Chez le mammifère la fonction de reproduction est sous le contrôle des neurones hypothalamiques à GnRH-I. Au cours du développement embryonnaire ces neurones migrent de la fosse nasale vers le cerveau. De nombreuses études s’intéressent aux facteurs impliqués dans leur migration, mais l’influence de leur environnement cellulaire est très peu étudiée. Nous avons émis l’hypothèse que les neurones à GnRH-I d’origine extra-cérébrale possèdent un environnement gliale nécessaire à leur migration, connaissant le rôle de ces cellules dans l’ontogenèse neuronale du cerveau. Nos résultats montrent que 1) les neurones à GnRH-I sont associés à des cellules gliales au cours de leurs migrations nasale et télencéphalique 2) ces cellules gliales sont des progéniteurs des cellules gliales olfactives engainantes qui se différencient dans les régions rostrales au cours de la migration neuronale. 3) ces cellules expriment des gènes codant pour des facteurs impliqués dans la migration de ces neurones. 4) le transcriptome de ces cellules gliales est perturbé en présence d’un perturbateur endocrinien œstrogèno-mimétique, et touche des familles de gènes impliquées dans les molécules d’adhésions cellulaires nécessaire à la migration et à la régulation de l’activité des neurones à GnRH-I. / GnRH-I cells control reproduction functions in mammals. These cells are extra cerebral since they come from the nasal pit and migrate to the forebrain during embryonic development. Numerous studies have described the influence of different molecules on the migration of GnRH-1 neurons, however, the role of microenvironment cells remains poorly understood. Considering the role of glial cells in the forebrain’s neuronal migration, we had hypothesized that extra-cerebral GnRH-I neurons possess a glial environment necessary for their migration from the nose to the brain. Our results demonstrated that 1) GnRH-I neurons are associated with glial cells during their migration in the nasal septum and forebrain 2) These glial cells are progenitors of olfactory ensheathing cells, and differentiated within the rostral regions during neuronal migration. 3) These cells express genes encoding factors involved in GnRH-I neurons migration 4) Glial cells transcriptome are disrupted with estrogen-mimicking endocrine disruptor, and affects gene families involved in cell adhesion molecules necessary for migration and activity regulation of GnRH-I neurons

Le récepteur atypique ACKR3 et le récepteur CXCR4 sont des récepteurs couplés aux protéines G appartenant à la famille des récepteurs CXC des chimiokines. Ces deux récepteurs sont activés par la chimiokine CXCL12 et sont surexprimés dans de nombreux cancers comme les gliomes, dont ils favorisent la prolifération et le caractère invasif. Le récepteur CXCR4 active des voies de signalisation qui dépendent de la protéine Gi et des β-arrestines et s’associe à plusieurs protéines impliquées dans la transduction du signal, le trafic et la localisation cellulaire du récepteur. Par contre, les mécanismes de signalisation impliqués dans les effets d’ACKR3 restent mal connus. Le récepteur déclenche une signalisation dépendant des β-arrestines, mais son couplage aux protéines G dépend du type cellulaire ou se fait par un mécanisme indirect via son association au récepteur CXCR4. Le récepteur ACKR3 s’associe également au récepteur de l’EGF pour induire la prolifération cellulaire par un mécanisme indépendant de sa stimulation par un agoniste. Ces données illustrent l’intérêt de caractériser de façon systématique l’interactome de ces récepteurs pour comprendre leurs rôles physiologiques et pathologiques. Cette thèse a poursuivi cet objectif grâce à la mise en œuvre d’une approche protéomique combinant la purification des partenaires des deux récepteurs par affinité suivie de leur identification par spectrométrie de masse. J’ai ainsi identifié respectivement 19 et 151 partenaires protéiques potentiels des récepteurs CXCR4 et ACKR3 exprimés dans les cellules HEK-293T. Parmi les protéines recrutées par ACKR3, nous nous sommes focalisés sur la connexine 43 (Cx43, une des protéines constituant les jonctions Gap) du fait de la similitude des effets du récepteur et de la Cx43 dans la pénétration des leucocytes dans le parenchyme cérébral, la migration des interneurones et la progression des gliomes. J’ai confirmé par Western blot et par BRET l’association spécifique de la Cx43 à l’ACKR3 et non pas au CXCR4. De la même façon, j’ai montré une co-localisation de la Cx43 et de l’ACKR3 dans des cellules de gliome humain, ainsi que dans les astrocytes de la zone sous-ventriculaire et les pieds astrocytaires entourant les capillaires cérébraux chez la souris, suggérant que les deux protéines forment un complexe protéique dans un contexte biologique authentique. Des études fonctionnelles ont révélé que l’ACKR3 module les fonctions de la Cx43 par différents mécanismes. L’expression de l’ACKR3 dans les cellules HEK-293T (mimant la surexpression du récepteur dans les tumeurs), induit par elle-même une inhibition de l’activité jonctionnelle de la Cx43. De même, la stimulation du récepteur par un agoniste réduit l’activité jonctionnelle de la Cx43 par un mécanisme impliquant l’activation d’une protéine Gi, la β-arrestine2 et l’internalisation de la Cx43. Cette thèse établit donc pour la première fois un lien fonctionnel entre le système constitué par les chimiokines CXCL11, CXCL12 et leur récepteur ACKR3 d’une part et les jonctions Gap d’autre part qui pourrait jouer un rôle critique dans la progression des gliomes. / The Atypical Chemokine Receptor 3 (ACKR3) and CXCR4 are two G protein-coupled receptors (GPCR) belonging to the CXC chemokine receptor family. Both receptors are activated upon CXCL12 binding and are over-expressed in various tumours, including glioma, where they have been found to promote proliferation and invasive behaviours. Upon CXCL12 binding, CXCR4 activates canonical GPCR signalling pathways involving Gαi protein and β-arrestins. In addition, CXCR4 was found to interact with several proteins able to modify its signalling, trafficking and localization. In contrast, the cellular pathways underlying ACKR3-dependent effects remain poorly characterized. Several reports show that ACKR3 engages β-arrestin-dependent signalling pathways, but its coupling to G proteins is restricted to either specific cellular populations, including astrocytes, or occurs indirectly via its interaction with CXCR4. ACKR3 also associates with the epidermal growth factor receptor to promote proliferation of tumour cells in an agonist-independent manner. These examples suggest that the extensive characterization of ACKR3 and CXCR4 interactomes might be a key step in understanding or clarifying their roles in physiological and pathological contexts. This thesis addressed this issue employing an affinity purification coupled to high-resolution mass spectrometry proteomic strategy that identified 19 and 151 potential protein partners of CXCR4 and ACKR3 transiently expressed in HEK-293T cells, respectively. Amongst ACKR3 interacting proteins identified, we paid particular attention on the gap junction protein Connexin-43 (Cx43), in line with its overlapping roles with the receptor in the control of leukocyte entry into the brain, interneuron migration and glioma progression. Western blotting and BRET confirmed the specific association of Cx43 with ACKR3 compared to CXCR4. Likewise, Cx43 is co-localized with ACKR3 but not CXCR4 in glioma initiating cell lines, and ACKR3 and Cx43 are co-expressed in astrocytes of the sub-ventricular zone and surrounding blood vessels in adult mouse brain, suggesting that both proteins form a complex in authentic cell or tissue contexts. Further functional studies showed that ACKR3 influences Cx43 trafficking and functionality at multiple levels. Transient expression of ACKR3 in HEK-293T cells to mimic ACKR3 overexpression detected in several cancer types, induces Gap Junctional Intercellular Communication (GJIC) inhibition in an agonist-independent manner. In addition, agonist stimulation of endogenously expressed ACKR3 in primary cultured astrocytes inhibits Cx43-mediated GJIC through a mechanism that requires activation of Gαi protein, and dynamin- and β-arrestin2-dependent Cx43 internalisation. Therefore, this thesis work provides the first functional link between the CXCL11/CXCL12/ACKR3 axis and gap junctions that might underlie their critical role in glioma progression.

O termo neuroplasticidade se refere às mudanças funcionais ou anatômicas que ocorrem no sistema nervoso decorrentes de experiências. O enriquecimento ambiental (EA) é um dos modelos experimentais utilizados para estudar eventos relacionados à neuroplasticidade, pois aumenta a neurogênese, os níveis de neurotrofinas, a sobrevivência neuronal, a sinaptogênese, além de induzir cascatas de sinalização e uma mudança na arborização dendritica dos neurônios de diversas regiões encefálicas. Nos últimos anos a importância dos astrócitos tem ganho destaque, principalmente no que tange a sua capacidade de modular sinapses e na participação ativa em eventos plásticos no encéfalo, essas mudanças estão relacionadas a alterações funcionais e morfológicas. O EA é um modelo interessante para avaliar performances comportamentais pois é um modelo que ocasiona mudanças na capacidade de armazenar e acessar novas informações. Sendo assim, acreditamos que o EA é capaz de gerar efeitos plásticos nos astrócitos do Stratum Radiatum da região CA1 e alterar as respostas comportamentais a tarefa de reconhecimento de objetos. Após oito semanas de EA iniciado logo após o desmame, camundongos CF-1 albinos não apresentam diferenças significativas no número de astrócitos GFAP-ir e na densidade óptica para GFAP no Stratum Radiatum. Entretanto ocorreu um aumento no número de processos originários do soma, aumento no tamanho destes processos no eixo lateral, paralelo as colaterais de Schaffer e no número de intersecções aos círculos concêntricos de Scholl na mesma região. Os astrócitos adquirem um formato estrelado, este achado pode estar relacionado ao aumento da densidade sináptica nesta região e corroboram com a idéia de que modificações astrocitárias são parte ativa dos processos plásticos que ocorrem no encéfalo. Nossos resultados mostraram também uma mudança comportamental na resposta a tarefa de reconhecimento de objetos. Os animais expostos ao EA despendem menos tempo explorando os objetos, tanto familiar como não familiar e apresentam igual capacidade de discriminar os objetos. Estes resultados demonstram um comportamento mais propicio a sobrevivência da espécie em animais expostos ao EA, o que inclui uma rápida exploração e um possível aumento na capacidade de aprender sobre o ambiente. / Environmental enrichment (EE) induces plastic changes in the brain, including morphological changes in hippocampal neurons, with increases in synaptic and spine densities. In recent years, the evidence for a role of astrocytes in regulating synaptic transmission and plasticity has increased, and it is likely that morphological and functional changes in astrocytes play an important role in brain plasticity. In others hand EE is used to investigate behavioral modifications associated with gene-environmental interaction. Our study was designed to evaluate changes in astrocytes induced by EE in the hippocampus, focusing on astrocytic density and on morphological changes in astrocytic processes and the performance in object recognition task (ORT) for evaluate animals ability to learn about their environment. After 8 weeks of EE starting at weaning, CF-1 mice presented no significant changes in astrocyte number or in the density of glial fibrillary acidic protein immunoreactivity (GFAP-ir) in the Stratum Radiatum. However, in the same region occur significant increase in the ramification of astrocytic processes, as well as by an increase in the number and length of primary processes extending in a parallel orientation to CA1 nerve fibers. This led astrocytes to acquire a more stellate morphology, a fact which could be related to the increase in hippocampal synaptic density observed in previous studies. These findings corroborate the idea that structural changes in astrocytic networks are an integral part of plasticity processes occurring in the brain. In other hand, our results indicate that EE decreased the time the animals spent exploring familiar and unfamiliar objects and total time spent exploring both objects, without affecting the capacity of discrimination of objects. These findings indicate a more propitious behavior for species survival in animals subjected to EE, including rapid exploration and learning about the environment.

A oclusão permanente e bilateral das artérias carótidas comuns (2VO), resultando em uma significante redução do fluxo sangüíneo cerebral (hipoperfusão) em ratos, é aceita como um modelo experimental bem estabelecido para investigar dano neuronal e déficit cognitivo que ocorrre com o envelhecimento e na doença de Alzheimer. Neste estudo foram avaliadas duas proteínas gliais: S100B e proteína glial fibrilar ácida (GFAP) no tecido cortical cerebral e hipocampo, bem como a S100B no fluído cerebroespinal, e captação de glutamato e a atividade da glutamina sintetase em hipocampo. A cognição foi avaliada através dos protocolos espaciais de memória de referência e de trabalho. O conteúdo de S100B periférico, particularmente no soro e no fluído cerebroespinal (CSF), tem sido usado como parâmetro de ativação glial em diversas condições patológicas. Preliminarmente, investigamos o efeito de anestésicos (tiopental, cetamina e halotano) no conteúdo de S100B no CSF e soro, isto porque alguns estudos têm sugerido um efeito prejudicial desses compostos. Além disso, foi investigado também o possível efeito dependente do sexo sobre o conteúdo de S100B no CSF, já que vários estudos têm sugerido os astrócitos como um dos alvos do estrogênio. Altos níveis de S100B no CSF foram encontrados em ratos anestesiados com tiopental; estes níveis, independente do anestésico, foram sexo-dependentes. Ratos adultos, machos Wistar foram submetidos a 10 semanas de hipoperfusão cerebral crônica após o método 2VO. Um significante aumento da S100B e GFAP em hipocampo foi observado, como também uma significante redução da captação de glutamato. Entretanto, observamos uma diminuição da S100B no CSF. Com relação à função cognitiva, houve um déficit tanto na memória espacial de referência como na de trabalho no labirinto aquático. Nossos dados reforçam a hipótese de que astrócitos têm um papel crucial nos mecanismos das patologias neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer, e que a patologia hipocampal resultante da hipoperfusão crônica contribui para os déficits de memória. / The permanent occlusion of common carotid arteries (2VO), resulting in a significant reduction in cerebral blood flow (hypoperfusion) in rats, is accepted as a well established experimental model to investigate neuronal damage and cognitive impairment that occurs in human ageing and Alzheimer's disease. In the present study, we evaluated two astroglial proteins: S100B and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in cerebral cortex and hippocampus tissue, as well S100B in cerebrospinal fluid, and glutamate uptake and glutamine synthetase activity in hippocampus tissue. Cognition was assessed by reference and working spatial memory protocols. Peripheral S100B content, particularly in serum and cerebrospinal fluid (CSF), has been used as a parameter of glial activation in several pathological conditions. Preliminary we investigated the effect of anesthetics (thiopental, ketamine and halothane) on CSF S100B levels since some studies have suggested a damage effect of these compounds. Moreover, we investigated a possible gender dependence on CSF S100B, since several studies have suggested astrocytes as putative targets for estrogen. Higher levels of CSF S100B were found when rats were anaesthetized with thiopental; these levels, independently of anesthetic, were gender dependent. Adult male Wistar rats were submitted to 10 weeks of chronic cerebral hypoperfusion after the 2VO method. A significant increase of S100B and GFAP in hippocampus tissue was observed, as well a significant decrease in glutamate uptake. Interestingly, we observed a decrease in S100B in cerebrospinal fluid. As for cognitive function, there was an impairment of both reference and working spatial memory in the water maze. Our data so support the hypothesis that astrocytes play a crucial role in the mechanisms of neurodegenerative disorders, like Alzheimer's disease, and that hippocampal pathology arising after chronic hypoperfusion gives rise to memory deficits.

A doença de Nicmann - Pick tipo C (DNPC) é uma desordem genética lisossomal neurodegenerativa causada pelo acúmulo de lipídios, principalmente colesterol, esfingomielina e glicoesfingolipídios no espaço perinuclear. U18666A é um agente inihidor no transporte de colesterol, que vem sendo utilizado em diversos modelos tanto in vivo quanto in vitro para mimificar DNPC, principalmente em fihrohlastos. Diversas doenças ncurodcgcncrativas estão associadas ao estresse oxidativo c acredita-se que radicais livres, produtos de lipoperoxidação e alterações na fluidez da membrana possam inibir a enzima Na+, K+-A TPase, levando a célula a um "déficit" energético. A deficiência de algumas proteínas como a GF AP parecem tornar os astrócitos menos eficientes em lidar com estados de injúrias no SNC, além de algumas pesquisas mostrarem um decréscimo na fosforilação de vimentina em fihrohlastos humanos com NPC. MK-801 é um receptor não competitivo de NMDA (N-mctil D-aspartato), sendo considerado um ncurotransmissor primário do cérebro. O objetivo desse estudo foi observar os efeitos da droga U 18666A, que causam o acúmulo de colesterol no citoplasma de astrôcitos de ratos jovens e a partir daí verificar a atividade de algumas hidrolascs lisossomais, parâmetros do estresse oxidativo, metabolismo energético e a hipelfosforilação de filamentos intermediários (GFAP e vimcntina) em astrócitos de ratos jovens. Através da coloração de Filippin c microscopia de fluorescência e através da utilização do CellM software, foi feita a visualização e quantificação do colesteroL A melhor dose de U18666A que permitiu o acúmulo de colesterol foi de 0,25 j..tg/mL em um período de incubação de 48 horas. Astrócitos de ratos incubados com a droga (DNPC) mostraram um significativo aumento de colesterol em relação aquelas culturas sem a droga. A medida da atividade da csfingomielinasc c enzimas beta-glicosidase em astrócitos de ratos com NPC foi significativamente menor do que astrócitos controle, o que é consistente com a atividade da DNPC humana. Verificando as alterações sofridas em nível de enzimas antioxidantcs c estresse oxidativo observamos que U 18666A leva a um aumento nos gmpos TBARS e Carbonil, porém a uma diminuição nos grupos tióis medidos por ensaios sulfidril. Além disso, ocorre um decréscimo na atividade de CAT e SOD e aumenta a produção de NO, ao analisarmos a atividade de Na+, K+ A TPase verifica-se um efeito inibitório na atividade dessa enzima. Os presentes resultados mostram que o acúmulo de colesterol nas culturas de células, induz o estresse oxidativo, o que indica que é potencialmente tóxico e confirma os resultados observados em outras doenças neurodegenerativas. Por fim, ao utilizarmos 4 grupos diferentes, fazendo uso ou não da droga c do MK-801 verificou-se que com o acúmulo de colesterol nas células ocorre uma hiperfosforilação dos Filamentos Intermediários, tanto de GFAP quanto de vimentina, porém o MK-801, sendo um antagonista de NMDA e agindo sobre os receptores de glutamato demonstram inibirem a cxcitotoxicidadc provocada pelo Ul8666A. Além dos parâmetros que foram testados em nosso trabalho, como extresse oxidativo, enzimas antioxidantcs c metabolismo energético, fazendo uso da droga para minriticar NPC, outros parâmetros bioquímicas das células, os quais ainda não foram testados em nossos estudos, podem ser testados com este modelo animal, contribuindo assim para uma melhor compreensão da doença. Podemos fazer uso ainda de substâncias que diminuam a excitotocicidade causada pelo aumento do colesterol, observados na NPC, a exemplo do antagonista do receptor NMDA, MK-801, podendo se tomar ferramentas viáveis para auxiliar no tratamento de doenças ncurodcgcncrativas relacionadas a cxcitotocicidadc glutamatérgica. / The Niemann - Pick type C (NPC) is a disorder genetic neurodegenerative caused by lysosomal accumulation of lipids, cspccially cholcstcrol, sphingomyclin and glycosphingolipids in the perinuclear space. U 18666A is an inhibitory agent in choiesteroi transport, which has heen used in several models hoth in vivo and in vitro to mimificar NPC, cspccially in fibroblasts. Various ncurodcgencrativc discases are associatcd with oxidative stress and it is believed that the free radicais, lipid peroxidation products and changes in membrane fluidity may inhibit the enzyme Na+, K + -ATPase, causing the cell suftcring a dcficit of cncrgy. Thc dcficiency of ccrtain protcins as GFAP sccm to makc astrocytes iess efficient in dealing with states of injury in the CNS, and some research shows a decrease in phosphorylation of vimentin in human fibroblasts with NPC. MK-801 is a noncompctitive NMDA receptor, bcing considercd a primary ncurotransmitter. Thc ohjective of this study was to observe the effects of U 18666A drug, eausing the accumulation of cholcstcrol in thc eytoplasm of young rat astrocytcs and thus verify thc activity of some lysosomai hydroiases, oxidative stress parameters, energy metabolism and hyperphosphorylation of intermediate filaments (vimentin and GFAP) in astrocytes of young rat. Through Filippin staining and fluorescence microscopy and by using the software Cel!M was made visualization and quantitation of cholesterol. The hest dose U18666A which allowed thc aceumulation of cholcstcrol was 0.25 mg I mL in a 48 hour period of incubation. Rat astrocytes (NPC) incubated with the drug showed a significant increase in total cholesterol relative to the cultures without drug. The measure of activity of sphingomyclinase and bcta-glucosidasc enzymes in rat astroeytcs NPC was signiticantly lower than contrai astrocytes, which is consistent with the activity of the human NPC. Noting the changcs suftcred in thc levei of antioxidant enzymcs and oxidativc stress U 18666A observed that ieads to an increase in TBARS and carbonyl groups, but a decrease in the thiol groups as measured by sulfl1ydryl tests. Moreover, there is a decrease in SOD and CAT activity and incrcascs the production of NO, by analyzing thc activity ofthe Na+, K + -ATPase there is an inhibitory effect on this enzyme. The present results show that the accumulation of cholesterol in cell cultures induces oxidative stress, which indicates that it is potcntially toxic, confirming the results observed in othcr ncurodcgcnerative discascs. Finally, we used four different groups, with or without the use of the dmg MK-801, and found that the accumulation of cholesterol in cells leads to hyperphosphorylation FI both GFAP and vimcntin, howcver, MK-801, an NMDA antagonist acts on the glutamatc receptor, and inhibit excitotoxicity caused by U 18666A. Besides the parameters that were tcstcd in our study, as oxidative stress, antioxidant cnzymcs and encrgy mctabolism, causing the dmg to mimificar NPC other biochemical parameters of the cells, which were not tested in our study may he tested with this model animal, thus contributing to a better undcrstanding of thc diseasc. Wc can still makc use of substances that rcduec thc excitotocicidade caused by increased choiesteroi, observed in NPC, such as the NMDA receptor antagonist, MK-801, which can hecome viahle tools to aid in the treatment of ncurodcgcnerativc diseascs rclatcd to cxcitotoeicidadc glutamatcrgic.

Os Transtornos do Espectro do Autismo, aqui tratados coletivamente sob o termo “autismo”, são distúrbios do desenvolvimento caracterizados por prejuízo no uso da linguagem e na comunicação, redução na interação social e comportamentos e interesses restritos e repetitivos. Evidências sugerem que o autismo é um transtorno multifatorial uma vez que se sabe da existência de um componente genético mas também da contribuição de fatores ambientais como infecções e uso de anticonvulsivantes ao logo da gestação. Apesar do grande número de estudos, a causa do transtorno é desconhecida, não existe tratamento e nenhum marcador diagnóstico foi identificado até o momento. O modelo animal baseado na administração pré-natal de ácido valpróico em ratos foi utilizado como ferramenta de estudo no presente trabalho e, através deste, foram realizadas análises de parâmetros astrocíticos no córtex frontal, hipocampo, estriado e cerebelo de ratos com 4 e 15 dias de idade, além de análises no hipocampo de animais de 120 dias. Os animais de 4 dias de idade apresentam níveis aumentados da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) no cerebelo Já os animais de 15 dias apresentam maiores níveis de GFAP em todas as estruturas estudadas. Além disso, há aumento nos níveis de vimentina no hipocampo e no conteúdo de S100B no córtex frontal e estriado. A atividade da glutamina sintetase encontra-se aumentada no hipocampo e reduzida no cerebelo e estriado. Além disso, nossos dados mostraram efeito do VPA sobre a transmissão glutamatérgica uma vez que houve aumento na captação desse transmissor, somada à maior expressão de GLT1 e conteúdo de GSH, além de diminuição na atividade da GS em 120 dias. Nossos resultados indicam que o VPA induz um processo de astrogliose reativa no encéfalo e que o cerebelo parece ser uma estrutura particularmente vulnerável. Sugere-se que os padrões regionais específicos das alterações encefálicas sejam causados pela heterogeneidade dos astrócitos e que a astrogliose pode ter papel no estabelecimento das características fisiopatológicas do autismo. Estudos adicionais são necessários para compreender a origem dessas alterações bem como suas consequências e suas implicações no diagnóstico e tratamento do autismo. / Autism Spectrum Disorders, which will be called “autism” in the present work, consist of a group of developmental disorders characterized by deficits in language and communication, low social interaction and restricted and repetitive behaviors and interests. It is known as a multifactorial disorder including both genetic and environmental components such as maternal infections and anticonvulsant used during pregnancy. Despite of the increasing number of publications in this area, the cause of autism is still unknown and there is neither treatment nor clinical marker. The animal model of autism based on the prenatal exposure to valproic acid in rats was used here to study different astrocytic parameters in the frontal cortex, hippocampus, striatum and cerebellum of male rats with 4 (P4) and 15 (P15) days of age. Additional analyses were done in the hippocampus of 120 days old rats (P120). The expression of GFAP increased in the cerebellum of P4 and in all brain structures from P15 rats. The number of vimentin+ astrocytes increased in hippocampus from P15 group and S100B levels increased in striatum and prefrontal cortex. The activity of GS in P15 increased in hippocampus and decreased in cerebellum and striatum. The effect of VPA on glutamatergic transmission was investigated in P120 were there was an increase in glutamate uptake, GLT1 expression and GSH content and reduced GS activity. Our results indicate that VPA induces early reactive astrogliosis and that cerebellum seems to be especially vulnerable. Regional patterns of brain alterations are probably due to astrocytic heterogeneity and astrogliosis seems to be relevant in establishing autistic neuropathological features. Additional studies are needed to better understand what triggers these alterations and what are their consequences and implications in autism diagnosis and treatment.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-07-02Bitstream added on 2014-06-13T19:01:27Z : No. of bitstreams: 1 lachat_d_dr_jabo.pdf: 9336468 bytes, checksum: f5dea24e18ee6a7cb21848540c6d48af (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Diversos estudos mostraram que a ingestão de dieta com níveis inadequados de ferro pode causar, no sistema nervoso central (SNC) de ratos, alterações morfológicas, bioquímicas e comportamentais no animal. Esses estudos têm ainda indicado que animais deficientes em ferro apresentam redução no número de lamelas de mielina e prejuízos na aprendizagem. A deficiência de ferro é uma das mais comuns desordens nutricionais em pacientes pediátricos e adultos e atinge cerca de 2,5 a 5 bilhões de pessoas em todo mundo. A consequência mais explícita da deficiência de ferro é a anemia. O ferro está relacionado ao desenvolvimento de fibras nervosas mielínicas, as quais constituem mais de 80% do nervo óptico. Objetivou-se, na presente investigação, avaliar com o auxílio de microscopia eletrônica de transmissão, os possíveis efeitos da anemia ferropriva na estrutura do nervo óptico de ratos Wistar durante os períodos de lactação e pós-lactação. Os animais foram divididos em 2 grupos: Controle e Anêmico. Os anêmicos receberam uma dieta com 4 mg de ferro/Kg, e os controle, uma dieta com 35 mg de ferro/Kg. Avaliações do peso corpóreo, hemoglobina e hematócrito foram feitas para checar os efeitos da deficiência de ferro. Os animais foram anestesiados com cloridrato de quetamina IM (22 mg/Kg) e então sacrificados por perfusão transcardíaca com PBS 0,05M, pH 7,4, seguido da mistura fixadora paraformaldeído 2% e glutaraldeído 1% diluída em tampão fosfato. Um segmento do nervo óptico foi retirado e pós-fixado em solução de tetróxido de ósmio a 1% por duas horas a 4ºC, desidratado em acetona e incluído em araldite. Cortes ultra-finos com 60 nanômetros de espessura foram montados em grades de cobre, contrastados com acetato de uranila e citrato de chumbo, observados e fotografados ao microscópio eletrônico de transmissão para detalhada análise ultraestrutural... / Several studies showed that ingestion of diets with inadequate iron levels can cause morphological, biochemical and behavioral changes in the central nervous system (CNS) of rats. These studies have also shown that iron-deficient animals have reduced number of myelin lamellae and prejudice on learning. Iron deficiency is one of the most common nutritional disorders in pediatric patients and adults and affects about 2.5-5 billion people around the world. The most explicit result of iron deficiency is anemia. The iron is related to the development of myelinated nerve fibers, which constitute more than 80% of the optic nerve. The aim of this research is to evaluate, with transmission electronic microscopy, the possible effects of iron deficiency anemia in Wistar rats optic nerve structure during lactation and pos-lactation period. The animals were divided into 2 groups: Control and Anemic. The anemic group received 4 mg iron/Kg, the control group received 35 mg iron/Kg. Evaluation of body weight, hemoglobin and hematocrit were made to check the iron deficiency effects. The animals were anesthetized with ketamine 22 mg/Kg and then sacrificed by transcardiac perfusion with PBS 0.05 M, pH 7.4, followed by paraformaldehyde fixative mixture 2% and 1% glutaraldehyde. An optic nerve segment was removed and post-fixed in a solution of osmium tetroxide for two hours at 4°C, dehydrated in acetone and embedded in Araldite. Ultrathin sections with 60 nanometers thick were mounted on copper grids, contrasted with uranyl acetate and lead citrate, observed and photographed by transmission electronic microscope for detailed ultrastructural analysis of nerve fibers, blood vessels and glial cells. Both hematological and body weight were smaller in the anemic group. The ultrastructural analysis showed damaged myelinated and unmyelinated fibers, and glial cells of the anemic animals when compared with... (Complete abstract click electronic access below)

A oclusão permanente e bilateral das artérias carótidas comuns (2VO), resultando em uma significante redução do fluxo sangüíneo cerebral (hipoperfusão) em ratos, é aceita como um modelo experimental bem estabelecido para investigar dano neuronal e déficit cognitivo que ocorrre com o envelhecimento e na doença de Alzheimer. Neste estudo foram avaliadas duas proteínas gliais: S100B e proteína glial fibrilar ácida (GFAP) no tecido cortical cerebral e hipocampo, bem como a S100B no fluído cerebroespinal, e captação de glutamato e a atividade da glutamina sintetase em hipocampo. A cognição foi avaliada através dos protocolos espaciais de memória de referência e de trabalho. O conteúdo de S100B periférico, particularmente no soro e no fluído cerebroespinal (CSF), tem sido usado como parâmetro de ativação glial em diversas condições patológicas. Preliminarmente, investigamos o efeito de anestésicos (tiopental, cetamina e halotano) no conteúdo de S100B no CSF e soro, isto porque alguns estudos têm sugerido um efeito prejudicial desses compostos. Além disso, foi investigado também o possível efeito dependente do sexo sobre o conteúdo de S100B no CSF, já que vários estudos têm sugerido os astrócitos como um dos alvos do estrogênio. Altos níveis de S100B no CSF foram encontrados em ratos anestesiados com tiopental; estes níveis, independente do anestésico, foram sexo-dependentes. Ratos adultos, machos Wistar foram submetidos a 10 semanas de hipoperfusão cerebral crônica após o método 2VO. Um significante aumento da S100B e GFAP em hipocampo foi observado, como também uma significante redução da captação de glutamato. Entretanto, observamos uma diminuição da S100B no CSF. Com relação à função cognitiva, houve um déficit tanto na memória espacial de referência como na de trabalho no labirinto aquático. Nossos dados reforçam a hipótese de que astrócitos têm um papel crucial nos mecanismos das patologias neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer, e que a patologia hipocampal resultante da hipoperfusão crônica contribui para os déficits de memória. / The permanent occlusion of common carotid arteries (2VO), resulting in a significant reduction in cerebral blood flow (hypoperfusion) in rats, is accepted as a well established experimental model to investigate neuronal damage and cognitive impairment that occurs in human ageing and Alzheimer's disease. In the present study, we evaluated two astroglial proteins: S100B and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in cerebral cortex and hippocampus tissue, as well S100B in cerebrospinal fluid, and glutamate uptake and glutamine synthetase activity in hippocampus tissue. Cognition was assessed by reference and working spatial memory protocols. Peripheral S100B content, particularly in serum and cerebrospinal fluid (CSF), has been used as a parameter of glial activation in several pathological conditions. Preliminary we investigated the effect of anesthetics (thiopental, ketamine and halothane) on CSF S100B levels since some studies have suggested a damage effect of these compounds. Moreover, we investigated a possible gender dependence on CSF S100B, since several studies have suggested astrocytes as putative targets for estrogen. Higher levels of CSF S100B were found when rats were anaesthetized with thiopental; these levels, independently of anesthetic, were gender dependent. Adult male Wistar rats were submitted to 10 weeks of chronic cerebral hypoperfusion after the 2VO method. A significant increase of S100B and GFAP in hippocampus tissue was observed, as well a significant decrease in glutamate uptake. Interestingly, we observed a decrease in S100B in cerebrospinal fluid. As for cognitive function, there was an impairment of both reference and working spatial memory in the water maze. Our data so support the hypothesis that astrocytes play a crucial role in the mechanisms of neurodegenerative disorders, like Alzheimer's disease, and that hippocampal pathology arising after chronic hypoperfusion gives rise to memory deficits.

O termo neuroplasticidade se refere às mudanças funcionais ou anatômicas que ocorrem no sistema nervoso decorrentes de experiências. O enriquecimento ambiental (EA) é um dos modelos experimentais utilizados para estudar eventos relacionados à neuroplasticidade, pois aumenta a neurogênese, os níveis de neurotrofinas, a sobrevivência neuronal, a sinaptogênese, além de induzir cascatas de sinalização e uma mudança na arborização dendritica dos neurônios de diversas regiões encefálicas. Nos últimos anos a importância dos astrócitos tem ganho destaque, principalmente no que tange a sua capacidade de modular sinapses e na participação ativa em eventos plásticos no encéfalo, essas mudanças estão relacionadas a alterações funcionais e morfológicas. O EA é um modelo interessante para avaliar performances comportamentais pois é um modelo que ocasiona mudanças na capacidade de armazenar e acessar novas informações. Sendo assim, acreditamos que o EA é capaz de gerar efeitos plásticos nos astrócitos do Stratum Radiatum da região CA1 e alterar as respostas comportamentais a tarefa de reconhecimento de objetos. Após oito semanas de EA iniciado logo após o desmame, camundongos CF-1 albinos não apresentam diferenças significativas no número de astrócitos GFAP-ir e na densidade óptica para GFAP no Stratum Radiatum. Entretanto ocorreu um aumento no número de processos originários do soma, aumento no tamanho destes processos no eixo lateral, paralelo as colaterais de Schaffer e no número de intersecções aos círculos concêntricos de Scholl na mesma região. Os astrócitos adquirem um formato estrelado, este achado pode estar relacionado ao aumento da densidade sináptica nesta região e corroboram com a idéia de que modificações astrocitárias são parte ativa dos processos plásticos que ocorrem no encéfalo. Nossos resultados mostraram também uma mudança comportamental na resposta a tarefa de reconhecimento de objetos. Os animais expostos ao EA despendem menos tempo explorando os objetos, tanto familiar como não familiar e apresentam igual capacidade de discriminar os objetos. Estes resultados demonstram um comportamento mais propicio a sobrevivência da espécie em animais expostos ao EA, o que inclui uma rápida exploração e um possível aumento na capacidade de aprender sobre o ambiente. / Environmental enrichment (EE) induces plastic changes in the brain, including morphological changes in hippocampal neurons, with increases in synaptic and spine densities. In recent years, the evidence for a role of astrocytes in regulating synaptic transmission and plasticity has increased, and it is likely that morphological and functional changes in astrocytes play an important role in brain plasticity. In others hand EE is used to investigate behavioral modifications associated with gene-environmental interaction. Our study was designed to evaluate changes in astrocytes induced by EE in the hippocampus, focusing on astrocytic density and on morphological changes in astrocytic processes and the performance in object recognition task (ORT) for evaluate animals ability to learn about their environment. After 8 weeks of EE starting at weaning, CF-1 mice presented no significant changes in astrocyte number or in the density of glial fibrillary acidic protein immunoreactivity (GFAP-ir) in the Stratum Radiatum. However, in the same region occur significant increase in the ramification of astrocytic processes, as well as by an increase in the number and length of primary processes extending in a parallel orientation to CA1 nerve fibers. This led astrocytes to acquire a more stellate morphology, a fact which could be related to the increase in hippocampal synaptic density observed in previous studies. These findings corroborate the idea that structural changes in astrocytic networks are an integral part of plasticity processes occurring in the brain. In other hand, our results indicate that EE decreased the time the animals spent exploring familiar and unfamiliar objects and total time spent exploring both objects, without affecting the capacity of discrimination of objects. These findings indicate a more propitious behavior for species survival in animals subjected to EE, including rapid exploration and learning about the environment.

Os Transtornos do Espectro do Autismo, aqui tratados coletivamente sob o termo “autismo”, são distúrbios do desenvolvimento caracterizados por prejuízo no uso da linguagem e na comunicação, redução na interação social e comportamentos e interesses restritos e repetitivos. Evidências sugerem que o autismo é um transtorno multifatorial uma vez que se sabe da existência de um componente genético mas também da contribuição de fatores ambientais como infecções e uso de anticonvulsivantes ao logo da gestação. Apesar do grande número de estudos, a causa do transtorno é desconhecida, não existe tratamento e nenhum marcador diagnóstico foi identificado até o momento. O modelo animal baseado na administração pré-natal de ácido valpróico em ratos foi utilizado como ferramenta de estudo no presente trabalho e, através deste, foram realizadas análises de parâmetros astrocíticos no córtex frontal, hipocampo, estriado e cerebelo de ratos com 4 e 15 dias de idade, além de análises no hipocampo de animais de 120 dias. Os animais de 4 dias de idade apresentam níveis aumentados da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) no cerebelo Já os animais de 15 dias apresentam maiores níveis de GFAP em todas as estruturas estudadas. Além disso, há aumento nos níveis de vimentina no hipocampo e no conteúdo de S100B no córtex frontal e estriado. A atividade da glutamina sintetase encontra-se aumentada no hipocampo e reduzida no cerebelo e estriado. Além disso, nossos dados mostraram efeito do VPA sobre a transmissão glutamatérgica uma vez que houve aumento na captação desse transmissor, somada à maior expressão de GLT1 e conteúdo de GSH, além de diminuição na atividade da GS em 120 dias. Nossos resultados indicam que o VPA induz um processo de astrogliose reativa no encéfalo e que o cerebelo parece ser uma estrutura particularmente vulnerável. Sugere-se que os padrões regionais específicos das alterações encefálicas sejam causados pela heterogeneidade dos astrócitos e que a astrogliose pode ter papel no estabelecimento das características fisiopatológicas do autismo. Estudos adicionais são necessários para compreender a origem dessas alterações bem como suas consequências e suas implicações no diagnóstico e tratamento do autismo. / Autism Spectrum Disorders, which will be called “autism” in the present work, consist of a group of developmental disorders characterized by deficits in language and communication, low social interaction and restricted and repetitive behaviors and interests. It is known as a multifactorial disorder including both genetic and environmental components such as maternal infections and anticonvulsant used during pregnancy. Despite of the increasing number of publications in this area, the cause of autism is still unknown and there is neither treatment nor clinical marker. The animal model of autism based on the prenatal exposure to valproic acid in rats was used here to study different astrocytic parameters in the frontal cortex, hippocampus, striatum and cerebellum of male rats with 4 (P4) and 15 (P15) days of age. Additional analyses were done in the hippocampus of 120 days old rats (P120). The expression of GFAP increased in the cerebellum of P4 and in all brain structures from P15 rats. The number of vimentin+ astrocytes increased in hippocampus from P15 group and S100B levels increased in striatum and prefrontal cortex. The activity of GS in P15 increased in hippocampus and decreased in cerebellum and striatum. The effect of VPA on glutamatergic transmission was investigated in P120 were there was an increase in glutamate uptake, GLT1 expression and GSH content and reduced GS activity. Our results indicate that VPA induces early reactive astrogliosis and that cerebellum seems to be especially vulnerable. Regional patterns of brain alterations are probably due to astrocytic heterogeneity and astrogliosis seems to be relevant in establishing autistic neuropathological features. Additional studies are needed to better understand what triggers these alterations and what are their consequences and implications in autism diagnosis and treatment.