A citricultura paulista pode ser considerada uma das mais competitivas e importantes atividades agroindustriais do Brasil, gerando aproximadamente 400 mil empregos e adicionando anualmente U$ 1,4 bilhões ao país. Entretanto ainda apresenta uma produtividade inferior àquela encontrada na Flórida, principalmente devido a deficiências nutricionais e hídricas e a doenças que há diversos anos atingem às lavouras. Nos últimos dez anos a clorose variegada dos citros (CVC), conhecida popularmente como a doença do amarelinho, apresenta-se como o principal problema, sendo a bactéria gram-negativa Xylella fastidiosa seu agente causal. Em vista da importância do cultivo da laranja no país, o projeto \"Genoma Xylella fastidiosa\" foi proposto, visando o seqüenciamento total do genoma deste fitopatógeno bem como o treinamento de pessoal capacitado na utilização das modernas técnicas de biologia molecular. Segmentos de DNA provenientes de 7 cosmídeos e diversos clones provenientes de bibliotecas de \"shotgun\" genômico foram seqüenciados em nosso laboratório, totalizando 271.220 pb do genoma da bactéria. Em seguida foi feita a anotação das orfs preditas por programa GLIMMER, sendo que em nosso laboratório foram anotadas aproximadamente 290 ORFs. Seqüenciamentos diretamente do genoma e de clones das bibliotecas de RDA foram também realizados, complementando as metodologias de primer walking e construção de bibliotecas de fago utilizadas em outros laboratórios do projeto para o fechamento de \"gaps\". Todos os resultados obtidos em nosso laboratório, somados às contribuições de todos os grupos do projeto, serão base para a melhor compreensão dos mecanismos utilizados pela bactéria, podendo favorecer o desenvolvimento de novas estratégias para o combate desta praga. / The São Paulo\'s citriculture can be considered one of the most competitive and important agroindustrial activity from Brazil. It provides aproximately 400,000 jobs and adds US$ 1,4000,000,000 for the country\'s economy. This activity, however, still shows less productivity than the one from Florida, mainly due to nutritional and hydric deficiencies and plagues that are already present for a long time. In the last ten years, the citrus variegated chlorosis (CVC), also known as little yellow disease, constitutes the main problem for the orange farmers. This disease is caused by gram-negative bacterium Xylella fastidiosa. Due to the importance of the orange cultive in the country, the project called Xylella fastidiosa\'s Genome was proposed. The main goals of this project are to sequence the entire genome of this phytopathogen and the trainning of specialized people in the use of modern techniques of molecular biology. DNA fragments cloned in 7 cosrnids and also form genomic shotgun libraries were sequenced in our laboratory. A total of 271,220 bp of bacteria genome were obtained. The next step was the annotation of the open reading frames (ORFs). This was made using the GLIMMER computer program which generates, in our laboratory, aproximately 290 ORFs. Direct sequencing of the genome and clones of RDA libraries were also done for obtaining nucleotide sequences form gaps. These methodologies complement the primer walking and phage library construction used by other laboratories included in the project. All results, obtained either by our laboratory or the other groups from the project, will be used for a better understanding of the mechanisms used by the bacteria, Altogether, they can be favor the development of new strategies in the plague combact.

Os elementos genéticos móveis encontrados no genoma da bactéria Xylella fastidiosa (Xf) são representados principalmente por bacteriófagos (na forma de profagos inseridos no genoma) e ilhas genômicas. As integrases são responsáveis pelo processo de mobilização (integração e/ou excisão) destes elementos, através do mecanismo de recombinação sítio-específica. Bacteriófagos e ilhas genômicas estão associados a eventos de rearranjos genômicos e à aquisição e ou interrupção de genes importantes para bactéria, tendo implicação direta na diversidade e organização genômica e, por conseqüência, na diferenciação entre linhagens. A extensão e o impacto desses eventos é o foco deste trabalho, através da análise in-silico das integrases e sua associação com regiões de profagos e ilhas genômicas, no genoma de quatro linhagens de Xf. Os dados aqui apresentados corroboram o papel das integrases e seus elementos genéticos móveis associados como agentes chaves no processo de diversidade e evolução da organização genômica entre as quatro linhagens de Xf. / The mobile genetic elements found in the genome of the bacterium Xylella fastidiosa (Xf) are mainly represented by bacteriophages (as prophages inserted into the genome) and genomic islands. The integrases are responsible for the process of mobilization (integration and / or excision) of these elements through the mechanism of site-specific recombination. Bacteriophages and genomic islands are associated with events of genomic rearrangements and the acquisition and or interruption of important genes for bacteria, with direct involvement in diversity and genomic organization and, consequently, the differentiation between strains. The extent and impact of these events are the focus of this work, through in-silico analysis of integrase and association with regions of prophages and genomic islands in the genome of four strains of Xf. The data presented here support the role of integrases and their mobile genetic elements associated as key players in the process of evolution and diversity of genomic organization between the four strains of Xf.

O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma metodologia para identificação de regiões promotoras funcionais a partir de segmentos de um genoma qualquer. O genoma da cana-de-açúcar foi escolhido para o desenvolvimento desta estratégia na qual envolve a obtenção de fragmentos de DNA os quais foram clonados em vetores de expressão. A triagem destes fragmentos foi realizada através de biobalística e resultou no isolamento de quatro clones. Um ensaio de transformação permanente em arroz com três clones gerou 12 plantas. Foi detectada expressão do marcador GUS em calos, folhas e raízes, comprovando sua funcionalidade. Desta maneira, o presente trabalho permitiu estabelecer uma metodologia de recuperação de sequências regulatórias funcionais com ampla possibilidade de serem explorados biotecnologicamente. / The aim of this work is develop a strategy to identify functional promoter regions from any genome. The modern sugarcane genome was chosen as a model for the development of this strategy that involves the generation of fragments of DNA and cloning them into expression vectors. These fragments were then screened by a transient expression assay using biolistic particle delivery resulting in the isolation of four clones. Three clones were permanently transformed in rice, and 12 plants were obtained. GUS expression was detected in the callus, leaves and roots of the rice plants thus confirming the functionality of sequences in these clones. The present work has established a strategy to identify and extract functional regulatory sequences containing functional regulatory regions which show great potential of being useful in both the biotechnology field and in the field of basic science.

Submitted by Maria Beatriz Vieira (mbeatriz.vieira@gmail.com) on 2017-10-18T11:53:11Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) tese_marcus_redu_eslabao.pdf: 2744083 bytes, checksum: 5950b0ffa159bbf193a91d88276a5e49 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-10-23T11:08:52Z (GMT) No. of bitstreams: 2 tese_marcus_redu_eslabao.pdf: 2744083 bytes, checksum: 5950b0ffa159bbf193a91d88276a5e49 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-10-23T11:09:03Z (GMT) No. of bitstreams: 2 tese_marcus_redu_eslabao.pdf: 2744083 bytes, checksum: 5950b0ffa159bbf193a91d88276a5e49 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-23T11:09:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 tese_marcus_redu_eslabao.pdf: 2744083 bytes, checksum: 5950b0ffa159bbf193a91d88276a5e49 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / O sequenciamento de DNA é uma técnica que fornece uma fonte vasta de informações sobre diversos organismos. Atualmente, novas metodologias de sequenciamento conhecidas como Next-Generation Sequencing, estão fazendo com que esta técnica fique inúmeras vezes mais rápida, precisa e economicamente acessível, tornando-se popular e disseminada no meio científico. Com a popularização do sequenciamento de genomas, laboratórios que não possuem ênfase em sequenciamento de DNA, utilizam desta abordagem para complementar seus estudos. Porém, a facilidade em obter a sequência do DNA contrasta com a dificuldade em processar, analisar e anotar o genoma, para que então seja possível obter informações biológicas relevantes sobre aquele organismo. Para auxiliar os pesquisadores que se utilizam desta técnica, alguns softwares estão disponíveis, porém, geralmente são pagos, não realizam toda a tarefa ou são de difícil utilização, neste último caso, por serem em sua grande maioria executados através de terminais de comando, que não contam com um ambiente gráfico para guiar os usuários. Com base nesta problemática, o presente trabalho teve por objetivo criar um software de anotação de genomas de fácil utilização e com interface gráfica amigável, gratuito e que anote com as informações necessárias para submissão ao GenBank. Para implementação do software, denominado Square, as linguagens de programação Python e Object Pascal foram utilizadas. Os algoritmos Prodigal, NCBI BLAST e tRNAscan-SE também foram integrados no software. Ao final da etapa de desenvolvimento, o Square foi testado com três genomas e comparado com dois anotadores populares: o RAST e o BASys. O resultado mostrou que o Square possui maior precisão que os dois outros anotadores, por se aproximar mais do resultado depositado no NCBI, e mais rápido, por ser executado localmente com rapidez. O Square demonstrou-se uma boa alternativa para usuários que não estão acostumados com o terminal de comando Linux e está disponível no endereço http://sourceforge.net/projects/sqgenome/. / DNA sequencing is a technique that provides a vast source of information on various organisms. Currently, new sequencing methods known as Next-Generation Sequencing, are making this technique many times more rapid, accurate and affordable, making it popular and widespread in the scientific community. With the popularization of genome sequencing, laboratories that do not have an emphasis on DNA sequencing, are using this approach to complement their studies. However, the ease in obtaining a DNA sequence contrasts with the difficulty to process, analyze and annotate the genome, in order to obtain relevant biological information. To assist researchers who use this technique, several programs are available, however, they are generally not free, do not perform all the necessary analysis or are difficult to use, mainly because a considerable number of them make use of command line to be executed, which is not intuitive. The objective of this study was to create a genome annotation software easy to use, with a user friendly interface, free and able to provide all the necessary information for the annotated genome to be submitted to GenBank. For software implementation named Square, Python and Object Pascal programming languages were used. The Prodigal algorithms, NCBI BLAST and tRNAscan-SE were also integrated in the software. At the end of the development stage, Square was tested with three genomes and compared to two popular annotators: RAST and BASYS. The result showed that the Square has higher accuracy than the other two annotator programs, as the results are similar to what is deposited in NCBI, and produce the result in a shorter time, as it runs locally. The Square proved to be a good alternative for users not familiar with the Linux command terminal and is available in http://sourceforge.net/projects/sqgenome/ address.

Orientador: Alexandre Reily Rocha / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Nanociências e Materiais Avançados, 2014.

O sequenciamento genômico da L. interrogans sorovar Copenhageni e os avanços das análises bioinformáticas permitiram a identificação de seis novos candidatos vacinais. Esses genes de Leptospira foram submetidos a ensaios de conservação do DNA genômico, RNA mensageiro e proteína nativa correspondente em doze sorovares de Leptospira, nos quais o gene LIC11469 foi o mais conservado. As proteínas recombinantes rLIC11469 e rLIC11030 foram purificadas por cromatografia de afinidade a metal, e submetidas a ensaio de dicroísmo circular. Em ensaios de localização celular pudemos observar a presença das proteínas nativas correspondentes na membrana externa de Leptospira. Ensaios de adesão mostraram a ligação da proteína rLIC11469 à laminina e ao plasminogênio. Ensaios de imunização e desafio demonstraram que a proteína rLIC11030 conferiu proteção contra infecção letal de L. interrogans em hamsters. Ambas as proteínas apresentaram reatividade com anticorpos presentes em soros de pacientes com leptospirose, sugerindo sua expressão durante a infecção. / The genomic sequencing of the L. interrogans serovar Copenhageni and the advances of bioinformatics analysis allowed the identification of six new vaccine candidates. These genes were subjected to genomic DNA, mRNA and native protein conservation assays in twelve serovars from Leptospira, and the gene LIC11469 was the most conserved among these serovars. The recombinant proteins rLIC11469 and rLIC11030 were purified by metal affinity chromatography, and subjected to circular dichroism. Through cellular localization assays we could observe the presence of the corresponding native proteins on the outer membrane of Leptospira. In adhesion assays, the protein rLIC11469 showed binding to laminin and plasminogen. Immunization and challenge assays showed that the protein rLIC11030 afforded protection against lethal leptospiral inoculation in hamsters. Both proteins showed reactivity against sera of patients diagnosed with leptospirosis, suggesting that these proteins are probably expressed during infection.

No presente trabalho, AFLPs e marcadores baseados em retrotransposons foram utilizados para a construção de um mapa de ligação integrado em cana-de-açúcar. Dois retrotransposons encontrados no genoma da cana-de-açúcar, denominados SURE e Garapa, foram estudados. Os princípios da técnica NBS-profiling foram usados para gerar marcadores direcionados às sequências desses retrotransposons. Os marcadores foram analisados numa população F1 de cana-de-açúcar, composta por 188 indivíduos, oriunda do cruzamento entre os genitores IAC66-6 e TUC71-7. O mapa integrado foi construído usando-se o software OneMap, especialmente desenvolvido para mapear espécies não endogâmicas. Excelentes padrões de AFLP e de marcas direcionadas ao retrotransposon SURE foram obtidos; entretanto, para o Garapa, ainda são necessários ajustes na técnica. Um total de 600 marcadores de dose única foi obtido a partir de 22 combinações de enzimas de restrição/primers de AFLP e seis combinações otimizadas para amplificar marcas direcionadas ao retrotransposon SURE. Construiu-se um mapa com 107 grupos de ligação, com tamanho de 4.316,5 cM e densidade de 8,74 cM/marcador. O mapeamento dos marcadores derivados do retrotransposon SURE revelou que esse elemento não está uniformemente distribuído nos grupos de ligação e confirmou o seu baixo número de cópias no genoma da cana, conforme foi sugerido na literatura. / In the presenty study, AFLPs and retrotransposon-based markers were used for the construction of an integrated linkage map of sugarcane. Two retrotransposons described in the sugarcane genome, named SURE and Garapa were studied. The principles of NBS-profiling technique were used to generate markers based on these retrotransposon sequences. The markers were analyzed in a F1-population, composed of 188 individuals, derived from a single cross between the IAC66-6 and TUC71-7 parents. The integrated genetic map was constructed using the software OneMap, specially designed for mapping outcrossing species. Excellent gel profiles of AFLP and retrotransposon-derived markers were obtained; however, for the Garapa element, technical adjustments are still needed. A total of 600 single-dose markers were obtained from 22 AFLP restriction enzyme/primer combinations and six combinations optimized to amplify the SURE-based markers. A map with 107 linkage groups was constructed, spanning 4,316.5 cM, with a marker density of 8.74 cM. Mapping of SURE-based markers revealed that this element is not uniformly distributed across the linkage groups, and confirmed its low copy number in the sugarcane genome, as suggested in the literature.

A família Baculoviridae é um grande grupo de vírus com cerca de 700 espécies de insetos hospedeiros, com dois fenótipos: o ODV (occlusion derived virion), que faz a infecção primária do intestino médio; e o BV (budded virus), responsável pela infecção sistêmica. No Brasil, o nucleopoliedrovírus Anticarsia gemmatalis (AgMNPV) é utilizado como controle biológico da lagarta-da-soja Anticarsia gemmatalis. O genoma do AgMNPV-2D contém 152 ORFs, 26 das quais codificam proteínas estruturais. Entre elas, a glicoproteína GP64 é fundamental para infecção secundária. Este estudo visa identificar proteínas estruturais do AgMNPV-2D por duas abordagens de espectrometria de massas. Também comparar a variabilidade da gp64 de isolados geográficos por sequenciamento por Sanger e de alta cobertura. Assim, identificamos as substituições de gp64 e vimos que ela não suporta a separação geográfica dos isolados. Também identificamos 44 e 33 proteínas em ODV e BV, respectivamente. Seis novas proteínas foram identificadas no ODV e sete delas no BV. Além disso, 11 proteínas celulares foram identificadas no AgMNPV-2D, possivelmente necessárias para infecção. Este achado contribui para o entendimento da morfogênese do AgMNPV e fatores associados à multiplicação viral. / Baculoviridae are arthropod-specific viruses with more than 700 host insects, which produce two phenotypes: the budded virus (BV) and, the occlusion-derived virus (ODV) for intra and across host spread, respectively. Brazil uses the Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) as a biological control agent of the velvet bean caterpillar (A. gemmatalis). The genome of the AgMNPV-2D carries 152 ORFs, 26 of which code for structural proteins. Herein, the structural proteins of AgMNPV-2D were analyzed by two mass spectrometry techniques. The additional objective was to compare the gene gp64. of different geographical populations by Sanger and next generation sequencing. This analysis allowed us to observe the substitutions of gp64 and refuted the notion of a geographical isolation of the samples. We also observed a total of 44 proteins of the ODV and 33 of the BV. Six new proteins were found in the ODV and seven in the BV. Furthermore, 11 cellular proteins were also identified, which are possibly assorted during viral morphogenesis. These findings may provide novel insights into AgMNPV biology and its host interaction, leading us to a better understanding about morphogenesis and also the associated factors of the viral multiplication.

No presente trabalho, AFLPs e marcadores baseados em retrotransposons foram utilizados para a construção de um mapa de ligação integrado em cana-de-açúcar. Dois retrotransposons encontrados no genoma da cana-de-açúcar, denominados SURE e Garapa, foram estudados. Os princípios da técnica NBS-profiling foram usados para gerar marcadores direcionados às sequências desses retrotransposons. Os marcadores foram analisados numa população F1 de cana-de-açúcar, composta por 188 indivíduos, oriunda do cruzamento entre os genitores IAC66-6 e TUC71-7. O mapa integrado foi construído usando-se o software OneMap, especialmente desenvolvido para mapear espécies não endogâmicas. Excelentes padrões de AFLP e de marcas direcionadas ao retrotransposon SURE foram obtidos; entretanto, para o Garapa, ainda são necessários ajustes na técnica. Um total de 600 marcadores de dose única foi obtido a partir de 22 combinações de enzimas de restrição/primers de AFLP e seis combinações otimizadas para amplificar marcas direcionadas ao retrotransposon SURE. Construiu-se um mapa com 107 grupos de ligação, com tamanho de 4.316,5 cM e densidade de 8,74 cM/marcador. O mapeamento dos marcadores derivados do retrotransposon SURE revelou que esse elemento não está uniformemente distribuído nos grupos de ligação e confirmou o seu baixo número de cópias no genoma da cana, conforme foi sugerido na literatura. / In the presenty study, AFLPs and retrotransposon-based markers were used for the construction of an integrated linkage map of sugarcane. Two retrotransposons described in the sugarcane genome, named SURE and Garapa were studied. The principles of NBS-profiling technique were used to generate markers based on these retrotransposon sequences. The markers were analyzed in a F1-population, composed of 188 individuals, derived from a single cross between the IAC66-6 and TUC71-7 parents. The integrated genetic map was constructed using the software OneMap, specially designed for mapping outcrossing species. Excellent gel profiles of AFLP and retrotransposon-derived markers were obtained; however, for the Garapa element, technical adjustments are still needed. A total of 600 single-dose markers were obtained from 22 AFLP restriction enzyme/primer combinations and six combinations optimized to amplify the SURE-based markers. A map with 107 linkage groups was constructed, spanning 4,316.5 cM, with a marker density of 8.74 cM. Mapping of SURE-based markers revealed that this element is not uniformly distributed across the linkage groups, and confirmed its low copy number in the sugarcane genome, as suggested in the literature.

Object and tasks of work: 1. Analyse and summarize literature about horse coat color and it genetic background. 2. Perform phenotypical analysis of Lithuanian Heavy Darught horse coat color polymorphism. 3. Introduce horse MC1R gene research methodology at K. Janušauskas Laboratory of Animal Genetics, LVA. 4. Investigate MC1R gene polymorphism and distribution of different alleles at Lithuanian heavy draught by PCR-RFLP method. 5. Determine correlation between restriction fragment lenght polymorphism (RFLP) in MC1R gene and horse bay coat color polymorhism. Research methodology: 1. DNA extraction from hair roots. 2. PCR to amplify MC1R gene. 3. RFLP method-MC1R – enzyme Tag I. 3. Electrophoresis in agarose gel. 4. Staining with Etidium bromide. 5. Genotyping. 6. Stasitical analysis of data. Results and conclutions: The following DNA restriction fragments were obtained for the MC1R – Tag I polymorphism: PCR product - 460 bp; genotypes E/E; ea/ea – 460 bp; genotypes e/e – 275 bp; 185 bp; genotypes E/e; e/ea – 460 bp; 275 bp; 185 bp. After phenotypical investigation of coat color from 32 Lithuanian Heavy draught horses following variation have been found: light bay, bay, dark bay, roan and chesnut. Light bay horses with different intensivity of coat color comprised 84,4 %. From total investigated animals 34.4 % had e/e genotype, E/e – 12.5 %, e/ea - 50 % and E/E genotype – 3.1 %. Two different genotypes e/e (40.7 %) and e/ea (59.3) were found among bay color horses... [to full text]