auf der Oberfläche eines Teils der Blasten bei akuter myeloischer Leukämie gefunden werden. Andere Leukozyten des peripheren Blutes tragen diese Struktur nicht. GD3-7-Aldehyd kommt in den Tumorzelllinien HEp-2, HL60 und T47D vor. In Gewebeschnitten von humanem Mammakarzinom sowie fötaler Milz und fötalem Darm von Primaten fanden sich Hinweise auf Strukturen mit oxidativ modifizierter Sialinsäure, in Geweben adulter Primaten wurden diese nicht gefunden. Auf der Oberfläche von Melanomzelllinien wie Ma-Mel-11, Ma-Mel-95 und SK-Mel-23 vorkommendes GD3 kann durch Natriumperjodatbehandlung zu GD3-7-Aldehyd oxidiert werden. Durch UV-Bestrahlung kann auf der Oberfläche von HEp-2- und SK-Mel-23-Zellen eine mit dem Antikörper 10C6 detektierbare Struktur induziert werden. HL60-Zellen lassen sich durch extern zugeführten GD3-7-Aldehyd dekorieren, es bleibt auf ihrer Oberfläche bis zu 48 Stunden nachweisbar. Für einen immunologischen Tumortherapieansatz könnten sowohl das geringe Vorkommen des Antigens in gesunden Geweben als auch die Induzierbarkeit auf der Oberfläche bestimmter Tumorzellen nach lokaler Vorbehandlung sowie die Toxizität der Substanz von Nutzen sein. Ein passender spezifischer Antikörper liegt nun vor. Die im Rahmen dieser Arbeit etablierten Detektionssysteme können für weitere Untersuchungen auf dem Gebiet der Glycolipidforschung eingesetzt werden. / Glycosphingolipids are a group of amphiphatic membrane and structure lipids consisting of one molecule of the aminoalcohol Sphingosin or one of its derivatives, a long chain fatty acid, and a carbohydrate moiety as polar side chain. One subgroup of these substances are gangliosides, which are characterized by sialic acid as a component of their glycan chain. The ganglioside GD3 is described as tumor associated antigen on the surface of neuroectodermal tumors and as proapoptotic lipid mediator. Its biological functions as well as its mode of operation in the context of apoptosis still remain unclear. There are hints, that not GD3 itself, but an oxidized derivative represents the actual effector molecule. A minimal change in the GD3 molecule, the 9-O-acetylation of the side chain of the terminal sialic acid, abolishes the proapoptotic effect completely. Tumor cells with activity of the enzyme 9-O-acetyltransferase can escape from apoptosis like that. The request of this work was to investigate the occurrence and function of this so far solely artificially generated oxidized GD3 derivative. The impact of oxidized GD3 on the survival of GD3-resistant tumor cells had to be analyzed. It had to be examined, whether GD3-7-aldehyde occurs in primary cells and tissues. Withal it was to clarify, if the molecule occurs under conditions of oxidative stress and if it can be induced on the surface of cells or intracellularly. Following that, it was to contemplate which novel approaches of immunological therapies for the treatment of resistant tumors could be possible under the use of GD3-7-aldehyde. Prerequisite to all experiments of this work and for following research are reliable detection methods of the metabolites GD3, and GD3-7-aldehyde. Whereas for the detection of GD3 and 9-O-acetyl-GD3 monoclonal antibodies were already existing, for the detection of GD3-7-aldehyde a novel monoclonal antibody directed against an oxidized ganglioside had to be generated for the first time and had to be characterized. For the selection of antibody producing cells, a new screening method had to be established. For the examination of the binding behavior of the ganglioside specific antibodies and for the performance of the incubation assays the gangliosides GD3 and 9-O-acetyl-GD3 had to be isolated from lyophilized bovine buttermilk via several chromatography steps and the oxidized derivative had to be produced. In doing so, GD3-7-al was purified by HPLC for the first time. The monoclonal antibody 10C6 generated in the framework of this study is member of immunoglobulin subclass IgG2a and binds to the oxidized form of the ganglioside GD3. The antigen detected by 10C6 is a glycan chain with structure Neu5Ac-8Neu5Ac-3Gal with oxidized terminal sialic acid. The antibody does not react with reduced or 9-O-acetylated forms of the ganglioside GD3 and possesses a higher sensitivity than the antibodies, established for the detection of both other GD3 derivatives. In this work it is shown in vitro, that the oxidative modification of GD3 to GD3-7-aldehyde can arise under conditions of oxidative stress. In GD3-resistant Molt-4-cells this substance induces apoptosis. Therefore GD3-7-aldehyde comes into consideration to be a proapoptotic effector molecule. The antigen detected by 10C6 occurs on the surface of monocytes of particular donors. Further, it can be found on the surface of a portion of the blasts of acute myeloic leukemia. Other leucocytes of the peripheral blood do not show this structure. GD3-7-aldehyde occurs in tumor cell lines HEp-2, HL60, and T47D. Hints for the existence of structures with oxidatively modified sialic acid were found in tissue slides of human mamma carcinoma and fetal gut. In tissues of adult primates this was not the case. On the surface of melanoma cell lines like Ma-Mel-11, Ma-Mel-95, and SK-Mel-23, existing GD3 can be converted into GD3-7-aldehyde by sodium periodate treatment. UV radiation can induce a structure detectable by 10C6 on the surface of HEp-2- and SK-Mel-23-cells. HL60-cells can be decorated by externally administered GD3-7-aldehyde. It is detectable on their surface for up to 48 hours. For an immunological approach of tumor therapy, the sparsely incidence of this antigen in healthy tissues as well as the inducibility on the surface of distinct tumor cells after pretreatment and the toxicity of this substance could be advantageous. A fitting antibody is now available. The detection methods established in the context of this work can be applied for further investigations in glycolipid research.

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L'élastine est la protéine matricielle responsable de l'élasticité des tissus retrouvée dans des tissus soumis à de fortes contraintes mécaniques tels que les poumons, les artères ou la peau. La dégradation de cette protéine lors de processus physiopathologiques produit des peptides bologiquement actifs nommés peptides d'élastine portant le motif GXXPG essentiel à leur activité. Ces peptides régulent diverses fonctions biologiques telles que le chimiotactisme, la synthèse de protéases, la prolifération. Tous ces effets dépendent de la fixation des peptides d'élastine au complexe récepteur de l'élastine. Ce complexe est composé de trois sous-unités : une protéine périphérique de 67 kDa, l'Elastin Binding Protein (EBP), et deux protéines associées à la membrane, la Protective Protein/Cathepsin A (PP/CA) et la Neuraminidase-1 (Neu-1) de 55 et 61 kDa respectivement. L'activité sialidase de Neu-1 est responsable de l'activation de ERK 1/2 après fixation des peptides d'élastine au complexe récepteur de l'élastine.Dans cette étude, nous démontrons que l'EBP et les radeaux lipidiques sont colocalisés à la membrane plasmique. Nous montrons, de plus, que la déstructuration de ces microdomaines aussi bien que leur déplétion en glycolipides bloque la signalisation du récepteur. L'utilisation d'un anticorps monoclonal bloquant dirigé contre le GM3 montre qu'il est essentiel à la signalisation. Après traitement par les peptides d'élastine, le contenu cellulaire en GM3 diminue alors que celui en lactosylcéramide augmente suggérant une conversion du GM3 en lactosylcéramide. L'utilisation de lactose ou de siRNA Neu-1 bloque cette conversion ce qui tend à démontrer que le complexe récepteur de l'élastine est impliqué dans ce mécanisme. Une analyse par cytométrie en flux confirme cette production de lactosylcéramide induite par les peptides d'élastine.L'analyse par spectrométrie de masse mettrait en évidence deux lactosylcéramides (C23:0 et C24:1) potentiellement bioactifs dont la synthèse chimique a été entreprise. La purification des radeaux lipidiques par ultracentrifugation différentielle en gradient de saccharose ainsi que leur identification par Dot-blot couplé à la fluorescence montre un changement de densité de ces microdomaines après stimulation par les peptides d'élastine.L'évaluation biologique in vitro de ces lactosylcéramides montre qu'ils miment les effets des peptides d'élastine sur l'activation de ERK 1/2, la prolifération et la synthèse de MMP-1. Enfin, l'évaluation ex vivo des lactosylcéramides démontre une réduction de la zone de tissu cardiaque nécrosé suggérant un rôle cardioprotecteur de ces molécules. Ce travail propose un mécanisme original de transduction du signal à la membrane plasmique et nous laisse envisager le complexe récepteur de l'élastine, les peptides d'élastine et le lactosylcéramide comme de nouveaux agents thérapeutiques potentiels. / Elastin is the matrix protein responsible for the elasticity of tissues where resilience is required such as lung, arteries or skin. Elastin degradation during physiopathological processes produces biologically active peptides named elastin peptides bearing the GXXPG pattern essential for their activity. These peptides regulate various biological functions such as chemotaxis, proteases synthesis and proliferation. These effects are dependent of elastin peptide binding to the elastin receptor complex (ERC). This complex is composed of three subunits: a peripheral protein of 67 kDa called elastin binding protein (EBP) and two membrane-associated proteins, protective protein/cathepsin A (PP/CA) and neuraminidase-1 (Neu-1) of 55 and 61 kDa, respectively. The sialidase activity of Neu-1 is responsible for ERK 1/2 pathway activation following binding of elastin peptide on the elastin receptor complex.In this study, we demonstrate that EBP and lipid rafts colocalize at the plasma membrane. We also show that the disruption of these microdomains and their depletion in glycolipids block the receptor signaling. The use of a monoclonal anti-GM3 blocking antibody shows that this glycosphingolipid is essential for signaling. Following elastin peptide treatment, cellular GM3 level decreases while the lactosylceramide one increases consistently with a GM3/LacCer conversion. The use of lactose or Neu-1 siRNA blocks this process suggesting that the elastin receptor complex is involved in this mechanism. Flow cytometry analysis confirms this elastin peptide-driven LacCer generation.Mass spectrometry analysis of elastin peptide-stimulated cell membrane extracts identified two potentially bioactive lactosylceramides (C23:0 and C24:1) and their synthesis has been realized. Lipid rafts purification by differencial ultracentrifugation in sucrose gradient shows a variation of the microdomains density as well as their identification by fluorescence linked-Dot-blot following elastin peptide stimulation.In vitro biological evaluation of these lactosylceramides shows that they mimic the elastin peptide effects on ERK 1/2 activation, proliferation and MMP-1 synthesis. Finally, ex vivo lactosylceramides evaluation demonstrates a decrease of cardiac tissue necrosis area suggesting that these molecules could be cardioprotective agents. This work proposes an original mechanism of signal transduction at the plasma membrane and let us foresees the elastin receptor complex, elastin peptides and lactosylceramide as new potential therapeutical targets.

Glycosphingolipide sind eine Gruppe von amphiphatischen Membran- und Strukturlipiden, welche aus einem Molekül des Aminoalkohols Sphingosin oder einem seiner Derivate, einer langkettigen Fettsäure und einem Kohlenhydratrest als polare Kopfgruppe zusammengesetzt sind. Eine Subgruppe dieser Substanzen stellen die Ganglioside dar, welche durch das Vorkommen von Sialinsäure als Bestandteil ihrer Glykankette charakterisiert sind. Das Gangliosid GD3 ist als tumorassoziiertes Antigen auf der Oberfläche neuroektodermaler Tumore sowie als proapoptotisch wirkender Lipidmediator beschrieben. Seine biologischen Funktionen und der genaue Wirkmechanismus im Rahmen der Apoptose sind bisher aber unbekannt. Es gibt jedoch Hinweise, dass nicht GD3 selbst, sondern sein oxidiertes Derivat das eigentliche Effektormolekül darstellt. Eine minimale Veränderung des GD3-Moleküls, die 9-O-Acetylierung der Seitenkette der terminalen Sialinsäure, hebt die proapoptotische Wirkung des Gangliosids auf. Tumorzellen, in denen das Enzym 9-O-Acetyltransferase aktiv ist, können der Apoptose auf diese Weise entgehen. Das Anliegen dieser Arbeit war es, Vorkommen und Funktion des bis dahin nur artifiziell generierten oxidierten GD3-Derivates zu untersuchen. Es war zu analysieren, welche Auswirkungen oxidiertes GD3 auf das Überleben von GD3-resistenten Tumorzellen hat. Es sollte geprüft werden, ob GD3-7-Aldehyd in Primärzellen und Geweben auftritt. Dabei war zu klären, ob das Molekül unter Bedingungen des oxidativen Stresses entstehen und auf der Zelloberfläche oder intrazellulär induziert werden kann. Daraus folgernd sollte betrachtet werden, welche neuen immunologischen Therapieansätze zur Behandlung resistenter Tumore unter Nutzung von GD3-7-Aldehyd möglich wären. Voraussetzungen für die Experimente dieser Arbeit und für nachfolgende Forschungsfragen sind zuverlässige Nachweismöglichkeiten der Metabolite GD3, 9 O-acetyl-GD3 und GD3-7-Aldehyd. Während für den Nachweis von GD3 und 9 O acetyl-GD3 bereits monoklonale Antikörper zur Verfügung standen, war für die Detektion von GD3-7-Aldehyd im Rahmen dieser Arbeit erstmals ein monoklonaler Antikörper gegen ein oxidiertes Gangliosid zu generieren und zu charakterisieren. Für die Selektion antikörperproduzierender Zellen musste dafür zunächst eine neue Screeningmethode etabliert werden. Für die Überprüfung des Bindungsverhaltens der gangliosidspezifischen Antikörper und für die Durchführung der Inkubationsversuche waren die Ganglioside GD3 und 9-O-acetyl-GD3 über mehrere Chromatographieschritte aus lyophilisierter Buttermilch zu isolieren und das oxidierte Derivat herzustellen. Dabei wurde erstmals die Reinigung von GD3-7-Aldehyd mit der HPLC durchgeführt. Der im Rahmen dieser Arbeit generierte monoklonale Antikörper 10C6 gehört der Immunglobulin-Subklasse IgG2a an und bindet an die oxidierte Form des Gangliosids GD3. Das von 10C6 erkannte Antigen ist eine Glycankette der Struktur Neu5Ac-8Neu5Ac-3Gal mit oxidierter terminaler Sialinsäure. Der Antikörper reagiert nicht mit reduzierten oder 9-O-acetylierten Gangliosidvarianten und weist eine höhere Sensitivität auf als die etablierten Antikörper zum Nachweis der beiden anderen GD3-Derivate. In der Arbeit wurde in vitro gezeigt, dass die oxidative Modifikation von GD3 zu GD3 7-Aldehyd unter Bedingungen des oxidativen Stresses entstehen kann. In der GD3-resistenten Zelllinie Molt-4 induziert die Substanz Apoptose. GD3-7-Aldehyd kommt daher als proapoptotisches Effektormolekül in Frage. Das von 10C6 erkannte Antigen kommt auf der Oberfläche von Monozyten einzelner Spender vor. Außerdem kann es auf der Oberfläche eines Teils der Blasten bei akuter myeloischer Leukämie gefunden werden. Andere Leukozyten des peripheren Blutes tragen diese Struktur nicht. GD3-7-Aldehyd kommt in den Tumorzelllinien HEp-2, HL60 und T47D vor. In Gewebeschnitten von humanem Mammakarzinom sowie fötaler Milz und fötalem Darm von Primaten fanden sich Hinweise auf Strukturen mit oxidativ modifizierter Sialinsäure, in Geweben adulter Primaten wurden diese nicht gefunden. Auf der Oberfläche von Melanomzelllinien wie Ma-Mel-11, Ma-Mel-95 und SK-Mel-23 vorkommendes GD3 kann durch Natriumperjodatbehandlung zu GD3-7-Aldehyd oxidiert werden. Durch UV-Bestrahlung kann auf der Oberfläche von HEp-2- und SK-Mel-23-Zellen eine mit dem Antikörper 10C6 detektierbare Struktur induziert werden. HL60-Zellen lassen sich durch extern zugeführten GD3-7-Aldehyd dekorieren, es bleibt auf ihrer Oberfläche bis zu 48 Stunden nachweisbar. Für einen immunologischen Tumortherapieansatz könnten sowohl das geringe Vorkommen des Antigens in gesunden Geweben als auch die Induzierbarkeit auf der Oberfläche bestimmter Tumorzellen nach lokaler Vorbehandlung sowie die Toxizität der Substanz von Nutzen sein. Ein passender spezifischer Antikörper liegt nun vor. Die im Rahmen dieser Arbeit etablierten Detektionssysteme können für weitere Untersuchungen auf dem Gebiet der Glycolipidforschung eingesetzt werden.:1 EINLEITUNG 1 1.1 Sphingolipide, Glycosphingolipide und Ganglioside 1 1.1.1 Biosynthese und Transport der Ganglioside 5 1.1.2 Biologische Funktionen und pathophysiologische Bedeutung der Ganglioside 10 1.2 Sialinsäuren 12 1.3 Das Disialogangliosid GD3 16 1.3.1 Vorkommen von GD3 16 1.3.2 Biologische Wirkungen von GD3 17 1.3.3 GD3 als Zielstruktur in der Tumortherapie 20 1.3.4 Modifikationen der Sialinsäure von GD3 23 1.3.4.1 9-O-Acetylierung der terminalen Sialinsäure von GD3 23 1.3.4.2 Oxidation der terminalen Sialinsäure von GD3 25 1.4 Zielstellung 27 2 MATERIAL UND METHODEN 28 2.1 Materialien 28 2.1.1 Biologische Materialien 28 2.1.1.1 Patientenproben 28 2.1.1.2 Versuchstiere 28 2.1.1.3 Zelllinien und Hybridome 28 2.1.2 Reagenzien, Antikörper und Enzyme 29 2.1.3 Chemikalien 31 2.1.4 Geräte und Hilfsmittel 32 2.2 Methoden 34 2.2.1 Zellkultur 34 2.2.1.1 Kulturmedien 34 2.2.1.2 Zellkulturtechnik 35 2.2.1.3 Zellernte der Suspensionszellen 35 2.2.1.4 Zellernte der adhärenten Zelllinien 35 2.2.1.5 Bestimmung der Zellzahl 36 2.2.1.6 Kryokonservierung 36 2.2.1.7 Auftauen 37 2.2.1.8 Hybridomkultivierung 37 2.2.1.9 Kultur von AML Blasten 37 2.2.2 Durchflusszytometrie 37 2.2.2.1 Oberflächenfärbung von Zelllinien 38 2.2.2.2 Oberflächenfärbung von PBMC und Granulozyten 39 2.2.2.3 Intrazelluläre Färbung 39 2.2.2.4 Detektion reaktiver Sauerstoffspezies mittels DCFDA-Färbung 39 2.2.2.5 SubG1-Analyse 41 2.2.3 Aufarbeitung von Gangliosiden aus Zellen 41 2.2.3.1 Herstellung des Rohextraktes 42 2.2.3.2 Entsalzung des Extraktes an einer Reversed Phase Chromatographie-Säule 43 2.2.4 Dünnschichtchromatographie - HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatographie) 44 2.2.4.1 Detektion mit Orcinfärbung 44 2.2.4.2 Detektion mit Primulin - Färbung 45 2.2.4.3 Detektion mit Overlay - Immunfärbung 45 2.2.5 Isolation von Glycolipiden aus lyophilisierter Buttermilch 47 2.2.5.1 Herstellung des Rohextraktes 48 2.2.5.2 Entsalzung mittels Dialyse 49 2.2.5.3 Si60-Kieselgel-Chromatographie 49 2.2.5.4 DEAE-Ionenaustauschchromatographie 50 2.2.5.5. Entsalzung mit RP-Säule 51 2.2.5.6 HPLC (High Performance Liquid Chromatographie) 51 2.2.6 Herstellung von GD3-7-Aldehyd aus GD3 52 2.2.6.1 Oxidation von Gangliosiden in situ auf HPTLC-Platten 52 2.2.6.2 Darstellung von GD3-7-Aldehyd unter Verwendung von Wasserstoffperoxid und Eisen-II-clorid (Fenton Reaktion) 53 2.2.7 Herstellung monoklonaler Antikörper gegen GD3-7-Aldehyd 53 2.2.7.1 Immunisierung der Mäuse 54 2.2.7.2 Vorbereitung der Myelomzellen 54 2.2.7.3 Präparation der Milzzellen 55 2.2.7.4 Fusion der Milz- und Myelomzellen 55 2.2.7.5 Selektion und Klonierung 56 2.2.7.5.1 Screening 56 2.2.7.5.2 Ermittlung der Spezifität 57 2.2.7.5.3 Bestimmung der Immunglobulinklasse und des Subtyps 57 2.2.8 Separation mononukleärer Zellen (PBMCs) und Granulozyten aus Vollblut 57 2.2.8.1 Isolation einzelner Leukozytenpopulationen mittels MACS Technologie 58 2.2.8.1.1 Positivselektion von Monozyten 58 2.2.8.1.2 Positivselektion von Slan-DCs mit M-DC8 58 2.2.9 Generierung und Maturierung von Dendritischen Zellen aus Monozyten 59 2.2.10 Indirekte Immunfluoreszenz 60 2.2.10.1 Aufzentrifugieren von Suspensionszellen auf Objektträger 60 2.2.10.2 Fixierung und Permeabilisierung der Zellen auf Objektträgern 60 2.2.10.3 Fluoreszenzfärbung von Zellen und Geweben auf Objektträgern 60 2.2.11 Immunhistochemische Färbung mit modifizierter ABC-Methode 61 2.2.12 Behandlung von HL60 mit GD3-7-Aldehyd 62 2.2.13 Inkubationsversuche von Molt-4 mit unterschiedlichen GD3-Derivaten 63 2.2.14 Induktion reaktiver Sauerstoffspezies in HEp-2 durch UV-Bestrahlung 63 3 ERGEBNISSE 64 3.1 Darstellung der Glycolipidantigene GD3, 9-O-acetyl-GD3 und GD3-7-Aldehyd 65 3.1.1 Isolation von GD3 und 9-O-acetyl-GD3 aus lyophilisierter Buttermilch 65 3.1.1.1 Reinigung des Rohextraktes über Si60-Kieselgelchromatographie 65 3.1.1.2 Reinigung des Glycolipidgemisches über DEAE-Sepharose-Ionenaustauschchromatographie 66 3.1.1.3 Reinigung der Ganglioside GD3 und 9-O-acetyl-GD3 mittels High Performance Liquid Chromatographie (HPLC) 67 3.1.1.4 Quantifizierung des gewonnenen Gangliosids GD3 69 3.1.1.5 Aufarbeitung von Gangliosidproben zur Gewinnung von 9-O-acetyl-GD3 70 3.1.2 Darstellung von GD3-7-al aus GD3 unter Verwendung von Natriumperjodat 71 3.2 Herstellung eines GD3-7-Aldehyd-spezifischen monoklonalen Antikörpers 73 3.2.1 Milzpräparation und Fusion 75 3.2.2 Entwicklung einer Screening-Methode für Hybridoma-Überstände 75 3.2.3 Vermehrung und Klonierung der produzierenden Zellen 77 3.2.4 Spezifität der Klone 77 3.2.5 Sensitivität der glycolipidspezifischen monoklonalen Antikörper 82 3.2.6 Nutzbarkeit des Antikörpers 10C6 für die Durchflusszytometrie 85 3.3 Apoptoseinduktion mit unterschiedlichen GD3-Derivaten an Molt-4-Zellen 86 3.4 Darstellung von GD3-7-al in vitro unter Bedingungen des oxidativen Stresses 88 3.5 Vorkommen von GD3-7-Aldehyd in biologischen Materialien 89 3.5.1 Indirekte Immunfluoreszenz mit den Antikörpern R24, M-T6004 und 10C6 auf verschiedenen Primatengeweben 89 3.5.2 Immunhistochemie mit den Antikörpern R24, M-T6004 und 10C6 auf humanem Darmgewebe 92 3.5.3 GD3-Metabolite im Lipidextrakt verschiedener Tumorzelllinien 93 3.5.4 GD3-Metabolite in Tumorgeweben 95 3.5.5 Nachweis von GD3-7-Aldehyd in peripheren mononukleären Blutzellen 97 3.5.5.1 Identifizierung der GD3-7-Aldehyd-haltigen Zellpopulation mittels Durchflusszytometrie 98 3.5.5.2 Untersuchung 6-Sulfo-LacNAc-dendritischer Zellen aus peripherem Blut auf das Vorkommen von GD3-7-Aldehyd 100 3.5.5.3 Untersuchung der von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen (MoDCs) 101 3.5.5.4 Untersuchung von Granulozyten 103 3.5.5.5 Vorkommen von GD3 und GD3-7-Aldehyd auf der Oberfläche von AML-Blasten 105 3.6 Untersuchung der Eignung von GD3-7-Aldehyd als mögliche Zielstruktur für eine immunologische Tumortherapie 107 3.6.1 Auswirkung von Bestrahlung und Wasserstoffperoxidinkubation auf die Ausprägung des 10C6 - Antigens auf der Oberfläche von AML-Blasten 107 3.6.2 Oxidation des Gangliosides GD3 auf der Oberfläche von Melanomzellen 108 3.6.3 Untersuchung der Ausprägung des 10C6-Antigens auf der Oberfläche von HEp-2-Zellen in Abhängigkeit vom Auftreten reaktiver Sauerstoffspezies 109 3.6.4 Untersuchung der Ausprägung von GD3-7-Aldehyd auf der Oberfläche von SK-Mel-23-Zellen in Abhängigkeit vom Auftreten reaktiver Sauerstoffspezies 112 3.6.5 Nachweis der Einlagerung von GD3-7-Aldehyd in die Zellmembran von HL60-Zellen 114 3.6.5.1 Nachweis des integrierten GD3-7-Aldehyd in Abhängigkeit von der Zeit 115 4 DISKUSSION 117 4.1 Untersuchung von GD3-7-Aldehyd – der Weg vom Apoptosemediator zum Tumortarget 117 4.2 Darstellung der Glycolipidantigene GD3, 9-O-acetyl-GD3 und GD3-7-Aldehyd 118 4.3 GD3-7-Aldehyd als Effektormolekül der mitochondrial vermittelten Apoptose 120 4.4 Gangliosidspezifische Antikörper 124 4.4.1 Immunogenität von nativen und modifizierten Gangliosiden 124 4.4.2 Auswahl antikörperproduzierender Zellklone mit neuem Screeningverfahren 127 4.4.3 Bindungsverhalten des monoklonalen Antikörpers 10C6 127 4.4.4 Bindungsverhalten des monoklonalen Antikörpers R24 128 4.4.5 Bindungsverhalten des monoklonalen Antikörpers M-T6004 129 4.4.6 Nutzbarkeit des monoklonalen Antikörpers 10C6 für die Durchflusszytometrie und die indirekte Immunfluoreszenz 129 4.5 Reaktive Sauerstoffspezies in biologischen Systemen 129 4.5.1 Darstellung von GD3-7-al in vitro unter Bedingungen des oxidativen Stresses 130 4.6 Vorkommen von GD3-7-Aldehyd in biologischen Systemen 131 4.6.1 Gewebefärbungen 131 4.6.2 Vorkommen von GD3-7-Aldehyd in Tumorzellen 132 4.6.3 Vorkommen von GD3-7-Aldehyd auf peripheren mononukleären Blutzellen 135 4.7 Tumortargeting mit GD3-7-Aldehyd 137 4.7.1 Untersuchung des Vorkommens von GD3-7-Aldehyd in Abhängigkeit vom Auftreten reaktiver Sauerstoffspezies 137 4.7.2 Dekorationsversuche HL60 138 4.7.3 Einbau veränderter Sialinsäuren als Therapiemodell 138 4.8 Ausblick 141 5 ZUSAMMENFASSUNG 143 6 LITERATURVERZEICHNIS 147 ANHANG 159 Abkürzungen 159 Abbildungen 162 Tabellen 166 Danksagung 167 THESEN 168 ANLAGE 1 169 ANLAGE 2 170 / Glycosphingolipids are a group of amphiphatic membrane and structure lipids consisting of one molecule of the aminoalcohol Sphingosin or one of its derivatives, a long chain fatty acid, and a carbohydrate moiety as polar side chain. One subgroup of these substances are gangliosides, which are characterized by sialic acid as a component of their glycan chain. The ganglioside GD3 is described as tumor associated antigen on the surface of neuroectodermal tumors and as proapoptotic lipid mediator. Its biological functions as well as its mode of operation in the context of apoptosis still remain unclear. There are hints, that not GD3 itself, but an oxidized derivative represents the actual effector molecule. A minimal change in the GD3 molecule, the 9-O-acetylation of the side chain of the terminal sialic acid, abolishes the proapoptotic effect completely. Tumor cells with activity of the enzyme 9-O-acetyltransferase can escape from apoptosis like that. The request of this work was to investigate the occurrence and function of this so far solely artificially generated oxidized GD3 derivative. The impact of oxidized GD3 on the survival of GD3-resistant tumor cells had to be analyzed. It had to be examined, whether GD3-7-aldehyde occurs in primary cells and tissues. Withal it was to clarify, if the molecule occurs under conditions of oxidative stress and if it can be induced on the surface of cells or intracellularly. Following that, it was to contemplate which novel approaches of immunological therapies for the treatment of resistant tumors could be possible under the use of GD3-7-aldehyde. Prerequisite to all experiments of this work and for following research are reliable detection methods of the metabolites GD3, and GD3-7-aldehyde. Whereas for the detection of GD3 and 9-O-acetyl-GD3 monoclonal antibodies were already existing, for the detection of GD3-7-aldehyde a novel monoclonal antibody directed against an oxidized ganglioside had to be generated for the first time and had to be characterized. For the selection of antibody producing cells, a new screening method had to be established. For the examination of the binding behavior of the ganglioside specific antibodies and for the performance of the incubation assays the gangliosides GD3 and 9-O-acetyl-GD3 had to be isolated from lyophilized bovine buttermilk via several chromatography steps and the oxidized derivative had to be produced. In doing so, GD3-7-al was purified by HPLC for the first time. The monoclonal antibody 10C6 generated in the framework of this study is member of immunoglobulin subclass IgG2a and binds to the oxidized form of the ganglioside GD3. The antigen detected by 10C6 is a glycan chain with structure Neu5Ac-8Neu5Ac-3Gal with oxidized terminal sialic acid. The antibody does not react with reduced or 9-O-acetylated forms of the ganglioside GD3 and possesses a higher sensitivity than the antibodies, established for the detection of both other GD3 derivatives. In this work it is shown in vitro, that the oxidative modification of GD3 to GD3-7-aldehyde can arise under conditions of oxidative stress. In GD3-resistant Molt-4-cells this substance induces apoptosis. Therefore GD3-7-aldehyde comes into consideration to be a proapoptotic effector molecule. The antigen detected by 10C6 occurs on the surface of monocytes of particular donors. Further, it can be found on the surface of a portion of the blasts of acute myeloic leukemia. Other leucocytes of the peripheral blood do not show this structure. GD3-7-aldehyde occurs in tumor cell lines HEp-2, HL60, and T47D. Hints for the existence of structures with oxidatively modified sialic acid were found in tissue slides of human mamma carcinoma and fetal gut. In tissues of adult primates this was not the case. On the surface of melanoma cell lines like Ma-Mel-11, Ma-Mel-95, and SK-Mel-23, existing GD3 can be converted into GD3-7-aldehyde by sodium periodate treatment. UV radiation can induce a structure detectable by 10C6 on the surface of HEp-2- and SK-Mel-23-cells. HL60-cells can be decorated by externally administered GD3-7-aldehyde. It is detectable on their surface for up to 48 hours. For an immunological approach of tumor therapy, the sparsely incidence of this antigen in healthy tissues as well as the inducibility on the surface of distinct tumor cells after pretreatment and the toxicity of this substance could be advantageous. A fitting antibody is now available. The detection methods established in the context of this work can be applied for further investigations in glycolipid research.:1 EINLEITUNG 1 1.1 Sphingolipide, Glycosphingolipide und Ganglioside 1 1.1.1 Biosynthese und Transport der Ganglioside 5 1.1.2 Biologische Funktionen und pathophysiologische Bedeutung der Ganglioside 10 1.2 Sialinsäuren 12 1.3 Das Disialogangliosid GD3 16 1.3.1 Vorkommen von GD3 16 1.3.2 Biologische Wirkungen von GD3 17 1.3.3 GD3 als Zielstruktur in der Tumortherapie 20 1.3.4 Modifikationen der Sialinsäure von GD3 23 1.3.4.1 9-O-Acetylierung der terminalen Sialinsäure von GD3 23 1.3.4.2 Oxidation der terminalen Sialinsäure von GD3 25 1.4 Zielstellung 27 2 MATERIAL UND METHODEN 28 2.1 Materialien 28 2.1.1 Biologische Materialien 28 2.1.1.1 Patientenproben 28 2.1.1.2 Versuchstiere 28 2.1.1.3 Zelllinien und Hybridome 28 2.1.2 Reagenzien, Antikörper und Enzyme 29 2.1.3 Chemikalien 31 2.1.4 Geräte und Hilfsmittel 32 2.2 Methoden 34 2.2.1 Zellkultur 34 2.2.1.1 Kulturmedien 34 2.2.1.2 Zellkulturtechnik 35 2.2.1.3 Zellernte der Suspensionszellen 35 2.2.1.4 Zellernte der adhärenten Zelllinien 35 2.2.1.5 Bestimmung der Zellzahl 36 2.2.1.6 Kryokonservierung 36 2.2.1.7 Auftauen 37 2.2.1.8 Hybridomkultivierung 37 2.2.1.9 Kultur von AML Blasten 37 2.2.2 Durchflusszytometrie 37 2.2.2.1 Oberflächenfärbung von Zelllinien 38 2.2.2.2 Oberflächenfärbung von PBMC und Granulozyten 39 2.2.2.3 Intrazelluläre Färbung 39 2.2.2.4 Detektion reaktiver Sauerstoffspezies mittels DCFDA-Färbung 39 2.2.2.5 SubG1-Analyse 41 2.2.3 Aufarbeitung von Gangliosiden aus Zellen 41 2.2.3.1 Herstellung des Rohextraktes 42 2.2.3.2 Entsalzung des Extraktes an einer Reversed Phase Chromatographie-Säule 43 2.2.4 Dünnschichtchromatographie - HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatographie) 44 2.2.4.1 Detektion mit Orcinfärbung 44 2.2.4.2 Detektion mit Primulin - Färbung 45 2.2.4.3 Detektion mit Overlay - Immunfärbung 45 2.2.5 Isolation von Glycolipiden aus lyophilisierter Buttermilch 47 2.2.5.1 Herstellung des Rohextraktes 48 2.2.5.2 Entsalzung mittels Dialyse 49 2.2.5.3 Si60-Kieselgel-Chromatographie 49 2.2.5.4 DEAE-Ionenaustauschchromatographie 50 2.2.5.5. Entsalzung mit RP-Säule 51 2.2.5.6 HPLC (High Performance Liquid Chromatographie) 51 2.2.6 Herstellung von GD3-7-Aldehyd aus GD3 52 2.2.6.1 Oxidation von Gangliosiden in situ auf HPTLC-Platten 52 2.2.6.2 Darstellung von GD3-7-Aldehyd unter Verwendung von Wasserstoffperoxid und Eisen-II-clorid (Fenton Reaktion) 53 2.2.7 Herstellung monoklonaler Antikörper gegen GD3-7-Aldehyd 53 2.2.7.1 Immunisierung der Mäuse 54 2.2.7.2 Vorbereitung der Myelomzellen 54 2.2.7.3 Präparation der Milzzellen 55 2.2.7.4 Fusion der Milz- und Myelomzellen 55 2.2.7.5 Selektion und Klonierung 56 2.2.7.5.1 Screening 56 2.2.7.5.2 Ermittlung der Spezifität 57 2.2.7.5.3 Bestimmung der Immunglobulinklasse und des Subtyps 57 2.2.8 Separation mononukleärer Zellen (PBMCs) und Granulozyten aus Vollblut 57 2.2.8.1 Isolation einzelner Leukozytenpopulationen mittels MACS Technologie 58 2.2.8.1.1 Positivselektion von Monozyten 58 2.2.8.1.2 Positivselektion von Slan-DCs mit M-DC8 58 2.2.9 Generierung und Maturierung von Dendritischen Zellen aus Monozyten 59 2.2.10 Indirekte Immunfluoreszenz 60 2.2.10.1 Aufzentrifugieren von Suspensionszellen auf Objektträger 60 2.2.10.2 Fixierung und Permeabilisierung der Zellen auf Objektträgern 60 2.2.10.3 Fluoreszenzfärbung von Zellen und Geweben auf Objektträgern 60 2.2.11 Immunhistochemische Färbung mit modifizierter ABC-Methode 61 2.2.12 Behandlung von HL60 mit GD3-7-Aldehyd 62 2.2.13 Inkubationsversuche von Molt-4 mit unterschiedlichen GD3-Derivaten 63 2.2.14 Induktion reaktiver Sauerstoffspezies in HEp-2 durch UV-Bestrahlung 63 3 ERGEBNISSE 64 3.1 Darstellung der Glycolipidantigene GD3, 9-O-acetyl-GD3 und GD3-7-Aldehyd 65 3.1.1 Isolation von GD3 und 9-O-acetyl-GD3 aus lyophilisierter Buttermilch 65 3.1.1.1 Reinigung des Rohextraktes über Si60-Kieselgelchromatographie 65 3.1.1.2 Reinigung des Glycolipidgemisches über DEAE-Sepharose-Ionenaustauschchromatographie 66 3.1.1.3 Reinigung der Ganglioside GD3 und 9-O-acetyl-GD3 mittels High Performance Liquid Chromatographie (HPLC) 67 3.1.1.4 Quantifizierung des gewonnenen Gangliosids GD3 69 3.1.1.5 Aufarbeitung von Gangliosidproben zur Gewinnung von 9-O-acetyl-GD3 70 3.1.2 Darstellung von GD3-7-al aus GD3 unter Verwendung von Natriumperjodat 71 3.2 Herstellung eines GD3-7-Aldehyd-spezifischen monoklonalen Antikörpers 73 3.2.1 Milzpräparation und Fusion 75 3.2.2 Entwicklung einer Screening-Methode für Hybridoma-Überstände 75 3.2.3 Vermehrung und Klonierung der produzierenden Zellen 77 3.2.4 Spezifität der Klone 77 3.2.5 Sensitivität der glycolipidspezifischen monoklonalen Antikörper 82 3.2.6 Nutzbarkeit des Antikörpers 10C6 für die Durchflusszytometrie 85 3.3 Apoptoseinduktion mit unterschiedlichen GD3-Derivaten an Molt-4-Zellen 86 3.4 Darstellung von GD3-7-al in vitro unter Bedingungen des oxidativen Stresses 88 3.5 Vorkommen von GD3-7-Aldehyd in biologischen Materialien 89 3.5.1 Indirekte Immunfluoreszenz mit den Antikörpern R24, M-T6004 und 10C6 auf verschiedenen Primatengeweben 89 3.5.2 Immunhistochemie mit den Antikörpern R24, M-T6004 und 10C6 auf humanem Darmgewebe 92 3.5.3 GD3-Metabolite im Lipidextrakt verschiedener Tumorzelllinien 93 3.5.4 GD3-Metabolite in Tumorgeweben 95 3.5.5 Nachweis von GD3-7-Aldehyd in peripheren mononukleären Blutzellen 97 3.5.5.1 Identifizierung der GD3-7-Aldehyd-haltigen Zellpopulation mittels Durchflusszytometrie 98 3.5.5.2 Untersuchung 6-Sulfo-LacNAc-dendritischer Zellen aus peripherem Blut auf das Vorkommen von GD3-7-Aldehyd 100 3.5.5.3 Untersuchung der von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen (MoDCs) 101 3.5.5.4 Untersuchung von Granulozyten 103 3.5.5.5 Vorkommen von GD3 und GD3-7-Aldehyd auf der Oberfläche von AML-Blasten 105 3.6 Untersuchung der Eignung von GD3-7-Aldehyd als mögliche Zielstruktur für eine immunologische Tumortherapie 107 3.6.1 Auswirkung von Bestrahlung und Wasserstoffperoxidinkubation auf die Ausprägung des 10C6 - Antigens auf der Oberfläche von AML-Blasten 107 3.6.2 Oxidation des Gangliosides GD3 auf der Oberfläche von Melanomzellen 108 3.6.3 Untersuchung der Ausprägung des 10C6-Antigens auf der Oberfläche von HEp-2-Zellen in Abhängigkeit vom Auftreten reaktiver Sauerstoffspezies 109 3.6.4 Untersuchung der Ausprägung von GD3-7-Aldehyd auf der Oberfläche von SK-Mel-23-Zellen in Abhängigkeit vom Auftreten reaktiver Sauerstoffspezies 112 3.6.5 Nachweis der Einlagerung von GD3-7-Aldehyd in die Zellmembran von HL60-Zellen 114 3.6.5.1 Nachweis des integrierten GD3-7-Aldehyd in Abhängigkeit von der Zeit 115 4 DISKUSSION 117 4.1 Untersuchung von GD3-7-Aldehyd – der Weg vom Apoptosemediator zum Tumortarget 117 4.2 Darstellung der Glycolipidantigene GD3, 9-O-acetyl-GD3 und GD3-7-Aldehyd 118 4.3 GD3-7-Aldehyd als Effektormolekül der mitochondrial vermittelten Apoptose 120 4.4 Gangliosidspezifische Antikörper 124 4.4.1 Immunogenität von nativen und modifizierten Gangliosiden 124 4.4.2 Auswahl antikörperproduzierender Zellklone mit neuem Screeningverfahren 127 4.4.3 Bindungsverhalten des monoklonalen Antikörpers 10C6 127 4.4.4 Bindungsverhalten des monoklonalen Antikörpers R24 128 4.4.5 Bindungsverhalten des monoklonalen Antikörpers M-T6004 129 4.4.6 Nutzbarkeit des monoklonalen Antikörpers 10C6 für die Durchflusszytometrie und die indirekte Immunfluoreszenz 129 4.5 Reaktive Sauerstoffspezies in biologischen Systemen 129 4.5.1 Darstellung von GD3-7-al in vitro unter Bedingungen des oxidativen Stresses 130 4.6 Vorkommen von GD3-7-Aldehyd in biologischen Systemen 131 4.6.1 Gewebefärbungen 131 4.6.2 Vorkommen von GD3-7-Aldehyd in Tumorzellen 132 4.6.3 Vorkommen von GD3-7-Aldehyd auf peripheren mononukleären Blutzellen 135 4.7 Tumortargeting mit GD3-7-Aldehyd 137 4.7.1 Untersuchung des Vorkommens von GD3-7-Aldehyd in Abhängigkeit vom Auftreten reaktiver Sauerstoffspezies 137 4.7.2 Dekorationsversuche HL60 138 4.7.3 Einbau veränderter Sialinsäuren als Therapiemodell 138 4.8 Ausblick 141 5 ZUSAMMENFASSUNG 143 6 LITERATURVERZEICHNIS 147 ANHANG 159 Abkürzungen 159 Abbildungen 162 Tabellen 166 Danksagung 167 THESEN 168 ANLAGE 1 169 ANLAGE 2 170

Várias evidências têm caracterizado os efeitos benéficos do gangliosídeo GM1 no tratamento de lesões neurológicas. O GM1 também foi estudado para o tratamento de doenças neurodegenerativas, principalmente em relação ao seu papel na neuroplasticidade e neuroproteção. O objetivo deste estudo foi analisar os possíveis efeitos de GM1 em modelo de doença de Parkinson induzida pela injeção intraestriatal unilateral de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) em ratos. O GM1 foi injetado em conjunto com 6-OHDA e sete dias após a cirurgia os cérebros foram coletados para análise. Os resultados bioquímicos mostraram que o tratamento com GM1 intraestrial atenua aspectos inflamatórios e reduz os indicadores de morte neuronal, tal como evidenciado pela manutenção dos níveis de GFAP, OX-42 e caspase-3 em níveis de controle. A melhoria no tratamento por GM1 foi também demonstrada com a preservação de um fator neurotrófico derivado do encéfalo (BDNF) e os níveis de tirosina hidroxilase após 6-OHDA. A análise comportamental corrobora os achados bioquímicos, demonstrando que o GM1 possui a capacidade de preservação dos movimentos, visto pelo teste de cilindro. Sugerimos que o GM1 exerce neuroproteção no modelo de 6-OHDA, quando administrado por uma via local. Isto poderia representar um meio viável para transpor as barreiras farmacocinéticos que afetam a entrega de uma concentração apropriada da droga para áreas do cérebro / Several evidences have characterized the beneficial effects of ganglioside GM1 in the treatment of neurological lesions. GM1 has also been studied for the treatment of neurodegenerative diseases, mainly in relation to its role in neuroplasticity and neuroprotection. The objective of this study was to analyze the possible effects of GM1 on a model of Parkinson\'s disease induced by unilateral intra-striatal injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) in rats. The GM1 was injected together with 6-OHDA and seven days after surgery the brains were collected for analysis. Biochemical results showed that treatment with intra-striatal GM1 attenuates inflammatory aspects and reduces the indicators of neuronal death, as evidenced by maintaining levels of GFAP, OX-42 and caspase-3 at control levels. Improvement after GM1 treatment was also demonstrated by the preservation of a brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and tyrosine hydroxylase levels after 6-OHDA. The behavioral analysis corroborates the biochemical findings, demonstrating that GM1 has the ability to preserve movements, as seen by the cylinder test. We suggest that GM1 exerts neuroprotection in the 6-OHDA model when administered by a local route. This could represent a viable means of overcoming the pharmacokinetic barriers affecting the delivery of an appropriate concentration of the drug to areas of the brain

Neste trabalho foi investigado o efeito da administração crônica de prolina sobre o conteúdo total de gangliosídios, fosfolipídios e de colesterol, assim como, sobre o perfil de gangliosídios no córtex, no hipocampo, no hipotálamo e no cerebelo de ratos. Também, foi avaliado o conteúdo e o perfil de gangliosídios nas frações solúvel e resistente a detergente obtidas de membranas sinápticas de córtex. Ratos Wistar foram divididos em dois grupos: 1) injetados subcutaneamente com solução 0,9% de NaCl (animais controle) e 2) injetados subcutaneamente com solução de prolina, em concentrações adequadas ao peso corporal (animais hiperprolinêmicos). Tanto a solução de prolina quanto a salina foram administradas do 6° ao 28° dia pós-natal. Doze horas após a última administração, os animais foram sacrificados mediante decapitação sem anestesia. As estruturas cerebrais foram dissecadas e em seguida homogeneizadas em clorofórmio:metanol na proporção 1:1 vpara a extração lipídica. As membranas sinápticas foram obtidas através de centrifugação diferencial e as frações solúvel e resistente a detergente foram isoladas através de tratamento das membranas com Triton X-100 a 4°C para investigação de microdomínios de membrana. Após a realização das análises, os resultados mostraram que os animais submetidos ao tratamento crônico com prolina apresentaram um marcado aumento no conteúdo de gangliosídios no córtex cerebral e no hipocampo, enquanto os conteúdos de fosfolipídios e de colesterol aumentaram somente no hipocampo. Além disso, os conteúdos destes compostos não foram alterados no hipotálamo e no cerebelo de animais hiperprolinêmicos. Por outro lado, o conteúdo de gangliosídios diminuiu nas frações solúvel e resistente a detergente obtidas de membranas sinápticas de córtex de animais hiperprolinêmicos. Embora os perfis de gangliosídios não tenham sido aparentemente modificados, as quantidades absolutas das espécies foram alteradas tanto no extrato total, como nos microdomínios de membrana obtidos do córtex. Estes dados revelam que o tratamento crônico com prolina afeta de forma distinta as diferentes regiões cerebrais quanto à composição lipídica das membranas celulares, refletindo-se sobre a distribuição de lipídios nos microdomínios de membrana do córtex. Entre as conseqüências destes fenômenos poderiam ser sugeridas modulações diferentes nas transmissões sinápticas que contribuiriam para o déficit cognitivo e/ou outras disfunções neurológicas presentes em pacientes com hiperprolinemia tipo II. / In the present work we investigated the effects of chronic proline administration on ganglioside, cholesterol and phospholipid total contents, as well as on ganglioside profile in cerebral cortex, hippocampus, hypothalamus and cerebellum of rats. We also evaluated the ganglioside content and profile in detergent- soluble and resistant fractions isolated from synaptic membranes obtained from cerebral cortex. Wistar rats were divided into two groups: 1) saline (control) and 2) proline injected (hyperprolinemic). Proline solution or saline were administered from 6th to 28th postnatal day, according to body weight. Twelve hours after the last injection, the animals were sacrificed by decapitation without anesthesia. Brain structures were homogenized with chlorophorm:methanol 1:1 for lipid extraction. Synaptic membrane was extracted by differential centrifugation and detergent- soluble and resistant fractions were isolated by cold Triton X-100 treatment. Results showed that rats subjected to chronic proline treatment presented a significant increase of ganglioside content on cortex and hippocampus, while phospholipid and cholesterol contents only increased in hippocampus. However, the content of these components were not altered in hypothalamus and cerebellum of hyperprolinemic rats. On the other hand, ganglioside content decreased in detergent- soluble and resistant fractions isolated from synaptic membrane obtained from hyperprolinemic cortex. Although ganglioside profiles were apparently not modified, the individual absolute quantities were altered in cortex total lipid extract and membrane microdomains obtained from cerebral cortex. Our findings suggest that chronic proline treatment affects, in a distinct manner, different cerebral regions concerning the lipid composition of the cell membranes, reflecting on its distribution in the cortex membrane microdomains. Among these phenomena consequences, different modulations in synaptic transmission may be suggested which may contribute to the impairment in cognition and/or other neurological disfunctions found in hyperprolinemia type II patients.